JP5276980B2 - 検出対象の検出、定量用キット、及び検出、定量方法 - Google Patents
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Description
刺激応答性ポリマーを含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、
電荷を有する第2の物質と前記検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物と、を含み、
第1の親和性物質と第2の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できることを特徴とするキット。
[2]第1の物質が、微粒子状の磁性物質を含むことを特徴とする[1]に記載のキット。
[3]第2の物質が、親水性の高分子化合物であることを特徴とする[1]又は[2]に記載のキット。
[4]第2の物質が、ポリアニオン又はポリカチオンであることを特徴とする[1]〜[3]のいずれか1項に記載のキット。
[5]ポリアニオンが、核酸又はポリアクリル酸であることを特徴とする[4]に記載のキット。
[6]ポリカチオンが、ポリアルキルアミン又はポリエチレンイミンであることを特徴とする[4]に記載のキット。
[7]検体中の検出対象を検出する方法であって、
刺激応答性ポリマーを含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、電荷を有する第2の物質と前記検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物と、前記検体とを混合し、刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記刺激応答性ポリマーの分散の有無を判定する工程を含み、
第1の親和性物質と第2の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できることを特徴とする方法。
[8]第1の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含むことを特徴とする[7]に記載の方法。
[9]検体中の検出対象を定量する方法であって、
刺激応答性ポリマーを含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、電荷を有する第2の物質と前記検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下におき、
前記混合物の濁度を測定し、前記検出対象の量と濁度との前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含む方法。
[10]第1の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含むことを特徴とする[9]に記載の方法。
11 刺激応答性ポリマー
13 第1の抗体(第1の親和性物質)
19 磁性物質
20 第2の結合物
21 第2の物質
23 第2の抗体(第2の親和性物質)
50 検出対象
本発明のキットは、検出対象を検出及び/又は定量するためのキットであって、第1の結合物と、第2の結合物とを含有する。各構成について、以下詳細に説明する。
第1の結合物は、刺激応答性ポリマーを含有する第1の物質と、検出対象に対する第1の親和性物質とが結合したものである。
本発明で用いられる第1の物質は刺激応答性ポリマーを含有するところ、この刺激応答性ポリマーは、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できるポリマーである。刺激は、特に限定されないが、温度、光、酸、塩基、pH、電気等の様々な物理的、あるいは化学的信号であってよい。
ここで用いる微粒子状の磁性物質は、多価アルコールとマグネタイトとで構成されてよい。この多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも2個有し且つ鉄イオンと結合可能なアルコール構造体である限りにおいて特に限定されず、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリンが挙げられる。例えば特開2005−82538公報には、デキストランを用いた微粒子状の磁性物質の製造方法が開示されている。また、グリジジルメタクリレート重合体のようにエポキシ基を有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。このような多価アルコールを用いて調製された微粒子状の磁性物質(磁性微粒子)は、良好な分散性を有するように、その平均粒径が0.9nm以上1000nm未満であることが好ましい。平均粒径は、特に目的とする検出対象の検出感度を高めるためには、2.9nm以上200nm未満であることが好ましい。
第2の結合物は、電荷を有する第2の物質と、検出対象に対する第2の親和性物質とが結合したものである。
電荷を有する第2の物質は、例えば親水性の高分子化合物であり、ポリアニオン又はポリカチオンであることが好ましい。ポリアニオンとは複数のアニオン基を有する物質を意味し、ポリカチオンとは複数のカチオン基を有する物質を意味する。ポリアニオンの例として、DNA及びRNA等の核酸が挙げられる。これらの核酸は、核酸骨恪に沿って複数個のホスホジエステル基が存在することにより、ポリアニオンの性質を有する。また、ポリアニオンには、多数のカルボン酸官能基を含むポリペプチド(グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸からなるポリペプチド)、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、及びアクリル酸やメタクリル酸を重合成分として含有するポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、及びヘパリン等の多糖等も含まれる。一方、ポリカチオンの例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアルキルアミン、ポリエチレンイミンやポリプロピルエチレンイミン等が挙げられる。なお、ポリアニオン(カルボキシル基)やポリカチオン(アミノ基)の官能基数は、25個以上が好ましい。
第1の結合物の第1の親和性物質、及び第2の結合物の第2の親和性物質は、検出対象の異なる部位において、同時に検出対象に結合できるものである。第1の親和性物質及び第2の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であってよい。
以上のキットの作成方法を説明する。
第1の結合物は、第1の物質と第1の親和性物質とを結合することによって作製する。この結合方法は、特に限定されないが、例えば、第1の物質側(例えば刺激応答性ポリマー部分)及び第1の親和性物質(例えば、第1の抗体)側の双方に、互いに親和性の物質(例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンSトランスフェラーゼ)を結合させ、これら物質を介して第1の物質及び第1の親和性物質を結合させる。
第2の結合物は、第2の物質と第2の親和性物質とを直接又は間接に結合することによって作製する。特に限定されないが、例えば、第2の物質側及び第2の親和性物質(例えば、第2の抗体)側の双方に、互いに親和性の物質(例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンSトランスフェラーゼ)を結合させ、これら物質を介して第2の物質及び第2の親和性物質を間接的に結合させる。
本発明の検出方法は、まず第1の結合物、第2の結合物及び検体を混合し、刺激応答性ポリマーが凝集する条件下において、刺激応答性ポリマーの分散の有無を判定する工程を含む。手順の詳細を以下に説明する。
まず、第1の結合物と第2の結合物とを容器内で混合し、更に検体を添加して混合物を得る。続いて、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におく。すると、検出対象が存在する場合には、刺激応答性ポリマーが第2の結合物中の電荷によって凝集阻害されて分散する一方、検出対象が存在しない場合には刺激応答性ポリマーが凝集阻害されず凝集することになる。
分散の有無の判定は、例えば目視又は濁度測定で行うことができる。濁度は光散乱装置での光透過率から算出でき、濁度が低ければ刺激応答性ポリマーの凝集が阻害されており、検出物質の存在が示唆される。ここで、使用する光の波長は、磁性物質の粒径等に応じ所望の検出感度が得られるよう適宜設定されてよい。光の波長は、従来汎用の装置を利用できる点で、可視光の範囲内(例えば、550nm)であることが好ましい。
本発明の定量方法によれば、まず、第1の結合物、第2の結合物及び検体を混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下におく、次に、混合物の濁度を測定し、検出対象の量と濁度との所定条件下における相関式に基づいて、検体中の検出対象の量を算出する。前半部分の手順は前述した検出方法と類似するので、説明を省略する。
上記所定条件と同一の条件における、検出対象の量と濁度との相関式を作成する。この相関式を構成する検出対象の量と濁度との測定は、データが多い程に信頼性の高い相関式が得られる。そこでデータは、2以上の検出対象の量に関するものであればよく、3点以上の検出対象の量に関するものであることが好ましい。
混合物の濁度測定値を、作成した相関式に代入することによって、検体中の検出対象の量を算出できる。
第1の物質が微粒子状の磁性物質を含有する場合、本発明の検出方法又は定量方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含むことが好ましい。これによって、凝集した磁性物質が、非凝集状態の磁性物質を含む夾雑物から分離される。このため、分離した磁性物質の量、溶媒に分散した際の光透過率等の測定値は、夾雑物の影響が除外され、検出物質の存在をより忠実に反映したものとなる。
検体中の検出対象としては、臨床診断に利用される物質が挙げられ、具体的には、体液、尿、喀痰、糞便中等に含まれるヒトイムノグロブリンG、ヒトイムノグロブリンM、ヒトイムノグロブリンA、ヒトイムノグロブリンE、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン(フィブリン及びそれらの分解産物)、α−フェトプロテイン(AFP)、C反応性タンパク質(CRP)、ミオグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、ヒト胎盤性ラクトーゲン(HPL)、HIVウイルス抗原、アレルゲン、細菌毒素、細菌抗原、酵素、ホルモン(例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン(TSH)、インスリン等)、薬剤等が挙げられる。
以下に、本発明の方法を利用するためのキットの構成とその使用方法の例を、検出対象が抗原の場合について説明する。
抗原検出用試薬キット:
試薬A:微粒子状の磁性物質及び検出対象の抗原に特異的に結合する第1の抗体が結合した温度応答性ポリマー
試薬B:第1の抗体とは異なる部位を認識し、検出対象の抗原に同時に結合しうる第2の抗体が結合した、電荷を有する化合物
試薬C:被測定物質の標準品(具体例として、精製抗原が挙げられる。)。
試薬D:希釈用バッファー(上記試薬の希釈用、並びに被測定試料の希釈用に使用可能なバッファーであって、トリス塩酸バッファー、リン酸バッファー等が挙げられる。)
[キットの作製]
(第1の結合物の調製)
まず、検出対象としてのヒト甲状腺刺激ホルモン(TSH)に対する第1の親和性物質としての抗体(クローン:195マウス、マウスIgG、Leinco Technology,Inc.製)を、従来周知のsulfo−NHS−Biotin法(旭テクノグラス社)によりビオチン化し、ビオチン標識抗TSHベータ抗体を調製した。
一方、ストレプトアビジンが結合された微粒子状の磁性物質であるマグナビート株式会社製のTherma−Max LSA Streptavidin(0.4質量%)250μLを1.5mLマイクロチューブにとり、このマイクロチューブを42℃に加熱することで、Therma−Max LSA Streptavidinを凝集させ、磁石で回収した後、上清を除去した。ここにTBSバッファー(20mM Tris−HCl、150mM NaCl、pH7.5)250μLを加え、冷却することで凝集物を分散させた。この分散液に、PBSバッファー(0.01M リン酸バッファー、0.0027M 塩化カリウム、0.137M 塩化ナトリウム、pH7.4)に溶解したビオチン標識抗TSHβ抗体50μL(0.75mg/mL)を加え、室温で15分間転倒混和した。マイクロチューブを42℃に加熱してTherma−Max LSA Streptavidinを凝集させ、磁石で回収した後、上清部分を除去し、余分なビオチン標識抗TSHベータ抗体を分離した(B/F分離)。ここにTBSバッファー250μLを加え、冷却することで凝集物を分散させた。続いて、過剰量のビオチンを添加して、ストレプトアビジンのビオチン結合部位を被覆した後、余分なビオチンを分離した(B/F分離)。更に0.5%(w/v)BSA(シグマ社製)、0.5%(w/v)Tween(登録商標)20、10mM EDTAを含有させたPBSバッファー(pH7.4)溶液に分散させることで、第1の結合物を調製した。
まず、検出対象としてのヒト甲状腺刺激ホルモン(TSH)に対する第2の親和性物質としての抗体(クローン:176マウス、マウスIgG、Leinco Technology,Inc.製、1mg/mL)1mLに2−メルカプトエタノール6mgを加え、37℃で120分反応させた。反応後、Slide−A−Lyzer(商品名) 透析カセット、10K MWCO(Pierce)により、PBSバッファー500mLに対して透析し、過剰の2−メルカプトエタノールを除き、限界排除分子量10000の限外濾過膜(MILLIPORE社製[Amicon Ultra−4 Ultracel 10k])を用いて0.5mLに濃縮し、マウス抗TSHα抗体の還元抗体を得た。この還元抗体0.5mLと100μLマレイミド化ポリアクリル酸ナトリウム(33mgをPBSバッファー1mLに溶解したもの)とを4℃で1晩反応させ、続いてSuperdex−200 10/300GL(GEヘルスケア社製)を用いてゲル濾過することで、標識抗体を作成した。この標識抗体(この抗体は、ポリアクリル酸抗TSHα抗体結合物ともいう。)を0.5%(w/v)BSA(シグマ社製)、0.5%(w/v)Tween(登録商標)20/PBS(pH7.4)、10mM EDTAの水溶液でタンパク質濃度4μg/mLに希釈することで、第2の結合物を調製した。
まず、窒素ガス導入管、温度計、及び撹拌装置を付した100mLの三口フラスコ内で、アクリル酸(和光純薬工業社製)2g、2−アミノエタンチオール(和光純薬工業社製)0.021g、及びアゾビスイソブチロニトリル(和光純薬工業社製)0.023gをN,N−ジメチルホルムアミド50mLに溶解し、1時間窒素置換を行った。その後、70℃で7時間重合反応を行った。得られた反応液を、10mLまで減圧濃縮し、粘稠状の物が粉状になるまでジエチルエーテルで再沈殿を行った。白色沈殿をろ過し、更に真空乾燥機で1晩乾燥することで、アミノ基末端ポリアクリル酸を得た(収量1.5g)。次にアミノ基末端ポリアクリル酸をマレイミド化した。窒素ガス導入管、及び撹拌装置を付した50mLのナスフラスコに、アミノ基末端ポリアクリル酸0.5g及びN,N−ジメチルホルムアミド10mLを入れ、溶解した。そこにEMCS(N−(6−マレイミドカプロイロキシ)スクシンイミド)(同仁化学研究所社製)3mgを加え、一晩反応した。得られた反応液を、1mLまで減圧濃縮し、粘稠な物が粉状になるまでジエチルエーテルで再沈殿を行った。白色沈殿をろ過し、更に真空乾燥機で、1晩乾燥しマレイミド基末端ポリアクリル酸を得た。分子量は約130000(東ソー社製、TSKgel Super AW3000、6mm ID.×150mm、移動相0.1M 硝酸ナトリウム)であり、収量は0.4gであった。
ヒト甲状腺刺激ホルモン(TSH;Aspen Bio Pharma,Inc.製、活性8.5IU/mg、WHO80/558)をPBSバッファー(pH7.4)に30μg/mLとなるように溶解した。この溶液をビトロスTSHキャリブレータ1(TSH:0mIU/L、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製)で0.06mIU/L、0.0012mIU/Lとなるよう希釈したものを、それぞれ試料とした。
図3に示されるように、従来汎用されている分光光度計用セミミクロセル71の光路外に、寸法5mm×9mm×2mmのネオジム永久磁石73(西興産業社製)を取り付けた。このセル71を、セル温度制御機が設けられた可視紫外分光光度計UV−3101PC(島津製作所製)内に設置し、37℃のもと10分間以上保持した。
第1の結合物150μL及び第2の結合物120μLをマイクロチューブ内に注ぎ、ボルテックスミキサで1秒間撹拌した。このマイクロチューブ内に各試料750μLを添加し、再びボルテックスミキサで60秒間撹拌した。
この撹拌液をセル71内に分注し、分光光度計に添付の使用説明書に従ってゼロ補正し、波長420nmの光を用いて、直ちにスリット幅10mmで、1200秒間にわたって連続して測定した。この結果を図5に示す。
上記の第1の結合物、第2の結合物及び試料を4℃の暗所内で保存し、1日1回ずつ3日間、同様の手順で濁度の測定を行った。この結果を表1に示す。
分光光度計用セミミクロセル71の光路外に、ネオジム永久磁石73(西興産業社製)を取り付けなかったことを除き、実施例1と同様の手順で、TSH量がゼロの試料の濁度を測定した。この結果を、実施例1におけるTSH量がゼロの試料の濁度と併せて図9に示す。
上記の試料について、種々の系を用いてTSH量を測定した。この結果から推定される各系の検出限界値を表2に示す。
(ビオチン含有ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)の合成)
窒素ガス導入管、温度計及び撹拌装置を付した200mLの三口フラスコ内で、N−イソプロピルアクリルアミド13.6g、ビオチンモノマー〔N−ビオチニル−N’−メタクリロイルトリメチレンアミド〕0.42g、2−アミノエタンチオール(和光純薬工業社製)0.2g及びアゾビスイソブチロニトリル0.2gをメタノール100mLに溶解し、30分間窒素置換を行った。その後、70℃で7時間重合反応を行った。得られた反応液を減圧濃縮し、得られた固体をアセトンに溶かし、ジエチルエーテルで再沈殿を行った。白色沈殿を濾過し、更に真空乾燥機で1晩乾燥することで、ビオチン含有ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)を11.84g得た。得られたビオチン含有ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)の分子量は約29000(Shodex GPC LF−804、8mm ID.×300mm、移動相THF)であった。
なお、ビオチンモノマー〔N−ビオチニル−N’−メタクリロイルトリメチレンアミド〕の調製は、特開2005−82538号公報に記載の方法を用いて、以下の通り行った。
N−(3−アミノプロピル)メタクリルアミド塩酸塩18g、ビオチン24g及びトリエチルアミン30gを300mlのN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、0℃に冷却した。ジフェニルホスフォニルアジド28gを50mlのDMFに溶解させた溶液を1時間かけて、この混合物中に滴下した。滴下終了後、0℃で3時間攪拌し、更に室温(20℃)で12時間攪拌した。この後、減圧下で、溶媒を留去し、クロロホルム−メタノール混合溶媒を用いて、カラムクロマトグラフィーで精製し、N−ビオチニル−N’−メタクリロイルトリメチレンアミドを得た。
ビオチン含有ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)100mgをTBSバッファー10mLに溶解し、0.1%(w/v)とした。0.1%(w/v)ビオチン含有ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)3mLに、10mg/mLになるように精製水(MILLIPORE社製 Direct−Q(商品名)で精製した水)に溶解したストレプトアビジン(和光純薬工業社製)15μLを添加し、30分間氷上で静置して反応させることで、ストレプトアビジン結合ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)のTBS溶液を得た。
ストレプトアビジン結合ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)のTBS溶液625μLに、ビオチン標識マウス抗TSHα抗体(コスモバイオ社(商品コード T103)より購入したマウス抗TSHα抗体(Leinco Technology,Inc.製)をsulfo−NHS−Biotin法(旭テクノグラス社)でビオチン化したもの)100μLを添加し、30分間氷上で静置して反応させ、マウス抗TSHα抗体結合ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)のTBS溶液を得た。
マウス抗TSHα抗体の代わりにマウス抗TSHβ抗体を用いた点を除き、実施例2と同様の手順でポリアクリル酸抗TSHβ抗体結合物を調製した。
マウス抗TSHα抗体結合ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)TBS溶液25μLの入った1.5mLのチューブを4本(a、b、c及びd)用意した。各チューブにビトロスTSHキャリブレーター1(オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製、商品コード 065002)5μLと、各濃度のTSHのTBS溶液 10μL(aはTSH濃度0、bはTSH濃度0.001μg/μL、cはTSH濃度0.01μg/μL、dはTSH濃度0.1μg/μL)との混合物を添加し、更にTBSバッファー165μLを加え、5分間、氷上にて静置した。その後、各チューブにポリアクリル酸抗TSHβ抗体結合物5μLを添加し、30分間氷上にて静置したものを測定サンプルとした。
Claims (10)
- 検出対象を検出及び/又は定量するためのキットであって、
温度応答性ポリマーを含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、
電荷を有する第2の物質と前記検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物と、を含み、
第1の親和性物質と第2の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できることを特徴とするキット。 - 第1の物質が、微粒子状の磁性物質を含むことを特徴とする請求項1に記載のキット。
- 第2の物質が、親水性の高分子化合物であることを特徴とする請求項1又は2に記載のキット。
- 第2の物質が、ポリアニオン又はポリカチオンであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載のキット。
- ポリアニオンが、核酸又はポリアクリル酸であることを特徴とする請求項4に記載のキット。
- ポリカチオンが、ポリアルキルアミン又はポリエチレンイミンであることを特徴とする請求項4に記載のキット。
- 検体中の検出対象を検出する方法であって、
温度応答性ポリマーを含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、電荷を有する第2の物質と前記検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物と、前記検体とを混合し、温度応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記温度応答性ポリマーの分散の有無を判定する工程を含み、
第1の親和性物質と第2の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できることを特徴とする方法。 - 第1の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含むことを特徴とする請求項7に記載の方法。 - 検体中の検出対象を定量する方法であって、
温度応答性ポリマーを含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、電荷を有する第2の物質と前記検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を温度応答性ポリマーが凝集する所定条件下におき、
前記混合物の濁度を測定し、前記検出対象の量と濁度との前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含む方法。 - 第1の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含むことを特徴とする請求項9に記載の方法。
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