JP6282819B2 - 検出対象を検出又は定量するためのキット、及び方法 - Google Patents
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刺激応答性物質を含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、水中で表面に疎水性部分を提示しかつ懸濁可能な固体粒子と、を備えるキット。
刺激応答性物質を含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、水中で表面に疎水性部分を提示しかつ懸濁可能な固体粒子と、前記検体とを混合し、この混合物を前記刺激応答性物質が凝集する条件下におき、前記刺激応答性物質の分散又はそれと相関する事象の有無を判定する工程を含む方法。
刺激応答性物質を含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、水中で表面に疎水性部分を提示しかつ懸濁可能な固体粒子と、前記検体とを混合し、この混合物を前記刺激応答性物質が凝集する所定条件下におき、
前記混合物の濁度又はそれと相関するパラメータを測定し、前記検出対象の量と濁度又は前記パラメータとの前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含む方法。
第1の親和性物質と第2の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できる(4)又は(5)記載の方法。
前記方法は、前記条件においた後の前記混合物に磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む(4)から(6)いずれか記載の方法。
本発明のキットは、検出対象を検出又は定量するためのキットであって、第1の結合物と、第2の結合物とを含有する。各構成について、以下詳細に説明する。
第1の結合物は、刺激応答性ポリマーを含有する第1の物質と、検出対象に対する第1の親和性物質とが結合したものである。
本発明で用いられる第1の物質は刺激応答性物質を含有する物質であり、この刺激応答性物質は、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できる物質である。刺激としては、特に限定されないが、温度変化、光の照射、酸又は塩基の添加(pHの変化)、電場変化等が挙げられる。
ここで用いる微粒子状の磁性物質は、多価アルコールとマグネタイトとで構成されてよい。この多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも2個有し且つ鉄イオンと結合可能なアルコール構造体である限りにおいて特に限定されず、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリンが挙げられる。例えば特開2005−82538公報には、デキストランを用いた微粒子状の磁性物質の製造方法が開示されている。また、グリシジルメタクリレート重合体のようにエポキシを有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。このような多価アルコールを用いて調製された微粒子状の磁性物質(磁性微粒子)は、良好な分散性を有するように、その平均粒径が0.9nm以上1000nm未満であることが好ましい。平均粒径は、特に目的とする検出対象の検出感度を高めるためには、2.9nm以上200nm未満であることが好ましい。
第1の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であってよい。ここで用いる抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよく、Fab等の抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。
第1の結合物は、第1の物質と第1の親和性物質とを結合することによって作製する。この結合方法は、特に限定されないが、例えば、第1の物質側(例えば刺激応答性物質部分)及び第1の親和性物質(例えば、第1の抗体)側の双方に、互いに親和性の物質(例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンSトランスフェラーゼ)を結合させ、これら物質を介して第1の物質及び第1の親和性物質を結合させる。
本発明で用いられる固体粒子は、水中で表面に疎水性部分を提示しかつ懸濁可能なものである。懸濁可能なことで、濁度等の本発明で測定されるパラメータに影響を与える(測定光を吸光又は散乱させる)ことができる。水中で表面に疎水性部分が提示されることで、凝集の間に凝集体に巻き込まれることができ、また後述の凝集体の磁石への吸着の間にも巻き込まれることができる。なお、懸濁可能性は、固体粒子の比重、粒子径等を適宜調節することで付与することができる。
本発明の方法では、第1の結合物に加えて、親水性又は有電荷の部分を有する第2の物質と、検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物を用いることが好ましい。これにより、検出感度を向上することができる。なお、第2の結合物を用いなくても、検出対象が有する親水性又は有電荷の部分が刺激応答性物質に接近するため、刺激応答性物質の凝集阻害効果をある程度得ることはできる。
第2の物質は、例えば電荷を有する高分子化合物であり、ポリアニオン又はポリカチオンであることが好ましい。ポリアニオンとは複数のアニオン基を有する物質を意味し、ポリカチオンとは複数のカチオン基を有する物質を意味する。ポリアニオンの例として、DNA及びRNA等の核酸が挙げられる。これらの核酸は、核酸骨恪に沿って複数個のホスホジエステル基が存在することにより、ポリアニオンの性質を有する。また、ポリアニオンには、多数のカルボキシルを含むポリペプチド(グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸からなるポリペプチド)、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸及びアクリル酸やメタクリル酸を重合成分として含有するポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、及びヘパリン等の多糖等も含まれる。一方、ポリカチオンの例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアルキルアミン、ポリエチレンイミンやポリプロピルエチレンイミン等が挙げられる。なお、ポリアニオン(カルボキシル)やポリカチオン(アミノ)の官能基数は、25個以上が好ましい。また、カルボキシル基を持つラテックス粒子等も挙げられる。
第2の親和性物質は、第1の親和性物質とは異なる部位において、第1の親和性物質と同じ検出対象に結合できるものである。第1の親和性物質及び第2の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であってよい。
第2の結合物は、第2の物質と第2の親和性物質とを直接又は間接に結合することによって作製する。特に限定されないが、例えば、第2の物質側及び第2の親和性物質(例えば、第2の抗体)側の双方に、互いに親和性の物質(例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンSトランスフェラーゼ)を結合させ、これら物質を介して第2の物質及び第2の親和性物質を間接的に結合させる。
以上の結合物(少なくとも第1の結合物を含む)、固体粒子、及び検体の混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におくと、検出対象が存在する場合には、刺激応答性ポリマーが検出対象の電荷部分又は親水性部分によって凝集阻害されて分散する。一方、検出対象が存在しない場合には、刺激応答性ポリマーが凝集阻害されず凝集することになる。
分散の有無の判定は、例えば目視又は濁度測定で行うことができる。濁度は光散乱装置での光透過率から算出でき、濁度が低ければ刺激応答性ポリマーの凝集が阻害されており、検出物質の存在が示唆される。ここで、使用する光の波長は、磁性物質の粒径等に応じ所望の検出感度が得られるよう適宜設定されてよい。光の波長は、従来汎用の装置を利用できる点で、可視光の範囲内(例えば、550nm)であることが好ましい。
本発明の定量方法によれば、まず、第1の結合物、第2の結合物及び検体を混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下におく、次に、混合物の濁度又はそれと相関するパラメータを測定し、検出対象の量と濁度又は上記パラメータとの所定条件下における相関式に基づいて、検体中の検出対象の量を算出する。前半部分の手順は前述した検出方法と類似するので、説明を省略する。
上記所定条件と同一の条件における、検出対象の量と濁度又はそれと相関するパラメータとの相関式を作成する。この相関式を構成する検出対象の量と濁度又はパラメータとの測定は、データが多い程に信頼性の高い相関式が得られる。そこでデータは、2点以上の検出対象の量に関するものであればよく、3点以上の検出対象の量に関するものであることが好ましい。
混合物の濁度測定値を、作成した相関式に代入することによって、検体中の検出対象の量を算出できる。
第1の物質が微粒子状の磁性物質を含有する場合、本発明の検出方法又は定量方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含むことが好ましい。これによって、凝集した磁性物質が、非凝集状態の磁性物質を含む夾雑物から分離される。このため、分離した磁性物質の量、溶媒に分散した際の光透過率等の測定値は、夾雑物の影響が除外され、検出物質の存在をより忠実に反映したものとなる。
検体中の検出対象としては、臨床診断に利用される物質が挙げられ、具体的には、体液、尿、喀痰、糞便中等に含まれるヒトイムノグロブリンG、ヒトイムノグロブリンM、ヒトイムノグロブリンA、ヒトイムノグロブリンE、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン(フィブリン及びそれらの分解産物)、α−フェトプロテイン(AFP)、C反応性タンパク質(CRP)、ミオグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、ヒト胎盤性ラクトーゲン(HPL)、HIVウイルス抗原、アレルゲン、細菌毒素、細菌抗原、酵素、ホルモン(例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン(TSH)、インスリン等)、薬剤等が挙げられる。
本実施例では、第1の結合物として抗TSHβ抗体結合−温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を、第2の結合物として抗TSHα抗体結合ポリエチレングリコールを用いて、ヒト甲状腺刺激ホルモン(TSH)を検出する例を示す。
Leinco Technologies,Inc.製の抗ヒトTSHβ抗体(Anti−Human Thyroid Stimulating Hormone Beta、クローン:195マウス、クラス:マウスIgG)を、サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)製sulfo−NHS−Biotinylation kit(Cat No.21425)を用いてビオチン化し、ビオチン化抗ヒトTSHβ抗体を調製した。
まず、検出対象としてのヒト甲状腺刺激ホルモン(TSH)に対する第2の親和性物質としての抗ヒトTSHα抗体(Anti−Human Thyroid Stimulating Hormone Alpha、クローン:176マウス、マウスIgG、Leinco Technology,Inc.製、1mg/mL)1mLに2−メルカプトエタノール6mgを加え、37℃で120分間反応させた。反応後、Slide−A−Lyzer(商品名) 透析カセット、10K MWCO(Pierce)により、PBSバッファー500mLに対して透析を行って、過剰の2−メルカプトエタノールを除き、限界排除分子量10000の限外濾過膜(MILLIPORE社製[Amicon Ultra−4 Ultracel 10k])を用いて0.5mLに濃縮し、マウス抗ヒトTSHα抗体の還元抗体を得た。この還元抗体0.5mLと、100μLマレイミド化ポリエチレングリコール(「SUNBRIGHT ME−400MA」、日油社製)とを4℃で1晩反応させ、続いてSuperdex−200 10/300GL(GEヘルスケア社製)を用いてゲル濾過することで、標識抗体を調製した。この標識抗体(この抗体は、ポリエチレングリコール−抗ヒトTSHα抗体結合物ともいう。)を、0.5%(w/v)BSA(シグマ社製)、0.5%(w/v)Tween(登録商標)20、10mM EDTAを含有するPBSバッファー(pH7.4)でタンパク質濃度2.5μg/mLになるように希釈することで、第2の結合物を調製した。
固体粒子として、ポリスチレン系ラテックス粒子であるJSRライフサイエンス社製「Immutex P2312」(10%、平均粒子径0.495μm)を用い、この濃度が1%、0.5%になるよう、PBSバッファー(pH7.4)で希釈した。
TSH;Aspen Bio Pharma,Inc.製ヒト甲状腺刺激ホルモン(活性8.5IU/mg、WHO80/558)の溶液(濃度30μg/mL)を、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティクス社製「ビトロス(登録商標) TSH キャリブレータ1」で、0.0015μIU/L、15.300μIU/L、153.00μIU/Lとなるよう希釈した。なお、ヒト甲状腺刺激ホルモン活性を含有しない(0.0000μIU/L)ことを除き、同様の手順で調製したものも調製した。
図3に示されるように、汎用の分光光度計用セミミクロセル71の光路外に、寸法5mm×9mm×2mmのネオジム永久磁石73(西興産業社製)を取り付けた。このセル71を、セル温度制御機が設けられた可視紫外分光光度計「UV−3101PC」(島津製作所製)内に設置し、37℃のもと10分間以上保持した。
第1の結合物の分散溶液400μL及び第2の結合物の分散溶液400μLをマイクロチューブ内に注ぎ、ボルテックスミキサーで1秒間撹拌した。ここに、各試料90μLを添加し、ボルテックスミキサーで60秒間撹拌した後、固体粒子の分散液10μLを添加し、固体粒子濃度を0.00%(PBSバッファーのみ添加)、0.005%、0.01%にした。
この撹拌液をセル71内に分注し、分光光度計に添付の使用説明書に従ってゼロ補正し、波長420nmの光を用いて、直ちにスリット幅3.0nmで300秒間にわたって連続して測定した。この結果を図4に示す。
11 刺激応答性物質
13 第1の抗体(第1の親和性物質)
15 アビジン
17 ビオチン
19 磁性物質
20 第2の結合物
21 第2の物質
23 第2の抗体(第2の親和性物質)
30 固体粒子
50 検出対象
Claims (7)
- 検体中の検出対象を検出する方法であって、
刺激応答性物質を含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、水中で表面に疎水性部分を提示しかつ懸濁可能な固体粒子と、前記検体とを混合し、この混合物を前記刺激応答性物質が凝集する条件下におき、前記刺激応答性物質の分散又はそれと相関する事象の有無を判定する工程を含む方法。 - 検体中の検出対象を定量する方法であって、
刺激応答性物質を含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、水中で表面に疎水性部分を提示しかつ懸濁可能な固体粒子と、前記検体とを混合し、この混合物を前記刺激応答性物質が凝集する所定条件下におき、
前記混合物の濁度又はそれと相関するパラメータを測定し、前記検出対象の量と濁度又は前記パラメータとの前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含む方法。 - 親水性又は有電荷の部分を有する第2の物質と前記検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物を更に混合し、
第1の親和性物質と第2の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できる請求項1又は2記載の方法。 - 第1の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、前記条件においた後の前記混合物に磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む請求項1から3いずれか記載の方法。 - 請求項1から4いずれか記載の方法で用いられて、検出対象を検出及び/又は定量するためのキットであって、
刺激応答性物質を含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、水中で表面に疎水性部分を提示しかつ懸濁可能な固体粒子と、を備えるキット。 - 親水性又は有電荷の部分を有する第2の物質と前記検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物を更に備える請求項5記載のキット。
- 第1の物質が微粒子状の磁性物質を含有する請求項5又は6記載のキット。
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