JPS63255660A - 細胞測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細胞測定法に係り、特に血液塗沫標本や細胞Ｍ
ｉ織標本を用いて細胞を識別するのに好適な細胞測定法
に関するものである。

〔従来の技術〕

従来の免疫分析方法としてラジオイムノアッセイ法やエ
ンザイムイムノアツセイ法などのいろいろな標識物質を
用いて種々の分析法が考えＪられている。こ九らの分析
法の多くは、血液中の各種成分の分析に応用されており
、いわゆる体液性免疫に関係していた。これに対して、
リンパ球や赤血球などの血液細胞や組繊細胞などを免疫
学的に調べるいわゆる細胞免疫に関しては、高感度免疫
分析技術の応用が始まったところであるといえる。

例えば、リンパ球にばＴ細胞（Ｔリンパ球）とＢ細胞（
Ｂリンパ球）とがある。両者はともに共通の骨髄幹細胞
から発生したものであるが、互いに協調して機能し、マ
クロファージ、単球、多核白血球らと共同して免疫反応
を起こす。各種免疫疾患において、細胞性免疫に重要な
役割を演するＴ細胞、液性抗体の産生をつかさどるＢ細
胞の量的異常を測定することは、診断あるいは疾患の病
態を把握する上で役立つといわれている。これらのＴ細
胞、Ｂ細胞の測定は、現在法のようにされている。すな
わち、Ｔ細胞はヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）と試験管内て
ロゼツＩ−を形成する性質あるいは特異的にＴ細胞と反
応する抗体（抗Ｔ細胞抗体）を用いて膜量光抗体法で染
色する。Ｂ細胞は、マウス赤血球（ＭＲＢＣ）と試験管
内でロゼツトを形成する性質あるいは膜表面に免疫グロ
ブリンを保有しているので、蛍光標識抗ヒ１へ免疫グロ
ブリン血清を用いて膜量光抗体法で陽性細胞を観察する
（日本臨床　４０巻　第９８５頁　秋季臨時増刊号　　
１９８２年）。

しかしながら、前述のロゼツト形成反応は、その手技が
比重遠心法の採用など面倒である上にロゼツト形成反応
に長時間を要し、しかもその上血球計算板を使用する検
鏡が必要である。このように、ロゼツト形成反応を利用
したＴ細胞、Ｂ細胞の測定には多大の手間が必要であっ
た。一方、膜量光抗体法は、特異抗体の利用により正確
度が高い便利な方法であるといえる。しかし、抗体１分
子に結合させることのできる標識化合物（蛍光物質）数
には限りがあるため、検出感度の点で問題があった。ま
た、標識化合物として使用することのできる蛍光物質は
、その種類が限られており、しかも蛍光波長が近接する
ものが大部分を占めている。このため、複数種類の細胞
あるいは細胞抗原を光学的に同時に識別するのは困難で
あった。

さらに、細胞あるいは細胞抗原の識別に酵素抗体法が利
用されている。これは、抗原と酵素標識抗体を反応させ
た後に酵素反応を起こして発色させる方法である。しか
しながら、このとき、発色反応の結果化じる色素は、細
胞表面に沈着した状態にあることが多く、後染色により
除去されやすいという問題点があった。さらに、使用さ
れ得る酵素は限られており、酵素反応の結果化ずる色調
を基に複数種類の細胞あるいは細胞抗原を光学的に識別
することは困難であった。また、発色まで多段階の反応
を要し、結果を得るまでに長時間を必要とした。

近年、金コロイド抗体法により細胞表面抗原の存在が証
明されるようになってきている。しかしながら、金コロ
イドの最大吸収波長は５２０〜５４０μｍであり、複数
種類の細胞あるいは細胞抗原の同時識別の目的には適し
ていないといえる。

さらに、近年、細胞を分類するにあたり、種々の細胞に
ついて特異的な染色性、形状などをもとにしてパターン
認識技術を駆使して分類する方法も試みられている。し
かしながら、これらのバタ−ン認識技術による細胞分類
の識別精度は未だ不十分であり、特異性の高い細胞の識
別方法の開発が望まれている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記した従来技術の膜量光抗体法は、標識化合物として
使用できる蛍光物質の種類が限られるため、複数種類の
細胞あるいは細胞抗原を光学的に同時に識別することが
困難であり、また、酵素抗体法が利用されているが、発
色反応の結果化する色素は細胞表面に沈着した状態にあ
ることが多く、後染色によって除去されやすく、かつ、
使用し得る酵素は限られており、複数種類の細胞あるい
は細胞抗原を光学的に識別することが困難であり、発色
までに多段階の反応を要し、結果を得るまでに長時間を
必要とした。また、近年、金コロイＩく抗体法やパター
ン認識技術を駆使して分類する方法も試みられているが
、細胞分類の識別精度は未だ不十分である。

本発明の目的は、Ｔ細胞あるいはＢ細胞に限らず血液細
胞や組繊細胞などの複数種類の細胞あるいは細胞抗原を
簡便、迅速に検出し、識別計測することができる細胞測
定法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

上記目的は、複数種類の被検細胞あるいは被検細胞の抗
原と、これらに対して特異的に反応する抗体を結合させ
て光学的に相互に識別し得る複数種類の微細粒子を反応
させ、しかるのちそれぞれの粒子を分別し得る光学的手
段により上記複数種類の被検細胞あるいは被検細胞の抗
原を同時に計測することによって達成するようにした。

あるいは、複数種類の被検細胞あるいは被検細胞の抗原
と、これらに対して特異的に反応する抗体を反応させた
後に、さらに光学的に相互に識別し得る複数種類の微細
粒子にそれぞれ結合させた上記抗体と特異的に反応する
細胞を反応させ、しかるのちそれぞれの粒子を分別し得
る光学的手段により上記複数種類の被検細胞あるいは被
検細胞の抗原を同時に開側することによって達成するよ
うにした。

微細粒子はラテックス粒子のような合成高分子であって
もよく、あるいは金属粒子であってもよく、さらに小胞
体であってもよく、これらに限度されるものではない。

要するに光学的に検知可能な小粒子であれば、本発明の
細胞測定法に用いることができる。また、微細粒子の大
きさは、１０−工Ｏｍからコ−０−６ｍ、特に好ましく
は１０−７ｍから］〇−θｍのときに細胞の識別に好適
である。

〔作用〕

測定対象である細胞あるいは細胞抗原の種類によって微
細粒子の粒子径を変えることにより、微細粒子の大きさ
の違いを基に複数種類の細胞あるいは細胞抗原の同時計
測が可能となる。また、細胞あるいは細胞抗原の種類に
よって、これと反応させる微細粒子の色調を変えて相互
に識別できるようにすると、微細粒子の色調を検知する
ことにより複数種類の細胞あるいは細胞抗原の同時計測
が可能となる。近年、種々の粒子径の着色粒子（ｄｙｅ
ｄ　ｐａｒｔｉｃｌ、ｅｓ）が市販されるようになった
が、これらを本発明の方法に使用することもできる。

従来より汎用されている抗体の標識法を蛍光色素の代表
であるＦ　Ｉ　Ｔ　Ｃ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏ
ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）と抗ヒトアルブミン抗体を例
にとって説明する。一定量の抗体に対してＦＩＴＣを加
えてゆくと、ＦＩＴＣ量を増すことによって単位蛋白質
量あたりの蛍光標識量（Ｆ／Ｐ比）の高い標識抗体が得
られる。通常、Ｆ／Ｐ二２前２前後光抗体を用いること
が多く、Ｆ／Ｐ＝３程度の標識抗体を調整することもで
きるが、抗体活性はむしろ低下してしまうことが多い。

このように抗体１分子あたりの有効な標識分子数には限
度があり、また、細胞抗原１分子に標識抗体が１分子し
か結合することができないため、十分な検出感度が得ら
れていなかった。

本発明においては、抗体を結合させた微細粒子を光学的
に識別する方法を採用しており、抗体を標識する従来法
と比較して高感度に細胞を検知できることはいうまでも
ない。また、複数種類の細胞あるいは細胞抗原の同時計
測といった点においては、従来法である蛍光抗体法や酵
素抗体法で使用される標識物質の種類は限られており、
標識物質の神頼を基にして識別することのできる細胞あ
るいは細胞抗原の種類には限度があった。これに対して
本発明の方法で使用する微細粒子については、粒子径、
形状あるいは色調を任意に選択することができ、光学的
に相互に識別し得る複数種類の微細粒子を使用すること
ができる。このため、本発明の細胞測定法は、複数種類
の細胞あるいは細胞抗原の識別、計測に適した方法であ
るといえる。

さらに、従来法で必要とされた発色反応は不要となるた
め、測定操作に必要な手間が大幅に省けて、短時間に簡
便な細胞の識別方法を提供するこ標本や細胞組織標本で
あるときに特に好適な方法である。微細粒子の粒子径を
適宜選択することによって、細胞の形状を損うことなく
、目的とする細胞表面抗原の存在部位を明らかにするこ
とができる。このため、抗原の存在を確認すると同時に
１枚の標本を用いて細胞の形状あるいは細胞染色などの
情報をもとに細胞を分類することもできる。

また、複数種類の細胞あるいは細胞抗原の検出のために
、従来、同一検体について複数枚数の標本が必要とされ
たが、本発明の方法により同一標本を用いて、複数種類
の細胞あるいは細胞抗原の同時計測が可能となる。また
、多重染色により最初に染色された色素が脱色するとい
う問題も解決される。

従来、染色、形状などの種々の情報を基にしてコンピュ
ータでのパターン認識技術によりなされている血球分類
も、それぞれの細胞に特異的な抗微細粒子を光学的に検
知することで血球分類が可能となる。

次に、従来法の酵素標識抗体法と本発明の複数の細胞抗
原を検出するための方法について、反応を追いながら説
明する。従来法では、例えば、第２図に示すように、ス
ライド１の細胞２の３で示す抗原１と４で示す抗原２の
２種類の細胞抗原の検出のために、発色後の色調の異な
る２種類の酵素をそれぞれの抗体に標識した酵素標識抗
体を準備する。まず、抗原１に対しては、酵素Ａ標識抗
体、主を反応させた後、基質Ａを加え、酵素反応を生じ
させて発色（例えば、赤色３′）を見ることにより検出
する。次に、抗Ｍ２についても、酵素Ｂ標識抗体声を加
えて反応させた後、基質Ｂを加え、発色（例えば青色４
′）を見ることで抗原２を検出する。従来法においては
、使用する標識酵素が限定されるため、同時検出抗原の
種類に限りがあるほか、後染色による脱色の問題などが
あることは、先に述べた通りである。

の抗体を結合させた光学的に識別し得る微細粒子（例え
ば、抗体、子結合の赤色微細粒子及び抗り結合の青色微
細粒子）を反応させる。こののち、それぞれの粒子を分
別し得る光学的手段、例えば、分光器５によってそれぞ
れの粒子を識別する。これによって抗原１及び抗原２が
同時に検出できる。

なお、第１図には赤色粒子と青色粒子の分光特性の−例
を示しである。

〔実施例〕

以下本発明の実施例について説明する。

実施例］− Ｔ細胞、Ｂ細胞の同時分析 患者血液の薄層塗抹標本を作成して乾燥後、直ちに固定
し、抗Ｂ細胞抗体を結合させた粒子径０．０３　μｍの
青色ラテックス微細粒子溶液と、抗Ｂ細胞抗体を結合さ
せた粒子径０．０３　μｍの赤色ラテックス微細粒子液
を先の固定標本と３７℃、３０分間反応させる。その後
、１％手血清アルブミン含有の０．１Ｍリン酸緩衝液（
ＰＨ７，４）で十分洗浄して余分の反応液を除去し、そ
の後光学顕微鏡を用いて青色及び赤色のラテックス微細
粒子が付着した細胞を目視計測することによってＴ細胞
、Ｂ細胞の百分率を求める。その結果を第１表に示す。

第　　１　　表 また、上記と同様の方法によって調製及び反応させた標
本を血液像自動分類装置に供し、赤色及び青色粒子の付
着した細胞を選別することによりＴ細胞、Ｂ細胞の百分
率を求めたところ、従来法と一致する良好な結果を迅速
に得ることができた。

実施例２ 患者血液の薄層塗抹標本を作成して乾燥後、直ちに固定
し、この標本にマウス抗Ｂ細胞抗体及びラット抗Ｂ細胞
抗体液を滴下して、３７°Ｃ１３０分間反応させる。そ
の後、１％アルブミン含有のリン酸緩衝液で洗浄した後
、ラビット抗マウス抗体を結合させた粒子径０．０３　
　μｍの青色ラテックス微細粒子溶液とラビット抗ラッ
ト抗体を結合させた粒子径０．０３　　μｍの赤色ラテ
ックス微細粒子を滴下し、３７℃、３０分間反応させた
後洗浄し、光学顕微鏡で青色及び赤色粒子の付着した細
胞を計測することによってゴ′細胞、Ｂ細胞の百分率を
求めた。これによる従来法との一致率は良好であった。

実施例３ リンパ球浮遊液（５Ｘ１０６／ｍｆｆ）Ｏ，ｉｍＱとＦ
ＩＴＣ標識抗ＩｇＭ（μ）抗体とを結合させたラテック
ス溶液０．１　　ｍＱと、抗Ｂ細胞抗体を結合させた粒
子径０．０２　　μｍの赤色ラテックス微細粒子溶液０
．１　　ｍＱを混合後、３７℃、３０分間反応される。

その後、１５０　ｇ　（１０００ｒｐｍ）１０分間の遠
心洗浄を２回行い、沈渣はミキサーでほぐした。最後の
沈渣に数滴のＭ　Ｅ　Ｍ　−ＮａＮ３を加え、この反応
細胞浮遊液をキャピラリーで再浮遊させ、１滴をスライ
ドガラスに落して、カバーガラスで液を封じた。その後
、光学顕微鏡で観察して赤色粒子の付着したＢ細胞を確
認後、同一視野を蛍光顕微鏡で観察した。これによって
先に観察したＢ細胞が蛍光を発生しているかどうかを観
察し、Ｂ細胞の形に沿って緑色の蛍光を発する細胞を認
めることができる。この実験によって同一細胞の多重標
識観察が可能であることがわかった。

実施例４ リンパ球浮遊液５０μＱと抗ヒ１−トランスフエリンリ
セブター抗体を結合させた粒子径０．０１μｍの赤色ラ
テックス微細粒子液５ｏμＱと、抗ヒ１〜Ｔ細胞抗体を
結合させた青色ラテックス微細粒子液５０μＱを混合し
て３７°Ｃ，１時間反応させ、混入赤血球を溶血させた
後に、３００ｇで１０分間遠心分離して細胞を洗浄し、
洗浄細胞を標本として光学顕微鏡で赤色及び青色粒子の
付着した細胞を観察することによって活性化Ｔ細胞を同
定する。

実施例５ リンパ球浮遊液２０μＱとマウス抗Ｂ細胞抗体１０μＱ
と反応させて４℃、１５分間インキュベートし、８００
ｇ、５分間の遠心分離を２回行い、細胞を洗浄し、さら
に、ボート抗マウス抗体を結合させた直径３０ｎｍの金
粒子液２０μＱを加えて、３７°Ｃ，３０分間インキュ
ベートし、８００ｇ＋５分間の遠心分離により洗浄し、
次に、ラビット抗Ｂ細胞抗体を結合させた粒子径０．８
　　μｍの黄色ラテックス液５０μＱを加えて３７°Ｃ
２３０分間反応させた。細胞を洗浄した後、細胞浮遊液
をスライドグラス」二に滴下して塗抹固定し、このよう
にして作成した標本を光学顕微鏡で観察した。この結果
、細胞の色調とともに、着色粒子の粒子径の違いをもと
にしてリンパ球浮遊液中のＴ細胞とＢ′細胞の分別が可
能となる。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明によれば、血液細胞や組繊
細胞などの複数種類の細胞あるいは細胞抗原を簡便、迅
速、高感度に同時に識別計測することができるという効
果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の複数の細胞抗原を検出するための方法
の一実施例を説明するための説明図、第２図は従来の複
数の細胞抗原を検出するための方法の説明図である。 トスライ１く、２・・・細胞、３・抗原１．４・・・抗
原２．５・・分光器。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中の被検細胞と該細胞と特異的に反応する抗体
   とを反応させることにより前記被検細胞を識別する方法
   において、前記被検細胞が複数種類からなるときにそれ
   ぞれの細胞と特異的に反応する抗体を結合させた光学的
   に相互に識別し得る複数種類の微細粒子を前記被検細胞
   と反応させて、しかるのちそれぞれの前記微細粒子を分
   別し得る光学的手段により前記複数種類の被検細胞を同
   時に計測することを特徴とする細胞測定法。 ２、前記複数種類の被検細胞に対応する微細粒子の色調
   が光学的に相互に識別し得るものである特許請求の範囲
   第１項記載の細胞測定法。 ３、前記複数種類の被検細胞に対応する微細粒子の形状
   あるいは粒子径が光学的に相互に識別し得るものである
   特許請求の範囲第１項記載の細胞測定法。 ４、前記複数種類の被検細胞に対応する微細粒子が合成
   高分子脂質を成分とする小胞体または無機物質のいずれ
   かであり、粒子径が１０＾−＾１＾０〜１０＾−＾６ｍ
   である特許請求の範囲第１項または第２項または第３項
   記載の細胞測定法。 ５、前記被検細胞を含む試料が血液塗沫標本あるいは細
   胞組織標本である特許請求の範囲第１項または第２項ま
   たは第３項または第４項記載の細胞測定法。 ６、試料中の被検細胞と該細胞と特異的に反応する抗体
   とを反応させることにより前記被検細胞を識別する方法
   において、複数種類からなる前記被検細胞とそれぞれの
   前記細胞と特異的に反応する抗体とを反応させたのちさ
   らに光学的に相互に識別し得る複数種類の微細粒子にそ
   れぞれ結合させた前記抗体と特異的に反応する抗体を反
   応させて、しかるのちそれぞれの前記微細粒子を分別し
   得る光学的手段により前記複数種類の被検細胞を同時に
   計測することを特徴とする細胞測定法。 ７、前記複数種類の被検細胞に対応する微細粒子の色調
   が光学的に相互に識別し得るものである特許請求の範囲
   第６項記載の細胞測定法。 ８、前記複数種類の被検細胞に対応する微細粒子の形状
   あるいは粒子径が光学的に相互に識別し得るものである
   特許請求の範囲第６項記載の細胞測定法。 ９、前記複数種類の被検細胞に対応する微細粒子が合成
   高分子脂質を成分とする小胞体または無機物質のいずれ
   かであり、粒子径が１０＾−＾１＾０〜１０＾−＾６ｍ
   である特許請求の範囲第６項または第７項または第８項
   記載の細胞測定法。 １０、前記被検細胞を含む試料が血液塗沫標本あるいは
   細胞組織標本である特許請求の範囲第６項または第７項
   または第８項または第９項記載の細胞測定法。 １１、試料中の被検細胞と該細胞と特異的に反応する抗
   体とを反応させることにより前記被検細胞を識別する方
   法において、複数種類からなる前記被検細胞の抗原とそ
   れぞれの前記抗原と特異的に反応する抗体を結合させた
   光学的に相互に識別し得る複数種類の微細粒子を反応さ
   せ、しかるのちそれぞれの前記微細粒子を分別し得る光
   学的手段により前記複数種類の細胞抗原を同時に計測す
   ることを特徴とする細胞測定法。 １２、前記複数種類の被検細胞に対応する微細粒子の色
   調が光学的に相互に識別し得るものである特許請求の範
   囲第１１項記載の細胞測定法。 １３、前記複数種類の被検細胞に対応する微細粒子の形
   状あるいは粒子径が光学的に相互に識別し得るものであ
   る特許請求の範囲第１１項記載の細胞測定法。 １４、前記複数種類の被検細胞に対応する微細粒子が合
   成高分子脂質を成分とする小胞体または無機物質のいず
   れかであり、粒子径が１０＾−＾１＾０〜１０＾−＾６
   ｍである特許請求の範囲第１１項または第１２項または
   第１３項記載の細胞測定法。 １５、前記被検細胞を含む試料が血液塗沫標本あるいは
   細胞組織標本である特許請求の範囲第１１項または第１
   ２項または第１３項または第１４項記載の細胞測定法。 １６、試料中の被検細胞と該細胞と特異的に反応する抗
   体とを反応させることにより前記被検細胞を識別する方
   法において、複数種類からなる前記被検細胞の抗原とそ
   れぞれの前記抗原と特異的に反応する抗体とを反応させ
   たのちに、さらに光学的に相互に識別し得る複数種類の
   微細粒子にそれぞれ結合させた前記抗体と特異的に反応
   する抗体を反応させ、しかるのちそれぞれの前記微細粒
   子を分別し得る光学的手段により前記複数種類の細胞抗
   原を同時に計測することを特徴とする細胞測定法。 １７、前記複数種類の被検細胞に対応する微細粒子の色
   調が光学的に相互に識別し得るものである特許請求の範
   囲第１６項記載の細胞測定法。 １８、前記複数種類の被検細胞に対応する微細粒子の形
   状あるいは粒子径が光学的に相互に識別し得るものであ
   る特許請求の範囲第１６項記載の細胞測定法。 １９、前記複数種類の被検細胞に対応する微細粒子が合
   成高分子脂質を成分とする小胞体または無機物質のいず
   れかであり、粒子径が１０＾−＾１＾０〜１０＾−＾６
   ｍである特許請求の範囲第１６項または第１７項または
   第１８項記載の細胞測定法。 ２０、前記被検細胞を含む試料が血液塗沫標本あるいは
   細胞組織標本である特許請求の範囲第１６項または第１
   ７項または第１８項または第１９項記載の細胞測定法。