CN105556289A - 靶标物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种靶标物质的检测方法，其为使包含样本的试验液中含有下述标记颗粒、加热后照射激发光、通过所述标记颗粒的发光状态来检测所述样本中包含的靶标物质的方法，该靶标物质的检测方法中，通过所述加热，使所述标记颗粒的凝聚状态发生变化[标记颗粒中，在包含磁性材料和荧光材料的复合颗粒的表面具有热响应性聚合物，进而具有与靶标物质具有结合性的生物分子]。

Description

靶标物质的检测方法
技术领域
本发明涉及靶标物质的检测方法。
背景技术
固定有各种生物物质的微粒在医疗诊断、生物科技的研究领域等中得到广泛应用。其中，研究并提出了由各种材料构成的、具有各种粒径及形态和功能的微粒。其中包括应用磁性颗粒的技术。具体而言，可以举出使用固定有抗体的磁性颗粒来进行亲和柱层析的技术。此时，通过利用乳胶珠反复进行离心分离和清洗操作来进行抗原的纯化，因此需要大量的溶剂。与此相对，若使用磁性颗粒，则能够利用磁铁容易地分离颗粒，所以不需要上述那样繁杂的操作。即，与没有磁性的乳胶珠相比，具有能够迅速且简便地进行抗原纯化的优点。并且，由于不需要离心分离及大量溶剂的使用，因而还适合于使用机械的自动化。因此，近年来，免疫磁性颗粒作为免疫诊断(夹心法)的载体得到频繁使用。
为了提高磁性颗粒的分子识别性，优选增大其表面积。从这方面出发，为了使每单位体积的磁珠的表面积更大，使其粒径更小是有效的。另一方面，若磁性颗粒的粒径达到纳米级，则颗粒的磁性极端减弱。此外，由于布朗运动对水的影响，利用磁铁进行磁分离变得极为困难。为了解决该问题，提出了使用在粒径为数十纳米的磁性纳米颗粒的表层固定有热响应性高分子的物质(参见专利文献1、2)。其中，通过加热使热响应性磁性颗粒凝聚，通过磁性材料所具有的颜色的变化(透明化)来进行靶标物质的检测。具体而言，在与靶标物质反应后进行加热，由此经时地监测反应液的吸光度，基于吸光度逐渐减小来判断靶标物质(样本)的存在。
专利文献1：国际公开第2008/001868号小册子
专利文献2：日本专利第4518767号说明书
发明内容
发明所要解决的课题
通过上述使用热响应性磁性颗粒的技术，认为确实可弥补颗粒微小化所带来的磁性降低的影响，其检测灵敏度提高。但是，为了实现更微量的分析、更确实地防止医疗诊断中的假阴性和假阳性，希望检测灵敏度进一步提高。
因此，本发明的目的在于提供在利用了热响应性磁性颗粒的靶标物质的检测中能够实现高的检测灵敏度的靶标物质的检测方法。
用于解决课题的手段
上述课题通过下述手段得到了解决。
[1]一种靶标物质的检测方法，其使包含样本的试验液中含有下述标记颗粒、加热后照射激发光、通过上述标记颗粒的发光状态来检测上述样本中包含的靶标物质的方法，该靶标物质的检测方法中，通过上述加热，使上述标记颗粒的凝聚状态发生变化。
[标记颗粒中，在包含磁性材料和荧光材料的复合颗粒的表面具有热响应性聚合物，进而具有与靶标物质具有结合性的生物分子]
[2]如[1]所述的靶标物质的检测方法，其中，在上述加热后，通过在上述试验液中局部聚集的上述标记颗粒的荧光发光的显现，鉴定为不存在靶标物质；通过未显现出上述聚集的荧光发光，鉴定为存在靶标物质。
[3]如[1]或[2]所述的靶标物质的检测方法，其中，在上述试验液中导入分散剂。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，上述激发光的波长为300nm～700nm，上述荧光的波长为350nm～800nm。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，上述复合颗粒包含具有上述磁性材料的相和具有上述荧光材料的相，具有上述荧光材料的相由透明材料所形成的连续相和荧光材料所形成的分散相构成。
[6]如[1]～[5]中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，按照跨越处于10℃～100℃范围的上述热响应性聚合物的临界溶解温度(CST)的方式来进行上述试验液的加热。
[7]如[1]～[6]中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，对上述试验液赋予磁力，使处于凝聚状态的上述标记颗粒聚集到被赋予了磁力的部位。
[8]如[1]～[7]中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，上述复合颗粒的平均粒径小于1μm。
[9]如[5]～[8]中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，上述透明材料包含二氧化硅或聚苯乙烯。
[10]如[1]～[9]中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，上述磁性材料为磁铁矿、氧化镍、铁氧体、钴铁氧化物、钡铁氧体、碳钢、钨钢、KS钢、稀土类钴磁铁或赤铁矿。
本说明书中，所谓“在颗粒的表面具有”，其含义除了包括以直接接触的方式存在于表面之外，还包括隔着其它材料存在于其表面外侧。
发明的效果
根据本发明的靶标物质的检测方法，在利用了热响应性磁性颗粒的靶标物质的检测中，可实现高的检测灵敏度。
本发明的上述特征和优点以及其它特征和优点可通过下述的记载和附图进一步明确。
附图说明
图1是示出本发明的靶标物质的检测方法的示例的说明图。
图2是示意性地示出构成标记颗粒的热响应性荧光颗粒的侧视图。
图3是示意性地示出热响应性荧光颗粒的由加热引起的凝聚和分散性的变化的侧视图。
图4是示意性地示出荧光标记颗粒的一个实施方式的侧视图。
图5是示出荧光标记颗粒与靶标物质和分散剂一起形成连结结构物的状态的说明图。
具体实施方式
本发明的靶标物质的检测方法如下：使包含样本的试验液中含有后述特定的标记颗粒，加热后照射激发光，通过此时产生的上述标记颗粒的荧光发光的状态来进行检测。以下，以其优选实施方式为中心来对本发明进行说明。
[检测方法]
图1是示出本发明的靶标物质的检测方法的示例的说明图。本实施方式的检测方法中，将荧光标记颗粒20、分散剂30和包含靶标物质S的样本进行混合。接着，在热响应性聚合物发生凝聚的条件下，判定有无热响应性聚合物的分散。此时，对样本照射激发光，通过其荧光发光进行检测。
图1(1)是存在靶标物质S的情况，此时，如后述图5所示，藉由靶标物质S形成连结结构物100，其在样本液中分散而不发生凝聚。另一方面，在不存在靶标物质S的情况下(图1(2))，分散剂30和荧光标记颗粒20不连结，荧光标记颗粒20独立地存在于体系内。此时，若进行加热而使液温为临界溶解温度(CST)以上，则荧光标记颗粒20发生凝聚。本实施方式中，在反应容器B的右侧面设置有磁铁M。通过该磁力，发生了凝聚而带有强磁性的荧光标记颗粒20被吸引，聚集到磁铁M的附近。另一方面，在以分散性高的连结结构物100的形式存在于液体中的图1(1)的状态下，该荧光标记颗粒20的凝聚未得到促进，其磁性停留于磁性小的状态。因此，即使磁铁M位于容器B的侧方，荧光标记颗粒20也不会被吸引至该处，维持分散状态。
本实施方式中，在上述图1的状态下对区分了靶标物质S的有无的反应液(容器B)照射激发光。于是，在包含靶标物质S的状态的图1(1)中，荧光停留于来自各荧光标记颗粒20的发光的水平，虽然液体整体中多少存在发光，但并没有那么强。另一方面，在不包含靶标物质S的图1(2)中，若照射激发光，则被加热并被吸引至磁铁附近的处于凝聚状态的荧光标记颗粒20发出荧光。处于凝聚状态且局部集中的荧光标记颗粒20形成荧光发光，能够以极其显著的状态检测出其荧光。
即，本实施方式中，通过在上述试验液中局部聚集的标记颗粒的荧光发光的显现，鉴定为不存在靶标物质；通过未显现出上述聚集的荧光发光，鉴定为存在靶标物质。
颗粒的凝聚以及在磁铁附近的集聚是在不使用荧光材料相2的以往的热响应性磁性颗粒的情况下也会产生的现象，由此，可观察到例如橙色的集中的部分。但是，没有凝聚的分散液也略微带有橙色，在靶标物质的量少时等，有时表现出的差异不太明显。与此相对，根据本发明，能够通过荧光来检测其差异，因此能够检测出显著的荧光发光的变化。若以检测灵敏度之差(因靶标物质的有无所产生的吸光度或荧光强度之差)来表示该变化，根据本发明的优选实施方式，相对于现有品能够提高10倍至数百倍。通过该效果，例如在感染症领域中，能够进行利用迄今为止的生物化学领域的检查设备难以进行的诊断。但是，本发明并不由该改善效果的例示来限定解释。
进而，在本实施方式中，构成荧光标记颗粒20的荧光材料相2由含有荧光色素(分散层)2b的二氧化硅(连续相)2a构成。其详细情况如后所述，二氧化硅材料通常比磁性材料比重小，容易漂浮在水等样本液的介质中。也具有其效果，分散和凝聚状态的变化变得更加敏锐，进而带来检测灵敏度的提高。
本实施方式中，有无分散(图1的(1)、(2))的判定通过激发光的照射和由此产生的荧光的检测来进行。从通过目视或通用的传感器来检测荧光的观点出发，优选上述激发光源发出下述波长区域的激发光。作为上述激发光源，可以举出汞灯、卤素灯和氙灯。特别优选使用由激光二极管或发光二极管照射的激发光。更优选具备用于仅使来自上述激发光源的特定波长的光透射的滤光器，进而，从通过目视等仅检测荧光的观点出发，进一步优选具备将上述激发光除去而仅使荧光透射的滤光器。进而，特别优选具备接收荧光的光电倍增管或CCD检测器，由此还能够检测出无法通过目视确认的强度或波长的荧光。另外，由于能够测定其荧光强度，因而还能够进行靶标物质的定量，能够进行高灵敏度检测和定量。
上述激发光的波长优选为300nm以上、更优选为400nm以上、特别优选为500nm以上。作为上限，优选为700nm以下、更优选为600nm以下、特别优选为550nm以下。通过为该范围的激发光，能够高效地生成下述范围的荧光，因而优选。
上述荧光的波长优选为350nm以上、更优选为450nm以上、特别优选为530nm以上。作为上限，优选为800nm以下、更优选为750nm以下、特别优选为580nm以下。通过为该范围，容易利用目视进行观察或容易利用通用的检测器进行检测，因而优选。
下面，对于可带来上述优异效果的荧光标记颗粒进行更详细的说明。需要说明的是，图示的方式中为了便于理解而将各材料示意性或夸张地示出，本发明并不由这些图中所示的方式来限定解释。
本发明的检测方法中，包含样本的试验液没有特别限定，优选使用将样本用PBS等缓冲液稀释而得到的试验液。稀释倍率因样本而不同，例如可以稀释2～100倍来使用。除此以外，在试验液中，可以适当含有用于处理的酸或碱。试验液中的被测物质的浓度没有特别限制，根据检测灵敏度高的本发明的方法，可以应对例如被测物质为1pg/mL以上的试验液，更优选为1ng/mL以上。没有特别的上限，实际上为1mg/mL以下。更具体而言，可以通过实验按照所检测的每个项目来设定。
分散剂的浓度没有特别限定，更优选为0.01质量％以上、更优选为0.1质量％以上。没有特别的上限，实际上为5质量％以下。标记颗粒的浓度没有特别限定，更优选为0.01质量％以上、更优选为0.1质量％以上。没有特别的上限，实际上为5质量％以下。
试验温度没有特别限定，实际上在25℃以上且45℃以下进行。
本实施方式的标记颗粒优选具有在加热后迅速凝聚的性质。利用该性质，能够进行靶标物质的检测。但是，根据热响应性聚合物的种类、赋予到复合颗粒上的方法，由热引起的应答有时会需要时间。
将这样的情况也考虑在内，荧光检测中优选在上述加热开始后开始测定，之后追踪荧光强度的经时变化，利用在经过600秒以上的时刻达到最小的荧光强度与加热开始后得到的最大的荧光强度之差来评价凝聚特性，由此能够得到高重现性和高灵敏度。
[标记颗粒]
图2是示意性地示出构成本发明的标记颗粒的热响应性荧光颗粒10的侧视图。本实施方式中，复合颗粒11具有形成壳的透明材料相(荧光二氧化硅相)2被覆了形成核的磁性材料相(磁性材料颗粒)1的表面的形态。并且，在该复合颗粒11的表面配置有热响应性聚合物3。本实施方式中，例示了像这样核/壳型的复合颗粒，但本发明不限定于此。例如，也可以为形成海岛状的形态、或以不定形混杂的状态。但是，该情况下，也优选荧光材料相2的至少一部分露出于复合颗粒的表面，以便能够从外部检测出荧光，更优选过半的颗粒表面由荧光材料相构成。因此，作为海岛状的形态，优选磁性材料相构成岛部、荧光材料相构成海部的形态。作为类似的形态，可以举出上述磁性材料相所形成的核大量存在于内部的核分散型颗粒。
对于热响应性聚合物3，为了便于图示，以从复合颗粒2的表面朝向外侧以放射状延伸的形态示出，但本发明不由此来限定解释。聚合物的表面吸附的形态是多种多样的，通常为不定形。可以为复杂地相互缠绕的结构，或者，也可以以各分子或若干分子收缩而成的颗粒状的形态固定于复合颗粒表面。但是，优选为在至少一部分中激发光到达复合颗粒且由此发出的荧光可到达外部的状态。在图3之后将该热响应性聚合物的相用影线简化示出。
图3是示意性地示出热响应性荧光颗粒10的由加热引起的凝聚和分散性的变化的侧视图。图中左侧的(1)是加热前的状态，示出了热响应性荧光颗粒10在体系内分散的状态。与此相对，通过进行加热，向图中右侧(2)的凝聚状态移动。像这样凝聚和分散性通过加热而发生变化的理由未必明确。若将推测包括在内来讲，认为聚合物通过加热而收缩，相邻的复合颗粒的可接近距离变得更短，因此促进其凝聚。本实施方式中，示出了通过加热在超过临界溶解温度(CST)时促进凝聚、在低于临界溶解温度(CST)时促进分散的示例，但也可以是相反的。即，也可以是在超过临界溶解温度(CST)时促进分散、在低于临界溶解温度(CST)时促进凝聚的方式。
图4是示意性地示出本发明的荧光标记颗粒的一个实施方式的侧视图。本实施方式中，示出了在复合颗粒11的表面赋予连结材料4、并在此处固定有结合性物质5的示例。在图示的方式中，虽然仿佛示出了在热响应性聚合物3的外侧(聚合物末端)配置有连结材料4，但这是为了便于图示，不需要形成这样的配置状态。倒不如说，在实际的荧光标记颗粒中，热响应性聚合物3以不定形存在，连结材料4以缠绕在其中的状态、或者吸附的状态等任意地存在即可。相反地，若利用分子设计性好的材料，则也可以如上所述在热响应性聚合物的末端导入连结材料。作为变更方式，也可以不使用连结材料4而在热响应性聚合物3中导入结合性物质5。此外，在热响应性聚合物与靶标物质具有结合性等情况下，还可以举出不使用结合性物质的荧光标记颗粒的示例。
需要说明的是，与后述的分散剂侧的结合性物质6相区分，有时将结合性物质5称为颗粒侧结合性物质5。
图5是示出本发明的荧光标记颗粒20与靶标物质S一起形成连结结构物的示例的说明图。导入至荧光标记颗粒的颗粒侧结合性物质5与靶标物质S具有结合性。另一方面，本实施方式中，在体系内导入有分散剂30。分散剂30由分散剂基剂7和分散剂侧结合性物质6构成。该分散剂侧结合性物质6也与上述靶标物质S具有结合性。因此，若体系内共存有荧光标记颗粒20、靶标物质S和分散剂30，则形成藉由靶标物质S将荧光标记颗粒20与分散剂30连结的结构(连结结构物100)。该连结结构物100由于分散剂30的效果而在体系内显示出分散性，妨碍荧光标记颗粒20发生凝聚。需要说明的是，图5中仅示出了一个连结材料4和一个结合性物质5，但这是进行了简化，典型的是优选如图4所示赋予了大量的连结材料4和结合性物质5。
如上述图1所示，利用图5所示的分散剂30和荧光标记颗粒20对靶标物质S的结合性及其连结结构物100，能够进行靶标物质S的检测。
[复合颗粒]
(磁性材料)
本发明中能够使用的磁性材料没有特别限制，优选为颗粒状的磁性材料。具体而言，优选平均粒径为0.5nm以上且小于1000nm的磁性颗粒，特别优选平均粒径为3nm以上且小于200nm。作为磁性材料(原材)，例如可以举出磁铁矿、氧化镍、铁氧体、钴铁氧化物、钡铁氧体、碳钢、钨钢、KS钢、稀土类钴磁铁和赤铁矿等的微粒。
(荧光材料)
本发明中，含有荧光材料的相优选由透明材料所形成的连续相2a和荧光材料所形成的分散相2b构成。此时，该透明材料优选包含二氧化硅或聚苯乙烯。
·二氧化硅相
作为上述荧光材料相，对形成荧光二氧化硅相的方法没有特别限制，可以为通过任意的制备方法所得到的荧光材料相。例如，可以举出JournalofColloidandInterfaceScience,159,150-157(1993)中记载的溶胶-凝胶法。本发明中，也可以参考国际公开2007/074722A1公报中记载的含荧光色素化合物的胶体二氧化硅颗粒的制备方法。
具体而言，对使用荧光色素作为荧光材料的示例进行说明。含有荧光色素的二氧化硅相可以如下制备：使荧光色素与硅烷偶联剂反应，使其以共价键、离子键或其它化学方式进行键合或吸附，使1种或2种以上的硅烷化合物与所得到的产物缩聚，形成硅氧烷键合，由此制备含有荧光色素的二氧化硅相。由此，得到有机硅氧烷成分与硅氧烷成分进行硅氧烷键合而成的二氧化硅相。作为一例，可以使具有或附加了N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基、马来酰亚胺基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、醛基、对硝基苯基、二乙氧基甲基、环氧基、氰基等活性基团的荧光色素和具有与这些活性基团对应地进行反应的取代基(例如氨基、羟基、硫醇基)的硅烷偶联剂进行反应，使其进行共价键合而得到产物，使1种或2种以上的硅烷化合物与该产物进行缩聚，形成硅氧烷键合，由此进行制备。
下面，例示出使用APS作为上述硅烷偶联剂、使用四乙氧基硅烷(TEOS)作为硅烷化合物的情况。
作为具有或附加了上述活性基团的上述功能性化合物的具体例，可以举出5-(和-6)-羧基四甲基若丹明-NHS酯(商品名、empBiotechGmbH公司制造)、分别以下式表示的DY550-NHS酯或DY630-NHS酯(均为商品名、DyomicsGmbH公司制造)等具有NHS酯基的荧光色素化合物。
作为具有上述取代基的硅烷偶联剂的具体例，可以举出γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三乙氧基硅烷、N-2(氨基乙基)3-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷等具有氨基的硅烷偶联剂。其中优选APS。
作为进行上述缩聚的上述硅烷化合物，没有特别限制，可以举出TEOS、γ-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPS)、γ-巯基丙基三乙氧基硅烷、γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)、3-硫氰根合丙基三乙氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三乙氧基硅烷、3-异氰酸根合丙基三乙氧基硅烷以及3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三乙氧基硅烷。其中，从形成上述二氧化硅颗粒内部的硅氧烷成分的观点出发，优选TEOS，从形成上述二氧化硅颗粒内部的有机硅氧烷成分的观点出发，优选MPS或APS。
例如，通过使用上述材料，以上述磁性颗粒为核的方式赋予至反应体系内，能够制造球状或接近球状的磁性材料/二氧化硅的复合颗粒。接近球状的二氧化硅颗粒是指例如长轴与短轴之比为2以下的形状。为了得到所期望的平均粒径的二氧化硅颗粒，可以使用YM-10、YM-100(均为商品名、Millipore公司制造)等超滤膜进行超滤，将粒径过大或过小的颗粒除去；或者，在适当的重力加速度下进行离心分离，仅回收上清或沉淀。
荧光复合颗粒的平均粒径没有特别限定，优选为1nm以上、更优选为20nm以上。作为上限，优选小于1μm、更优选为500nm以下。
本发明中，上述平均粒径如下求出：从透射型电子显微镜(TEM)、扫描型电子显微镜(SEM)等的图像中随机选择100个标记试剂二氧化硅颗粒，利用图像处理装置由它们的合计投影面积求出标记试剂二氧化硅颗粒的占有面积，用该合计的占有面积除以所选择的标记试剂二氧化硅颗粒的个数(100个)，求出与所得到的值等效的圆的直径的平均值(平均等效圆直径)。
需要说明的是，上述平均粒径与作为包括一次颗粒凝聚而成的二次颗粒在内的概念的、后述“基于动态光散射法的粒度”不同，是仅由一次颗粒构成的颗粒的平均粒径。
本说明书中，上述“基于动态光散射法的粒度”是利用动态光散射法进行测定的，与上述平均粒径不同，是不仅包括一次颗粒、还包括一次颗粒凝聚而成的二次颗粒的概念，成为评价上述复合颗粒的分散稳定性的指标。
作为基于动态光散射法的粒度的测定装置，可以举出ZetasizerNano(商品名；Malvern公司制造)。该方法如下：测定微粒等光散射体的光散射强度的时间变动，由其自相关函数计算出光散射体的布朗运动速度，由其结果导出光散射体的粒度分布。
荧光二氧化硅颗粒作为粒状物质优选为单分散，粒度分布的变异系数、即所谓的CV值没有特别限制，优选为10％以下、更优选为8％以下。
·乳胶相
本发明中，由于其效果显著而优选应用上述二氧化硅微粒，但也可以代替二氧化硅微粒或在其基础上使用乳胶相作为复合颗粒的荧光材料相的连续相。作为形成乳胶相的材料，可以举出由聚苯乙烯、苯乙烯-磺酸(盐)共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯腈-丁二烯-磺酸共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物等构成的合成高分子颗粒。另外，作为乳胶相的色素的导入方法，可以利用日本特开2000-178309、日本特开平10-48215号、日本特开平8-269207号、日本特开平6-306108号等中记载的方法来进行。需要说明的是，荧光物质(标记物质)在这种颗粒上的固定化可以适当利用常规方法来进行。例如，可以参照日本特表2005-534907、日本特开2010-156642、日本特开2010-156640等。
本发明中，荧光材料的相中的荧光材料(荧光色素)的量没有特别限定，在将透明材料(连续相)的量设为100质量份时，优选为0.05质量份以上、更优选为0.10质量份以上。作为上限，优选为1.0质量份以下、更优选为0.50质量份以下。磁性材料的相与荧光材料的相的比例也可以适当调节。
关于磁性材料的相与透明材料的相的比例，为了利用磁性材料的相的作用检测出荧光微粒，优选将其集中于特定位置。另一方面，关于透明材料的相，优选荧光材料以特定的比例存在于透明材料中，由此能够高效地进行荧光测定。因此，上述透明材料的相与荧光材料的相的比例、以及磁性材料的相与透明材料的相的比例优选以满足上述目的的方式进行设计。
另外，磁性材料的相与荧光材料的相的比例可以由透明材料的相与荧光材料的相的比例、以及磁性材料的相与透明材料的相的比例来求出。
(热响应性聚合物)
热响应性聚合物优选即便与具有电荷的分子结合也不发生结构变化。需要说明的是，作为温度响应性聚合物，优选具有临界溶解温度(下文中也称为CST)的聚合物。该临界溶解温度(CST)是指该聚合物的特性、形态以此为界发生变化的温度。热响应性聚合物可以显示出最低临界溶解温度(LCST)，也可以显示出最高临界溶解温度(UCST)。在热响应性聚合物显示出最低临界溶解温度(LCST)的情况下，可以举出提高液温时发生凝聚、降低液温时发生再分散的聚合物。相反地，在显示出最高临界溶解温度(UCST)的情况下，可以举出降低液温时发生凝聚、提高液温时发生再分散的聚合物。临界溶解温度(CST)优选为10℃以上、更优选为30℃以上。作为上限，优选为100℃以下、更优选为50℃以下。
需要说明的是，最低临界溶解温度和最高临界溶解温度例如可以如下确定。首先，将试样装入吸光光度计的比色皿中，以1℃/分钟的速度使试样升温。在此期间记录550nm下的透射率变化。此处，将聚合物透明地溶解时的透射率设为100％，将完全凝聚时的透射率设为0％时，求出透射率达到50％时的温度作为LCST。
作为具有最低临界溶解温度的聚合物，可以举出由N-正丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰吡咯烷、N-丙烯酰哌啶、N-丙烯酰吗啉、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、N,N-二甲基甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰吡咯烷、N-甲基丙烯酰哌啶、N-甲基丙烯酰吗啉等N取代(甲基)丙烯酰胺衍生物构成的聚合物；羟丙基纤维素、聚乙烯醇部分醋化物、聚乙烯基甲醚、(聚氧乙烯-聚氧丙烯)嵌段共聚物、聚氧乙烯月桂胺等聚氧乙烯烷基胺衍生物；聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯等聚氧乙烯山梨糖醇酐酯衍生物；(聚氧乙烯壬基苯基醚)丙烯酸酯、(聚氧乙烯辛基苯基醚)甲基丙烯酸酯等(聚氧乙烯烷基苯基醚)(甲基)丙烯酸酯类；和(聚氧乙烯月桂基醚)丙烯酸酯、(聚氧乙烯油烯基醚)甲基丙烯酸酯等(聚氧乙烯烷基醚)(甲基)丙烯酸酯类等聚氧乙烯(甲基)丙烯酸酯衍生物等。此外，也可以利用它们的聚合物以及由它们中的至少2种单体构成的共聚物。另外，还可以利用N-异丙基丙烯酰胺和N-叔丁基丙烯酰胺的共聚物。在使用包含(甲基)丙烯酰胺衍生物的聚合物的情况下，可以在具有最低临界溶解温度的范围内在该聚合物中共聚其它可共聚的单体。
其中，可以优选利用由选自由N-正丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰吡咯烷、N-丙烯酰哌啶、N-丙烯酰吗啉、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、N,N-二甲基甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰吡咯烷、N-甲基丙烯酰哌啶、N-甲基丙烯酰吗啉组成的组中的至少一种单体构成的聚合物或N-异丙基丙烯酰胺和N-叔丁基丙烯酰胺的共聚物。
作为具有最高临界溶解温度的聚合物，可以利用由选自由丙烯酰甘氨酰胺、丙烯酰哌啶甲酰胺、丙烯酰天冬酰胺和丙烯酰谷酰胺等组成的组中的至少一种单体构成的聚合物。另外，也可以为由它们中的至少2种单体构成的共聚物。可以在具有最高临界溶解温度的范围内在这些聚合物中共聚丙烯酰胺、乙酰基丙烯酰胺、生物素醇丙烯酸酯、N-生物素基-N’-甲基丙烯酰基三亚甲基酰胺、丙烯酰肌氨酰胺、甲基丙烯酰肌氨酰胺、丙烯酰甲基尿嘧啶等其它可共聚的单体。
作为热响应性聚合物，例如可以适当使用日本专利第4518767号说明书中记载的聚合物。
(热响应性聚合物在复合颗粒上的固定化)
热响应性聚合物的固定化可以藉由多元醇或多元醇衍生物来进行。该热响应性聚合物可以接枝聚合到固定在复合颗粒表面的多元醇或多元醇衍生物上，或者可以通过该聚合物末端或侧链的官能团与多元醇或多元醇衍生物所具有的官能团的键合来进行固定。固定有该热响应性聚合物的复合颗粒(热响应性荧光颗粒)的平均粒径比上述复合颗粒大出热响应性聚合物的部分，其优选范围基本上与作为上述复合颗粒所规定的范围相同。
多元醇优选在结构单元中具有至少2个羟基。例如，可以举出葡聚糖、聚乙烯醇、甘露醇、山梨糖醇。另外，也可以使用如甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物那样、具有环氧基且开环后形成多元醇结构体的化合物。多元醇衍生物可以使用通过修饰导入有羧基、氨基、环氧基、硫醇基、甲基丙烯酰基或丙烯酰基等反应性官能团或聚合性基团的多元醇。
(连结材料)
连结材料为任意的材料，优选在结合性物质的导入所需要的情况下适当选择使用。其种类没有特别限定，优选能够掺入到热响应性聚合物中且与结合性物质具有结合性的材料。若考虑将生物物质用于结合性物质，例如可以举出生物素、亲和素、链霉亲和素、一次抗体、二次抗体等。
作为将连结材料掺入到热响应性聚合物中的方法，可以参考国际公开第01/09141号小册子或日本专利第4518767号说明书的记载内容。具体而言，可以通过使生物素等与甲基丙烯酰基或丙烯酰基等聚合性官能团结合而形成加聚性单体、并与其它单体共聚来进行。作为其它方法，可以利用下述方法：在聚合物的聚合时使具有羧酸、氨基或环氧基等官能团的单体与其它单体进行共聚，按照常规方法藉由该官能团使抗体亲和性物质(例如瓜胶(メロンゲル)、蛋白质A、蛋白质G)与聚合物结合。或者，也可以在聚合物的聚合时使具有羧酸、氨基或环氧基等官能团的单体与其它单体进行共聚，并按照常规方法使针对检测对象抗原的抗体(结合性物质)与这些官能团直接结合。如此，可以省去连结物质的使用。
(颗粒侧结合性物质)
颗粒侧结合性物质为任意的材料，根据需要并根据靶标物质的种类来适当选择即可。作为吸附或结合在上述复合颗粒的表面的生物分子(结合性物质)，例如可以举出抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖链、配体、受体、蛋白质或肽。此处，配体是指与蛋白质特异性结合的物质，例如是指与酶结合的底物、辅酶、调节因子、或者激素、神经递质等，不仅包括低分子量的分子或离子，还包括高分子量的物质。此处所用的抗体可以为任意类型的免疫球蛋白分子，也可以为Fab等具有抗原结合部位的免疫球蛋白分子片段。另外，抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体，优选为具有不同的抗原识别部位的两种单克隆抗体。使结合性物质结合于连结物质的方法没有特别限定，可以利用这种技术中的常规方法来进行。
根据图5所示的示例，将优选的材料示于下述表A中。
【表A】
[分散剂]
(分散剂基剂)
分散剂基剂例如为亲水性的高分子化合物，优选为聚阴离子或聚阳离子。聚阴离子是指具有2个以上阴离子基团的物质，聚阳离子是指具有2个以上阳离子基团的物质。作为聚阴离子的示例，可以举出DNA和RNA等核酸。这些核酸中沿着核酸骨架存在2个以上的磷酸二酯基，由此具有聚阴离子的性质。另外，聚阴离子还包括含有多个羧酸官能团的多肽(由谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸构成的多肽)、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、以及含有丙烯酸或甲基丙烯酸作为聚合成分的聚合物、羧甲基纤维素、透明质酸以及肝素等多糖等。另一方面，作为聚阳离子的示例，可以举出聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、聚烷基胺、聚乙烯亚胺或聚丙基乙烯亚胺等。需要说明的是，聚阴离子(羧基)或聚阳离子(氨基)的官能团数优选为25个以上。
(分散剂侧结合性物质)
分散剂侧结合性物质根据需要并根据靶标物质的种类来适当选择即可。其种类优选考虑向上述分散剂基剂中的导入来选择。具体物质与作为上述颗粒侧结合性物质所列举的物质含义相同。
分散剂基剂与结合性物质的结合方法没有特别限定，例如可以举出使双方与相互具有亲和性的物质(例如，亲和素和生物素、谷胱甘肽和谷胱甘肽S转移酶)结合并藉由这些物质间接结合的方法。在使两者直接结合的情况下，可以藉由官能团进行结合，例如在使用官能团的情况下，可以根据Ghosh等的方法(Ghoshetal:BioconjugateChem.、1、71-76、1990)的马来酰亚胺-硫醇偶联来进行结合。具体而言，可以举出下述两种方法。在其第1种方法中，首先在核酸的5’端导入巯基(别名：硫氢基)，另一方面，使6-马来酰亚胺己酸琥珀酰亚胺酯(例如，“EMCS(商品名)”(同仁化学研究所公司制造))与抗体反应而导入马来酰亚胺基。接着，使这两种物质藉由巯基和马来酰亚胺基而结合。在第2种方法中，首先，与第1种方法同样地在核酸的5’端导入巯基，使作为同双官能性试剂的N,N-1,2-亚苯基二马来酰亚胺进一步与该巯基反应，由此向核酸的5’端导入马来酰亚胺基，另一方面，向抗体上导入巯基。接着，使这两种物质藉由巯基和马来酰亚胺基而结合。
除此以外，作为将核酸导入至蛋白质中的方法，例如已知NucleicAcidsResearch第15卷5275页(1987年)和NucleicAcidsResearch第16卷3671页(1988年)中记载的方法。这些技术可以应用于核酸与抗体的结合。
[靶标物质]
作为靶标物质，可以举出临床诊断中利用的物质，具体而言，可以举出体液、尿、咳痰、粪便等中包含的人免疫球蛋白G、人免疫球蛋白M、人免疫球蛋白A、人免疫球蛋白E、人白蛋白、人纤维蛋白原(纤维蛋白和它们的分解产物)、α-甲胎蛋白(AFP)、C反应蛋白(CRP)、肌红蛋白、癌胚抗原、肝炎病毒抗原、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、人胎盘催乳素(HPL)、HIV病毒抗原、过敏原、细菌毒素、细菌抗原、酶、激素(例如，人促甲状腺激素(TSH)、胰岛素等)、药剂等。
实施例
通过实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不由此来限定解释。
利用表A所示的材料重现了图5所示的体系。作为标记颗粒，如表A所示，将磁性颗粒用二氧化硅颗粒被覆，其平均粒径为约200nm。使其含有于包含样本的试验液中，在约50℃下加热15分钟。之后照射激发光(550nm)，通过上述标记颗粒的发光(580nm)状态对上述样本中包含的靶标物质进行检测。此时，在样本的存在下，分散剂藉由靶标物质结合于磁性荧光热响应性颗粒上，因而维持了分散，结果，与加热前相比，荧光强度未发生变化；与此相对，在不存在样本的条件下，磁性荧光热响应性颗粒通过加热而凝聚，之后沉降，结果，与加热前相比，确认到荧光强度降低。
虽然结合其实施方式对本发明进行了说明，但是申请人认为，只要没有特别指定，则本发明不限定于说明的任何细节，应当在不违反所附权利要求书所示的发明精神和范围的情况下宽泛地解释。
本申请主张基于2013年10月2日在日本进行了专利申请的日本特愿2013-207387的优先权，将其参照于此并将其内容作为本说明书记载内容的一部分引入。
符号说明
1磁性材料相(磁性材料颗粒、核)
2透明材料相(荧光二氧化硅相、壳)
2a透明材料(连续相)
2b荧光材料(荧光色素，分散相)
3热响应性聚合物(热响应性聚合物相)
4连结材料
5颗粒侧结合性物质
6分散剂侧结合性物质
7分散剂基剂
10热响应性荧光颗粒
11复合颗粒
20荧光标记颗粒(荧光热响应性磁性颗粒)
30分散剂
100连结结构物
S靶标物质
M磁铁

Claims (10)

1.一种靶标物质的检测方法，其为使包含样本的试验液中含有下述标记颗粒、加热后照射激发光、通过所述标记颗粒的发光状态来检测所述样本中包含的靶标物质的方法，所述靶标物质的检测方法中，
通过所述加热，使所述标记颗粒的凝聚状态发生变化，
标记颗粒中，在包含磁性材料和荧光材料的复合颗粒的表面具有热响应性聚合物，进而具有与靶标物质具有结合性的生物分子。
2.如权利要求1所述的靶标物质的检测方法，其中，在所述加热后，通过在所述试验液中局部聚集的所述标记颗粒的荧光发光的显现，鉴定为不存在靶标物质；通过未显现出所述聚集的荧光发光，鉴定为存在靶标物质。
3.如权利要求1或2所述的靶标物质的检测方法，其中，在所述试验液中导入分散剂。
4.如权利要求1～3中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，所述激发光的波长为300nm～700nm，所述荧光的波长为350nm～800nm。
5.如权利要求1～4中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，所述复合颗粒包含具有所述磁性材料的相和具有所述荧光材料的相，具有所述荧光材料的相由透明材料所形成的连续相和荧光材料所形成的分散相构成。
6.如权利要求1～5中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，按照跨越处于10℃～100℃范围的所述热响应性聚合物的临界溶解温度(CST)的方式来进行所述试验液的加热。
7.如权利要求1～6中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，对所述试验液赋予磁力，使处于凝聚状态的所述标记颗粒聚集到被赋予了磁力的部位。
8.如权利要求1～7中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，所述复合颗粒的平均粒径小于1μm。
9.如权利要求5～8中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，所述透明材料包含二氧化硅或聚苯乙烯。
10.如权利要求1～9中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，所述磁性材料为磁铁矿、氧化镍、铁氧体、钴铁氧化物、钡铁氧体、碳钢、钨钢、KS钢、稀土类钴磁铁或赤铁矿。
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