JP6080163B2 - 標的物質の検出方法 - Google Patents
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Description
そこで本発明は、熱応答性磁性粒子を利用した標的物質の検出において、高い検出感度を実現することができる標的物質の検出方法の提供を目的とする。
〔1〕下記の標識粒子を検体を含む試験液に含有させ、加熱した後に、励起光を照射し、前記標識粒子の発光の状態により上記検体に含まれる標的物質を検出する方法であって、
前記加熱により前記標識粒子が凝集して前記試験液中でこの凝集体が局部的に集合し、集合した凝集体による蛍光発光が発現した場合に標的物質の不存在を同定し、
前記加熱によっても前記標識粒子が凝集せず、集合した凝集体による蛍光発光が発現しない場合に標的物質の存在を同定する、標的物質の検出方法。
[標識粒子:磁性材料を有する相と、該磁性材料を有する相を被覆してなる、シリカを含む透明材料からなる連続相と蛍光材料からなる分散相とで構成された蛍光材料を有する相と、該蛍光材料を有する相に固定化された熱応答性ポリマーと、該熱応答性ポリマーに固定化された、前記標的物質に対して結合性を有する結合性物質とを有する]
〔2〕前記結合性物質が抗体である〔1〕に記載の標的物質の検出方法。
〔3〕前記の磁性材料を有する相が前記標識粒子のコアをなし、該コアを被覆する形態で前記の蛍光材料を有する相が配された〔1〕又は〔2〕に記載の標的物質の検出方法。
〔4〕前記試験液に分散剤を導入する〔1〕〜〔3〕のいずれか1項に記載の標的物質の検出方法。
〔5〕前記励起光の波長が300〜700nmで、前記蛍光の波長が350〜800nmである〔1〕〜〔4〕のいずれか1項に記載の標的物質の検出方法。
〔6〕10℃〜100℃の範囲にある上記熱応答性ポリマーの臨界溶液温度(CST)を跨ぐよう前記試験液の加熱を行なう〔1〕〜〔5〕のいずれか1項に記載の標的物質の検出方法。
〔7〕前記試験液に磁力を付与し、凝集状態にある前記標識粒子を磁力が付与された箇所に集合させる〔1〕〜〔6〕のいずれか1項に記載の標的物質の検出方法。
〔8〕前記の磁性材料を有する相と、該磁性材料を有する相を被覆してなる、前記のシリカを含む透明材料からなる連続相と蛍光材料からなる分散相とで構成された蛍光材料を有する相とからなる複合粒子の平均粒径が1μm未満である〔1〕〜〔7〕のいずれか1項に記載の標的物質の検出方法。
〔9〕前記磁性材料が、マグネタイト、酸化ニッケル、フェライト、コバルト鉄酸化物、バリウムフェライト、炭素鋼、タングステン鋼、KS鋼、希土類コバルト磁石、またはヘマタイトである〔1〕〜〔8〕のいずれか1項に記載の標的物質の検出方法。
本明細書において、「粒子の表面に有する」とは、表面に直接接触するかたちで存在していることのほか、別の材料を介在してその表面外方に存在していることを含む意味である。
図1は、本発明に係る標的物質の検出方法の例を示した説明図である。本実施形態の検出方法においては、蛍光標識粒子20、分散剤30、および標的物質Sを含む検体を混合する。次いで、熱応答性ポリマーが凝集する条件下において、熱応答性ポリマーの分散の有無を判定する。このとき、励起光を検体に照射し、その蛍光発光により検出する。
つまり、本実施形態においては、前記試験液中で局部的に集合した標識粒子の蛍光発光の発現により標的物質の不存在を同定し、前記集合した蛍光発光が発現しないことにより標的物質の存在を同定する。
前記蛍光の波長は350nm以上であることが好ましく、450nm以上であることがより好ましく、530nm以上であることが特に好ましい。上限としては、800nm以下であることが好ましく、750nm以下であることがより好ましく、580nm以下であることが特に好ましい。この範囲とすることにより、目視での観察や汎用された検出器での検出がしやすくなり好ましい。
以下では、上記の優れた効果をもたらす蛍光標識粒子について、さらに詳細に説明する。なお、図示した形態は理解の便宜から各材料を模式化ないし誇張して示したものであり、これらの図に示された形態により本発明が限定して解釈されるものではない。
分散剤の濃度は特に限定されないが、0.01質量%以上であることがより好ましく、0.1質量%以上であることがより好ましい。上限は特にないが、5質量%以下であることが実際的である。標識粒子の濃度は特に限定されないが、0.01質量%以上であることがより好ましく、0.1質量%以上であることがより好ましい。上限は特にないが、5質量%以下であることが実際的である。
試験温度は特に限定されないが、25℃以上45℃以下で行うことが実際的である。
このようなことも考慮し、蛍光検出は前記加熱開始後から測定を開始しその後蛍光強度の経時変化を追跡することが好ましく、600秒以上経過した時点で最小となる蛍光強度と加熱開始後に得られる最大の蛍光強度との差分で凝集特性を評価することで高い再現性と高感度を得ることができる。
図2は、本発明に係る標識粒子を構成する熱応答性蛍光粒子10を模式化して示した側面図である。本実施形態において、複合粒子11は、コアをなす磁性材料相(磁性材料粒子)1の表面を、シェルをなす透明材料相(蛍光シリカ相)2が被覆した形態を有する。そして、その複合粒子11の表面に熱応答性ポリマー3が配置されている。本実施形態においては、このようにコア/シェル型の複合粒子を例示したが、本発明はこれに限定されない。例えば、海島状になった形態や、不定形に混ざり合った状態であってもよい。ただし、そのときにも、蛍光を外部から検出できるよう、蛍光材料相2の少なくとも一部は複合粒子の表面に露出していることが好ましく、粒子表面の過半が蛍光材料相で構成されていることがより好ましい。したがって、海島状の形態としては、磁性材料相が島部を構成し、蛍光材料相が海部を構成した形態が好ましい。類似の形態としては、前記磁性材料相がなすコアが多数内部に存在するコア分散型粒子が挙げられる。
なお、結合性物質5を、後述する分散剤側の結合性物質6と区別して、粒子側結合性物質5と呼ぶことがある。
図5に示した分散剤30および蛍光標識粒子20の標的物質Sに対する結合性およびその連結構造物100を利用して、標的物質Sの検出を行うことができることは、前記図1で示したとおりである。
(磁性材料)
本発明に用いることができる磁性材料は、特に制限はないが、粒子状のものであることが好ましい。具体的には、平均粒径が、0.5nm以上1000nm未満の磁性粒子であることが好ましく、平均粒径が3nm以上200nm未満であることが特に好ましい。磁性材料(素材)としては、例えば、マグネタイト、酸化ニッケル、フェライト、コバルト鉄酸化物、バリウムフェライト、炭素鋼、タングステン鋼、KS鋼、希土類コバルト磁石及びヘマタイト等の微粒子が挙げられる。
本発明においては、蛍光材料を含有する相が、透明材料からなる連続相2aと蛍光材料からなる分散相2bで構成されていることが好ましい。このとき当該透明材料は、シリカまたはポリスチレンを含むことが好ましい。
前記蛍光材料相として、蛍光シリカ相を形成する方法に特に制限はなく、任意の調製方法によって得られたるものであってもよい。例えば、Journal of Colloid and Interface Science,159,150−157(1993)に記載のゾル−ゲル法が挙げられる。本発明においては、国際公開2007/074722A1公報に記載された蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の調製方法も参考になる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡(TEM)、走査型電子顕微鏡(SEM)等の画像から無作為に選択した100個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積から標識試薬シリカ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した標識試薬シリカ粒子の個数(100個)で割った値に相当する円の直径の平均値(平均円相当直径)を求めたものである。
なお、前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ(商品名;マルバーン社製)が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
本発明においては、その効果が顕著であることから、上記のシリカ微粒子を適用することが好ましいが、これに替え、あるいはこれに加え、複合粒子の蛍光材料相の連続相としてラテックス相を用いてもよい。ラテックス相をなす材料としては、ポリスチレン、スチレン−スルホン酸(塩)共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリルニトリル−ブタジエン−スルホン酸共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等からなる合成高分子粒子を挙げることができる。また、ラテックス相の色素の導入方法としては、特開2000−178309、特開平10−48215号、特開平8−269207号、特開平6−306108号などに記載の方法で行うことができる。なお、この種の粒子に対する蛍光物質(標識物質)の固定化は、適宜定法により行うことができる。例えば、特表2005−534907、特開2010−156642、特開2010−156640などを参照することができる。
磁性材料の相と透明材料の相との比率は、磁性材料の相の作用により蛍光微粒子が検出のために所定位置に集まることが好ましい。一方、透明材料の相は、透明材料中に蛍光材料が特定の割合で存在し、これにより蛍光測定を効果的に行うことができることが好ましい。したがって、上記の透明材料の相と蛍光材料の相の比率、及び磁性材料の相と透明材料の相との比率は、上記の目的を満足するように設計することが好ましい。
また、磁性材料の相と蛍光材料の相の比率は、透明材料の相と蛍光材料の相の比率、及び磁性材料の相と透明材料の相の比率から求めることができる。
熱応答性ポリマーは、電荷を有する分子と結合しても構造変化しないことが好ましい。なお、温度応答性ポリマーとしては、臨界溶液温度(以下、CSTとも称する)を有するポリマーが好ましい。この臨界溶液温度(CST)とは、そこを境に当該ポリマーの特性や形態が変化する温度を意味する。熱応答性ポリマーは、下限臨界溶液温度(LCST)を示すものであっても、上限臨界溶液温度(UCST)を示すものであってもよい。熱応答性ポリマーが下限臨界溶液温度(LCST)を示す場合には、液温を上げると凝集し、下げると再分散するものが挙げられる。逆に、上限臨界溶液温度(UCST)を示す場合には、液温を下げると凝集し、上げると再分散するものが挙げられる。臨界溶液温度(CST)は10℃以上であることが好ましく、30℃以上であることがより好ましい。上限としては、100℃以下であることが好ましく、50℃以下であることがより好ましい。
なかでも、N−n−プロピルアクリルアミド、N−イソプロピルアクリルアミド、N−エチルアクリルアミド、N、N−ジメチルアクリルアミド、N−アクリロイルピロリジン、N−アクリロイルピペリジン、N−アクリロイルモルホリン、N−n−プロピルメタクリルアミド、N−イソプロピルメタクリルアミド、N−エチルメタクリルアミド、N、N−ジメチルメタクリルアミド、N−メタクリロイルピロリジン、N−メタクリロイルピペリジン、N−メタクリロイルモルホリンからなる群から選ばれる少なくとも1種のモノマーからなるポリマー又はN−イソプロピルアクリルアミドとN−t−ブチルアクリルアミドのコポリマーが好ましく利用できる。
熱応答性ポリマーの固定化は、多価アルコールまたは多価アルコール誘導体を介して行うことができる。この熱応答性ポリマーは、複合粒子表面に固定された多価アルコールまたは多価アルコール誘導体にグラフト重合されるか、またはそのポリマー末端または側鎖の官能基と、多価アルコールまたは多価アルコール誘導体の有する官能基との結合によって、固定しうる。その熱応答性ポリマー固定化複合粒子(熱応答性蛍光粒子)の平均粒径は、前記複合粒子より、熱応答性ポリマーの分だけ大きくなるが、その好ましい範囲はほぼ前記複合粒子として規定した範囲と同様である。
連結材料は任意の材料であり、結合性物質の導入に必要な場合に適宜選定して用いることが好ましい。その種類は特に限定されないが、熱応答性ポリマーに組み込むことができ、結合性物質との結合性を有するものが好ましい。結合性物質に生体物質を用いることを考慮すると、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、一次抗体、二次抗体などが挙げられる。
粒子側結合性物質は任意の材料であり、標的物質の種類に併せて必要に応じて適宜選定されればよい。前記複合粒子の表面に吸着又は結合させる生体分子(結合性物質)としては、例えば、抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質又はペプチドが挙げられる。ここで、リガンドとはタンパク質と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。ここで用いる抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよく、Fab等の抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、異なる抗原認識部位を有する2種類のモノクローナル抗体であることが好ましい。結合性物質を連結物質に結合させる手法は特に限定されず、この種の技術における定法により行うことができる。
(分散剤基剤)
分散剤基剤は、例えば親水性の高分子化合物であり、ポリアニオン又はポリカチオンであることが好ましい。ポリアニオンとは複数のアニオン基を有する物質を意味し、ポリカチオンとは複数のカチオン基を有する物質を意味する。ポリアニオンの例として、DNA及びRNA等の核酸が挙げられる。これらの核酸は、核酸骨恪に沿って複数個のホスホジエステル基が存在することにより、ポリアニオンの性質を有する。また、ポリアニオンには、多数のカルボン酸官能基を含むポリペプチド(グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸からなるポリペプチド)、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、及びアクリル酸やメタクリル酸を重合成分として含有するポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、及びヘパリン等の多糖等も含まれる。一方、ポリカチオンの例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアルキルアミン、ポリエチレンイミンやポリプロピルエチレンイミン等が挙げられる。なお、ポリアニオン(カルボキシル基)やポリカチオン(アミノ基)の官能基数は、25個以上が好ましい。
分散剤側結合性物質は、標的物質の種類に併せて必要に応じて適宜選定されればよい。その種類は、前記分散剤基剤への導入を考慮して選定することが好ましい。具体的なものは、前記粒子側結合性物質として挙げたものと同義である。
[標的物質]
標的物質としては、臨床診断に利用される物質が挙げられ、具体的には、体液、尿、喀痰、糞便中等に含まれるヒトイムノグロブリンG、ヒトイムノグロブリンM、ヒトイムノグロブリンA、ヒトイムノグロブリンE、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン(フィブリン及びそれらの分解産物)、α−フェトプロテイン(AFP)、C反応性タンパク質(CRP)、ミオグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、ヒト胎盤性ラクトーゲン(HPL)、HIVウイルス抗原、アレルゲン、細菌毒素、細菌抗原、酵素、ホルモン(例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン(TSH)、インスリン等)、薬剤等が挙げられる。
2 透明材料相(蛍光シリカ相、シェル)
2a 透明材料(連続相)
2b 蛍光材料(蛍光色素,分散相)
3 熱応答性ポリマー(熱応答性ポリマー相)
4 連結材料
5 粒子側結合性物質
6 分散剤側結合性物質
7 分散剤基剤
10 熱応答性蛍光粒子
11 複合粒子
20 蛍光標識粒子(蛍光熱応答性磁性粒子)
30 分散剤
100 連結構造物
S 標的物質
M 磁石
Claims (9)
- 下記の標識粒子を検体を含む試験液に含有させ、加熱した後に、励起光を照射し、前記標識粒子の発光の状態により前記検体に含まれる標的物質を検出する方法であって、
前記加熱により前記標識粒子が凝集して前記試験液中でこの凝集体が局部的に集合し、集合した凝集体による蛍光発光が発現した場合に標的物質の不存在を同定し、
前記加熱によっても前記標識粒子が凝集せず、集合した凝集体による蛍光発光が発現しない場合に標的物質の存在を同定する、標的物質を検出する方法。
[標識粒子:磁性材料を有する相と、該磁性材料を有する相を被覆してなる、シリカを含む透明材料からなる連続相と蛍光材料からなる分散相とで構成された蛍光材料を有する相と、該蛍光材料を有する相に固定化された熱応答性ポリマーと、該熱応答性ポリマーに固定化された、前記標的物質に対して結合性を有する結合性物質とを有する] - 前記結合性物質が抗体である請求項1に記載の標的物質の検出方法。
- 前記の磁性材料を有する相が前記標識粒子のコアをなし、該コアを被覆する形態で前記の蛍光材料を有する相が配された請求項1又は2に記載の標的物質の検出方法。
- 前記試験液に分散剤を導入する請求項1〜3のいずれか1項に記載の標的物質の検出方法。
- 前記励起光の波長が300〜700nmで、前記蛍光の波長が350〜800nmである請求項1〜4のいずれか1項に記載の標的物質の検出方法。
- 10℃〜100℃の範囲にある前記熱応答性ポリマーの臨界溶液温度(CST)を跨ぐよう前記試験液の加熱を行なう請求項1〜5のいずれか1項に記載の標的物質の検出方法。
- 前記試験液に磁力を付与し、凝集状態にある前記標識粒子を磁力が付与された箇所に集合させる請求項1〜6のいずれか1項に記載の標的物質の検出方法。
- 前記の磁性材料を有する相と、該磁性材料を有する相を被覆してなる、前記のシリカを含む透明材料からなる連続相と蛍光材料からなる分散相とで構成された蛍光材料を有する相とからなる複合粒子の平均粒径が1μm未満である請求項1〜7のいずれか1項に記載の標的物質の検出方法。
- 前記磁性材料が、マグネタイト、酸化ニッケル、フェライト、コバルト鉄酸化物、バリウムフェライト、炭素鋼、タングステン鋼、KS鋼、希土類コバルト磁石、またはヘマタイトである請求項1〜8のいずれか1項に記載の標的物質の検出方法。
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