CN109613257B - 一种转铁蛋白(trf)检测试剂盒 - Google Patents

一种转铁蛋白(trf)检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及转铁蛋白（TRF）检测技术领域，特别涉及一种转铁蛋白（TRF）检测试剂盒及其制备、使用方法，试剂R1中含有缓冲液，氯化锂，L(+)‑鼠李糖，γ‑环糊精，1,2‑丙二醇，PEG‑10000，丙烯酸松香聚氧乙烯蔗糖酯，防腐剂；试剂R2中含有缓冲液，L(+)‑鼠李糖，γ‑环糊精，1,2‑丙二醇，兔抗人转铁蛋白（TRF）抗体包被胶乳颗粒，丙烯酸松香聚氧乙烯蔗糖酯，防腐剂；本发明显著改善了试剂的稳定性和线性范围，显著增强了试剂的灵敏度、抗肝素干扰能力和准确度。

Description

一种转铁蛋白(TRF)检测试剂盒
技术领域
本发明属于生化检测技术领域，具体涉及一种转铁蛋白(TRF)检测试剂盒及其制备、使用方法。
背景技术
转铁蛋白又名运铁蛋白(transferrin，TRF，siderophilin)，分子量约7.7万，为单链糖蛋白，合糖量约6％，是血浆中主要的含铁蛋白质，负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁。以TRF-Fe3+的复合物形式进入骨髓中，供成熟红细胞的生成。转铁蛋白(TRF)主要由肝细胞合成，半衰期为7天。血浆中TRF的浓度受铁供应的调节，在缺铁状态时，血浆转铁蛋白(TRF)浓度上升，经有效治疗后恢复到正常水平。
转铁蛋白(TRF)在急性时相反应中往往降低。因此在炎症、恶性病变时常随着白蛋白、前白蛋白同时下降。在慢性肝疾病及营养不良时亦下降，因此可以作为营养状态的一项指标。转铁蛋白(TRF)，连接上铁离子之后可以防止铁中毒以及通过肾的流失。其水平的升高常见于铁缺乏症、怀孕、雌性激素的控制以及类脂肪的肾病。其水平的降低常见于遗传性的缺陷、睾丸激素的控制、感染、急性炎症、某些类型的肾炎、血色素缺失、急性的疟疾以及营养不良。因此，转铁蛋白(TRF)检测具有非常重要的临床意义。
目前，测定转铁蛋白(TRF)常用方法有ELISA法、免疫比浊法等。其中ELISA法，操作繁琐，灵敏度低，检测结果多为定性；免疫比浊法，操作简单、使用方便，但灵敏度和稳定性较差，并且不抗肝素干扰。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种转铁蛋白(TRF)检测试剂盒，采用胶乳增强免疫比浊法，克服了普通免疫比浊法的灵敏度低、稳定性差、不抗肝素干扰等缺点，可以有效检测转铁蛋白(TRF)的含量，具有灵敏度高，稳定性好的优点；本发明的另一目的在于提供该检测试剂盒的制备和使用方法。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：一种转铁蛋白(TRF)检测试剂盒，其包括试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1包括如下含量的组分：
Figure BDA0001888561300000021
所述试剂R2包括如下含量的组分：
Figure BDA0001888561300000022
优化的，试剂R1中缓冲液为25℃，pH为7.35的N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(3-丙磺酸)(EPPS)缓冲液；试剂R2中缓冲液为25℃，pH为7.25的N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(3-丙磺酸)(EPPS)缓冲液。
优化的，所述防腐剂为乙内酰脲(GML-3Plus)。
优化的，兔抗人转铁蛋白(TRF)抗体包被胶乳颗粒的制备方法为：取适量粒径为约90nm与粒径280nm的表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒(比例为3∶1)，加入到pH为6.3的N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)缓冲液35ml，使胶乳颗粒终浓度为2.0％；然后加入适量兔抗人转铁蛋白(TRF)抗体、EDC，42℃下搅拌反应10小时左右，12500rpm离心25分钟，去除上清，所得沉淀即为兔抗人转铁蛋白(TRF)抗体包被胶乳颗粒。
上述的转铁蛋白(TRF)检测试剂盒的使用方法为：使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主波长为600nm，R1试剂和R2试剂的比例为4∶1。
本发明检测的基本原理为：样本中的抗原转铁蛋白(TRF)与试剂中超敏化的兔抗人转铁蛋白(TRF)抗体胶乳颗粒形成不溶性免疫复合物，在波长600nm处检测其浊度变化，其变化程度与样本中转铁蛋白(TRF)浓度成正比。
本发明的有益效果在于：
1)本发明采用胶乳增强免疫比浊法，通过优化反应体系，试剂R1和试剂R2采用N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(3-丙磺酸)(EPPS)缓冲液，并添加L(+)-鼠李糖、γ-环糊精、1，2-丙二醇等多种稳定剂，优化各稳定剂的配比，显著改善了试剂的稳定性。
2)优选的新型非离子表面活性剂丙烯酸松香聚氧乙烯蔗糖酯，可以促进并维持抗体稳定，防止体系浑浊，使试剂有抗肝素干扰能力，并且有防腐抑菌作用，显著增强了试剂的稳定性和抗干扰能力。
3)采用胶乳增强免疫比浊法，大大增强了试剂的反应灵敏度和线性范围，并且试剂的重复性和抗干扰能力更强。
4)该试剂操作简便快速，适用于自动化分析，是一种更加稳定、灵敏、抗肝素干扰的转铁蛋白(TRF)试剂，试剂的准确度和稳定性良好，抗干扰性强，使用方便，完全可以满足临床需要。
附图说明
图1为试剂稳定性对比曲线图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1
本实施例所提供的转铁蛋白(TRF)的检测试剂，包括试剂R1和试剂R2：
试剂R1的组分包括：
Figure BDA0001888561300000041
所述试剂R2包括如下含量的组分：
Figure BDA0001888561300000042
Figure BDA0001888561300000051
本实施例试剂的使用方法：
本实施例描述的转铁蛋白(TRF)检测试剂盒，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，利用终点法进行测定。将R1和R2按照4∶1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如表1。
表1试剂检测方法表
Figure BDA0001888561300000052
计算：转铁蛋白(TRF)含量(mg/dL)＝(ΔA测定÷ΔA标准)×C标准
实施例2
本实施例所描述的转铁蛋白(TRF)的检测试剂，包试剂R1和试剂R2(检测方法同实施例1)：
试剂R1的组分包括：
Figure BDA0001888561300000053
Figure BDA0001888561300000061
所述试剂R2包括如下含量的组分：
Figure BDA0001888561300000062
实施例3
本实施例所描述的转铁蛋白(TRF)的检测试剂，包试剂R1和试剂R2(检测方法同实施例1)：
试剂R1的组分包括：
Figure BDA0001888561300000063
所述试剂R2包括如下含量的组分：
Figure BDA0001888561300000071
对比例1
本对比例所描述的转铁蛋白(TRF)的检测试剂，包试剂R1和试剂R2(检测方法同实施例1)：
试剂R1的组分包括：
Figure BDA0001888561300000072
所述试剂R2包括如下含量的组分：
Figure BDA0001888561300000073
Figure BDA0001888561300000081
对比例2
本对比例所描述的转铁蛋白(TRF)的检测试剂，包试剂R1和试剂R2(检测方法同实施例1)：
试剂R1的组分包括：
Figure BDA0001888561300000082
所述试剂R2包括如下含量的组分：
Figure BDA0001888561300000083
Figure BDA0001888561300000091
对比例3
本对比例采用市场常见的国家食品药品监督管理局认可的转铁蛋白(TRF)检测试剂盒。该试剂盒未采用双胶乳颗粒，也未添加新型非离子表面活性剂丙烯酸松香聚氧乙烯蔗糖酯。
试验一
精密度试验：取具有溯源性的高值质控物(靶值380mg/dL)、低值质控物(靶值180mg/dL)各一份，分别用实施例1-3和对比例1-3配方配制试剂，进行对照检测，对每份质控物进行20次检测，将共20次检测结果计算平均值、标准差和变异系数。结果见表2。
表2-1高值质控物精密度试验数据表
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 对比例3
平均值(X) 381 382 380 388 376 388
标准偏差(S) 3.505 3.323 3.154 13.929 13.837 16.490
变异系数CV 0.92％ 0.87％ 0.83％ 3.59％ 3.68％ 4.25％
表2-2低值质控物精密度试验数据表
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 对比例3
平均值(X) 182 181 181 186 182 188
标准偏差(S) 3.294 3.367 3.421 9.151 8.827 10.622
变异系数CV 1.81％ 1.86％ 1.89％ 4.92％ 4.85％ 5.65％
由表2中变异系数可知，与对比例1-3相比，实施例1、实施例2实施例3配方配制试剂检测数值更接近靶值，标准偏差和变异系数均较小，具有更高的批内精密度，这说明本发明通过采用胶乳增强免疫比浊法(双纳米胶乳颗粒联用)，并且采用新型非离子表面活性剂丙烯酸松香聚氧乙烯蔗糖酯，科学配比L(+)-鼠李糖、γ-环糊精、1，2-丙二醇等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的批内精密度。
试验二
准确度对比试验：取具有溯源性的高值质控物(靶值380mg/dL)、低值质控物(靶值180mg/dL)各一份，分别用实施例1-3和对比例1-3配方配制试剂，制得转铁蛋白(TRF)检测试剂盒进行对照检测，各检测5次，计算平均值，与质控物靶值进行对照。结果见表3。
表3-1高值质控物准确度试验数据表
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 对比例3
最大值 382 381 383 395 379 398
最小值 378 378 379 365 361 369
平均值 381 380 381 391 362 394
表3-2低值质控物准确度试验数据表
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 对比例3
最大值 182 181 183 186 182 198
最小值 178 178 179 173 171 169
平均值 181 180 181 186 175 194
由表3中检测结果可知，与对比例1-3相比，实施例1、实施例2、实施例3配方配制试剂检测数值更接近靶值，平均值与靶值的差值在1以内，具有更高的准确度，这说明本发明通过采用胶乳增强免疫比浊法(双纳米胶乳颗粒联用)，并且采用新型非离子表面活性剂丙烯酸松香聚氧乙烯蔗糖酯，科学配比L(+)-鼠李糖、γ-环糊精、1，2-丙二醇等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的准确度。
试验三
试剂灵敏度的对比试验：取具有溯源性的校准品由低到高稀释出7个浓度样本，分别用实施例1-3和对比例1-3配方配制试剂，制得转铁蛋白(TRF)检测试剂进行对照检测，将检测结果与理论浓度相比较。结果见表4。
表4灵敏度对比试验数据表
理论浓度 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 对比例3
1mg/dL 1.02 1.10 0.99 0.10 0.21 0.05
5mg/dL 5.02 4.99 5.05 4.85 4.89 4.78
10mg/dL 10.02 10.05 9.98 9.54 9.61 9.45
100mg/dL 100.25 100.34 100.21 100.11 100.16 101.10
200mg/dL 200.59 200.68 200.32 200.26 200.35 200.24
400mg/dL 400.18 400.25 400.34 401.25 402.32 403.25
600mg/dL 601.25 600.26 601.56 585.96 582.01 580.25
由表4中检测结果可知，在样本浓度低至1mg/dL时，对比例1-3检测值为0.05～0.21，而实施例1、实施例2实施例3配方配制试剂仍可以检测出样本的准确值；并且与对比例1-3相比实施例1、实施例2实施例3配方配制试剂检测接近线性下限的低值样本(1-10mg/dL)时的准确度更高。另外，在样本浓度在线性上限600mg/dL时，对比例检测值在580.25～585.96mg/dL之间，测试值明显偏低，而实施例1、实施例2实施例3配方配制试剂仍可以检测出样本的准确值，这表明实施例1、实施例2实施例3配方配制试剂拥有更高的分析灵敏度、准确度及更宽的线性范围。因此可以这说明本发明通过采用胶乳增强免疫比浊法(双纳米胶乳颗粒联用)，并且采用新型非离子表面活性剂丙烯酸松香聚氧乙烯蔗糖酯，科学配比L(+)-鼠李糖、γ-环糊精、1，2-丙二醇等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的分析灵敏度、准确度和线性范围。
试验四
试剂抗肝素干扰的对比试验：取三组新鲜血液样本，每组样本分成三等份，分别用普通采血管(非肝素管，作为对照)、肝素钠采血管、肝素锂采血管处理，得到3组，共9个样本，分别用实施例1-3和对比例1-3配方配制试剂，制得转铁蛋白(TRF)检测试剂进行对照检测。结果见表5。
表5抗肝素干扰对比试验数据表
Figure BDA0001888561300000121
由表5中检测结果可知，与对比例1-3相比，实施例1、实施例2、实施例3配方配制试剂检测肝素钠或肝素锂处理的样本结果与非肝素处理的样本没有差异，说明实施例1-3配方配制试剂可以抗肝素干扰，而对比列1-3配方配制试剂检测肝素锂或肝素钠处理样本时，结果明显偏高，说明检测时明显受到了肝素的干扰。这说明本发明通过采用胶乳增强免疫比浊法(双纳米胶乳颗粒联用)，并且采用新型非离子表面活性剂丙烯酸松香聚氧乙烯蔗糖酯，科学配比L(+)-鼠李糖、γ-环糊精、1，2-丙二醇等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的抗肝素干扰能力。
试验五
试剂的稳定性对比试验：对实施例1-3和对比例1-3中的试剂，分别均匀分装13组，每组的试剂量为R1为20mL，R2为5mL。放置到2-8℃冰箱中，每月的同一天取出一组试剂检测转铁蛋白(TRF)质控品(靶值为180mg/dL)，检测结果如图1所示，实施例1-3试剂在2-8℃储存条件下比对比例更加稳定。
由检测结果可知，在保存13个月时，对比例1-3检测数值为140-147，与靶值相差33-40，并且检测值呈现明显的随储存时间延长而降低趋势；而实施例1、实施例2实施例3配方配制试剂检测数值为178-183，与靶值相差2-3；这表明实施例1、实施例2实施例3配方配制试剂拥有更高的稳定性。这说明本发明通过采用胶乳增强免疫比浊法(双纳米胶乳颗粒联用)，并且采用新型非离子表面活性剂丙烯酸松香聚氧乙烯蔗糖酯，科学配比L(+)-鼠李糖、γ-环糊精、1，2-丙二醇等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的稳定性。
综上所述，通过验证，本发明提供的试剂比对比例灵敏度高、重复性好、线性范围宽、抗肝素干扰，能够达到市场对产品的应用要求，并且准确度高，是一种更加稳定、良好的转铁蛋白(TRF)检测试剂盒。

Claims (4)

1.一种转铁蛋白（TRF）检测试剂盒，其特征在于：其包括试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1包括如下含量的组分：
缓冲液 32mmol/L，
氯化锂 9g/L，
L(+)-鼠李糖 6~15g/L，
γ-环糊精 8-16g/L，
1,2-丙二醇 5-15g/L，
PEG-10000 8~20g/L，
丙烯酸松香聚氧乙烯蔗糖酯 0.2~0.5g/L，
防腐剂 0.4g/L；
所述试剂R2包括如下含量的组分：
缓冲液 55mmol/L，
L(+)-鼠李糖 6~15g/L，
γ-环糊精 8-16g/L，
1,2-丙二醇 5-15g/L，
兔抗人转铁蛋白（TRF）抗体包被胶乳颗粒 0.21%~0.34%（W/V），
丙烯酸松香聚氧乙烯蔗糖酯 0.2~0.5g/L，
防腐剂 0.4g/L。
2.根据权利要求1所述的转铁蛋白（TRF）检测试剂盒，其特征在于：试剂R1中缓冲液为25℃，pH为7.35的N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(3-丙磺酸)（EPPS）缓冲液；试剂R2中缓冲液为25℃，pH为7.25的N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(3-丙磺酸)（EPPS）缓冲液。
3.根据权利要求1所述的转铁蛋白（TRF）检测试剂盒，其特征在于：所述防腐剂为乙内酰脲。
4.根据权利要求1所述的转铁蛋白（TRF）检测试剂盒的制备方法，其特征在于：兔抗人转铁蛋白（TRF）抗体包被胶乳颗粒的制备方法为：按3:1的比例取粒径为约90nm表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒与粒径280nm的表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，加入到pH为6.3的N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸（BES）缓冲液35ml，使胶乳颗粒终浓度为2.0%；然后加入适量兔抗人转铁蛋白（TRF）抗体、EDC，42℃下搅拌反应10小时左右，12500 rpm离心25分钟，去除上清，所得沉淀即为兔抗人转铁蛋白（TRF）抗体包被胶乳颗粒。
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