检测对象的检测、定量用试剂盒及检测、定量方法
技术领域
本发明涉及检测对象的检测、定量用试剂盒及检测、定量方法。
背景技术
一直以来,作为检测被检体中的检测对象的方法,使用胶乳凝集法。所谓胶乳凝集法,是检测生物体样品等流体中的抗原时,通过混合流体、和担载有与抗原特异性结合的抗体或其片断的胶乳,测定胶乳的凝集程度,来检测或定量抗原的方法(例如,参照专利文献1)。
根据该胶乳凝集法,作为检验体添加的抗原使多个胶乳结合抗体交联,促进胶乳的凝集。这样,由于程序简单,因此能够简便且快速地检测抗原。然而,抗原微量时,不易发生该交联,因而胶乳不充分凝集。因此,难以检测微量的抗原。
为此,广泛采用ELISA法或CLEIA法这样的利用酶底物反应的方法。这些方法中,例如,使与抗原特异性结合的一次抗体与抗原结合,并使该一次抗体与具有酶的二次抗体结合。其中,通过添加酶底物,测定酶催化反应的程度,来检测或定量抗原。
根据这些方法,例如如果使用发光试剂作为底物,则底物添加后的发光检测灵敏度高,因此也能够检测微量的抗原。
专利文献1:特公昭58-11575号公报
发明内容
然而,在利用酶底物反应的方法中,必需要二次抗体、发光试剂、发光检测装置等特殊的试剂、仪器,作业成本高。
此外,如图10所示,该方法由对样品和各试剂进行孵育的工序(ST110、ST130)、洗净系统的工序(ST120)、测定发光的工序(ST140)等多个阶段构成,操作复杂。而且,各个阶段所需要的时间非常长,不适于大规模处理。
本发明是鉴于以上情况完成的,其课题之一是提供能够快速、廉价且简便地检测、定量检测对象的检测、定量用试剂盒以及检测、定量方法;进而,其课题之一是提供能够高灵敏度地进行检测、定量的检测、定量用试剂盒以及检测、定量方法。
本发明人等发现,如果接近具有电荷的化合物,则会阻碍刺激响应性聚合物的凝集,从而完成了本发明。具体而言,本发明提供如下的内容。
一种试剂盒,其特征在于,用于检测和/或定量检测对象,含有第1结合物和第2结合物,
第1结合物:含有刺激响应性聚合物的第1物质和对上述检测对象的第1亲和性物质相结合的结合物,
第2结合物:具有电荷的第2物质和对上述检测对象的第2亲和性物质相结合的结合物,
第1亲和性物质和第2亲和性物质能够在上述检测对象的不同部位同时与上述检测对象结合。
根据[1]所述的试剂盒,其特征在于,第1物质含有微粒状的磁性物质。
根据[1]或[2]所述的试剂盒,其特征在于,第2物质是亲水性的高分子化合物。
根据[1]~[3]中任一项所述的试剂盒,其特征在于,第2物质是聚阴离子或聚阳离子。
根据[4]所述的试剂盒,其特征在于,聚阴离子是核酸或聚丙烯酸。
根据[4]所述的试剂盒,其特征在于,聚阳离子是聚烷基胺或聚乙烯亚胺。
一种检测检验体中的检测对象的方法,其特征在于,
包括如下工序:将第1结合物、第2结合物和所述检验体混合,置于刺激响应性聚合物凝集的条件下,判断所述刺激响应性聚合物有无分散,所述第1结合物为含有刺激响应性聚合物的第1物质和对所述检测对象的第1亲和性物质相结合的结合物,所述第2结合物为具有电荷的第2物质和对所述检测对象的第2亲和性物质相结合的结合物,
第1亲和性物质和第2亲和性物质能够在所述检测对象的不同部位同时与所述检测对象结合。
根据[7]所述的方法,其特征在于,第1物质含有微粒状的磁性物质,所述方法还包括通过施加磁力将凝集的磁性物质分离的工序。
定量检验体中的检测对象的方法,其中,包括如下工序:
将第1结合物、第2结合物和所述检验体混合,并将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的条件下,所述第1结合物为含有刺激响应性聚合物的第1物质和对所述检测对象的第1亲和性物质相结合的结合物,所述第2结合物为具有电荷的第2物质和对所述检测对象的第2亲和性物质相结合的结合物,
测定所述混合物的浊度,基于所述检测对象的量与浊度在所述规定条件下的关系式,算出所述检验体中的检测对象的量。
根据[9]所述的方法,其特征在于,第1物质含有微粒状的磁性物质,所述方法还包括通过施加磁力将凝集的磁性物质分离的工序。
根据本发明,如果存在检测对象,则第1亲和性物质和第2亲和性物质与该结合对象结合,因此与第1亲和性物质结合的刺激响应性聚合物和、与第2亲和性物质结合的第2物质接近。由此,由于电荷部分配置在刺激响应性聚合物的附近,因此会阻碍对刺激进行响应的刺激响应性聚合物的凝集。因此,通过观察有无该凝集阻碍,就可以检测是否存在检测对象。此外,通过测定凝集阻碍的程度,就可以定量检测对象。
以上程序都是无需特别使用特殊的试剂、仪器就可以进行的,廉价且简便。此外,由于仅测定凝集阻碍程度,而不是利用被酶催化的反应的体系,因此可以快速地进行。此外,第2物质所具有的电荷部分高度阻碍刺激响应性聚合物的凝集,因此可以高灵敏度地检测、定量检测对象。
附图说明
图1:是本发明一种实施方式的试剂盒的构成示意图。
图2:是表示本发明一种实施方式的试剂盒使用状态的概要图。
图3:是表示本发明一实施例的方法中施加磁力方式的图。
图4:是本发明一实施例的方法的流程图。
图5:是表示本发明一实施例的方法中反应时间与浊度之间的相关性的曲线图。
图6:是表示本发明一实施例的方法中检测对象量与浊度之间的相关性的曲线图。
图7:是表示本发明一实施例的方法中检测对象量与浊度之间的相关性的曲线图。
图8:是表示本发明一实施例的方法中检测对象量与浊度之间的相关性的曲线图。
图9:是表示本发明另外的实施例的方法中反应时间与浊度之间的相关性的曲线图。
图10:是以往例的方法的流程图。
符号说明
10第1结合物
11刺激响应性聚合物
13第1抗体(第1亲和性物质)
19磁性物质
20第2结合物
21第2物质
23第2抗体(第2亲和性物质)
50检测对象
具体实施方式
以下,参照附图对本发明的一种实施方式进行说明。
<试剂盒>
本发明的试剂盒是用于检测和/或定量检测对象的试剂盒,含有第1结合物和第2结合物。对于各构成,以下进行详细说明。
[第1结合物]
第1结合物为含有刺激响应性聚合物的第1物质和对检测对象的第1亲和性物质相结合的结合物。
(第1物质)
本发明中使用的第1物质含有刺激响应性聚合物,该刺激响应性聚合物是对外部刺激进行响应而发生结构变化,从而能够调整凝集和分散的聚合物。刺激没有特别限定,可以是温度、光、酸、碱、pH、电等各种物理或化学信号。
特别是,在本发明中,刺激响应性聚合物优选为能够根据温度变化而凝集和分散的温度响应性聚合物。此外,刺激响应性聚合物优选即使与具有电荷的分子结合也不发生结构变化。应说明的是,作为温度响应性聚合物,可以列举具有最低临界溶液温度(以下也称为LCST)的聚合物、具有最高临界溶液温度的聚合物。
作为本发明中使用的具有最低临界溶液温度的聚合物,可以列举由N-正丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰基吡咯烷、N-丙烯酰基哌啶、N-丙烯酰基吗啉、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、N,N-二甲基甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰基吡咯烷、N-甲基丙烯酰基哌啶、N-甲基丙烯酰基吗啉等N取代(甲基)丙烯酰胺衍生物形成的聚合物;羟丙基纤维素、聚乙烯醇部分乙酰化物、聚乙烯基甲基醚、(聚氧乙烯-聚氧丙烯)嵌段共聚物、聚氧乙烯月桂基胺等聚氧乙烯烷基胺衍生物;聚氧乙烯脱水山梨醇月桂酸酯等聚氧乙烯脱水山梨醇酯衍生物;(聚氧乙烯壬基苯基醚)丙烯酸酯、(聚氧乙烯辛基苯基醚)甲基丙烯酸酯等(聚氧乙烯烷基苯基醚)(甲基)丙烯酸酯类;以及(聚氧乙烯月桂基醚)丙烯酸酯、(聚氧乙烯油烯基醚)甲基丙烯酸酯等(聚氧乙烯烷基醚)(甲基)丙烯酸酯类等聚氧乙烯(甲基)丙烯酸酯衍生物等。进而,也可以利用由这些聚合物以及由它们中的至少两种单体形成的共聚物。此外,还可以利用N-异丙基丙烯酰胺与N-叔丁基丙烯酰胺的共聚物。使用含有(甲基)丙烯酰胺衍生物的聚合物时,也可以在该聚合物中以具有最低临界溶液温度的范围共聚其他的能够共聚的单体。在本发明中,其中,可优选利用由选自N-正丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰基吡咯烷、N-丙烯酰基哌啶、N-丙烯酰基吗啉、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、N,N-二甲基甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰基吡咯烷、N-甲基丙烯酰基哌啶、N-甲基丙烯酰基吗啉中的至少一种单体形成的聚合物或N-异丙基丙烯酰胺与N-叔丁基丙烯酰胺的共聚物。
作为本发明中使用的具有最高临界溶液温度的聚合物,可以利用由选自丙烯酰基甘氨酸酰胺、丙烯酰基哌啶甲酰胺、丙烯酰基天冬酰胺以及丙烯酰基谷氨酸酰胺等中的至少一种单体形成的聚合物。此外,还可以是由这些至少两种单体形成的共聚物。这些聚合物中,可以以具有最高临界溶液温度的范围共聚丙烯酰胺、乙酰基丙烯酰胺、生物醇丙烯酸酯(biotinolacrylate)、N-生物素基-N’-甲基丙烯酰基三亚甲基酰胺、丙烯酰基肌氨酸酰胺、甲基丙烯基肌氨酸酰胺、丙烯酰基甲基尿嘧啶等、其他的能够共聚的单体。
(微粒状的磁性物质)
在此使用的微粒状的磁性物质,可以由多元醇和磁铁矿构成。该多元醇只要是在构成单元中至少具有2个羟基且能够与铁离子结合的醇结构体就没有特别限定,例如可以列举葡聚糖、聚乙烯醇、甘露醇、山梨糖醇、环糊精。例如在特开2005-82538公报中,公开了使用葡聚糖的微粒状磁性物质的制造方法。此外,还可以使用如甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物那样具有环氧基、且开环后形成多元醇结构体的化合物。使用这样的多元醇制备成的微粒状磁性物质(磁性微粒),优选其平均粒径在0.9nm以上且小于1000nm,以便具有良好的分散性。为了提高作为目的的检测对象的检测灵敏度,特别优选平均粒径在2.9nm以上且小于200nm。
〔第2结合物〕
第2结合物为具有电荷的第2物质和对检测对象的第2亲和性物质相结合的结合物。
(第2物质)
具有电荷的第2物质例如是亲水性的高分子化合物,优选为聚阴离子或聚阳离子。聚阴离子是指具有多个阴离子基的物质,聚阳离子是指具有多个阳离子基的物质。作为聚阴离子的例子,可以列举DNA和RNA等核酸。这些核酸由于沿着核酸骨架存在多个磷酸二酯基,因此具有聚阴离子的性质。此外,聚阴离子也包括含有多个羧酸官能团的多肽(由谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸形成的多肽)、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、以及含有丙烯酸、甲基丙烯酸作为聚合成分的聚合物、羧甲基纤维素、透明质酸、以及肝素等多糖等。另一方面,作为聚阳离子的例子,可以列举聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、聚烷基胺、聚乙烯亚胺、聚丙基乙烯亚胺等。另外,聚阴离子(羧基)、聚阳离子(氨基)的官能团数优选25个以上。
(第1亲和性物质、第2亲和性物质)
第1结合物的第1亲和性物质、以及第2结合物的第2亲和性物质,在检测对象的不同部位能够同时与检测对象结合。第1亲和性物质和第2亲和性物质,例如可以是识别检测对象的不同抗原确定基的单克隆抗体。
在此使用的抗体,可以是任意类型的免疫球蛋白分子,也可以是Fab等具有抗原结合部位的免疫球蛋白分子片断。此外,抗体可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体,优选具有不同的抗原识别部位的两种类的单克隆抗体。
〔制作方法〕
说明以上的试剂盒的制作方法。
[第1结合物的制作]
第1结合物通过将第1物质和第1亲和性物质结合来制作。该结合方法没有特别限定,例如在第1物质侧(例如刺激响应性聚合物部分)和第1亲和性物质(例如第1抗体)侧的双方,结合相互具有亲和性的物质(例如抗生物素蛋白和生物素、谷胱甘肽和谷胱甘肽S转移酶),通过这些物质使第1物质和第1亲和性物质结合。
具体而言,生物素向刺激响应性聚合物的结合,如国际公开第01/09141号小册子所记载,可以通过使生物素等与甲基丙烯基、丙烯基等聚合性官能团结合而形成加成聚合性单体,并与其他单体共聚来进行。此外,抗生物素蛋白等向第1亲和性物质的结合可以依照常法进行。接着,混合生物素结合刺激响应性聚合物和抗生物素蛋白结合第1亲和性物质,则通过抗生物素蛋白和生物素的结合,第1亲和性物质和刺激响应性聚合物结合。
作为另外的方法,可以利用在聚合物聚合时使具有羧酸、氨基或环氧基等官能团的单体与其他单体共聚,通过该官能团,根据本技术领域中周知的方法使抗体亲和性物质(例如、Melongel(メロンゲル)、A蛋白、G蛋白)与聚合物结合的方法。通过使如此得到的抗体亲和性物质与第1抗体结合,制作刺激响应性聚合物与对检测对象抗原的第1抗体的第1结合物。
或者,可以在聚合物聚合时使具有羧酸、氨基或环氧基等官能团的单体与其他单体共聚,依照常法使对检测对象抗原的第1抗体与这些官能团直接结合。
或者,可以使第1亲和性物质和刺激响应性聚合物与微粒状的磁性物质结合。
也可以将第1物质置于刺激响应性聚合物凝集的条件之后,通过离心分离进行分离,由此精制第1结合物。第1结合物的精制可以通过如下方法进行,即,使微粒状的磁性物质与刺激响应性聚合物结合,进而使其与第1亲和性物质结合后,施加磁力将磁性物质回收。
微粒状的磁性物质与刺激响应性聚合物的结合可以采用本技术领域中周知的方法进行,即,通过反应性官能团进行结合的方法;在磁性物质中的多元醇上的活性氢或多元醇中导入聚合性不饱和键而进行接枝聚合的方法等(例如、参照ADV.Polym.Sci.、Vol.4、p111、1965;J.PolymerSci.、Part-A、3、p1031、1965)。
接着,对使具有电荷的第2物质和对检测对象抗原的第2抗体结合来制作第2结合物的方法进行描述。
[第2结合物的制作]
第2结合物通过将第2物质和第2亲和性物质直接或间接结合来制作。没有特别限定,例如,在第2物质侧和第2亲和性物质(例如第2抗体)侧的双方,结合相互具有亲和性的物质(例如抗生物素蛋白和生物素、谷胱甘肽和谷胱甘肽S转移酶),通过这些物质使第2物质和第2亲和性物质间接结合。
使第2物质和第2亲和性物质直接结合时,可以通过官能团使其结合,例如,使用官能团时,可以依照Ghosh等人的方法(Ghoshetal:BioconjugateChem.、1、71-76、1990)的马来酰亚胺-硫醇偶联来结合。具体可以列举以下两种方法。
在第1方法中,首先,在核酸的5’末端导入巯基(别名:巯基),另一方面,使6-马来酰亚胺基己酸琥珀酰亚胺酯(例如“EMCS(商品名)”(同仁化学研究所社制))与抗体反应而导入马来酰亚胺基。接着,将这两种物质通过巯基和马来酰亚胺基结合。
在第2方法中,首先,与第1方法同样地在核酸的5’末端导入巯基,在该巯基进一步与作为均二官能性试剂的N,N-1,2-亚苯基二马来酰亚胺反应,由此在核酸的5’末端导入马来酰亚胺基,另一方面,在抗体中导入巯基。接着,将这两种物质通过巯基和马来酰亚胺基而结合。
此外,作为将核酸导入到蛋白质中的方法,已知例如在NucleicAcidsResearch第15卷5275页(1987年)和NucleicAcidsResearch第16卷3671页(1988年)中记载的方法。这些技术可以应用于核酸与抗体的结合。
根据NucleicAcidsResearch第16卷3671页(1988年),首先,通过使寡核苷酸与胱胺、碳二亚胺和1-甲基咪唑反应,由此在寡核苷酸的5’末端的羟基中导入巯基。将导入有巯基的寡核苷酸精制后,使用二硫苏糖醇进行还原,然后加入2,2’-二吡啶基二硫醚,由此在寡核苷酸的5’末端通过二硫键导入吡啶基。另一方面,对于蛋白质,事先使其与亚氨基四氢噻吩反应而导入巯基。将这些导入有吡啶基二硫醚基的寡核苷酸和导入有巯基的蛋白质混合,使吡啶基和巯基特异性地反应,从而使蛋白质和寡核苷酸结合。
根据NulcleicAcidsReseach第15卷5275页(1987年),首先,事先在寡核苷酸的3’末端导入氨基,并使其与作为均二官能性试剂的二硫-双-丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(简称:二硫-双-丙酰基-NHS)反应。反应后,通过添加二硫苏糖醇将二硫-双-丙酰基-NHS分子中的二硫醚键还原,并在寡核苷酸的3’末端导入巯基。对于蛋白质的处理,使用如特开平5-48100号公报所示那样的杂二官能性交联剂。首先,通过使蛋白质与具有能够与蛋白质中的官能团(例如氨基)反应的第1反应性基团(琥珀酰亚胺基)、和能够与巯基反应的第2反应性基团(例如马来酰亚胺基等)的杂二官能性交联剂反应,由此在蛋白质中导入第2反应性基团,制成预活化的蛋白试剂。将如此得到的蛋白试剂与硫醇化聚核苷酸的巯基共价结合。
使用核酸以外的聚阴离子或聚阳离子时,可以通过在它们的末端等导入巯基,用与上述同样的操作制作第2结合物。
如此制造的试剂盒例如可以通过以下的方法用于检测和/或定量检测对象。
<检测方法>
本发明的检测方法包括如下工序:首先将第1结合物、第2结合物和检验体混合,并置于刺激响应性聚合物凝集的条件下,判断刺激响应性聚合物有无分散。以下详细说明程序。
(混合、凝集)
首先,在容器内将第1结合物和第2结合物混合,进而添加检验体,得到混合物。接着,将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的条件下。这样,检测对象存在时,刺激响应性聚合物通过第2结合物中的电荷发生凝集阻碍而分散,另一方面,检测对象不存在时,刺激响应性聚合物没有凝集阻碍地发生凝集。
参照图1~图2说明该现象。
如图1所示,第1结合物10含有刺激响应性聚合物11,该刺激响应性聚合物11通过抗生物素蛋白15和生物素17与对检测对象50的第1抗体13结合。此外,第1结合物10含有微粒状的磁性物质19,在该磁性物质19的表面结合有刺激响应性聚合物11。另一方面,第2结合物20含有具有负电荷的第2物质21,该第2物质21与对检测对象50的第2抗体23结合。第1抗体13和第2抗体23能够在检测对象50的不同部位同时与检测对象50结合。
如图2所示,如果将第1结合物10、第2结合物20和检验体的混合物置于规定条件下,则检测对象50存在时,刺激响应性聚合物11通过第2结合物20中的电荷发生凝集阻碍而分散(图2(A)),另一方面,检测对象50不存在时,刺激响应性聚合物11没有凝集阻碍地发生凝集(图2(B))。
为了使刺激响应性聚合物凝集,例如使用温度响应性聚合物时,将装有混合液的容器转移到温度响应性聚合物凝集的温度的恒温槽即可。此外,使用pH响应性聚合物时,在装有混合液的容器中加入酸溶液或碱溶液即可。使用光响应性聚合物时,对装有混合液的容器照射能够凝集聚合物的波长的光即可。
另外,温度响应性聚合物的凝集可以在第1结合物和第2结合物与检测对象结合前进行,也可以同时并列进行,在能够缩短处理时间方面考虑,优选后者。但是,温度响应性聚合物凝集的条件,与第1结合物和第2结合物与检测对象结合的条件大为不同时,优选前者。
其中,最低临界溶液温度和最高临界溶液温度例如以下所示地确定。首先,将样品装入吸光光度计的比色池中,以1℃/分钟的速度将样品升温。其间,记录550nm处的透过率变化。其中,将聚合物溶解至透明时的透过率作为100%、将完全凝集时的透过率作为0%时,求出透过率达到50%时的温度,作为LCST。
(判定)
有无分散的判定例如可以通过目测或浊度测定来进行。浊度可以由光散射装置测得的光透过率算出,如果浊度低则刺激响应性聚合物的凝集被阻碍,暗示检测物质的存在。其中,使用的光的波长可以根据磁性物质的粒径等适当设定,以便得到所需的检测灵敏度。从可以利用以往通用的装置方面考虑,光的波长优选为可见光的范围内(例如550nm)。
目测或浊度测定可以在一定时刻断续地进行,也可以经时地连续进行。此外,也可以基于某时刻的浊度测定值与其他时刻的浊度测定值之差来进行判定。
<定量方法>
根据本发明的定量方法,首先,将第1结合物、第2结合物和检验体混合,并将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的规定条件下,接着,测定混合物的浊度,基于检测对象的量与浊度在规定条件下的关系式,算出检验体中的检测对象的量。前半部分的程序与前述的检测方法类似,因此省略说明。
(关系式)
制作与上述规定条件相同条件下的、检测对象的量与浊度的关系式。构成该关系式的检测对象的量与浊度的测定,其数据越多则得到可靠性越高的关系式。于是,数据只要涉及2个以上检测对象的量即可,优选涉及3个以上检测对象的量。
其中,检测对象的量与浊度的关系式,不仅是表示检测对象的量与浊度的直接相关的式子,而且还可以是检测对象的量与反映浊度的参数之间的关系式。
(计算)
将混合物的浊度测定值代入制作好的关系式中,由此可以算出检验体中的检测对象的量。
(分离)
第1物质含有微粒状的磁性物质时,本发明的检测方法或定量方法优选进一步含有通过施加磁力而将凝集的磁性物质分离的工序。由此,凝集的磁性物质从含有非凝集状态的磁性物质的夹杂物中分离出来。因此,分离的磁性物质的量、分散于溶剂时的光透过率等的测定值,排除了夹杂物的影响,更忠实地反映检测物质的存在。
磁力的施加可以使磁性物质接近嗞石来进行。该磁石的磁力根据使用的磁性物质所具有的磁力大小而不同。作为磁石,可以列举例如MAGNA公司制钕磁石。
此外,磁力的施加可以在判定前或与判定同时并列地进行,从可以缩短工序所耗费的时间方面考虑,优选同时进行。另外,如果施加磁力,则由于凝集的磁性物质以卷入夹杂物的方式被分离,因此推测分离后的混合物的浊度在夹杂物存在时反而变小。
另外,检测方法或定量方法中的“浊度测定”,不仅包括直接测定浊度,还包括测定反映浊度的参数。作为所述参数,可以列举在多个时刻的浊度测定值的差异、所分离的凝集物量、分离后的非凝集物的浊度等。其中,多个时刻中的1点,例如,在检测对象不存在的阴性对照中施加磁力时,优选为浊度达到最大值的时刻附近。由此,与在另外时刻的浊度测定值之间的差异增大,可以更正确地定量检测对象的量。
(检测对象)
作为检验体中的检测对象,可以列举用于临床诊断的物质,具体可以列举体液、尿、吐的痰、粪便中等含有的人免疫球蛋白G、人免疫球蛋白M、人免疫球蛋白A、人免疫球蛋白E、人白蛋白、人纤维蛋白原(纤维蛋白及其分解产物)、α-甲胎蛋白(AFP)、C反应性蛋白(CRP)、肌红蛋白、癌胎儿性抗原、肝炎病毒抗原、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、人胎盘性催乳素(HPL)、HIV病毒抗原、变态反应原、细菌毒素、细菌抗原、酶、激素(例如人甲状腺刺激激素(TSH)、胰岛素等)、药剂等。
[试剂盒的构成及其使用方法的例子]
以下,对于检测对象为抗原的情况,说明用于利用本发明方法的试剂盒的构成及其使用方法的例子。
试剂盒例如由以下的试剂构成。
抗原检测用试剂盒:
试剂A:微粒状的磁性物质和与检测对象的抗原特异性地结合的第1抗体相结合的温度响应性聚合物
试剂B:识别与第1抗体不同的部位,并能够与检测对象的抗原同时结合的第2抗体相结合的、具有电荷的化合物
试剂C:被测定物质的标准品(作为具体例,可以列举精制抗原)。
试剂D:稀释用缓冲液(是用于稀释上述试剂、并且能够用于稀释被测定样品的缓冲液,可以列举TRIS盐酸缓冲液、磷酸缓冲液等)
此外,作为测定浊度的装置,可以使用能够将容器内保持在聚合物凝集的温度、能够照射200nm~900nm的透过光的以往周知的装置。
由上述试剂构成的试剂盒,例如可以按以下方法使用。
首先,将5~1000μL的试剂A和5~1000μL的试剂B混合。准备在装有试剂A和试剂B的溶液中:(1)添加被测定物质的标准品而成的阳性对照、(2)什么都不添加的阴性对照、(3)添加被检液5~1000μL的样品,以聚合物分散的温度(例如约0~30℃)使其反应一定时间。使用温度响应性聚合物时,反应后,向保持在该聚合物的凝集温度(例如42℃)的容器中加入反应液,照射550nm的透过光,测定浊度,进行有无抗原的判定或抗原的定量。
作为与上述不同的使用方法,可以使试剂A与上述(1)、(2)、和(3)以聚合物分散的温度反应一定时间后,添加试剂B,反应一定时间后,向保持在凝集温度的容器中加入反应液,照射550nm的透过光,测定浊度,进行有无抗原的判定或抗原的定量。
实施例
<实施例1>
[试剂盒的制作]
(第1结合物的制备)
首先,将作为对检测对象即人甲状腺刺激激素(TSH)的第1亲和性物质的抗体(克隆:195小鼠、小鼠IgG、LeincoTechnology,Inc.制),通过以往周知的sulfo-NHS-Biotin法(AsahiTechnoGlass公司)进行生物素化,制备生物素标记抗TSHβ抗体。
另一方面,取结合有链霉抗生物素蛋白的微粒状磁性物质即Magnabeat公司制的Therma-MaxLSAStreptavidin(0.4质量%)250μL到1.5mL微管中,将该微管加热到42℃,使Therma-MaxLSAStreptavidin凝集,用磁石回收后,除去上清。向其中加入TBS缓冲液(20mMTris-HCl、150mMNaCl、pH7.5)250μL,进行冷却从而使凝集物分散。向该分散液中加入溶解于PBS缓冲液(0.01M磷酸缓冲液、0.0027M氯化钾、0.137M氯化钠、pH7.4)中的生物素标记抗TSHβ抗体50μL(0.75mg/mL),在室温下颠倒混合15分钟。将微管加热到42℃使Therma-MaxLSAStreptavidin凝集,用磁石回收后,除去上清部分,将剩余的生物素标记抗TSHβ抗体分离(B/F分离)。向其中加入TBS缓冲液250μL,进行冷却从而使凝集物分散。接着,添加过量的生物素,将链霉抗生物素蛋白的生物素结合部位被覆后,将剩余的生物素分离(B/F分离)。进而,使其分散于含有0.5%(w/v)BSA(SIGMA公司制)、0.5%(w/v)Tween(注册商标)20、10mMEDTA的PBS缓冲液(pH7.4)溶液中,由此制备第1结合物。
(第2结合物的制备)
首先,在作为对检测对象即人甲状腺刺激激素(TSH)的第2亲和性物质的抗体(克隆:176小鼠、小鼠IgG、LeincoTechnology,Inc.制、1mg/mL)1mL中加入2-巯基乙醇6mg,在37℃反应120分钟。反应后,通过Slide-A-Lyzer(商品名)透析盒、10KMWCO(Pierce)对PBS缓冲液500mL进行透析,除去过剩的2-巯基乙醇,使用截留分子量为10000的超滤膜(MILLIPORE公司制[AmiconUltra-4Ultracel10k])浓缩到0.5mL,得到小鼠抗TSHα抗体的还原抗体。将该还原抗体0.5mL和100μL马来酰亚胺化聚丙烯酸钠(将33mg溶解于PBS缓冲液1mL中而成)在4℃反应1晚,接着,使用Superdex-20010/300GL(GEHealthcare公司制)进行凝胶过滤,由此制作标记抗体。将该标记抗体(该抗体也称为聚丙烯酸抗TSHα抗体结合物)用0.5%(w/v)BSA(SIGMA公司制)、0.5%(w/v)Tween(注册商标)20/PBS(pH7.4)、10mMEDTA的水溶液稀释到蛋白质浓度为4μg/mL,由此制备第2结合物。
另外,上述马来酰亚胺化聚丙烯酸钠如下制备。
首先,在带有氮气导入管、温度计和搅拌装置的100mL三颈瓶内,将丙烯酸(和光纯药工业社制)2g、2-氨基乙硫醇(和光纯药工业社制)0.021g和偶氮双异丁腈(和光纯药工业社制)0.023g溶解于N,N-二甲基甲酰胺50mL中,进行氮置换1小时。然后,在70℃进行聚合反应7小时。将得到的反应液减压浓缩到10mL,用二乙基醚进行再沉淀,直到粘稠状物形成粉状。将白色沉淀过滤,进而用真空干躁机干躁1晚,由此得到氨基末端聚丙烯酸(产量1.5g)。接着将氨基末端聚丙烯酸进行马来酰亚胺化。在带有氮气导入管和搅拌装置的50mL梨形瓶中加入氨基末端聚丙烯酸0.5g和N,N-二甲基甲酰胺10mL并进行溶解。向其中加入EMCS(N-(6-马来酰亚胺己酰氧)琥珀酰亚胺)(同仁化学研究所社制)3mg,反应一晚。将得到的反应液减压浓缩到1mL,用二乙基醚进行再沉淀,直到粘稠物形成粉状。将白色沉淀过滤,进而用真空干躁机干躁1晚,得到马来酰亚胺基末端聚丙烯酸。分子量约为130000(TOSOH公司制、TSKgelSuperAW3000、6mmID.×150mm、流动相0.1M硝酸钠),产量为0.4g。
(样品的制备)
将人甲状腺刺激激素(TSH;AspenBioPharma,Inc.制、活性8.5IU/mg、WHO80/558)溶解于PBS缓冲液(pH7.4)中,使得浓度为30μg/mL。将该溶液用VITROSTSHCalibrator1(TSH:0mIU/L、OrthoClinicalDiagnostics公司制)分别稀释到0.06mIU/L、0.0012mIU/L,作为样品。
[定量]
如图3所示,在以往通用的分光光度计用SEMIMICROCELL71的光路外,安装尺寸5mm×9mm×2mm的钕永久磁石73(西兴产业社制)。将该比色池71设置在设有比色池温度控制机的可见紫外分光光度计UV-3101PC(岛津制作所制)内,在37℃下保持10分钟以上。
图4是表示实施例的定量方法程序的流程图。定量方法包括:将上述的第1结合物、第2结合物和样品混合的工程(ST10),以及测定混合物浊度的工程(ST20)。
(混合)
将第1结合物150μL和第2结合物120μL注入到微管内,用涡旋混合机搅拌1秒。向该微管内添加各样品750μL,再用涡旋混合机搅拌60秒。
(关系式的制作)
将该搅拌液分注到比色池71内,根据添附的使用说明书对分光光度计进行零校正,用波长420nm的光,直接以缝宽10mm连续测定1200秒。将其结果示于图5。
如图5所示,可知直到约600秒,TSH的量越高则浊度越低。这是由于,将TSH靠近中心地配置,因此刺激响应性聚合物通过第2结合物的电荷发生凝集阻碍而分散。另一方面,从约600秒附近开始,TSH的量与浊度的关系开始倒转,随着时间的经过浊度比初期值还低。这被推测为,是由于凝集的磁性物质被吸附到磁石而分离。
接着,显示各样品在0秒、600秒、1000秒这3点的测定值的差异。将其结果示于图6~图8。
如图6~图8所示,0秒、600秒、1000秒中的2点测定值之间的差异都依赖于TSH的量。尤其是在600秒的测定值与在1000秒的测定值之间的差异最大,可以最高灵敏度地进行检测或定量。由此确认,阴性对照(即TSH量为零)施加磁力时,优选选择浊度达到最大值的时刻附近(600秒)作为测定时刻之一。
[再现性评价]
将上述的第1结合物、第2结合物和样品保存在4℃的暗室内,1天1次连续3天用同样的程序进行浊度测定。将其结果示于表1。
[表1]
如表1所示,在3天的任一时刻,CV(变动系数)都为5.8以下的低值。由此确认,只要是实施例的体系就可以获得高再现性。
<实施例2>
除了在分光光度计用SEMIMICROCELL71的光路外不安装钕永久磁石73(西兴产业社制)之外,用与实施例1同样的程序,测定TSH量为零的样品的浊度。将其结果与实施例1的TSH量为零的样品的浊度一并示于图9。
如图9所示,直到约600秒,实施例1和2的浊度大致相等,实施例2的浊度在约600秒以后达到饱和。其结果是,在直到约600秒的时间内,即使不施加磁力也能够以一定高灵敏度进行检测或定量,以更高灵敏度进行检测或定量时,暗示应利用施加磁力后在约600秒的测定值与在其后的时刻的测定值之间的差异。
[比较例]
对于上述样品,用各种体系测定TSH量。由其结果推定的各体系的检测限值示于表2。
[表2]
如表2所示,在以往的体系中,检测限值为0.0025~0.005mIU/L。由此确认,在0.0012mIU/L也能检测的实施例,与以往的体系相比,检测灵敏度格外的高。
并且,由于在任何时刻都依赖于TSH的量,浊度存在差异,因此可以在检验体中的TSH检测中使用。1000秒以内的检测时间与耗费约38分钟的以往技术(参照图10)相比,非常短。此外,对实际的检验体仅进行以上的ST10和ST20的操作,就能够检测或定量检测物质,因此程序简便。
也就是说,本发明是不利用酶底物反应地测定浊度的体系,因此程序简便的同时,与以往的体系相比具有格外高的检测灵敏度,而且显示出具有能够在短时间内完成检测、定量的划时代的效果。
<实施例3>
(含有生物素的聚(N-异丙基丙烯酰胺)的合成)
在带有氮气导入管、温度计和搅拌装置的200mL三颈瓶内,将N-异丙基丙烯酰胺13.6g、生物素单体〔N-生物素基-N’-甲基丙烯酰基三亚甲基酰胺〕0.42g、2-氨基乙硫醇(和光纯药工业社制)0.2g和偶氮双异丁腈0.2g溶解于甲醇100mL中,进行氮置换30分钟。然后,在70℃下进行聚合反应7小时。将得到的反应液减压浓缩,将得到的固体溶于丙酮,用二乙基醚进行再沉淀。将白色沉淀过滤,进而用真空干躁机干躁1晚,由此得到含有生物素的聚(N-异丙基丙烯酰胺)11.84g。得到的含有生物素的聚(N-异丙基丙烯酰胺)的分子量约为29000(ShodexGPCLF-804、8mmID.×300mm、流动相THF)。
另外,生物素单体〔N-生物素基-N’-甲基丙烯酰基三亚甲基酰胺〕的制备使用特开2005-82538号公报中记载的方法,如下进行。
将N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐18g、生物素24g和三乙基胺30g溶解于300ml的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,冷却到0℃。用1小时向该混合物中滴加将二苯基磷酰叠氮化物28g溶解于50ml的DMF中而成的溶液。滴加结束后,在0℃搅拌3小时,进而在室温(20℃)搅拌12小时。然后,在减压下,馏去溶剂,使用氯仿-甲醇混合溶剂,用柱色谱法精制,得到N-生物素基-N’-甲基丙烯酰基三亚甲基酰胺。
(链霉抗生物素蛋白结合N-异丙基丙烯酰胺的制备)
将含有生物素的聚(N-异丙基丙烯酰胺)100mg溶解于TBS缓冲液10mL中,制成0.1%(w/v)。在0.1%(w/v)的含有生物素的聚(N-异丙基丙烯酰胺)3mL中,添加以浓度为10mg/mL的方式溶解于精制水(用MILLIPORE公司制Direct-Q(商品名)精制的水)中而得的链霉抗生物素蛋白(和光纯药工业社制)15μL,在冰上静置30分钟使其反应,由此得到链霉抗生物素蛋白结合聚(N-异丙基丙烯酰胺)的TBS溶液。
(小鼠抗TSHα抗体结合聚(N-异丙基丙烯酰胺)的制备)
在链霉抗生物素蛋白结合聚(N-异丙基丙烯酰胺)的TBS溶液625μL中,添加100μL生物素标记小鼠抗TSHα抗体(将从COSMOBIO公司(商品号T103)购买的小鼠抗TSHα抗体(LeincoTechnology,Inc.制)用sulfo-NHS-Biotin法(AsahiTechnoGlass公司)进行生物素化而得),在冰上静置30分钟使其反应,得到小鼠抗TSHα抗体结合聚(N-异丙基丙烯酰胺)的TBS溶液。
(聚丙烯酸抗TSHβ抗体结合物的制备)
除了使用小鼠抗TSHβ抗体来代替小鼠抗TSHα抗体之外,用与实施例2同样的程序制备聚丙烯酸抗TSHβ抗体结合物。
(利用抗TSHα抗体结合聚(N-异丙基丙烯酰胺)-聚丙烯酸抗TSHβ抗体结合物的TSH检测)
准备装有小鼠抗TSHα抗体结合聚(N-异丙基丙烯酰胺)TBS溶液25μL的1.5mL管4根(a、b、c和d)。向各管中添加VITROSTSHCalibrator1(OrthoClinicalDiagnostics公司制、商品号065002)5μL和各浓度TSH的TBS溶液10μL(a的TSH浓度为0、b的TSH浓度为0.001μg/μL、c的TSH浓度为0.01μg/μL、d的TSH浓度为0.1μg/μL)的混合物,进而加入TBS缓冲液165μL,在冰上静置5分钟。然后,向各管中添加聚丙烯酸抗TSHβ抗体结合物5μL,将在冰上静置30分钟后的物质作为测定样品。
在恒温槽中将分光光度计UVmini(岛津制作所社制)的比色池支架保持在31.5℃。将没有装入样品的石英比色池(QS,Hella,光路长10mm)置于比色池支架,静置5分钟。然后,在石英比色池内添加管a中的测定样品200μL,6分钟后测定吸光度。对于管b~d中的样品,也用同样程序测定吸光度。吸光度的结果是,a为0.216、b为0.199、c为0.176、d为0.168。
由以上结果可知,吸光度随着TSH的浓度而变化,换言之,通过测定吸光度就可以定量TSH的浓度。也就是说,确认本发明的方法是无需二次抗体、发光试剂、发光检测装置等特殊的试剂、仪器,就能够快速、廉价并简便地检测、定量检测对象的新方法。