JPWO2014104019A1 - 尿中ポドサイトの検出方法 - Google Patents
尿中ポドサイトの検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2014104019A1 JPWO2014104019A1 JP2014554455A JP2014554455A JPWO2014104019A1 JP WO2014104019 A1 JPWO2014104019 A1 JP WO2014104019A1 JP 2014554455 A JP2014554455 A JP 2014554455A JP 2014554455 A JP2014554455 A JP 2014554455A JP WO2014104019 A1 JPWO2014104019 A1 JP WO2014104019A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- podocytes
- bound
- urine
- insoluble carrier
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000000557 podocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 105
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 62
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 34
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 34
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 34
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 14
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 6
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 6
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 6
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 16
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 8
- 102000004401 podocalyxin Human genes 0.000 description 8
- 108090000917 podocalyxin Proteins 0.000 description 8
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 208000022461 Glomerular disease Diseases 0.000 description 5
- 231100000852 glomerular disease Toxicity 0.000 description 5
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 208000028208 end stage renal disease Diseases 0.000 description 4
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006453 Class 3 Receptor-Like Protein Tyrosine Phosphatases Human genes 0.000 description 2
- 108010044214 Class 3 Receptor-Like Protein Tyrosine Phosphatases Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010159 IgA glomerulonephritis Diseases 0.000 description 2
- 206010021263 IgA nephropathy Diseases 0.000 description 2
- 241000238413 Octopus Species 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 201000005206 focal segmental glomerulosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 2
- 210000000585 glomerular basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 2
- 201000006334 interstitial nephritis Diseases 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XGWFJBFNAQHLEF-UHFFFAOYSA-N 9-anthroic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C(=O)O)=C(C=CC=C3)C3=CC2=C1 XGWFJBFNAQHLEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 1
- 208000027932 Collagen disease Diseases 0.000 description 1
- 208000007342 Diabetic Nephropathies Diseases 0.000 description 1
- 206010018367 Glomerulonephritis chronic Diseases 0.000 description 1
- 206010018372 Glomerulonephritis membranous Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- 101001018100 Homo sapiens Lysozyme C Proteins 0.000 description 1
- 208000005777 Lupus Nephritis Diseases 0.000 description 1
- 102100033468 Lysozyme C Human genes 0.000 description 1
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 206010037549 Purpura Diseases 0.000 description 1
- 241001672981 Purpura Species 0.000 description 1
- 206010038357 Renal amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009535 clinical urine test Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 208000033679 diabetic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000007720 emulsion polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000007891 familial visceral amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000005337 ground glass Substances 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 210000001039 kidney glomerulus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 201000008350 membranous glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 231100000855 membranous nephropathy Toxicity 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 201000009925 nephrosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical class OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/493—Physical analysis of biological material of liquid biological material urine
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/34—Genitourinary disorders
- G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本発明は、不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を用いて、尿中ポドサイトを光学顕微鏡により検出する方法に関するものであり、より詳細には以下の（１）〜（３）の工程を含む、尿中ポドサイトを検出する方法に関する。（１）不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を準備する工程、（２）不溶性担体の結合した抗体を、被験者の尿検体に接触させる工程、および、（３）不溶性担体の結合した抗体と接触させた尿検体を、光学顕微鏡により観察し、ポドサイトを計測する工程。
Description
本発明は、不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を用いて、尿中ポドサイトを光学顕微鏡により検出する方法に関する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2012-282394号の優先権を請求する。
透析や移植を必要とするend-Stage kidney disease（ESKD）患者は世界中で増え続けている。1990〜2000年の10年間でESKD患者は43万人から106.5万人に増加したが、2008年には少なくとも165万人程度に増加している。2011年には日本の維持透析患者数は約30万人となり、人口100万人当たりの患者数は2126人であり、その数は世界第2位である。慢性腎臓病（CKD）は世界中で増え続けるESKDの予備軍であり、米国の2000年のCKD患者数は成人人口の13.07%（2561万人）と推測されている。日本の2005年のCKD患者数は成人人口の12.9%（1330万人）である。また、CKDは心血管疾患（CVD）の危険因子であり、欧米のCKDにおいては、透析導入される患者数よりもCVDにより死亡する患者の方が多数であり、日本においてもCKDはCVDの危険因子である（非特許文献１）。よってCKD患者に対して、それぞれの進行過程に合った適切な治療を行うことができれば、透析導入数やCVDで死亡する人数を大幅に減らすことが可能であると考えられる。
ポドカリキシンは、腎糸球体を構成するタコ足細胞（ポドサイト）の表面に存在し、濾過機能を担っている糖タンパク質である。ポドサイトは糸球体基底膜のボウマン腔側に位置し、糸球体濾過機構に重要な役割を持つ。ポドサイトの障害の程度を把握することは、腎疾患において極めて重要な意味を持つことから（非特許文献２）、尿中に排出されるポドカリキシンを検出することにより、腎障害の検査が行われている。例えば、尿中ポドカリキシンを測定することによる、簡便な腎障害の検査手段が開示されている（特許文献１）。
ポドサイトの尿中への脱落は分節状糸球体硬化病変の最初の引き金となることが明らかにされてきている。また小児のIgA腎症や巣状糸球体硬化症などの糸球体疾患の患者においては、尿中にポドサイトが脱落していることが報告されている。したがって、尿中のポドサイト数が糸球体疾患において重症度の指標になるとされている（非特許文献３）。正常人においてはポドサイトが尿中へ脱落することはない。このため、尿中でポドサイトが検出された場合は、その患者は腎疾患であると判断され、即治療が必要となる。
現在、尿中ポドサイトの検出は蛍光抗体法で行われている。しかし、蛍光抗体法は操作が煩雑で時間がかかり、かつ蛍光顕微鏡を必要とするため実施できる施設は限られているのが現状である。
不溶性担体、例えばラテックス粒子を抗体に結合させたものを用いて、抗原を検出する方法として、ラテックス凝集法が一般的に知られており、種々の検出キットが市販されている。ラテックス凝集法は、抗原存在下で抗体結合ラテックス粒子を凝集させ、この凝集を吸光度等で観察することにより抗原を検出する。ラテックス凝集法は、ポドサイトの表面に存在する抗原タンパク質以外に、尿中に浮遊するベジクル様抗原タンパク質をも検出してしまうため、ポドサイトの検出に適用することができなかった。
日本腎臓学会編 CKD診療ガイドライン2012、p.5, 7
Hara et al., Nephron69: 397-403 (1995)
松田 昭彦 埼玉医科大学雑誌 第28巻 第3号 平成13年7月
本発明は、従来の方法より簡便に尿中ポドサイトを検出する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を用いることにより、尿中ポドサイトを光学顕微鏡で検出し得ることに着目し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．以下の工程を含む、尿中ポドサイトを検出する方法：
（１）不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を準備する工程；
（２）不溶性担体の結合した抗体を、被験者の尿検体に接触させる工程；
（３）不溶性担体の結合した抗体と接触させた尿検体を、光学顕微鏡により観察し、ポドサイトを計測する工程。
２．前記不溶性担体がポリスチレンラテックス粒子である、前項１に記載の尿中ポドサイトを検出する方法。
３．ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体が、抗ポドカリキシン抗体である、前項１または２に記載の尿中ポドサイトを検出する方法。
４．ポドサイトの計測数が１個/mL以上である場合に、腎障害の可能性があると判定される、前項１〜３のいずれか１に記載の尿中ポドサイトを検出する方法。
５．尿検体が、尿沈渣である、前項１〜４のいずれか１に記載の尿中のポドサイトを検出する方法。
６．以下の試薬を含む、前項１〜５のいずれか１に記載の尿中ポドサイトを検出する方法に用いられる、尿中ポドサイトを検出するための試薬キット：
（ａ）不溶性担体が結合した、ポドサイト特異的に細胞表面に発現するタンパク質を特異的に認識する抗体を含む試薬；
（ｂ）光学顕微鏡での細胞観察に用いられる試薬および器具のうち、少なくとも１つ。
１．以下の工程を含む、尿中ポドサイトを検出する方法：
（１）不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を準備する工程；
（２）不溶性担体の結合した抗体を、被験者の尿検体に接触させる工程；
（３）不溶性担体の結合した抗体と接触させた尿検体を、光学顕微鏡により観察し、ポドサイトを計測する工程。
２．前記不溶性担体がポリスチレンラテックス粒子である、前項１に記載の尿中ポドサイトを検出する方法。
３．ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体が、抗ポドカリキシン抗体である、前項１または２に記載の尿中ポドサイトを検出する方法。
４．ポドサイトの計測数が１個/mL以上である場合に、腎障害の可能性があると判定される、前項１〜３のいずれか１に記載の尿中ポドサイトを検出する方法。
５．尿検体が、尿沈渣である、前項１〜４のいずれか１に記載の尿中のポドサイトを検出する方法。
６．以下の試薬を含む、前項１〜５のいずれか１に記載の尿中ポドサイトを検出する方法に用いられる、尿中ポドサイトを検出するための試薬キット：
（ａ）不溶性担体が結合した、ポドサイト特異的に細胞表面に発現するタンパク質を特異的に認識する抗体を含む試薬；
（ｂ）光学顕微鏡での細胞観察に用いられる試薬および器具のうち、少なくとも１つ。
本発明の検出方法は光学顕微鏡を用いて尿中ポドサイトを検出することが可能であるため、従来の蛍光顕微鏡を用いた検出方法に比較して、簡便に尿中ポドサイトを検出することが可能であり、より多くの施設で尿中ポドサイトの検出を行うことができる。また本発明の方法によれば、尿中に含まれるベジクル様ポドカリキシンと、ポドサイトを区別することが可能であるため、偽陽性を排除することが可能である。また本発明の検出方法は、従来の蛍光顕微鏡を用いた検出方法の約1/3量の尿検体で、ポドサイトを観察することが可能である。
本発明は、以下の工程を含む尿中ポドサイトを検出する方法を対象とする。
（１）不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体（以下単に「不溶性担体の結合した抗体」と称することもある）を準備する工程；
（２）不溶性担体の結合した抗体を、被験者の尿検体に接触させる工程；
（３）不溶性担体の結合した抗体と接触させた尿検体を、光学顕微鏡により観察し、ポドサイトを計測する工程。
（１）不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体（以下単に「不溶性担体の結合した抗体」と称することもある）を準備する工程；
（２）不溶性担体の結合した抗体を、被験者の尿検体に接触させる工程；
（３）不溶性担体の結合した抗体と接触させた尿検体を、光学顕微鏡により観察し、ポドサイトを計測する工程。
ポドサイト（タコ足細胞）は、腎臓の糸球体上皮細胞であり、高度に最終分化し、分裂能を持たない細胞と考えられている。ポドサイトは糸球体基底膜のボウマン腔側に位置し、糸球体濾過機構に重要な役割をもつため、ポドサイトの障害の程度を把握することは、腎疾患において極めて重要な意味を持つ。例えば、糸球体疾患患者においては尿中にポドサイトが脱落していることがわかっており、正常人においてはポドサイトが尿中に脱落することはない。したがって、尿中のポドサイトの有無を確認することにより、腎疾患を検出することが可能であり、尿中のポドサイト数は腎疾患の重症度の指標になると考えられる。
本発明は、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を用いる。ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質は、尿中においてポドサイトの表面のみに存在するのではなく、ポドサイトに結合せず、尿中に浮遊している場合もある。前記抗体は、ポドサイトの表面に存在するタンパク質と尿中に浮遊しているタンパク質の両方を認識するが、光学顕微鏡を用いて検出することによりこれらを区別し、偽陽性を排除することができる。例えばポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質がポドカリキシンの場合、尿中に排泄されているポドカリキシン関連物質としては、ポドサイトとベジクル様ポドカリキシンが存在する。本発明において、ポドサイトとベジクル様ポドカリキシンを認識する抗ポドカリキシン抗体を使用した場合、光学顕微鏡の像を観察することによりこれらの２つの区別が可能となる。大きさ（直径）が10〜30μm（リンパ球、好中球の約２倍）であって、不溶性担体の結合した抗体がリング状に結合した細胞が顕微鏡像にて認められた場合、ポドサイト陽性と判断することができる。
本発明において用いられる抗体は、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体であれば、いかなるものであってもよい。ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質とは、ポドサイト以外の尿中に存在し得る細胞の表面には発現しておらず、ポドサイトの表面のみに発現しているタンパク質を意味する。かかるタンパク質としては、例えば、ポドカリキシン、GLEPP-1（glomerular epithelial protein-1）等が例示される。
上記ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体は、当該タンパク質の細胞外領域を認識する抗体を用いる必要がある。細胞外領域を認識する抗体は、タンパク質を可溶化する処理を行わずに当該タンパク質を認識し得、ポドサイトを破壊せずに、反応させることが可能である。ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体のうち、本発明においては、ポドカリキシンを認識する抗ポドカリキシン抗体を使用することが好ましい。抗ポドカリキシン抗体は、ポドサイトの表面に発現しているポドカリキシンを認識しうる抗体であれば、いかなるものであってもよい。本発明において用いられる抗ポドカリキシン抗体は、公知のものであってもよく、また今後開発される抗体であってもよく、特に限定されない。本発明においては、細胞外領域（糖領域を含む）を認識する抗ポドカリシキン抗体を使用する必要がある。また、本発明における抗ポドカリキシン抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにこれらの結合活性断片などが挙げられる。
ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体に結合した不溶性担体としては、本発明の目的を達成し得るものであれば、公知のものを含めて、いかなるものも使用可能である。例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリクロロカーボネート、シリコン樹脂、シリコンラバー等の合成高分子化合物、多孔性ガラス、スリガラス、アルミナ、シリカゲル、活性炭、金属酸化物等の無機物質等が例示される。これら不溶性担体は、微粒子、ラテックス粒子等の形態で使用することが可能である。
本発明に用いられる不溶性担体としては、ラテックス粒子を用いることが好適である。ラテックス粒子は人工担体であり、目的に応じて担体表面を化学的に処理し易いこと、また非特異反応が起こりにくいこと等の利点がある。ラテックス粒子の材質は特に限定されないが、例えばポリスチレンラテックス等のスチレン系ラテックス、アクリル酸系ラテックス等が挙げられる。これらラテックス粒子のうち、乳化剤を用いない乳化重合によって得られる、ポリスチレンラテックス粒子等を用いることが好ましい。ポリスチレンラテックス粒子等は表面の疎水性が強いため、タンパク質もしくはペプチドを吸着するのに適しており、且つ表面の負電荷同士の反発に基づき、乳化剤なしでも溶液中で安定に分散するという性質を有しているためである。また、種々の変性ラテックス（例えば、カルボン酸変性ラテックス）、磁性ラテックス（磁性粒子を内包させたラテックス）等も必要に応じて使用できることは言うまでもない。
本発明に用いられるラテックス粒子としては、公知のものを使用可能であるが、ラテックス粒子の平均粒径が小さいもの、即ち、単位重量あたりの表面積が大きいものが、抗体に効率良く結合させることができるので好ましい。ラテックス粒子の平均粒径としては、具体的には、通常0.4μｍ以上1.5μｍ以下、好ましくは0.4μｍ以上1.0μｍ以下である。ラテックス粒子の平均粒径が1.5μｍを超えると、ポドサイトに結合する抗体結合ラテックス数が少なくなるため検出が困難になる可能性がある。なお平均粒径は、電子顕微鏡写真や粒度分布測定装置による一般的な方法で求めることができるものである。ラテックス粒子は、着色された着色ラテックス粒子を用いることが好ましい。
また、ラテックス粒子の粒径の差は小さい方が好ましい。具体的には、最小値と最大値の差が最小値を基準にして10%以内であることが好ましい。ラテックス粒子の表面の電荷密度は最も小さなものと大きなものの差が最も小さなものを基準にして10%以内であることが好ましい。
不溶性担体を、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体に結合する方法は、特に限定されず、従来公知の方法により、物理的及び／又は化学的結合により両者を結合する方法等が挙げられる。
不溶性担体の結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体は、適当な溶媒中に0.025〜1%（重量%）で分散もしくは懸濁させて、試薬として調製したものを用いることが好ましい。溶媒は本発明の目的に沿うものであればいかなるものであってもよいが、緩衝液を用いることが好適である。緩衝液は特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。上記緩衝液のpHは特に限定されないが、好ましい下限は5.5、好ましい上限は8.5、より好ましい下限は6.5である。
本発明の検出方法において、ポドサイトが検出される尿検体は、いかなる被験者から得られたものであってもよい。また被験者からの尿の採取方法は問わないが、早朝尿もしくは随時尿を採取することが好ましい。本発明の検出方法に必要な尿の量は5〜20mL程度であり、従来の蛍光抗体法に必要な尿量と比較して少量である。本発明の検出方法は、従来の一般的な尿検査と同時に行われてもよいし、腎疾患の疑いのある被験者や、腎疾患と診断された患者について別途尿を採取して行われてもよい。
本発明においてポドサイトが検出される尿検体は、被験者から得られた尿を処理して得られるものであり、好ましくは尿沈渣である。尿の処理は、処理液を添加して混合することにより行うことができる。処理液は、尿のpH調整、尿沈渣のマスキングが可能なものであればいかなるものであってもよいが、好ましくは、緩衝液にキレート剤などを添加した溶液が例示される。緩衝液、キレート剤は、本発明の目的に沿うものであればいかなるものであってもよい。処理液としては、より具体的には、2M TES-NaOHに0.2M EDTAを含む溶液（pH7.0）や、かかる溶液を希釈した溶液が例示される。尿沈渣は公知の手法により調製することができるが、例えば上記処理液を尿に混合し、遠心分離して上清を除去して、ペレットを得ることにより、調製することができる。
不溶性担体の結合したポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を、被験者の尿検体に接触させると、抗原抗体反応により不溶性担体の結合した抗体がポドサイトに集積し、不溶性担体が標識としての機能を発揮して、ポドサイトを可視化する。不溶性担体の結合した抗体を被験者の尿検体に接触させる方法は、特に限定されず、公知の免疫染色の手法と同様の手法により行えばよい。通常、検体と不溶性担体の結合した抗体とを混合し、一定時間静置もしくは振盪させることにより、十分に反応させることが可能である。反応後の尿検体中には、抗原抗体反応をしていない不溶性担体の結合した抗体が含まれるが、尿検体中からこれらの抗原抗体反応をしていない不溶性担体の結合した抗体を除去する必要はない。
不溶性担体の結合した抗体と接触させた前記の尿検体を、光学顕微鏡により観察し、ポドサイトを計測する。光学顕微鏡による観察は、通常と同様に、観察対象である尿検体をスライドグラスに載せて、観察を行えばよい。
光学顕微鏡で観察し、ポドサイトが確認された場合は、腎疾患であると判定される。好ましくは、ポドサイトの計測数が１個/mL以上である場合に、腎障害（腎疾患）の可能性があると判定される。本明細書において腎障害と腎疾患は同義に用いられ、腎障害または腎疾患は、腎炎などの腎臓病に加えて、糖尿病、膠原病などの他の疾患に伴って引き起こされる、腎機能が低下した状態を含む。本発明の検出方法では、検出されたポドサイト数により、腎疾患の重症度を判定することも可能である。検出されたポドサイト数が多くなるにつれて、腎疾患が重篤であると判定することができる。よって、本発明の検出方法は、腎疾患患者について、腎疾患の進行をモニタリングすることを目的として、行われてもよい。
本発明の検出方法は、腎疾患の判定に用いることが可能であるが、好ましくは糸球体に異常の認められる糸球体疾患の判定に用いられる。糸球体疾患としては、急性（糸球体）腎炎、糖尿病性腎症、IgA腎症、ネフローゼ症候群、慢性糸球体腎炎、膜性腎症、ANCA関連腎炎、全身性エリテマトーデス（ループス腎炎）、紫斑病性腎炎、間質性腎炎、半月体形成性腎炎、巣状糸球体硬化症、腎硬化症、急性腎不全、慢性腎不全、腎アミロイドーシス、強皮症腎、シェーグレン症候群による間質性腎炎、薬剤性腎症等が例示される。
本発明は、以下の試薬を含む尿中ポドサイトを検出するための試薬キットをも包含する。
（ａ）不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を含む試薬。
（ｂ）光学顕微鏡での細胞観察に用いられる試薬および器具のうち、少なくとも１つ。
（ｂ）光学顕微鏡での細胞観察に用いられる試薬および器具としては、尿の処理に用いられる処理液、スライドグラス、ポジティブコントロール、ポドサイト観察例、採尿スピッツ等が例示される。
（ａ）不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を含む試薬。
（ｂ）光学顕微鏡での細胞観察に用いられる試薬および器具のうち、少なくとも１つ。
（ｂ）光学顕微鏡での細胞観察に用いられる試薬および器具としては、尿の処理に用いられる処理液、スライドグラス、ポジティブコントロール、ポドサイト観察例、採尿スピッツ等が例示される。
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
（実施例１）蛍光抗体法と本発明の方法の、尿中ポドサイト検出手順の比較
１．蛍光抗体法
下記の手順により、蛍光抗体法を行った。
（１）早朝新鮮尿30mLを、尿細胞保存液20mLの入っているウリキープ5D（武藤化学株式会社）に保存した。（所要時間1〜2分間）
（２）スライドグラス上に、サイトスピンにてオートスメアサンプルを作製した（所要時間10分間）。
（３）作製したオートスメアサンプルを風乾させた（所要時間1〜2時間）。
（４）風乾させたサンプルと抗ポドカリキシン抗体とを、室温で1時間静置して反応させた（所要時間1時間）。
（５）反応後、スライドグラスをPBSで3回洗浄した（所要時間5分間）
（６）スライドグラス上のサンプルと、FITC標識抗マウスIgGとを、室温で1時間静置して反応させた（所要時間1時間）
（７）反応後、スライドグラスをPBSで3回洗浄した（所要時間5分間）
（８）蛍光顕微鏡を用いて、スライドグラス上のサンプルを100倍で検鏡した。
下記の手順により、蛍光抗体法を行った。
（１）早朝新鮮尿30mLを、尿細胞保存液20mLの入っているウリキープ5D（武藤化学株式会社）に保存した。（所要時間1〜2分間）
（２）スライドグラス上に、サイトスピンにてオートスメアサンプルを作製した（所要時間10分間）。
（３）作製したオートスメアサンプルを風乾させた（所要時間1〜2時間）。
（４）風乾させたサンプルと抗ポドカリキシン抗体とを、室温で1時間静置して反応させた（所要時間1時間）。
（５）反応後、スライドグラスをPBSで3回洗浄した（所要時間5分間）
（６）スライドグラス上のサンプルと、FITC標識抗マウスIgGとを、室温で1時間静置して反応させた（所要時間1時間）
（７）反応後、スライドグラスをPBSで3回洗浄した（所要時間5分間）
（８）蛍光顕微鏡を用いて、スライドグラス上のサンプルを100倍で検鏡した。
２．本発明の不溶性担体の結合した担体を用いた方法
（ラテックス粒子結合抗ポドカリキシン抗体の作製）
TechNote 205, Rev.003, Active: 30/Mar/02 "Covalent Coupling", Bangs Laboratories Inc.を参照して、ラテックス粒子結合抗ポドカリキシン抗体を作製した。
（ラテックス粒子結合抗ポドカリキシン抗体の作製）
TechNote 205, Rev.003, Active: 30/Mar/02 "Covalent Coupling", Bangs Laboratories Inc.を参照して、ラテックス粒子結合抗ポドカリキシン抗体を作製した。
（ラテックス粒子結合抗ポドカリキシン抗体を用いた検出方法）
下記の手順により、上記ラテックス粒子結合抗ポドカリキシン抗体を用いた検出方法を行った。
（１）早朝新鮮尿9mLを、2M TES-NaOHに0.2M EDTAを含む溶液（pH7.0）1mLと混合した。（所要時間1〜2分間）
（２）混合した試料を、遠心分離（1710g×5分間）後、上清を除去し、ペレットを得た。（所要時間7〜8分間）
（３）ペレットに、蒸留水を7.5mL添加して混合し、その後直ぐに400mM TES-NaOHに40mM EDTAに含む溶液（pH7.0）7.5mLを添加した。（所要時間1〜2分間）
なお蒸留水を加える理由は、尿沈渣中の赤血球を溶血させるためである。
（４）混合した試料を、遠心分離（1710g×5分間）後、上清を除去し、ペレットとして尿沈渣を得た。（所要時間7〜8分間）
（５）尿沈渣に、ラテックス粒子結合抗ポドカリキシン抗体45μL（ラテックス粒子濃度が0.1%（重量%））を添加して、室温で90分間振盪させて反応させた（所要時間90分間）。
（６）反応後のサンプルをスライドグラスに載せて、光学顕微鏡により100倍で検鏡した。
下記の手順により、上記ラテックス粒子結合抗ポドカリキシン抗体を用いた検出方法を行った。
（１）早朝新鮮尿9mLを、2M TES-NaOHに0.2M EDTAを含む溶液（pH7.0）1mLと混合した。（所要時間1〜2分間）
（２）混合した試料を、遠心分離（1710g×5分間）後、上清を除去し、ペレットを得た。（所要時間7〜8分間）
（３）ペレットに、蒸留水を7.5mL添加して混合し、その後直ぐに400mM TES-NaOHに40mM EDTAに含む溶液（pH7.0）7.5mLを添加した。（所要時間1〜2分間）
なお蒸留水を加える理由は、尿沈渣中の赤血球を溶血させるためである。
（４）混合した試料を、遠心分離（1710g×5分間）後、上清を除去し、ペレットとして尿沈渣を得た。（所要時間7〜8分間）
（５）尿沈渣に、ラテックス粒子結合抗ポドカリキシン抗体45μL（ラテックス粒子濃度が0.1%（重量%））を添加して、室温で90分間振盪させて反応させた（所要時間90分間）。
（６）反応後のサンプルをスライドグラスに載せて、光学顕微鏡により100倍で検鏡した。
蛍光抗体法と本発明の不溶性担体の結合した抗体を用いた方法の手順を比較すると、蛍光抗体法は最短でも3時間10分間の時間を必要とするが、本発明の不溶性担体の結合した抗体を用いた方法では、抗体との反応終了までが、1時間50分間と短縮されていた。
急性腎炎患者の尿を使用して、本実施例の蛍光抗体法と本発明の不溶性担体の結合した抗体を用いた方法によりポドサイトを可視化した画像を、図１に示す。本発明の不溶性担体の結合した抗体を用いた方法によれば、蛍光抗体法と同程度の明瞭さで、ポドサイトを検出することが可能であることがわかった。また本発明の不溶性担体の結合した抗体を用いた方法は、蛍光抗体法の約1/3量の尿検体で、ポドサイトを観察することが可能であった。
上記説明したとおり、尿中ポドサイトを不溶性担体の結合した抗体を用いて光学顕微鏡で検出することにより、これまで尿中ポドサイト検査が実施できなかった施設でも容易に実施できるようになり、腎障害の検査の実施が可能となる。腎障害の検査が実施可能な施設が増えることにより、適切な診断が行われ、適切な治療を選択できることから、患者にとって有益である。
Claims (6)
- 以下の工程を含む、尿中ポドサイトを検出する方法：
（１）不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を準備する工程；
（２）不溶性担体の結合した抗体を、被験者の尿検体に接触させる工程；
（３）不溶性担体の結合した抗体と接触させた尿検体を、光学顕微鏡により観察し、ポドサイトを計測する工程。 - 前記不溶性担体がポリスチレンラテックス粒子である、請求項１に記載の尿中ポドサイトを検出する方法。
- ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体が、抗ポドカリキシン抗体である、請求項１または２に記載の尿中ポドサイトを検出する方法。
- ポドサイトの計測数が１個/mL以上である場合に、腎障害の可能性があると判定される、請求項１〜３のいずれか１に記載の尿中ポドサイトを検出する方法。
- 尿検体が、尿沈渣である、請求項１〜４のいずれか１に記載の尿中のポドサイトを検出する方法。
- 以下の試薬を含む、請求項１〜５のいずれか１に記載の尿中ポドサイトを検出する方法に用いられる、尿中ポドサイトを検出するための試薬キット：
（ａ）不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を含む試薬；
（ｂ）光学顕微鏡での細胞観察に用いられる試薬および器具のうち、少なくとも１つ。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012282394 | 2012-12-26 | ||
| JP2012282394 | 2012-12-26 | ||
| PCT/JP2013/084490 WO2014104019A1 (ja) | 2012-12-26 | 2013-12-24 | 尿中ポドサイトの検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2014104019A1 true JPWO2014104019A1 (ja) | 2017-01-12 |
| JP6310861B2 JP6310861B2 (ja) | 2018-04-11 |
Family
ID=51021100
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2014554455A Active JP6310861B2 (ja) | 2012-12-26 | 2013-12-24 | 尿中ポドサイトの検出方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20160003820A1 (ja) |
| EP (1) | EP2940471B1 (ja) |
| JP (1) | JP6310861B2 (ja) |
| WO (1) | WO2014104019A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6751080B2 (ja) * | 2015-04-22 | 2020-09-02 | 原 正則 | 尿中ポドサイト数を推定する方法 |
| WO2018177949A1 (en) * | 2017-03-25 | 2018-10-04 | Charité-Universitätsmedizin Berlin | Urine flow cytometry as biomarker of renal diseases |
| EP3385711A1 (en) * | 2017-04-05 | 2018-10-10 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | Urine flow cytometry as biomarker of renal diseases |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63255660A (ja) * | 1987-04-11 | 1988-10-21 | Hitachi Ltd | 細胞測定法 |
| WO2002037099A1 (fr) * | 2000-10-27 | 2002-05-10 | International Reagents Corporation | Procede de diagnostic de la nephropathie |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4421896A (en) * | 1979-11-13 | 1983-12-20 | The Dow Chemical Company | Method of coupling a protein to a polymer particle containing hydrazide groups in a polymer latex and the products formed therefrom |
| US4426295A (en) * | 1981-09-28 | 1984-01-17 | Evans Deborah A | Cell suspension chamber process |
| NO308755B1 (no) * | 1996-12-20 | 2000-10-23 | Iystein Fodstad | FremgangsmÕte til karakterisering av unormale celler, anvendelse og sett for utførelse av fremgangsmÕten |
| US20050250091A1 (en) * | 2004-05-05 | 2005-11-10 | Chemlmage Corporation | Raman molecular imaging for detection of bladder cancer |
| JP5515740B2 (ja) * | 2007-09-27 | 2014-06-11 | 国立大学法人 新潟大学 | 尿中タンパク質定量用の尿前処理剤、尿前処理方法、及び尿中タンパク質定量方法。 |
| EP2517014B1 (en) * | 2009-12-21 | 2014-11-19 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Early marker of proteinuria in patients treated with an anti-vegf treatment |
-
2013
- 2013-12-24 WO PCT/JP2013/084490 patent/WO2014104019A1/ja active Application Filing
- 2013-12-24 JP JP2014554455A patent/JP6310861B2/ja active Active
- 2013-12-24 EP EP13868804.9A patent/EP2940471B1/en active Active
-
2015
- 2015-06-24 US US14/748,889 patent/US20160003820A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63255660A (ja) * | 1987-04-11 | 1988-10-21 | Hitachi Ltd | 細胞測定法 |
| WO2002037099A1 (fr) * | 2000-10-27 | 2002-05-10 | International Reagents Corporation | Procede de diagnostic de la nephropathie |
| US20040058395A1 (en) * | 2000-10-27 | 2004-03-25 | Masanori Hara | Method of diagnosing nephropathy |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 原正則ほか: "ルーチン尿沈渣検査による尿中Podocyte検出の試み", 日本腎臓学会誌, vol. 53, no. 3, JPN6014012667, 25 May 2011 (2011-05-25), pages 446, ISSN: 0003726089 * |
| 原正則ほか: "光学顕微鏡を用いた尿中Podocyte(Pod)の新しい検出法-抗体結合ラテックス粒子を用いた試み-", 日本腎臓学会誌, vol. 55, no. 6, JPN6014012666, 25 August 2013 (2013-08-25), pages 1054, ISSN: 0003726088 * |
| 黒澤芳子: "尿中ポドサイト検査", 医学検査, vol. 49, no. 4, JPN6014012665, 25 April 2000 (2000-04-25), pages 349, ISSN: 0003726090 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2014104019A1 (ja) | 2014-07-03 |
| EP2940471B1 (en) | 2019-09-18 |
| EP2940471A4 (en) | 2016-10-05 |
| US20160003820A1 (en) | 2016-01-07 |
| JP6310861B2 (ja) | 2018-04-11 |
| EP2940471A1 (en) | 2015-11-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dong et al. | Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium | |
| US10908152B2 (en) | Paper based diagnostic test | |
| Obeid et al. | Development of a NanoBioAnalytical platform for" on-chip" qualification and quantification of platelet-derived microparticles | |
| JP6485759B2 (ja) | 末梢循環腫瘍細胞単位の悪性度の検出方法及びそのキット | |
| TWI475229B (zh) | A reagent group for transfusion test and its test method | |
| JP6310861B2 (ja) | 尿中ポドサイトの検出方法 | |
| Van Beers et al. | Detection of anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) by indirect immunofluorescence | |
| JP6893639B2 (ja) | がんの判定方法、がんの判定のための装置及びコンピュータプログラム | |
| Bystryak et al. | A flow-through cell counting assay for point-of-care enumeration of CD4 T-cells | |
| KR102172016B1 (ko) | 항-cyfra21-1 자가항체-항원 결합체 및 cyfra21-1 항원 마커의 검출방법 및 이들 마커의 비율을 이용한 폐암 진단키트 | |
| WO2016125243A1 (ja) | エクソソーム測定方法及びエクソソーム抽出方法 | |
| US20120040850A1 (en) | Methods for Diagnosis and Assessment of Autoimmune Disorders | |
| CA2486119A1 (en) | Method of isolating an endothelial cell and method of donor specific crossmatching | |
| JP5017596B2 (ja) | 凝集検査方法 | |
| WO2019069980A1 (ja) | 大腸癌の検出方法 | |
| Chong et al. | Circulating tumor cell detection in lung cancer animal model | |
| JP2010286375A (ja) | 重症薬疹易罹患性診断用マーカー、重症薬疹易罹患性の診断方法および重症薬疹易罹患性診断用キット | |
| JP5844825B2 (ja) | 検出対象の検出及び定量のための方法及びキット | |
| US20240077479A1 (en) | Detection system and method for the migrating cell | |
| JP2004177402A (ja) | 特異結合反応測定方法、それに用いる試薬キットおよび特異結合反応測定装置 | |
| JP2668448B2 (ja) | 糖尿病性腎症診断のための尿中の蛋白量判定方法および感作ラテックス | |
| JP2004309477A (ja) | 抗体測定方法 | |
| JP4458887B2 (ja) | ボルナ病ウイルス検出抗原及び試薬 | |
| WO2017204208A1 (ja) | Ｓｍｎタンパク質の核内構造体の発現解析方法 | |
| WO2021099545A1 (en) | Nanoparticle tracking analysis as a biomarker tool in autoimmune diseases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20161107 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170614 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170810 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180206 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180206 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180227 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180319 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6310861 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |