JP5844825B2 - 検出対象の検出及び定量のための方法及びキット - Google Patents

Description

本発明は、検体中の検出対象を検出及び定量する方法及びキットに関する。

臨床検査等の分野で、抗原抗体反応等を利用して、検体中の微量成分を検出することが行われている。検体としては、例えば血清、血漿、尿、リンパ液等の各種体液といった生体から得られる検体が挙げられる。

かかる検体には、数多くのタンパク質、抗体、糖等の物質が含有されているのが一般的であり、これらの物質と、検出対象の検出のための担体との非特異反応が、検出結果に悪影響を及ぼすことが知られている。つまり、図８に示されるように、検体中の検出対象Ｔの有無にかかわらず、検体中の非特異反応物質が担体Ｃと結合し凝集体を形成してしまうため、凝集の程度から検出対象Ｔを検出することが困難である。

そこで、従来、非特異反応を抑制するために、検体中の非特異反応の原因成分を除去する技術が開発されている。特許文献１（特開平８−３２７６２９号公報）では、非特異反応物質に結合する抗体を担持した磁性粒子を、検体に添加し、磁石で磁性粒子とともに非特異反応物質を検体から分離する。その後の検体を用いて検出対象の検出を行うことで、非特異反応による悪影響が抑制された検出結果が得られる旨が、特許文献１には記載されている。

特開平８−３２７６２９号公報

しかし、抗体と非特異反応物質との結合の効率を高めるためには、比表面積が大きい、つまり小粒径の磁性粒子を用いる必要があるが、小粒径の磁性粒子では、磁力による移動に時間を要する。このジレンマにより、特許文献１に示される技術では、検体からの非特異反応物質の分離に、長時間がかからざるを得ない。

本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、検体からの非特異反応物質の分離を短時間で行うことができる、検体中の検出対象の検出及び定量のための方法及びキットを提供することを目的とする。

本発明者らは、凝集作用を利用することで、非特異反応物質との結合効率及び非特異反応物質の分離効率を両立できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的に、本発明は以下のものを提供する。

（１） 検体中の検出対象を検出する方法であって、
刺激応答性物質及び微粒子状の磁性物質を含有する凝集性物質と前記検出対象以外の物質に対する親和性物質とが結合した結合物と、前記検体とを混合し、この混合物に前記刺激応答性物質が凝集する条件下で磁力を付加することで、凝集した前記結合物を分離し、その後の前記混合物における前記検出対象を検出する工程を有する方法。

（２） 前記検出対象の検出は、凝集した前記結合物を、前記混合物が収容されている容器内で固液分離させた状態で行う（１）記載の方法。

（３） 前記検出対象の検出は、前記検出対象に対する親和性物質が担持された担体を、前記混合物と混合し、前記担体の凝集の有無により判別する工程を含む（１）又は（２）記載の方法。

（４） 前記検出対象の検出は、検出感度を増加させる増感剤を添加した状態で行う（１）から（３）いずれか記載の方法。

（５） 検体中の検出対象を定量する方法であって、
刺激応答性物質及び微粒子状の磁性物質を含有する凝集性物質と前記検出対象以外の物質に対する親和性物質とが結合した結合物と、前記検体とを混合し、この混合物に前記刺激応答性物質が凝集する条件下で磁力を付加することで、凝集した前記結合物を分離し、その後の前記混合物における前記検出対象の量を定量する工程を有する方法。

（６） 前記検出対象の定量は、凝集した前記結合物を、前記混合物が収容されている容器内で固液分離させた状態で行う（５）記載の方法。

（７） 前記検出対象の定量は、前記検出対象に対する親和性物質が担持された担体を、前記混合物と混合し、前記担体の凝集の程度を検出する工程を含む（５）又は（６）記載の方法。

（８） 前記検出対象の定量は、検出感度を増加させる増感剤を添加した状態で行う（５）から（７）いずれか記載の方法。

（９） 検体中の検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、
刺激応答性物質及び微粒子状の磁性物質を含有する凝集性物質と前記検出対象以外の物質に対する親和性物質とが結合した結合物と、
前記検出対象に対する親和性物質と、を備えるキット。

（１０） 前記親和性物質は、担体に担持された形態である（９）記載のキット。

（１１） 検出感度を増加させる増感剤を更に備える（９）又は（１０）記載のキット。

本発明によれば、親和性物質に非特異反応物質を結合させた後、刺激応答性物質が凝集する条件下で磁力を付加する。結合物は、親和性物質への非特異反応物質の結合のときには凝集していない又は軽度の凝集にとどまるため、結合効率に優れる。また、結合物の分離のときには、結合物は凝集するために、磁力による移動速度が高まる。これにより、検体からの非特異反応物質の分離を短時間で行うことができる。

本発明の一実施形態に係る方法に用いられる結合物の概略構成図である。 本発明の一実施形態に係る方法のフロー図である。 本発明の一実施形態に係る方法の機構を示す図である。 本発明の一実施形態に係る方法で用い得る凝集性物質を磁力で分離した状態を示す写真である。 従来例に係る粒子物質を磁力で分離した状態を示す写真である。 図４で用いた凝集性物質の低い再分散性を示す写真である。 図５で用いた粒子物質の高い再分散性を示す写真である。 従来例に係る方法における非特異反応物質の凝集を示す概略構成図である。

以下、本発明の実施形態を説明するが、これらに本発明が限定されるものではない。

本発明の検出方法では、まず、結合物及び検体を混合し、この混合物に刺激応答性物質が凝集する条件下で磁力を付加する。まず、ここで用いる結合物について詳細に説明する。

［結合物］
結合物は、刺激応答性物質及び微粒子状の磁性物質を含有する凝集性物質と、検出対象以外の物質（つまり、除去すべき非特異反応物質）に対する親和性物質とが結合したものである。

（凝集性物質）
刺激応答性物質は、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できる物質である。刺激としては、特に限定されないが、温度変化、光の照射、酸又は塩基の添加（ｐＨの変化）、電場変化等が挙げられる。

特に、本発明では、刺激応答性物質としては、温度変化によって凝集及び分散可能な温度応答性ポリマーが利用できる。なお、温度応答性ポリマーとしては、下限臨界溶液温度（以下、ＬＣＳＴとも称する）を有するポリマーや上限臨界溶液温度（以下、ＵＣＳＴとも称する）を有するポリマーが挙げられる。例えば、ＬＣＳＴが３７℃である下限臨界溶液温度を有するポリマーは、ＬＣＳＴ未満の温度の水溶液中では完全に分散し、ＬＣＳＴ以上に水温を上昇させると直ちに凝集させることができる。また、ＵＣＳＴが５℃である上限臨界溶液温度を有するポリマーは、ＵＣＳＴを超える温度の水溶液中では完全に分散し、ＵＣＳＴ以下に水温を下降させると直ちに凝集させることができる。

本発明で用いられる下限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリン等のＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなるポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメチルエーテル、（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン）ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンラウリルアミン等のポリオキシエチレンアルキルアミン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタンラウレート等のポリオキシエチレンソルビタンエステル誘導体；（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（メタ）アクリレート類；及び（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）（メタ）アクリレート類等のポリオキシエチレン（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。更に、これらのポリマー及びこれらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーも利用できる。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーも利用できる。（メタ）アクリルアミド誘導体を含むポリマーを使用する場合、このポリマーにその他の共重合可能なモノマーを、下限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。本発明では、なかでも、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマー又はＮ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーが好ましく利用できる。また、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはプロリン以外のアミノ酸）に代表されるようなペンタポリペプチドの繰返し配列を持つエラスチン由来ポリペプチド等も利用できる。

本発明で用いられる上限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、アクリロイルグリシンアミド、アクリロイルニペコタミド、アクリロイルアスパラギンアミド及びアクリロイルグルタミンアミド等からなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマーが利用できる。また、これらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーであってもよい。これらのポリマーには、アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクリロイルトリメチレンアミド、アクリロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクリロイルメチルウラシル等、その他の共重合可能なモノマーを、上限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。

また、本発明では、刺激応答性物質として、ｐＨの変化によって凝集及び分散可能なｐＨ応答性ポリマー等の物質が利用できる。ｐＨ応答性物質が構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、刺激付与時における第１の結合物、後述の第２の結合物、及び検体の変性等による検出・定量精度の低下を抑制できる点で、ｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ５〜９であることが更に好ましい。

このようなｐＨ応答性ポリマーとしては、カルボキシル、リン酸、スルホニル、アミノ等の基を官能基として含有するポリマーが例示できる。より具体的には、（メタ）アクリル酸、マレイン酸、スチレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、ホスホリルエチル（メタ）アクリレート、アミノエチルメタクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド等の解離基を有するモノマーが重合されたものであってもよく、これら解離基を有するモノマーと、ｐＨ応答能が損なわれない程度において、他のビニルモノマー、例えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル類、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類、スチレン、塩化ビニル、Ｎ−ビニルピロリドン等のビニル化合物、（メタ）アクリルアミド類等とが共重合されたものであってもよい。

微粒子状の磁性物質は、親和性物質を結合可能なものであれば特に限定されず、例えば、多価アルコールとマグネタイトとで構成されてよい。

多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し且つ鉄イオンと結合可能なアルコール構造体である限りにおいて特に限定されず、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリンが挙げられる。例えば特開２００５−８２５３８公報には、デキストランを用いた微粒子状の磁性物質の製造方法が開示されている。また、グリシジルメタクリレート重合体のようにエポキシを有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。

微粒子状の磁性物質（磁性微粒子）は、従来の方法で用いられる場合、磁力による移動速度を確保する観点で大きい粒子径を有する必要があったが、本発明では、磁力による移動速度は刺激応答性物質の凝集を利用して確保するため、大きい粒子径を有しなくてもよい。具体的な粒径は、付加できる磁力の大きさに応じて適宜設定されてよく、特に限定はされないが、平均粒径は、０．９ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であってよく、２．９ｎｍ以上２００ｎｍ未満、特に１５０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、９５ｎｍ以下、９０ｎｍ以下、８５ｎｍ以下、８０ｎｍ以下であることが好ましい。なお、本発明における平均粒径は、動的光散乱法によって測定される。

また、刺激応答性物質は、上記の刺激応答性ポリマーに限らず、例えば、特許第３６９３９７９号、特許第３９１６３３０号公報、特開２００２−８５９５７号公報、特許第４０７１７３８号公報、特許第２８６９６８４号公報、特許第２９２７６０１号公報、特許第３８４５２４９号公報等に開示されるヒドロゲルであってもよい。

（親和性物質）
親和性物質は、非特異反応物質の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。ここで用いる抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよく、Ｆａｂ等の抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。

非特異反応物質は、検体の組成や特性に応じて除去すべき物質であり、特に限定されないが、例えば、ＩｇＭ、アルブミン、グロブリン、フィブリン、リウマトイド因子等が挙げられる。また、非特異反応物質は、１種又は２種以上であってよい。

［結合物の作製］
結合物は、凝集性物質と親和性物質とを結合することによって作製する。この結合方法は、特に限定されないが、例えば、凝集性物質側（例えば刺激応答性物質部分）及び親和性物質（例えば、抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して凝集性物質及び親和性物質を結合させる。

具体的には、刺激応答性物質へのビオチンの結合は、国際公開ＷＯ０１／００９１４１に記載されているように、ビオチン等をメタクリルやアクリル等の重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合することにより行うことができる。また、親和性物質へのアビジン等の結合は常法に従って行うことができる。次に、ビオチン結合刺激応答性物質及びアビジン結合第１の親和性物質を混合すると、アビジンとビオチンとの結合を介して、親和性物質及び刺激応答性物質が結合する。

別法として、ポリマー等の物質の製造時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を持つモノマーを他のモノマーと共重合させ、この官能基を介し、当技術分野で周知の方法に従って抗体親和性物質（例えば、メロンゲル、プロテインＡ、プロテインＧ）をポリマーに結合させる方法が利用できる。このようにして得られた抗体親和性物質に抗体を結合させることにより、刺激応答性ポリマー等の物質と、検出対象の抗原に対する抗体との結合物が作製される。

あるいは、ポリマーの製造時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を有するモノマーを他のモノマーと共重合させ、これらの官能基に検出対象の抗原に対する抗体を常法に従って直接結合させてもよい。

あるいは、微粒子状の磁性物質に親和性物質及び刺激応答性物質を結合させてもよい。

凝集性物質を刺激応答性物質が凝集する条件においた後、遠心分離によって分離することで、結合物を精製してもよい。結合物の精製は、刺激応答性物質に微粒子状の磁性物質を結合させ、更に親和性物質を結合させた後、刺激応答性物質が凝集する条件におき、磁力を付加して磁性物質を回収する方法によって行ってもよい。

微粒子状の磁性物質と刺激応答性ポリマー等の物質との結合は、反応性官能基を介して結合する方法や、磁性物質中の多価アルコール上の活性水素又は多価アルコールに重合性不飽和結合を導入してグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の方法で行ってよい（例えば、ＡＤＶ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、Ｖｏｌ．４、ｐ１１１、１９６５やＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．、Ｐａｒｔ−Ａ、３、ｐ１０３１、１９６５参照）。

次に、図２及び３を参照しつつ、検出・定量方法の手順を説明する。以上の結合物及び検体を混合すると、検体中の非特異反応物質が親和性物質と結合し、捕捉される。図１に示されるように、一実施形態に係る結合物１０は刺激応答性物質１１を含有し、この刺激応答性物質１１はアビジン１５及びビオチン１７を介して非特異反応物質５０に対する抗体１３に結合されている。また、結合物１０は微粒子状の磁性物質１９を含み、この磁性物質１９の表面に刺激応答性物質１１が結合されている。この時点では、磁性物質１９の比表面積が大きく、抗体１３に非特異反応物質５０を効率良く捕捉することができる。なお、２種以上の非特異反応物質を捕捉すべきときは、各々に対する親和性物質を有する結合物を、同時に添加してもよく、別々に添加してもよい。

捕捉を行う工程は、混合物を刺激応答性物質が凝集しない条件（例えば、ＬＣＳＴを用いた場合、下限臨界溶液温度未満の温度）下において行うことが、捕捉効率を最大化する観点では好ましい。しかし、検体との混合前の結合物を刺激応答性物質が凝集しない条件においておけば、たとえ、混合物を刺激応答性物質が凝集する条件（例えば、ＬＣＳＴを用いた場合、下限臨界溶液温度以上の温度）下においても、高度の凝集が開始する前に、相当部分の非特異反応物質を捕捉することは可能である。この態様は、刺激応答性物質が凝集する条件下へと混合物を移行させる手間（制御、移動、時間等）を省略できる点で有利である。

次に、この混合物を、刺激応答性物質が凝集する条件下におき、磁力を付加する。図２では、混合物を収容する容器の下部近傍に磁石Ｍを配置し、これにより、非特異反応物質を捕捉した凝集状態の結合物Ａが容器の下部へと移動し、混合物から分離される。この時点では、結合物が凝集しているため、磁石の方へと短時間で引き付けられる。ここまでの工程は、具体的な条件によって異なるが、通常、５〜１０分以内に終えることができる。このため、本発明は、分離工程と、その後の検出及び定量の工程とを連続的に高効率で行うことができる点でも、有利である。なお、図３では、図示の簡略化の観点から凝集状態の結合物Ａが磁石Ｍに直接吸着するように描いてあるが、磁石Ｍが容器の外部に配置されるのが一般的である。

次に、その後の混合物における検出対象を検出又は定量する。この検出及び定量は、特に限定されず、種々の方法で行ってよい。本発明では、結合物Ａが凝集し、磁力に強くひきつけられているため、混合物へと再分散しにくい。このため、検出及び定量は、凝集した結合物Ａを、混合物が収容されている容器内で固液分離させた状態で行うこともできる。この態様は、混合物を別の容器又は洗浄された容器に移動させる手間が省ける点で好ましい。なお、この態様は、刺激応答性物質が凝集する条件下で行うことが確実な固液分離の観点で好ましいが、検出及び定量に要求される精度によっては刺激応答性物質が凝集しない条件下で行ってもよい。同様に、検出及び定量の間、磁力を付加し続けることが確実な固液分離の観点で好ましいが、検出及び定量に要求される精度によっては、検出及び定量の少なくとも一部（特に、抗体担持抗体と混合物との混合の後）を、磁力を付加しない条件（例えば、磁石が容器近傍に配置されていない）下で行ってもよい。

図２及び３に示されるように、検出は、検出対象Ｔに対する親和性物質（例えば、抗体又はそのフラグメント）が担持された担体Ｃを、混合物と混合し、担体Ｃの凝集の有無により判別する工程を含んでよい。同様に、定量は、検出対象Ｔに対する親和性物質が担持された担体を、混合物と混合し、担体Ｃの凝集の程度を検出する（例えば、光透過率を測定する）工程を含んでよい。検出対象Ｔが存在すると、検出対象Ｔに結合した親和性物質を担持した担体Ｃが凝集するため、その凝集によって、検出及び定量を行うことができる。かかる工程は、従来公知の間接凝集免疫工程であり、担体としてはラテックス、ゼラチン粒子等の周知のものが使用できる。本発明は、検出及び定量が、凝集した結合物Ａを混合物が収容されている容器内で固液分離させた状態で行える結果、上記のような従来公知の間接凝集免疫工程を用いることができる点でも有利である。

ただし、検出及び定量に要求される精度が極めて高い場合等には、必要に応じ、混合物を別の容器又は洗浄された容器に移し、あるいは別の試験系に移した後に、検出及び定量を行ってもよい。この場合にも、検出及び定量は従来公知の種々の方法で行ってよく、間接凝集免疫工程のみならず、標識物質（酵素、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質等）を用いた標識免疫工程等も可能である。

検出及び定量は、検出感度を増加させる増感剤を添加した状態で行うことが好ましい。増感剤は、検出対象の検出感度のみならず、非特異反応物質の検出感度も増加させることが一般的であるが、本発明では非特異反応物質が分離されているため、検出対象の検出感度の増加という利点のみを享受することができる。かかる増感剤は、検出及び定量の方法に応じて適宜選択され、例えば間接免疫凝集による場合には、担体の凝集を促進する、ポリエチレングリコールやデキストラン等の水溶性高分子等が使用できる。なお、増感剤の添加のタイミングは、前述の担体とともに添加しなければよく、単独で添加してもよいし、結合物とともに添加してもよい。

検出及び定量が終了した後、容器を洗浄し、検出対象及び結合物（存在する場合）を排出する。このとき、結合物を容易に排出する観点で、容器を磁力が付加されない条件下におくことが好ましい。

前述のように、本発明では、分離工程を５〜１０分以内という短時間で終えることができる。このため、本発明の方法を行う装置として、従来の複数試薬を添加して検出及び定量を行う装置を、用いる試薬を結合物及び抗体担持担体等へと代えるだけで、大きな改変なく転用することもできる。かかる従来装置で添加される複数試薬としては、希釈液又は増感剤及び抗体担持担体の組合せや、刺激応答性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、有電荷又は親水性の第２の物質と検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物との組合せ（特開２００９−１６８６３６号公報参照）等が挙げられる。

本発明は、検体中の検出対象を検出及び／又は定量するためのキットも包含する。このキットは、刺激応答性物質及び微粒子状の磁性物質を含有する凝集性物質と検出対象以外の物質に対する親和性物質とが結合した結合物と、検出対象に対する親和性物質と、を備える。結合物と、検出対象に対する親和性物質とを組み合わせることは、凝集作用を利用することで、非特異反応物質との結合効率及び非特異反応物質の分離効率を両立するという新規な着想がなければ、想到し得ないものである。キットは、ＩｇＭ、アルブミン、グロブリン、フィブリン、リウマトイド因子等の非特異反応物質の各々に対する親和性物質を１種又は２種以上含んでよい。

本発明のキットにおいて、親和性物質は、担体に担持された形態であることが好ましい。また、本発明のキットは、検出感度を増加させる増感剤を更に備えることが好ましい。これらの詳細は、前述の通りであるため、省略する。

＜実施例１＞
（非特異反応物質に対する親和性物質が結合した刺激応答性磁性微粒子の調製）
まず、非特異反応物質としてのヒトＩｇＭに対するリガンドとしての抗体を、従来周知のｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ法（旭テクノグラス社）によりビオチン化し、ビオチン標識抗ヒトＩｇＭ抗体を調製した。

一方、ストレプトアビジン及び温度応答性ポリマーが結合された磁性微粒子であるＪＮＣ社製のＴｈｅｒｍａ−Ｍａｘ ＬＳＡ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（０．２質量％、平均粒子径１００ｎｍ）２５０μＬを１．５ｍＬマイクロチューブ内にとった。このマイクロチューブを４２℃に加熱することで、Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ ＬＳＡ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを凝集させ、磁石で回収した後、上清を除去した。除去後のチューブにＴＢＳバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）２５０μＬを加え、冷却することで凝集物を分散させた。

この分散液に、ＰＢＳバッファ（０．０１Ｍ リン酸バッファ、０．００２７Ｍ 塩化カリウム、０．１３７Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に溶解した上記ビオチン標識抗ヒトＩｇＭ抗体５０μＬ（０．７５ｍｇ／ｍＬ）を加え、室温で２０分間に亘り転倒混和した。その後、マイクロチューブを４２℃に加熱して、Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ ＬＳＡ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを凝集させ、磁石で回収した後、上清を除去することで余分なビオチン標識抗ヒトＩｇＭ抗体を分離した（Ｂ／Ｆ分離）。分離後のマイクロチューブにＴＢＳバッファ２５０μＬを加え、冷却することで、凝集物を分散させた。更に、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファ（ｐＨ７．４）溶液に凝集物を分散させることで、ヒトＩｇＭに対する親和性物質が結合した刺激応答性磁性粒子溶液を調製した。

（試料の調製）
「ルミパルスＩＩ ＴＰ−Ｎ」及び「エスルラインＴＰ」（富士レビオ社）にて陰性となったヒト血清を、トレポネーマ抗体キット「メディエースＴＰＬＡ」（積水メディカル社）及び生化学自動分析装置「ＣＡ−９０」（古野電気社）を用いて測定し、陽性と判別される（非特異反応による擬陽性と疑われる）ヒト血清のうち、「ビトロス マイクロチップ ＩｇＭ」（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社）にてＩｇＭ濃度を測定し３００ｍｇ／ｄＬ以上となったものを、検体として採用した。これとは別に、「ルミパルスＩＩ ＴＰ−Ｎ」（富士レビオ社）、「エスルラインＴＰ」（富士レビオ社）及びトレポネーマ抗体キット「メディエースＴＰＬＡ」（積水メディカル社）の測定結果（陽性、陰性）が一致したヒト血清を各々、陽性対照検体及び陰性対照検体として採用した。

（生化学自動分析装置への磁石付加）
生化学自動分析装置「ＣＡ−９０」のディスポーサブルプラスチックキュベットの測光面と直交する面に、寸法１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍのネオジム磁石（ネオマグ社）を接着させたものを反応キュベットとして準備した。

（ＴＰ測定試薬の準備）
「メディエースＴＰＬＡ」キットのうち、検体希釈用緩衝液を、上で調製した、ヒトＩｇＭに対する親和物質が結合した刺激応答性磁性粒子溶液へと置き換え、「メディエースＴＰＬＡ」キットのうち梅毒陽性標準血清（A）：５濃度で標準曲線を作製した。

検体、陽性対照検体及び陰性対照検体を、ネオジム磁石付きキュベットを装着した生化学自動分析装置「ＣＡ−９０」において、上で用意した「メディエースＴＰＬＡキット」を用いて分析した。この結果を表１に示す。

刺激応答性磁性粒子溶液を用い、検体中のＩｇＭを効率良く除去した場合、「メディエースＴＰＬＡ」による測定結果は陰性へと変わり、「ルミパルスＩＩ ＴＰ−Ｎ」及び「エスプラインＴＰ」による測定結果と一致した。これにより、ラテックス凝集法におけるＩｇＭの非特異反応による悪影響が抑制されたことが分かった。なお、対照である陽性検体、陰性検体での分析結果については、刺激応答性磁性粒子溶液の使用による変化は認められなかった。

＜参考例＞
使用した試薬及び器材と、その略称を以下に示す。
１.ＪＮＣ社製「Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ ＬＳＡ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（３０）」
：「ＴＭ−ＬＳＡ（３０）」（濃度:２ｍｇ／ｍｌ）
２．Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ（商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１」
：「ＤｙＭＯＳ−Ｃ１」（ビーズ平均粒径：１μｍ、濃度：１０ｍｇ／ｍｌ）
３．分光光度計用セミミクロセル
４．西興産業社製ネオジム永久磁石（寸法：５×９×２ｍｍ）
５．エッペンドルフピペット１００μＬ、及びエッペンドルフ１００μＬチップ

「ＴＭ−ＬＳＡ(３０)」１ｍＬを３７℃に加温し、磁石にて５分間かけて「ＴＭ−ＬＳＡ（３０）」粒子を回収した後、上清を捨て、滅菌水１ｍＬを添加し、回収用磁石を外した状態で室温（２１℃）にて撹拌した。この「ＴＭ−ＬＳＡ(３０)」粒子を均一に分散させた後、滅菌水で２倍に希釈し、「ＴＭ−ＬＳＡ(３０)」１ｍｇ／ｍＬの分散液を準備した。

「ＤｙＭＯＳ−Ｃ１」１ｍＬ分取し、磁石にて５分間かけて「ＤｙＭＯＳ−Ｃ１」粒子を回収した後、上清を捨て、滅菌水１ｍＬを添加し、回収用磁石を外した状態で室温（２１℃）にて撹拌した。この「ＤｙＭＯＳ−Ｃ１」粒子を均一に分散させた後、滅菌水で１０倍に希釈し、「ＤｙＭＯＡ−Ｃ１」１ｍｇ／ｍＬの分散液を準備した。

準備した「ＴＭ−ＬＳＡ(３０)」及び「ＤｙＭＯＳ−Ｃ１」の分散液各１ｍＬを、３７℃で５分間加温し、ネオジム磁石を設けた別々のセミミクロセルに添加した。このセミミクロセルを室温（２１℃）で３分間静置した。この時点でのセミミクロセルの状態を図４（「ＴＭ−ＬＳＡ(３０)」）及び図６（「ＤｙＭＯＳ−Ｃ１」）に示す。「ＴＭ−ＬＳＡ(３０)」は磁石に集積され、分散が認められない一方、「ＤｙＭＯＳ−Ｃ１」は大部分が磁石に集積されるものの、一部に分散が認められた。

その後、１００μＬピペットを用い、磁石及び磁石に集積された粒子群にチップが触れず、また排出した液の流れが直接ぶつからないように、１００μＬ全量のピペッティングを３回行った。チップが磁石及び磁石に集積された粒子群に触れないよう、静かに上清を採取して別の容器に移し、目視で粒子量を確認した。この時点でのセミミクロセルの状態を図５（「ＴＭ−ＬＳＡ(３０)」）及び図７（「ＤｙＭＯＳ−Ｃ１」）に示す。「ＴＭ−ＬＳＡ(３０)」の上清は無色透明であり、粒子の存在を確認できなかったのに対し、「ＤｙＭＯＳ−Ｃ１」の上清には、多量の粒子による明らかな濁りが確認された。これにより、本発明の結合物は凝集し、磁力に強くひきつけられているため、と再分散しにくいことが分かった。

１０ 結合物
１１ 刺激応答性物質
１３ 抗体（親和性物質）
１９ 磁性物質
５０ 非特異反応物質
Ａ 凝集状態の結合物
Ｃ 担体
Ｍ 磁石
Ｔ 検出対象

Claims (9)

1. 検体中の検出対象を検出する方法であって、
   刺激応答性物質及び微粒子状の磁性物質を含有する凝集性物質と前記検出対象以外の物質に対する親和性物質とが結合した結合物と、前記検体とを混合し、この混合物に前記刺激応答性物質が凝集する条件下で磁力を付加することで、凝集した前記結合物を分離し、その後の前記混合物における前記検出対象を検出する工程を有し、
   前記検出対象の検出は、凝集した前記結合物を、前記混合物が収容されている容器内で固液分離させた状態で行う方法。
2. 前記検出対象の検出は、前記検出対象に対する親和性物質が担持された担体を、前記混合物と混合し、前記担体の凝集の有無により判別する工程を含む請求項１記載の方法。
3. 前記検出対象の検出は、検出感度を増加させる増感剤を添加した状態で行う請求項１又は２記載の方法。
4. 検体中の検出対象を定量する方法であって、
   刺激応答性物質及び微粒子状の磁性物質を含有する凝集性物質と前記検出対象以外の物質に対する親和性物質とが結合した結合物と、前記検体とを混合し、この混合物に前記刺激応答性物質が凝集する条件下で磁力を付加することで、凝集した前記結合物を分離し、その後の前記混合物における前記検出対象の量を定量する工程を有し、
   前記検出対象の定量は、凝集した前記結合物を、前記混合物が収容されている容器内で固液分離させた状態で行う方法。
5. 前記検出対象の定量は、前記検出対象に対する親和性物質が担持された担体を、前記混合物と混合し、前記担体の凝集の程度を検出する工程を含む請求項４記載の方法。
6. 前記検出対象の定量は、検出感度を増加させる増感剤を添加した状態で行う請求項４又は５記載の方法。
7. 検体中の検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、
   刺激応答性物質及び微粒子状の磁性物質を含有する凝集性物質と前記検出対象以外の物質に対する親和性物質とが結合した結合物と、
   前記検出対象に対する親和性物質と、を備え、
   請求項１から６いずれか記載の方法で用いられるキット。
8. 前記親和性物質は、担体に担持された形態である請求項７記載のキット。
9. 検出感度を増加させる増感剤を更に備える請求項７又は８記載のキット。