JP5329658B2 - 検出対象の検出方法及び定量方法 - Google Patents
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Description
刺激応答性ポリマーを含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、親水性を有する第2の物質と前記検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物と、前記検体とを混合し、
得られた混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記混合物を展開担体に展開させ、又は得られた混合物を展開担体に展開させ、前記混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、
前記展開担体における第1の結合物又は第2の結合物の存在に起因する信号を確認し、前記信号が、前記検出対象の非存在下と異なる場合には、前記検体中に検出対象が存在すると判別する工程を含む方法であり、
第1の親和性物質と第2の親和性物質とが、前記検出対象の異なる部位に結合できる方法。
[2] 第1の結合物の存在に起因する信号の強度が、前記検出対象の非存在下よりも弱い場合に、前記検体中に検出対象が存在すると判別する[1]記載の方法。
[3] 前記混合物は、第1の結合物の凝集体を除去した後に前記展開担体に展開させ、
第1の結合物の存在に起因する信号の強度が、前記検出対象の非存在下よりも強い場合に、前記検体中に検出対象が存在すると判別する[1]記載の方法。
[4] 検体中の検出対象を定量する方法であって、
刺激応答性ポリマーを含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、親水性を有する第2の物質と前記検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物と、前記検体とを混合し、
得られた混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記混合物を展開担体に展開させ、又は得られた混合物を展開担体に展開させ、前記混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、
前記展開担体における第1の結合物又は第2の結合物の存在に起因する信号の強度を測定し、前記検出対象の量と信号強度との前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出する工程を含む方法であり、
第1の親和性物質と第2の親和性物質とが、前記検出対象の異なる部位に結合できる方法。
[5] 第1の結合物の凝集体の存在に起因する信号を測定する[4]記載の方法。
[6] 前記混合物は、第1の結合物の凝集体を除去した後に前記展開担体に展開させ、
第1の結合物の存在に起因する信号の強度を測定する[4]記載の方法。
[7] 第1の結合物は有色粒子を有し、
前記信号は、前記有色粒子の存在に基づく色に依存したものである[1]から[6]いずれか記載の方法。
[8] 第1の結合物又は第2の結合物は、前記展開担体上で発色もしくは発光する物質を有し、
前記信号は、前記発色もしくは発光する物質の存在に基づく色又は光に依存したものである[1]から[7]いずれか記載の方法。
[9] 検出対象を検出及び/又は定量するためのキットであって、
刺激応答性ポリマーを含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、親水性を有する第2の物質と前記検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物と、
前記結合物を展開するための展開担体と、を備えるキット。
[10] 第1の結合物は有色粒子を有する[9]記載のキット。
[11] 第1の結合物又は第2の結合物は、前記展開担体上で発色もしくは発光する物質を有する[9]又は[10]記載のキット。
〔混合・凝集〕
本発明の検出方法では、まず、結合物及び検体を混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におく。ここで用いる結合物は少なくとも2種であり、そのうち必須の構成要素である第1の結合物、及び第2の結合物について詳細に説明する。
第1の結合物は、刺激応答性ポリマーを含有する第1の物質と、検出対象に対する第1の親和性物質とが結合したものである。
本発明で用いられる第1の物質は刺激応答性ポリマーを含有する物質であり、この刺激応答性ポリマーは、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できるポリマーである。刺激としては、特に限定されないが、温度変化、光の照射、酸又は塩基の添加(pHの変化)、電場変化等が挙げられる。
第1の物質は、刺激応答性ポリマー及び後述の親和性物質を担持する微粒子を含有してもよい。ここで用いる微粒子は、凝集の程度に応じて展開担体上の信号が変化するように、単独では後述の展開担体の孔径よりも小さく、且つ、凝集した際には展開担体の孔径よりも大きくなるような平均粒子径を有する必要があるが、その具体的組成は刺激応答性ポリマー及び親和性物質を担持できる限りにおいて特に限定されない。
第1の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であってよい。ここで用いる抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよく、Fab等の抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。
第1の結合物は、第1の物質と第1の親和性物質とを結合することによって作製する。この結合方法は、特に限定されないが、例えば、第1の物質側(例えば刺激応答性ポリマー部分)及び第1の親和性物質(例えば、第1の抗体)側の双方に、互いに親和性の物質(例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンSトランスフェラーゼ)を結合させ、これら物質を介して第1の物質及び第1の親和性物質を結合させる。
本発明の方法では、第1の結合物に加えて、親水性を有する第2の物質と、検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物を用いる。これにより、検出感度を向上することができる。
親水性を有する第2の物質は、例えば電荷を有する高分子化合物であり、ポリアニオン又はポリカチオンであることが好ましい。ポリアニオンとは複数のアニオン基を有する物質を意味し、ポリカチオンとは複数のカチオン基を有する物質を意味する。ポリアニオンの例として、DNA及びRNA等の核酸が挙げられる。これらの核酸は、核酸骨恪に沿って複数個のホスホジエステル基が存在することにより、ポリアニオンの性質を有する。また、ポリアニオンには、多数のカルボキシルを含むポリペプチド(グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸からなるポリペプチド)、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸及びアクリル酸やメタクリル酸を重合成分として含有するポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、及びヘパリン等の多糖等も含まれる。一方、ポリカチオンの例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアルキルアミン、ポリエチレンイミンやポリプロピルエチレンイミン等が挙げられる。なお、ポリアニオン(カルボキシル)やポリカチオン(アミノ)の官能基数は、25個以上が好ましい。また、カルボキシル基を持つラテックス粒子等も挙げられる。
第2の親和性物質は、第1の親和性物質とは異なる部位において、第1の親和性物質と同じ検出対象に結合できるものである。第1の親和性物質及び第2の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であってよい。
第2の結合物は、第2の物質と第2の親和性物質とを直接又は間接に結合することによって作製する。特に限定されないが、例えば、第2の物質側及び第2の親和性物質(例えば、第2の抗体)側の双方に、互いに親和性の物質(例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンSトランスフェラーゼ)を結合させ、これら物質を介して第2の物質及び第2の親和性物質を間接的に結合させる。
検体と結合物との混合物を展開担体に展開させ、この展開担体における結合物の存在に起因する信号を確認し、この信号が、検出対象の非存在下と異なる場合には、検体中に検出対象が存在すると判別する。つまり、図2に示したように、検出対象の有無に応じて、各混合物中の凝集の状態が異なるため、各混合物の展開態様も異なることになる。そこで、検出対象の非存在下と異なる信号が確認された場合には、検体中に検出対象が存在したと判別できるのである。このように、判別が、展開担体上の信号を確認するだけで、特殊な試薬、機器を特に使用することなく行われるので、種々の環境において、安価且つ簡便に検出を実施できる。
本発明の方法で用いられる展開担体は、水溶液中で微粒子を展開できるものであれば特に限定されず、従来公知のクロマトグラフィー用担体であってよい。具体的には、有孔の三次元構造膜、例えばナイロン膜、ニトロセルロース膜等が挙げられ、合成又は天然高分子膜のいずれであってもよい。ただし、展開担体は、前述した微粒子の平均粒子径よりも大きく且つ凝集体の凝集径よりも小さい孔径を有する必要があるところ、種々の微粒子に対応でき汎用性に優れる点で、0.01μm〜0.5μm程度の孔径を有することが好ましい。
本発明の定量方法によれば、まず、第1の結合物、第2の結合物及び検体を混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下におく。次に、混合物を展開担体に展開させ、この展開担体における結合物の存在に起因する信号の強度を測定し、検出対象の量と信号強度との所定条件下における相関式に基づいて、検体中の検出対象の量を算出する。展開までの手順は前述した検出方法と共通するので、説明を省略する。
測定は、測定すべき信号の種類に応じ、従来公知の手順に従って行えばよく、肉眼で又は測定機器を用いて行ってよい。また、次に説明する相関式で用いる信号強度は、測定値そのものであってもよいし、信号強度の範囲に応じて分類された群のスコア値であってもよい。スコア値とは、例えば、以下のようなものである。
スコア0:信号が確認されず。
スコア1:信号が微弱である。
スコア2:信号が明確に確認される。
上記所定条件と同一の条件における、検出対象の量と信号強度との相関式を作成する。この相関式を構成する検出対象の量と信号強度との測定は、データが多い程に信頼性の高い相関式が得られる。そこでデータは、2点以上の検出対象の量に関するものであればよく、3点以上の検出対象の量に関するものであることが好ましい。
混合物を展開したときの信号強度値を、作成した相関式に代入することによって、検体中の検出対象の量を算出できる。
以上の検出方法で検出できる対象としては、環境汚染物質、飲食品汚染物質、臨床診断に利用される物質が挙げられ、具体的には、ダイオキシン、環境ホルモン、農薬、PCB、有機水銀等、プリオン、カビ毒、フグ毒、抗生物質、防カビ剤等、体液、尿、喀痰、糞便中等に含まれるヒトイムノグロブリンG、ヒトイムノグロブリンM、ヒトイムノグロブリンA、ヒトイムノグロブリンE、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン(フィブリン及びそれらの分解産物)、α−フェトプロテイン(AFP)、C反応性タンパク質(CRP)、ミオグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、ヒト胎盤性ラクトーゲン(HPL)、HIVウイルス抗原、アレルゲン、細菌毒素、細菌抗原、酵素、ホルモン(例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン(TSH)、インスリン等)、薬剤等が挙げられる。
本発明は、検出対象を検出及び/又は定量するためのキットも包含する。このキットは、刺激応答性ポリマーを含有する凝集性物質を持つ第1の物質と検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、親水性を有する第2の物質と前記検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物と、この結合物を展開するための展開担体と、を備える。第1の物質又は第2の物質は有色粒子を有することが好ましい。また、第1の結合物又は第2の結合物は、前記展開担体上で発色もしくは発光する物質を有することが好ましい。各構成要素の詳細は前述の通りであるので、省略する。
PBSバッファー:10倍濃度の市販のPBS(81mM Na2HPO4、14.7mM KH2PO4、26.8mM KCl、1370mM NaCl、pH7.4、ニッポンジーン(株)製)を精製水で1/10(V/V)に希釈して用いた。
精製水:MILLIPORE社製「Direct−Q」(商品名)で精製した水。
本実施例では、第1の結合物として抗TSHβ抗体結合−温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を、第2の結合物として抗TSHα抗体結合ポリアクリル酸ナトリウムを用いて、ヒト甲状腺刺激ホルモン(TSH)を検出する例を示す。
Leinco Technologies,Inc.製の抗ヒトTSHβ抗体(Anti−Human Thyroid Stimulating Hormone Beta、クローン:195マウス、クラス:マウスIgG)をsulfo−NHS−Biotinを用いて旭テクノグラス社がビオチン化し、ビオチン化抗ヒトTSHβ抗体を調製した。
まず、検出対象としてのヒト甲状腺刺激ホルモン(TSH)に対する第2の親和性物質としての抗ヒトTSHα抗体(Anti−Human Thyroid Stimulating Hormone Alpha、クローン:176マウス、マウスIgG、Leinco Technology,Inc.製、1mg/mL)1mLに2−メルカプトエタノール6mgを加え、37℃で120分間反応させた。反応後、Slide−A−Lyzer(商品名) 透析カセット、10K MWCO(Pierce)により、PBSバッファー500mLに対して透析を行って、過剰の2−メルカプトエタノールを除き、限界排除分子量10000の限外濾過膜(MILLIPORE社製[Amicon Ultra−4 Ultracel 10k])を用いて0.5mLに濃縮し、マウス抗ヒトTSHα抗体の還元抗体を得た。この還元抗体0.5mLと、100μLマレイミド化ポリアクリル酸ナトリウムとを4℃で1晩反応させ、続いてSuperdex−200 10/300GL(GEヘルスケア社製)を用いてゲル濾過することで、標識抗体を調製した。この標識抗体(この抗体は、ポリアクリル酸ナトリウム−抗ヒトTSHα抗体結合物ともいう。)を、0.5%(w/v)BSA(シグマ社製)、0.5%(w/v)Tween(登録商標)20、10mM EDTAを含有するPBSバッファー(pH7.4)でタンパク質濃度4μg/mLになるように希釈することで、第2の結合物を調製した。
TSH;Aspen Bio Pharma,Inc.製ヒト甲状腺刺激ホルモン(活性8.5IU/mg、WHO80/558)の溶液(濃度30μg/mL)を、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティクス社製「ビトロス(登録商標) TSH キャリブレータ1」で、0.06mIU/L、0.0012mIU/Lとなるよう希釈したものを、それぞれ検体2、3とした。なお、ヒト甲状腺刺激ホルモン活性を含有しないことを除き、同様の手順で調製したものを検体1とした。
第1の結合物の分散溶液150μL及び第2の結合物の分散溶液200μLをマイクロチューブ内に注ぎ、ボルテックスミキサーで1秒間撹拌した後、検体1〜3各々を50μL注ぎ、ボルテックスミキサーで撹拌した後、室温(21℃)で5分間インキュベートした。チューブから反応液全量を採り、予め37℃に保温してある反応管(図3参照)に注ぎ、37℃で5分間に亘り保温した。
図9に示されるように、検出対象を含有しない検体1では、メニスカスに対応する位置(下端から約10mm)に、凝集体中の結合物(磁性粒子)の存在に起因する茶色のバンドが確認された。これに対して、検出対象を含有する検体2、3では、メニスカスに対応する位置での茶色のバンドは確認されず、広範囲に茶色域が確認された。従って、メニスカスに対応する位置の茶色バンドの濃さが、検出対象の非存在下よりも弱い場合に、検体中に検出対象が存在すると判別できることが分かった。また、茶色域の位置がメニスカス位置に集中せず、広範囲に亘ることによっても、検体中に検出対象が存在すると判別できることが分かった。
本実施例では、第1の結合物として抗HBs抗体結合−温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を、第2の結合物として抗HBs抗体結合ポリエチレングリコールを用いて、HBs抗原を検出する例を示す。
(株)特殊免疫研究所製の抗HBsモノクローナル抗体(抗原決定基:a、クローン番号Hyb−824)を、PIERCE社製EZ−Link Sulfo−NHS−Biotin Kit,Product#21420(商品名)を用い、キットに添付のビオチン化方法に従ってビオチン化し、ビオチン化抗HBsモノクローナル抗体を調製した。
抗ヒトTSHα抗体の代わりに、(株)特殊免疫研究所製の抗HBsモノクローナル抗体(抗原決定基:d、クローン番号Hyb−3423)及び抗HBsモノクローナル抗体(抗原決定基:y、クローン番号Hyb−3457)を用いた点、及び2−メルカプトエタノールの代わりに2−メルカプトエチルアミン塩酸塩を用いた点を除き、実施例1と同様の手順で、2種類の抗HBsモノクローナル抗体の還元抗体を得た。これらの還元抗体から、マレイミド化ポリアクリル酸ナトリウムの代わりにマレイミド化ポリエチレングリコールを用いた点を除き、実施例1と同様の手順で2種類の標識抗体を得て、第2の結合物を調製した。なお、用いたマレイミド化ポリエチレングリコールは、SUNBRIGHT ME−400MA(商品名)日油(株)製 重量平均分子量40,000である。
(株)特殊免疫研究所製の精製HBs抗原を、0.5%BSA(シグマ社製)及びPBSバッファー(pH7.4)で、1000ng/mLの濃度へと希釈した。この希釈物を、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製「ビトロス(登録商標) HBs抗原(ロット番号2330)キットで陰性と判断されたヒト血清で、10ng/mLの濃度へと希釈したものを陽性検体(検体2)とした。また、このヒト血清を陰性検体(検体1)とした。
第1の結合物の分散溶液100μL、第2の結合物の分散溶液100μL及び検体5μLを用いた点を除き、実施例1と同様の手順でメンブレンフィルタへの展開を行い、メンブレンフィルタ上の様子を観察した。この結果を図10に示す。
図10に示されるように、検出対象を含有しない検体1では、メニスカスに対応する位置(図中の矢印で示す位置)に、凝集体中の結合物(磁性粒子)の存在に起因する茶色のバンドが確認された。これに対して、検出対象を含有する検体2では、メニスカスに対応する位置での茶色のバンドは確認されず、広範囲に茶色域が確認された。従って、メニスカスに対応する位置の茶色バンドの濃さが、検出対象の非存在下よりも弱い場合に、検体中に検出対象が存在すると判別できることが分かった。また、茶色域の位置がメニスカス位置に集中せず、広範囲に亘ることによっても、検体中に検出対象が存在すると判別できることが分かった。
11 刺激応答性ポリマー
13 第1の抗体(第1の親和性物質)
15 アビジン
17 ビオチン
19 磁性物質
20 第2の結合物
21 第2の物質
23 第2の抗体(第2の親和性物質)
30 展開担体
40 展開器具
41 上保持具
42 下保持具
43 供給口部
44 窓部
47 フィルタ
50 検出対象
Claims (11)
- 検体中の検出対象を検出する方法であって、
刺激応答性ポリマーを含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、親水性を有する第2の物質と前記検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物と、前記検体とを混合し、
得られた混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記混合物を展開担体に展開させ、又は得られた混合物を展開担体に展開させ、展開中の前記混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、
前記展開担体における第1の結合物又は第2の結合物の存在に起因する信号を確認し、前記信号が、前記検出対象の非存在下と異なる場合には、前記検体中に検出対象が存在すると判別する工程を含む方法であり、
第1の親和性物質と第2の親和性物質とが、前記検出対象の異なる部位に結合できる方法。 - 第1の結合物の存在に起因する信号の強度が、前記検出対象の非存在下よりも弱い場合に、前記検体中に検出対象が存在すると判別する請求項1記載の方法。
- 前記混合物は、第1の結合物の凝集体を除去した後に前記展開担体に展開させ、
第1の結合物の存在に起因する信号の強度が、前記検出対象の非存在下よりも強い場合に、前記検体中に検出対象が存在すると判別する請求項1記載の方法。 - 検体中の検出対象を定量する方法であって、
刺激応答性ポリマーを含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、親水性を有する第2の物質と前記検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物と、前記検体とを混合し、
得られた混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記混合物を展開担体に展開させ、又は得られた混合物を展開担体に展開させ、展開中の前記混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、
前記展開担体における第1の結合物又は第2の結合物の存在に起因する信号の強度を測定し、前記検出対象の量と信号強度との前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出する工程を含む方法であり、
第1の親和性物質と第2の親和性物質とが、前記検出対象の異なる部位に結合できる方法。 - 第1の結合物の凝集体の存在に起因する信号を測定する請求項4記載の方法。
- 前記混合物は、第1の結合物の凝集体を除去した後に前記展開担体に展開させ、
第1の結合物の存在に起因する信号の強度を測定する請求項4記載の方法。 - 第1の結合物は有色粒子を有し、
前記信号は、前記有色粒子の存在に基づく色に依存したものである請求項1から6いずれか記載の方法。 - 第1の結合物又は第2の結合物は、前記展開担体上で発色もしくは発光する物質を有し、
前記信号は、前記発色もしくは発光する物質の存在に基づく色又は光に依存したものである請求項1から7いずれか記載の方法。 - 検出対象を検出及び/又は定量するためのキットであって、
刺激応答性ポリマーを含有する第1の物質と前記検出対象に対する第1の親和性物質とが結合した第1の結合物と、親水性を有する第2の物質と前記検出対象に対する第2の親和性物質とが結合した第2の結合物と、
前記結合物を展開するための展開担体と、を備えるキット。 - 第1の結合物は有色粒子を有する請求項9記載のキット。
- 第1の結合物又は第2の結合物は、前記展開担体上で発色もしくは発光する物質を有する請求項9又は10記載のキット。
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