CN114470164A - 一种毛囊干细胞（orsc）制剂及其在神经损伤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种毛囊干细胞(ORSC)制剂及其在神经损伤中的应用，包括一种毛囊干细胞(ORSC)制剂，该毛囊干细胞(ORSC)制剂包括组分：PBS缓冲液、毛囊干细胞、海藻糖溶液、复合分化诱导剂、生长因子、增殖抑制剂。本发明涉及一种毛囊干细胞(ORSC)制剂，该制剂内添加有海藻糖溶液、复合分化诱导剂、生长因子及增殖抑制剂：海藻糖溶液在细胞表面形成保护膜，用于保持毛囊干细胞在生命机体环境内的存活率，注射后不易被生命机体清除；复合分化诱导剂和生长因子相配合用于毛囊干细胞定向分化成神经细胞；增殖抑制剂通过抑制细胞周期的进程起到抑制损伤处普通的细胞增殖，提高毛囊干细胞的分化率。

Description

一种毛囊干细胞(ORSC)制剂及其在神经损伤中的应用
技术领域
本发明是一种毛囊干细胞(ORSC)制剂及其在神经损伤中的应用，属于干细胞制剂技术领域。
背景技术
人体覆盖大约有五百万个毛囊，毛囊是由多种细胞组成的一个迷你器官，从内向外依次分为毛干、内根鞘和外根鞘，毛囊下端膨大成毛球部，容纳毛乳头，毛囊呈周期性生长，依次分为生长期、退化期和静止期，新生毛发的生长需要位于毛囊外根鞘即隆突区的细胞进入生长期，并在邻近的间质真皮乳头细胞辅助作用及干细胞微环境共同参与下形成毛芽。
毛囊干细胞则存在于毛囊隆突区，既可以向上分化成皮脂腺或表皮、或向下迁移维持毛囊的周期性生长，又因其具有完全自我更新能力及多向分化潜能，可诱导分化为脂肪、软骨、骨、血管平滑肌细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、黑色素细胞等组织特异性细胞和造血细胞，同时，由于毛囊干细胞具有数量充足、位置固定、容易获取、少并发症等优点，广泛应用于再生医学领域。
现有技术多采用注射培养的毛囊干细胞来治疗神经性损伤，对神经损伤部位进行给药，但该方法的治疗效果较差：一方面因为经培养后注射入机体的细胞容易被机体清除，另一方面不同患者对毛囊干细胞会有显著性差异，不易达到预期效果。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种毛囊干细胞(ORSC)制剂及其在神经损伤中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现，包括：
一种毛囊干细胞(ORSC)制剂，包括组分及浓度：PBS缓冲液、毛囊干细胞、海藻糖溶液、复合分化诱导剂、生长因子、增殖抑制剂；
Figure BDA0003523776890000021
一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，制备得到所述的毛囊干细胞(ORSC)制剂，具体包括以下步骤：
S1.获取毛囊干细胞；
S2.传代培养步骤S1所得的毛囊干细胞，备用；
S3.对步骤S2所得的毛囊干细胞进行指标检测，用于筛选出未染菌且具有分化能力的细胞，筛选出的细胞用于后续步骤；
S4.至少将步骤S3中符合指标检测标准的毛囊干细胞与生长因子混合，制成毛囊干细胞制剂。
优选的，一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，所述步骤S1包括：
S11.将含有毛囊的人体皮肤组织用PBS溶液反复清洗2-3次，用于去除附着在人体皮肤组织上的血污和杂质；
S12.采用两步酶消化法，将步骤S11中得到的人体皮肤组织依次浸泡在中性蛋白酶溶液和胰蛋白酶溶液中，去除皮下脂肪组织、表皮、毛发以及油脂，使得毛囊细胞被清晰观察到，得到毛囊细胞；
S13.重悬步骤S12中得到的毛囊细胞，于干细胞培养基中进行培养，得到原代毛囊干细胞，存储备用。
优选的，一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，所述步骤S2具体包括：计数步骤S13中得到的原代毛囊干细胞的密度，传代培养3-5代至毛囊干细胞的密度达到3×107-5×107个/ml，置于冻存盒中备用。
优选的，一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，所述步骤S3具体包括：对步骤S2得到的备用毛囊干细胞进行病毒和细菌检测、细胞活率检测、分化功能指标检测，选取病毒和细菌检测呈阴性、细胞活率95％以上且具有分化功能的毛囊干细胞进行存储，备用。
优选的，一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，所述步骤S4包括：
S41.将步骤S3存储的毛囊干细胞活化，重悬于海藻糖溶液内；
S42.添加复合分化诱导剂和生长因子诱导毛囊干细胞分化；
S43.添加增殖抑制剂；
S44.将步骤S43中得到的液体干细胞制剂冻干，保存。
优选的，一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，步骤S42中所添加的复合分化诱导剂为悬浮有25％鼠李糖和15％氯化锂的PBS溶液。
优选的，一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，步骤S42中所添加的生长因子为神经生长因子和人碱性成纤维细胞生长因子中的一种或两种。
优选的，一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，步骤S42中所添加的增殖抑制剂为腺苷溶液。
优选的，一种毛囊干细胞(ORSC)制剂制得的干细胞制剂在神经损伤中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明涉及一种毛囊干细胞(ORSC)制剂，该毛囊干细胞(ORSC)制剂相比于单独存储的毛囊干细胞溶液具有更好的治疗神经性损伤疾病的效果，该制剂内添加有海藻糖溶液、复合分化诱导剂、生长因子以及增殖抑制剂：海藻糖溶液在细胞表面形成独特的保护膜，保护生物分子结构不被破坏，有助于保持毛囊干细胞在存储环境以及在生命机体环境内的存活率，注射后不易被生命机体清除；复合分化诱导剂和生长因子相配合使用有助于毛囊干细胞定向分化成神经细胞；增殖抑制剂起到阻滞普通细胞增殖的过程，通过抑制细胞周期的进程起到抑制损伤处普通的细胞增殖，提高毛囊干细胞的分化率。
(2)本发明涉及一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，使用该制备方法可得到稳定的易于存储的毛囊干细胞(ORSC)制剂，提高毛囊干细胞在机体内的存活时间以及分化率，进而提高神经性损伤疾病的治疗效果。
(3)本发明涉及一种毛囊干细胞(ORSC)制剂，该毛囊干细胞(ORSC)制剂应用于治疗。
附图说明
图1为本发明所述毛囊干细胞制剂的制备方法中步骤S12得到的毛囊细胞的毛囊细胞示意图；
图2为本发明所述毛囊干细胞制剂的制备方法中步骤S2中细胞的流式分析图；
图3为本发明所述毛囊干细胞制剂的制备方法中步骤S42中神经细胞的分化染色图；
图4为本发明所述毛囊干细胞制剂的制备方法中所述印记示意图；
图5为本发明所述毛囊干细胞制剂的制备方法中所述SFI功能指数示意图；
图6为本发明所述毛囊干细胞制剂的制备方法中所述CAMP振幅示意图；
图7为本发明所述毛囊干细胞制剂的制备方法中所述CAMP发作潜伏期示意图；
图8为本发明所述毛囊干细胞制剂的制备方法中所述大鼠坐骨神经髓鞘形态组织切片采集图；
图9为本发明所述毛囊干细胞制剂的制备方法中所述脊髓前角神经元的组织形态示意图；
图10为本发明所述毛囊干细胞制剂的制备方法中所述脊髓前角神经元计数示意图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
一种毛囊干细胞(ORSC)制剂，包括组分及浓度：PBS缓冲液、毛囊干细胞、海藻糖溶液、复合分化诱导剂、生长因子、增殖抑制剂；
Figure BDA0003523776890000051
一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，包括步骤：
S11.将含有毛囊的人体皮肤组织用PBS溶液反复清洗2-3次，去除附着在人体皮肤组织上的多余的血污和杂质，再用无菌手术剪将头皮组织顺毛干方向切成2mm*5mm的皮条状，得到干净的人体皮肤组织；
S12.采用两步酶消化法，将步骤S11中得到的皮条状组织放入含有0.25％的中性蛋白酶溶液中，1％双抗中消化液4℃过夜消化，第二天将头皮组织加入含有双抗的生理盐水培养皿中清洗，将毛干顺毛囊方向夹出，去除头皮组织，放入0.25％不含EDTA的2ml胰蛋白酶溶液中，37℃消化5-10min，加入生理盐水终止反应，500G，10min离心，弃上清，将沉淀用4ml ORSC完全培养基重悬加入到T25瓶中，得到毛囊细胞，得到的毛囊细胞如图1所示；
S13.重悬步骤S12中得到的毛囊细胞，于干细胞培养基中进行培养，得到原代毛囊干细胞，存储备用。
S2.传代培养步骤S1所得的毛囊干细胞，具体包括：计数步骤S13中得到的原代毛囊干细胞的密度，传代培养3-5代至毛囊干细胞的密度达到3×107-5×107个/ml，取部分置于冻存盒中备用，同时用2.5g/L的胰蛋白酶消化培养3-5代的细胞，用含体积分数为1％小牛血清白蛋白的PBS溶液调整细胞密度至1×104个/μL，再分别加入鼠抗人单克隆抗体CD73、CD90、CD105、CD34、CD45以及HLA-DR，4℃内静置孵育30min，PBS溶液洗涤1次，直标单抗直接上机检测，间标单抗再加兔抗鼠FITC二抗，4℃内静置孵育30min，PBS溶液洗涤2次，随后使用流式细胞仪进行分析，同时以PBS溶液代替一抗且正常加入FITC二抗做为空白对照一起进行流式细胞分析，分析结果如图2所示，其中图2(a)为加入抗体CD73的细胞分析结果、图2(b)为加入抗体CD90的细胞分析结果、图2(c)为加入抗体CD105的细胞分析结果、图2(d)为加入抗体CD34的细胞分析结果、图2(e)为加入抗体CD45的细胞分析结果、图2(f)为加入抗体HLA-1的细胞分析结果、图2(g)为空白对照的细胞分析结果；当传代培养3-5代且毛囊干细胞的密度达到3×107-5×107个/ml时，既能保证后续制备的毛囊干细胞制剂达到标准含量，当该密度在3-5代达到时，其毛囊干细胞的群体倍增水平也能保证毛囊干细胞制剂的细胞活率以及分化率；
S3.对步骤S2所得的毛囊干细胞进行指标检测，用于筛选出未染菌且具有分化能力的细胞，筛选出的细胞用于后续步骤，具体包括：对步骤S2得到的备用毛囊干细胞进行病毒和细菌检测、细胞活率检测、分化功能指标检测，选取病毒和细菌检测呈阴性、细胞活率95％以上且具有分化功能的毛囊干细胞进行存储，备用；指标检测主要用于检测毛囊干细胞在培养过程中是否被病毒或细菌污染，一方面可以得到纯净的毛囊干细胞，另一方面防止病毒或细菌污染后续制成的毛囊干细胞制剂，影响毛囊干细胞制剂的分化效果或引起人体的排异反应；
S41.将步骤S3存储的毛囊干细胞活化，重悬于海藻糖溶液内；海藻糖为由两个葡萄糖分子组成的非还原性双糖，常以二水化合物的形式存在，是一种典型的应激代谢物，能够在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面形成独特的保护膜，保护生物分子结构不被破坏，将毛囊干细胞重悬于海藻糖溶液内，有助于保持毛囊干细胞在存储环境以及在生命机体环境内的存活率，注射后不易被生命机体清除，除可以包覆在毛囊干细胞外，还可与鼠李糖、神经生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、腺苷等生物活性物质结合，保护其生物活性；
S42.添加复合分化诱导剂和生长因子诱导毛囊干细胞分化；其中复合分化诱导剂为悬浮有25％鼠李糖和15％氯化锂的PBS溶液，生长因子为神经生长因子和人碱性成纤维细胞生长因子中的一种或两种，细胞的分化结果如图3所示；首先，氯化锂溶液具有增加细胞活性的作用，且在毛囊干细胞分化的过程中，合适浓度的氯化锂溶液还可以通过激活其Wnt/β-catenin信号通路、且上调通路下游各因子转录的方式促进毛囊干细胞的分化，加快分化的成功率，其次，氯化锂溶液具有抗炎的能力，对神经性损伤的再生性修复具有积极作用，最后，氯化锂离子可以与鼠李糖上的官能团结合，随鼠李糖进入机体神经性损伤处，辅助毛囊干细胞分化成神经细胞；添加在复合分化诱导剂中的鼠李糖一方面具有激活T淋巴细胞、增强巨噬细胞和吞噬细胞的作用，可以进一步提高人体的免疫力，以免引起机体过强的排异反应将毛囊干细胞清除，另一方面，鼠李糖具有强大的渗透力，可迅速被人体吸收，辅助携带毛囊干细胞制剂中的毛囊干细胞以及其余物质到达进入神经性损伤的位置，快速起到治疗作用；神经生长因子的添加使得毛囊干细胞的分化大部分朝向神经细胞分化，且人碱性成纤维细胞生长因子作为传递发育信号，能促进中胚层和神经外胚层细胞分裂，刺激分化细胞的增殖和迁移；
S43.添加增殖抑制剂；其中增殖抑制剂为腺苷溶液；腺苷溶液可导致细胞增殖过程中G0/G1期细胞增多，阻滞增殖过程，通过抑制细胞周期的进程起到抑制损伤处普通的细胞增殖，提高毛囊干细胞的分化率；
S44.将步骤S43中得到的液体干细胞制剂冻干，保存。
实施例2
按照实施例1所述制备方法制备该毛囊干细胞(ORSC)制剂，组分及浓度如下：
Figure BDA0003523776890000081
实施例3
按照实施例1所述制备方法制备该毛囊干细胞(ORSC)制剂，组分及浓度如下：
Figure BDA0003523776890000082
实施例4
一种毛囊干细胞(ORSC)制剂制得的干细胞制剂在神经损伤中的应用。
试验例1坐骨神经损伤大鼠模型建模
选取30只健康的SD大鼠，随机选取25只分为5组，依次列为实验1组至实验5组，并建立坐骨神经损伤大鼠模型，余下5只作为空白对照组。
对雄性大鼠行腹腔注射麻醉，再将大鼠俯卧位固定于鼠固定架上，铺孔巾并暴露鼠左下肢并剪掉鼠毛。碘酒、酒精消毒三遍，于左侧股后正中行纵行、长约6-8mm切口，暴露皮下肌肉。用止血钳钝性分离股二头肌、半腱肌、半膜肌后，分离出白色、粗大的坐骨神经，刺激后左足出现抽动。距坐骨结节6-8mm处定位；用大止血钳夹闭坐骨神经干，压满3扣；挤压5秒钟后松开止血钳，间隔10秒后再夹闭5秒钟，再放松10秒，第三次再夹闭5秒。神经干挤压伤宽度约3mm。9-0无创缝线标记后，将坐骨神经送回原位，整理肌肉，缝合创口；假手术组大鼠麻醉后，仅切开皮肤暴露左侧坐骨神经但不做钳夹，在相应部位相同方法标记后缝合。
使用33号头针和定制的50μl柱塞注射器，将5μl浓度为5×104的毛囊干细胞(ORSC)制剂注射到远端神经残端的神经外膜中。在神经横断过程结束时，全身组中的所有动物均通过尾静脉注射相应的1×106实施例1所述的毛囊干细胞(ORSC)制剂，注射时间持续2周，定时每周注射一次。相同条件下，余下1组后足神经性损伤大鼠模型，定义为对比组，注射不含复合分化诱导剂、生长因子以及增殖抑制剂的毛囊干细胞溶液；空白对照组也在相同条件下注射相同体积的PBS溶液。
伤口闭合后，所有大鼠均接受0.05mg/kg丁丙诺啡(buprenorphine)，并在术后监测感染或困扰的迹象。
试验例2足印试验
在坐骨神经损伤手术后3、7、10和14天时进行SD大鼠的足迹分析。具体的，将大鼠的后爪浸入无毒的手指涂料中。然后让大鼠在狭窄的100×10厘米规格的木制轨道上行走。获得的足迹用以计算SFI。
制备大鼠足印行走箱，从第一次注射时起连续2周定时观察SD大鼠的活动情况，在第3、7、10、14天时记录大鼠行走时的后足足印，这些后足足印包括正常脚足印(N)和实验脚足印(E)，根据足印深浅判断大鼠后足神经恢复程度；同时，从5组实验组中任意抽取1组并结合对照组进行步行轨迹分析，其轨迹分析结果如图4的印记示意图所示。
选取全部的实验组和对照组，根据后足足印计算SFI以评估大鼠的运动功能恢复，具体的：PL为打印长度，表示从脚跟到第三脚趾的距离；TS为脚趾展开，表示从第一脚到第五脚的距离；IT为中间脚趾传播，表示第二至第四脚趾之间的距离。此试验例中SFI的具体分析公式为SFI＝-38.3×(EPL-NPL)/NPL+109.5×(ETS-NTS)/NTS+13.3×(EIT-NIT)/NIT-8.8，SFI的具体数值-100时表示坐骨神经完全被挤压或横断，0时表示大鼠具有完整的坐骨神经，SFI的计算结果如图5所示。
试验例3电生理测试
将所有大鼠麻醉以进行坐骨神经电生理检查，用双通道便携式数字微型EMG设备制作电生理记录，具体的，在大鼠坐骨神经周围放置一个双极刺激电极，靠近损伤部位，双极将记录电极放置在腓肠肌中(距刺激点60mm)、刺激强度为10mA、并通过20Hz低通和2000Hz高通滤波器处理复合肌肉动作电位记录CMAP的振幅和发作潜伏期，CMAP振幅示意图如图6所示，CMAP发作潜伏期示意图如图7所示。
试验例4大鼠坐骨神经髓鞘形态组织切片观察
在第7天和第14天时随机选取大鼠，通过四氧化锇对髓磷脂进行染色，具体的，将大鼠坐骨神经髓鞘形态组织在低聚甲醛中固定12小时，然后在水中浸泡9小时，将片段在1％四氧化锇中染色12小时，通过分级乙醇系列脱水，浸入二甲苯中并用石蜡包埋，然后使用低温恒温器切成5μm厚的横截面，使用解剖显微镜以400倍放大倍数采集图像，再使用ImageJ软件测量轴突和纤维直径。髓磷脂厚度和g-比值计算如下：髓磷脂厚度＝(纤维直径-轴突直径)/2；髓磷脂厚度＝(纤维直径-轴突直径)/2；g比率＝轴突直径/纤维直径。其中，大鼠坐骨神经髓鞘形态组织切片采集图的示意图如图8所示，图中箭头表示髓磷脂，由该图中可观察到髓磷脂的密度。
试验例5试剂盒检测
大鼠观察期间第3、7、10、14天定时随机从每组中抽取2只大鼠进行抽血，利用大鼠神经元细胞鉴定试剂盒进行神经元数量的检测，数据如表1所示，表中○表示注射部位检测到的神经元含量较多；□表示注射部位检测到较少的神经元含量；×表示注射部位未检测到正常含量的神经元。
表1大鼠后足神经恢复程度
Figure BDA0003523776890000111
由表1可以看出，由实施例2中所述制备方法制得的毛囊干细胞(ORSC)制剂在神经性损伤中具有良好的治疗效果，且注射实施例3-6中所述毛囊干细胞(ORSC)制剂比只单独注射毛囊干细胞溶液具有更好的治疗效果，当海藻糖溶液浓度约为75mg/ml、氯化锂溶液浓度为25ng/ml、同时添加神经生长因子和人碱性成纤维细胞生长因子、腺苷溶液浓度为1.5μg/ml时具有最好的治疗效果。
试验例6脊髓腹角神经元染色
随机选取第14天的大鼠，使用免疫组织化学和单克隆抗体NeuN评估神经元的生存能力，将石蜡横向切片脱蜡并脱水，进行抗原回收，并使用过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，将组织学切片在潮湿的暗室中与一抗NeuN一抗(1：200)孵育2小时，加入二抗(1：500；兔来源的多克隆抗体)，将切片孵育30分钟。反应用3-3'二氨基联苯胺过氧化物酶。将切片用水洗涤，脱水，并用盖玻片固定在载玻片上进行观察，观察结果如图9所示。使用Image-ProPlus 6.0软件分别对第7天和第14天的大鼠的神经元进行计数，计数结果如图10所示。
由表2可以看出，由此制备方法制得的毛囊干细胞(ORSC)制剂在神经性损伤中具有良好的治疗效果，且经大鼠神经元细胞鉴定试剂盒检测注射部位的神经元含量发现，神经元含量与大鼠后足恢复程度成正比，证明此制备方法的可行性以及其所得的毛囊干细胞(ORSC)制剂的有效性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种毛囊干细胞(ORSC)制剂，其特征在于，包括组分及浓度：PBS缓冲液、毛囊干细胞、海藻糖溶液、复合分化诱导剂、生长因子、增殖抑制剂；
Figure FDA0003523776880000011
2.一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，其特征在于，制备得到如权利要求1所述的毛囊干细胞(ORSC)制剂，具体包括以下步骤：
S1.获取毛囊干细胞；
S2.传代培养步骤S1所得的毛囊干细胞，备用；
S3.对步骤S2所得的毛囊干细胞进行指标检测，用于筛选出未染菌且具有分化能力的细胞，筛选出的细胞用于后续步骤；
S4.至少将步骤S3中符合指标检测标准的毛囊干细胞与生长因子混合，制成毛囊干细胞制剂。
3.根据权利要求2所述的一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括：
S11.将含有毛囊的人体皮肤组织用PBS溶液反复清洗2-3次，用于去除附着在人体皮肤组织上的血污和杂质；
S12.采用两步酶消化法，将步骤S11中得到的人体皮肤组织依次浸泡在中性蛋白酶溶液和胰蛋白酶溶液中，去除皮下脂肪组织、表皮、毛发以及油脂，使得毛囊细胞被清晰观察到，得到毛囊细胞；
S13.重悬步骤S12中得到的毛囊细胞，于干细胞培养基中进行培养，得到原代毛囊干细胞，存储备用。
4.根据权利要求3所述的一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括：计数步骤S13中得到的原代毛囊干细胞的密度，传代培养3-5代至毛囊干细胞的密度达到3×107-5×107个/ml，置于冻存盒中备用。
5.根据权利要求4所述的一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：对步骤S2得到的备用毛囊干细胞进行病毒和细菌检测、细胞活率检测、分化功能指标检测，选取病毒和细菌检测呈阴性、细胞活率95％以上且具有分化功能的毛囊干细胞进行存储，备用。
6.根据权利要求5所述的一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S4包括：
S41.将步骤S3存储的毛囊干细胞活化，重悬于海藻糖溶液内；
S42.添加复合分化诱导剂和生长因子诱导毛囊干细胞分化；
S43.添加增殖抑制剂；
S44.将步骤S43中得到的液体干细胞制剂冻干，保存。
7.根据权利要求6所述的一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，其特征在于：步骤S42中所添加的复合分化诱导剂为悬浮有25％鼠李糖和15％氯化锂的PBS溶液。
8.根据权利要求6所述的一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，其特征在于：步骤S42中所添加的生长因子为神经生长因子和人碱性成纤维细胞生长因子中的一种或两种。
9.根据权利要求6所述的一种毛囊干细胞(ORSC)制剂的制备方法，其特征在于：步骤S42中所添加的增殖抑制剂为腺苷溶液。
10.权利要求7至9任一所述的一种毛囊干细胞(ORSC)制剂制得的干细胞制剂在神经损伤中的应用。
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