CN107412265B - 治疗早老症或早衰症的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗早老症或早衰症的方法。具体地说，本发明属于细胞治疗技术领域，涉及一种治疗早老症或早衰症的方法，特别是涉及一种用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂，特别是涉及一种包括GD2+基质细胞和KDR+造血干细胞的治疗剂。进一步的，本发明涉及GD2+基质细胞和KDR+造血干细胞二者组合在制备用于治疗早老症或早衰症或者用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂中的用途。已经发现，本发明治疗剂可以有效地用于治疗早老症或早衰症，特别是用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退。

Description

治疗早老症或早衰症的方法

技术领域

本发明属于细胞治疗技术领域，涉及一种治疗早老症或早衰症的方法，特别是涉及一种用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂，特别是涉及一种包括GD2+基质细胞和KDR+造血干细胞的治疗剂。进一步的，本发明涉及GD2+基质细胞和KDR+造血干细胞二者组合在制备用于治疗早老症或早衰症或者用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂中的用途。已经发现，本发明治疗剂可以有效地用于治疗早老症或早衰症，特别是用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退。

背景技术

衰老可以分为生理性衰老和病理性衰老，生理性衰老是机体发育成熟后，随时间推移，发生渐进性的生物体结构和组织功能的退化，而病理性衰老是疾病或异常因素所导致的衰老加速，比如早衰症等。

早衰症(儿童早老症)属遗传病，身体衰老的过程较正常快5至10倍，患者样貌像老人，器官亦很快衰退，造成生理机能下降。病征包括身材瘦小、脱发和较晚长牙。患病儿童一般只能活到7至20岁，大部分都会死于衰老疾病，如心血管病，现未有有效的治疗方法，只靠药物针对治疗.

1999年《science》杂志评选出的10大科学进展中，干细胞的研究工作格外令人瞩目。一方面揭示了许多有关细胞生长和发育的基础理论难题；另一方面，干细胞可望将其用于创伤修复、神经再生和抗衰老等临床医学研究。2007年英国科学家Anastasia在自然杂志撰文指出成体干细胞对人体自我修复和组织再生至关重要，成体干细胞减少是人体衰老的主要原因。

作为成体干细胞之一的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有多向分化潜能、免疫调节和自我复制等特点，日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。

间充质干细胞能增加血管内皮生长因子等的表达，在抗衰老方面起重要作用。大量研究表明成年人干细胞类型和功能特性的变化可能随着年龄的增长有病变发生。特别是氧化代谢应激和慢性抑郁作用增加端粒的消耗及在DNA修复方面的消耗，会引起DNA的破坏和基因的不稳定，导致在复制过程中发生衰老和死亡。修复衰老可以用来预防与衰老相关的紊乱，包括造血免疫紊乱，心力衰竭及心血管病神经功能降低症、肌肉和肠道疾病、动脉粥样硬化及恶性肿瘤等疾病。

目前认为衰老是细胞活性的降低，最终导致细胞、组织和器官的衰老，因此衰老即是细胞的衰老。在机体中衰老和再生同时在生物体内存在，衰老的进程大于再生的能力即会衰老。如果细胞能永生化，那组织衰老的进程将被延缓甚至阻断。干细胞目前已经在动物实验得以印证具有抗衰老的作用，并且部分干细胞已经应用于临床抗衰老中，这些干细胞具有提高组织功能，改善组织形态等方面已经取得确切疗效，考虑到干细胞有抗原识别作用，干细胞提升机体抗自由基能力，从整体上调控机体的功能状态，是一种全身性、系统性、根本性的延年益寿。间充质干细胞不仅安全、可靠，而且无免疫排斥，也无不良反应。可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，尤其对治疗衰老和组织器官损伤修复有很大的临床应用价值。

早在2009年韩忠朝教授的研究小组发现GD2+间充质干细胞较未分选的间充质干细胞相比，GD2+间充质干细胞分化能力明显增强，另外，在GD2+间充质干细胞中胚胎干细胞标志SSEA-4、Oct-4、Sox-2、Nanog的表达也明显提高。

造血干细胞(通常缩写为HSC)，是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞，同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。

一般来说，造血干细胞存在于三个部位，分别是骨髓、外周血和脐带血，根据其来源分别称之为骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞和脐带血造血干细胞。随着医学和生物技术的发展，近年来研究发现人类足月胎盘存在大量的造血干细胞，胎盘血内含有丰富的各种阶段早期造血干细胞，其含量大约是脐带血的十几倍，一个胎盘中的造血干细胞可完全满足于两个成年人的需求，若能和脐带血细胞一起应用于病人，无疑大大增加了造血干细胞的含量，这使造血干细胞可完全应用于所有的适用人群。而且这些胎盘造血干细胞在冷冻储存前后都可以分离出来。胎盘造血干细胞菌落形成单位(CFU)的活性是确定的，在免疫缺陷鼠中的移植实验已经证明胎盘造血干细胞在移植中的潜力。另外,移植胎盘造血干细胞的配型要求不需要很严格，且移植后反应较轻且不需要采用药物。此外，作为胎盘造血干细胞来源-胎盘，来源广泛，孕妇生产后往往成为废弃物，其采集不会引起母亲和新生儿任何不适的感觉或产生任何不良的影响。诸多优点使胎盘造血干细胞有望取代骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞和脐带血造血干细胞用于造血干细胞移植中。这些结果有力地表明，人类足月胎盘有可能成为一种新型的用于移植的造血干细胞的来源。

早在2014年哈佛大学干细胞研究所Amy Wagers研究小组，发现年轻的小数血液可以使年老的小鼠返老还童，这项令世人瞩目的研究成果被《科学》杂志评为十大科学突破之一。2017年《自然》杂志发表的最新研究表明年轻人的血液中存在一种可以抗衰老的蛋白质，可以逆转衰老症状，包括记忆力减退、肌肉功能减弱、新城代谢的减少以及骨骼结构的丧失。这些研究表明造血干细胞具有抗衰老的功能。

人骨髓、脐血、正常或动员的外周血来源的CD34+细胞中的0.1％～0.5％表达血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth facror receptor 2，VEGFR 2)，这种受体亦被称为KDR或Flk-1。在1999年Zieglar研究小组发现，在在造血干细胞移植中，只有KDR+造血干细胞可以成功植入，而CD34+KDR-细胞无法植入。限制性稀释实验表明：能长期持续植入的细胞均为KDR+，骨髓中的CD34+KDR+细胞有20％为HSC。HSC存在于CD34+KDR+亚群，而造血祖细胞存在于CD34+KDR-亚群，因而应用KDR可将造血干/祖细胞区分开来。

机体机能老化和脏器功能衰退较为特殊且典型的表现为早老症(人们通常亦称为早衰症)。修复机体机能老化以及延缓脏器功能衰退是治疗早老症的必要手段。令人遗憾的是，迄今为止临床上尚无有效的治疗早老症的方法。

因此，本领域技术人员迫切期待有一种有效的方法来治疗早老症或早衰症，从而实现修复机体机能老化以及延缓脏器功能衰退的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有效的方法来延缓和治疗早老症或早衰症，从而实现修复机体机能老化以及延缓脏器功能衰退的目的。本发明人出人意料地发现，使用间充质干细胞与造血干细胞可以有效地修复机体机能老化以及延缓脏器功能衰退，从而达到治疗早老症或早衰症的目的。本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明一方面提供了间充质干细胞与造血干细胞组合在制备用于治疗早老症或早衰症或者用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂中的用途。

根据本发明第一方面的用途，其中所述间充质干细胞是GD2+基质细胞。

根据本发明第一方面的用途，其中所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的间充质干细胞。

根据本发明第一方面的用途，其中所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的GD2+基质细胞。

根据本发明第一方面的用途，其中所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的GD2+基质细胞，且GD2阳性表达率大于90％，例如大于95％。

根据本发明第一方面的用途，其中所述间充质干细胞的细胞悬液中，添加有甘氨酸和甘露醇。在一个实施方案中，所述间充质干细胞的细胞悬液中添加有甘氨酸和甘露醇，每10⁶个细胞添加的0.5μmol甘氨酸和0.05μmol甘露醇。已经出人意料的发现，当在注射的间充质干细胞中添加适量的甘氨酸和甘露醇，在明显降低间充质干细胞的情况下可以得到与高间充质干细胞用量基本相同的生物学效果，这一意义是非同寻常的，原因在于间充质干细胞的来源稀缺。上述甘氨酸和甘露醇可以预先就添加到间充质干细胞的细胞悬液中，亦可以在间充质干细胞注射到生物体内之前添加到细胞悬液中。

根据本发明第一方面的用途，其中所述造血干细胞来源于：脐带血、骨髓、胎盘血、和/或动员外周血。

根据本发明第一方面的用途，其中所述造血干细胞是KDRKDR阳性表达的造血干细胞。

根据本发明第一方面的用途，其中所述造血干细胞是KDR阳性表达的造血干细胞，该KDR阳性表达的造血干细胞中KDR阳性表达率大于85％，例如大于90％。

根据本发明第一方面的用途，其中所述造血干细胞中CD34阳性表达率大于80％，例如大于85％。

根据本发明第一方面的用途，其中所述治疗剂呈药盒的形式，该药盒中包括单独密封包装的间充质干细胞和单独密封包装的造血干细胞。

根据本发明第一方面的用途，其中所述治疗剂在用于哺乳动物，例如人时所述间充质干细胞的剂量每次用量是每公斤患者体重用量为(0.1～10)×10⁵个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为(0.5～5)×10⁵个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为(0.75～1.5)×10⁵个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为10⁵个基质细胞。

根据本发明第一方面的用途，其中所述治疗剂在用于哺乳动物，例如人时所述造血干细胞的剂量每次是每公斤患者体重用量为(1～5)×10⁷个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为(2～4)×10⁷个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为3×10⁷个单个核细胞。或者，在一个实施方案中，其中所述治疗剂在用于哺乳动物，例如人时所述造血干细胞的剂量每次是每公斤患者体重用量为(2～10)×10⁵个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为(2～5)×10⁵个单个核细胞，例如每公斤体重用量为(2～4)×10⁵个单个核细胞。

根据本发明第一方面的用途，其中所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时，先使用间充质干细胞，在1个月之后使用造血干细胞。

进一步的，本发明第二方面提供了一种用于治疗早老症或早衰症或者用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂，其呈药盒的形式，该药盒中包括单独密封包装的间充质干细胞和单独密封包装的造血干细胞。

根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述间充质干细胞是GD2+基质细胞。

根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的间充质干细胞。

根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的GD2+基质细胞。

根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的GD2+基质细胞，且GD2阳性表达率大于90％，例如大于95％。

根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述间充质干细胞的细胞悬液中，添加有甘氨酸和甘露醇。在一个实施方案中，所述间充质干细胞的细胞悬液中添加有甘氨酸和甘露醇，每10⁶个细胞添加的0.5μmol甘氨酸和0.05μmol甘露醇。

根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述造血干细胞来源于：脐带血、骨髓、胎盘血、和/或动员外周血。

根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述造血干细胞是KDR阳性表达的造血干细胞。

根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述造血干细胞是KDR阳性表达的造血干细胞，该KDR阳性表达的造血干细胞中KDR阳性表达率大于85％，例如大于90％。

根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述造血干细胞中CD34阳性表达率大于80％，例如大于85％。

根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时所述间充质干细胞的剂量每次用量是每公斤患者体重用量为(0.1～10)×10⁵个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为(0.5～5)×10⁵个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为(0.75～1.5)×10⁵个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为10⁵个基质细胞。

根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时所述造血干细胞的剂量每次是每公斤患者体重用量为(1～5)×10⁷个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为(2～4)×10⁷个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为3×10⁷个单个核细胞。或者，在一个实施方案中，其中所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时所述造血干细胞的剂量每次是每公斤患者体重用量为(2～10)×10⁵个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为(2～5)×10⁵个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为(2～4)×10⁵个单个核细胞。

根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时，先使用间充质干细胞，在1个月之后使用造血干细胞。

本发明所用的间充质干细胞可以使用本领域已知的方法来制备。

例如，对于通过胎盘获得的间充质干细胞，可以参照中国专利申请号201210292509.9中的方法获得，例如通过该文献方法获得的GD2阳性表达率不低于90％的GD2+基质细胞。在一个实例中，获得该GD2+基质细胞的方法包括以下步骤：

(1)胎盘组织清洗：胎盘组织是在生物安全柜内进行处理，根据胎盘大小使用适量PBS缓冲液对胎盘组织进行冲洗2-3遍，使胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液凝块；

(2)胎盘组织消化处理：使用手术剪从步骤(1)得到的胎盘组织上剪下胎盘小叶，把小叶转移到培养皿上，加入25ml PBS缓冲液并把胎盘小叶尽量剪碎，加入25ml 0.25％胰酶(Gibco)(胰酶跟PBS缓冲液体积比例为1:1)并混匀组织，把培养皿放进37℃的恒温摇床里消化20分钟；

(3)胎盘组织过滤处理：往培养皿里加入5ml FBS(Gibco)并混匀以达到终止消化的目的，把消化过后的胎盘组织碎片转移到200目金属过滤器上，对胎盘组织碎片进行研磨并利用另一培养皿收集过滤完的液体，分开两次往金属过滤器加入10ml的PBS缓冲液清洗组织并继续研磨，将收集的滤液转移至50ml离心管，以速度1400rpm离心10分钟，去除上清液并加入PBS缓冲液重悬细胞，以速度1400rpm离心10分钟，去除上清液，加入PBS缓冲液重悬细胞，抽取小量样本进行细胞计数，以速度1400rpm离心10分钟以达到清洗细胞的效果；

(4)配制胎盘全细胞冻存液：所述胎盘全细胞冻存液中包含15重量份的人血白蛋白、10重量份的DMSO(二甲基亚砜)和65重量份的DMEM-F12，配好的冻存液放在4℃冰箱保存直至使用；

(5)胎盘全细胞冻存：将步骤(3)得到的胎盘组织过滤液离心后去除上清液，在4℃的低温环境下，加入步骤(4)得到的全细胞冻存液，然后以每一管每毫升4×10⁷到1×10⁸的细胞密度加入冻存管里，此过程需在4℃的低温条件下进行，将冻存管放入程序降温盒里，先在4℃的温度条件下低温冷藏0.5小时，再-80℃的温度条件下冷冻1天，然后将冻存管于液氮中冷冻，备用；

必要时，可以进一步地包括与冻存方法配套使用的复苏方法：

(6)冻存胎盘全细胞复苏:将步骤(4)冷冻的胎盘全细胞从液氮中取出，放在恒温水浴里解冻至一半冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基(其例如包含15％FBS+1％L-Glutamine+0.05％Gentamicin+84％DMEM-F12)进行点滴法清洗胎盘全细胞，解冻获得的细胞悬液与间充质干细胞培养基的体积比为1:3(1ml:3ml)，将混合有间充质干细胞培养基的细胞悬液转移到离心管，以速度1400rpm离心10分钟清洗DMSO，去除上清液，加入PBS缓冲液重悬细胞，并以1份细胞悬液比2-3份红细胞裂解液的比例加入红细胞裂解液(Roche)，在15-25℃的环境下培养10-15分钟，放进离心机以速度1400rpm离心10分钟进行离心，离心后去除上清液，观察红细胞裂解情况，如有需要再重复红细胞裂解的步骤进行裂解，最后加入PBS缓冲液重悬细胞并抽取小量样本进行细胞计数，放进离心机以速度1400rpm离心10分钟进行离心以清洗细胞，去除上清液；

必要时，可以进一步地包括复苏后间充质干细胞分离和扩增的方法：

(7)细胞培养：向步骤(6)得到的全细胞中补加适量的间充质干细胞培养基重悬细胞，转移到T25培养瓶，再将T25培养瓶放进CO2浓度为5％的37℃培养箱中进行培养，培养至第6天时将T25培养瓶从培养箱中取出，进行第一次半换液，继续培养，在第9天时将T25培养瓶从培养箱中取出，进行第二次半换液，在第12天把平皿里面的培养基抽走，加入15ml间充质干细胞培养基继续培养，往后每2天进行一次全换液；

(8)细胞传代：当T25培养瓶里面的贴壁细胞融合率达到80％左右，可利用消化酶(TrypLE Express)将贴壁细胞脱离T25培养瓶底部，离心后移除上清液，并加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，接种于T25细胞培养瓶进行传代，并进行扩增培养；此后每两天换液一次直至融合率达到80％后，即得(可在其中补充甘氨酸和甘露醇，以用于生物体注射治疗；或者在其经传代、冻存等处理后，在用于生物体注射治疗之前向其中补充甘氨酸和甘露醇)，必要时再进行传代。

必要时，可以进一步地针对以上步骤(8)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；

必要时，可以进一步地将以上步骤(8)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存，备用。

在上述获得的GD2阳性表达率不低于90％的GD2+基质细胞的这种胎盘间充质干细胞过程中，对所获得的细胞进行GD2阳性表达率检测，选取GD2阳性表达率不低于90％例如不低于95％的GD2+基质细胞作为本发明使用的间充质干细胞。

又例如，对于通过脐带获得的间充质干细胞，可以参照中国专利申请号201210159916.2中的方法获得，例如通过该文献方法获得的GD2阳性表达率不低于90％的GD2+基质细胞。在一个实例中，获得该GD2+基质细胞的方法包括以下步骤：

(1)配制脐带组织冻存液：所述脐带组织冻存液中包含80重量份的人血白蛋白和10重量份的DMSO(二甲基亚砜，dimethyl sulfoxide)，配好的冷存液放在4℃冰箱保存直至使用；

(2)消毒和清洗：在生物安全柜中，用酒精对脐带组织表面进行消毒，将脐带从中间剪开，平铺在无菌10cm细胞培养平皿上，利用PBS清洗组织，以减小组织上面的红细胞；

(3)脐带组织处理：将步骤(2)得到的脐带组织转移至另一个10cm细胞培养平皿中，将脐带组织剪成大小1cm3的正方形状；

(4)脐带组织冷存：在4℃的低温环境下，将组织块和冻存液加入冻存管中，然后将冻存管放入程序降温盒，先在4℃的温度条件下低温冷藏0.5小时，再-80℃的温度条件下冷冻1天，然后将冻存管于液氮中冷冻，备用；

必要时，可以进一步地包括与冻存方法配套使用的复苏方法：

(5)冻存脐带组织复苏：将步骤(4)冷冻的脐带组织从液氮中取出，放在恒温水浴里解冻至一半冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基(其例如包含15％FBS+1％L-Glutamine+0.05％Gentamicin+84％DMEM-F12)进行点滴法清洗脐带组织，利用100um过滤器将废液去掉；

必要时，可以进一步地包括复苏后间充质干细胞分离和扩增的方法：

(6)脐带组织贴壁处理：将复苏的冻存脐带组织平铺于另一个10cm细胞培养平皿中，每个平皿中的组织块数量维持在10-15块，使组织块风干10-15分钟直至组织贴在平皿上；

(7)脐带组织培养：沿平皿边缘慢慢加入间充质干细胞培养基(其例如包含15％FBS+1％L-Glutamine+0.05％Gentamicin+84％DMEM-F12)至组织淹没即可；将平皿置于CO2浓度为5％的37℃培养箱进行培养，培养至第五天时将平皿从培养箱取出，补加5ml间充质干细胞培养基；在第十天将平皿内的培养基转移，加入15ml新鲜的间充质干细胞培养基；在第十二天清除所有脐带组织块并继续培养，此后每两天进行一次全换液；

(8)细胞传代：当平皿里面的贴壁细胞融合率达到60％左右，可利用消化酶(TrypLE Express)将贴壁细胞脱离平皿底部，离心后移除上清液，并加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，接种于T25细胞培养瓶进行传代，并进行扩增培养；此后每两天换液一次直至融合率达到80％后，即得(可在其中补充甘氨酸和甘露醇，以用于生物体注射治疗；或者在其经传代、冻存等处理后，在用于生物体注射治疗之前向其中补充甘氨酸和甘露醇)，必要时再进行传代；

必要时，可以进一步地针对以上步骤(8)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；

必要时，可以进一步地将以上步骤(8)所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冻存，备用。

在上述获得的GD2阳性表达率不低于90％的GD2+基质细胞的这种脐带间充质干细胞过程中，对所获得的细胞进行GD2阳性表达率检测，选取GD2阳性表达率不低于90％例如不低于95％的GD2+基质细胞作为本发明使用的间充质干细胞。

本发明所用的造血干细胞可以使用本领域已知的方法来制备。

例如，对于通过胎盘获得的造血干细胞，可以参照中国专利申请号2014104050724中的方法获得，例如通过该文献方法获得的造血干细胞中CD34阳性表达率大于80％，例如大于85％；并且，通过该文献方法获得的造血干细胞中KDR阳性表达率大于85％，例如大于90％。在一个实例中，获得该KDR阳性表达的细胞的方法包括以下步骤：胎盘的收集、胎盘的初检、胎盘的预消毒、胎盘及母血检测、胎盘造血干细胞的灌洗、造血干细胞的浓缩纯化。各步骤具体为：

(1)胎盘的收集：在手术室无菌环境下收集胎盘及母血，存放于无菌的胎盘储运盒中，贴好标签、条码，胎盘储运盒的温度保持在4-10℃，24小时内送达实验室；

(2)胎盘的初检：检查胎盘储运盒盒内温度、标签、送达日期、储运盒是否有渗漏、是否有母血血样；

(3)胎盘的预消毒：将胎盘的胎儿面展开放置于胎盘冲洗盒的底部，用生理盐水冲洗胎盘表面，打开胎盘冲洗盒底面的排水孔，去掉冲洗的生理盐水，检查胎盘表面钙化情况；

(4)胎盘及母血检测：对所取的胎盘和母血样本进行检测，检测的项目包括肝炎病毒检测、艾滋病毒检测、性病检测、组织配型(HLA)检测、造血干/祖细胞定性检测(CFU-GM)；

(5)胎盘造血干细胞的灌洗：将胎盘在无菌条件下用无菌生理盐水清洗掉胎盘上的血凝块及积血，采用消毒剂消毒后，将灌洗液针头插入胎盘脐动脉中，胎盘灌注回收瓶针头插入脐静脉中，止血钳夹紧，缓慢开启恒流泵，灌洗液经胶管、开关、蠕动泵、针头、胎盘动脉、胎盘、胎盘静脉、胎盘灌注回收瓶针头，最后在灌洗液回收瓶中接收灌洗液；

(6)造血干细胞的浓缩纯化：将灌洗出来的灌洗液，在离心机中以1500-2000rpm离心15-20分钟，去掉上清液，收集沉淀和下层的液体，将收集到的沉淀和下层的液体与生理盐水按2：1-1：2的比例混匀得混合液，然后将混合液和淋巴细胞分离液按2：1-1：2的比例分别加入到离心管中，添加的顺序为先在离心管中加入淋巴细胞分离液，再缓慢加入混合液，加入过程中注意保持淋巴细胞分离液的液面平整，加完后以2200-2500rpm离心20-25分钟，离心时慢加速慢减速，离心结束后，收集中间白膜层到新的离心管中，以2：1-1：2的比例加生理盐水混匀，1200-1500rpm离心10-15分钟；离心结束后去掉上清液，加入10-20mL生理盐水吹打沉淀，再1200-1500rpm离心10-15分钟，离心结束后，去掉上清液，用DMEM培养基重悬沉淀，收集造血干细胞群，将重悬的细胞群进行细胞和霉菌培养，造血干细胞定量检测(CD34)，造血干细胞活性检测(台盼蓝染色)，造血干细胞定性检测(CFU-GM)。

在上述获得的CD34阳性表达率大于80％例如大于85％，且KDR阳性表达率大于85％例如大于90％的造血干细胞过程中，对所获得的造血干细胞进行CD34阳性表达率检测和KDR阳性表达率，选取CD34阳性表达率大于80％例如大于85％且KDR阳性表达率大于85％例如大于90％的造血干细胞过作为本发明使用的造血干细胞。

或者，在一个实施方案中，本发明所用的造血干细胞可照如下方法获得：取造血干细胞来源组织(包括但不限于脐带血、骨髓、胎盘血、动员外周血)，按8：1～1：8比例加入羟乙基淀粉，混合均匀后，转移到AXP造血干细胞分离系统配套处理耗材内，装入AXP造血干细胞分离系统，放入离心机，以离心率(RCF)1200～1600离心10～30min，再以RCF50～200离心5～15min后取出，自动分离得到单个核细胞，导出AXP数据得到造血干细胞的分离数量。使用流式细胞仪检测分离的到的细胞的CD34和KDR含量。然后将分离得到的细胞按8：1～1：8比例加入DMSO，程序降温至-90℃后放入液氮环境下冻存。使用前，放在37度水浴中复苏。使用上述方法获得的CD34阳性表达率大于80％例如大于85％，且KDR阳性表达率大于85％例如大于90％的造血干细胞。

进一步的，在冻存前，可以将本发明所述间充质干细胞即GD2+基质细胞和KDR+造血干细胞各自独立地分装于瓶子中，接着将两个瓶子置于本发明所述药盒中，得到本发明用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂，接着将该治疗剂在冻存条件下保存。

根据本发明记载的在动物试验中获得的结果，本发明人尝试将本发明方法用于人特别是具有早老症特征的患者以修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退。结果显示，本发明方法不但在动物试验中呈现优良的结果，而且在人体中呈现令人鼓舞结果。尽管CN106074604A亦公开了一种治疗早衰症或早老症的方法，然而本发明发现本发明方法比之于该CN 106074604A所记载的方法更具临床价值。

本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

在本发明的具体实验中，使用到的胎盘间充质干细胞即GD2+基质细胞是参照中国专利申请号201210292509.9之实施例1、6、7的方法获得的，并且GD2阳性表达率大于95％。

在本发明的具体实验中，使用到的脐带间充质干细胞即GD2+基质细胞是参照中国专利申请号201210159916.2之实施例1、6、7的方法获得的，并且GD2阳性表达率大于95％。

在本发明的具体实验中，使用到的胎盘造血干细胞是参照中国专利申请号2014104050724之实施例1的方法获得的，并且CD34标志物阳性表达率大于85％、KDR标志物阳性表达率大于90％。

在本发明的具体实验中，使用到的脐带血造血干细胞其CD34标志物阳性表达率大于85％、KDR/2标志物阳性表达率大于90％，并且是参照如下方法制备的：按8：1～1：8比例加入羟乙基淀粉，混合均匀后，转移到AXP造血干细胞分离系统配套处理耗材内，装入AXP造血干细胞分离系统，放入离心机，以离心率(RCF)1200～1600离心10～30min，再以RCF50～200离心5～15min后取出，自动分离得到单个核细胞，导出AXP数据得到造血干细胞的分离数量。使用流式细胞仪检测分离的到的细胞的CD34和KDR含量。然后将分离得到的细胞按8：1～1：8比例加入DMSO，程序降温至-90℃后放入液氮环境下冻存。使用前，放在37度水浴中复苏。在造血干细胞中添加了甘氨酸和甘露醇的试验中，各造血干细胞在注射前添加甘氨酸和甘露醇，以每10⁶个细胞计添加0.5μmol甘氨酸和0.05μmol甘露醇。

实施例1：使用胎盘间充质干细胞即GD2+基质细胞与脐带血KDR+造血干细胞治疗 衰老小鼠

一、动物的选择和分组

1、动物的选择：模型小鼠为健康C57BL/6J小鼠，雌性，8周龄，重18～22g，60只。

2、动物分组：单纯随机分为对照组、模型组、治疗组三组，每组20只。

二、建立小鼠衰老模型

模型组和治疗组每日颈背部皮下注射5％的D-半乳糖，注射量为0.25ml/10g，连续给药8-16周建立衰老动物模型。对照组则给予相同体积的生理盐水。

三、输注

衰老模型建成两周之后，治疗组注射GD2+胎盘MSC和KDR+脐带血HSC。采用表达绿色荧光蛋白的慢病毒载体标记GD2+MSC及脐带血KDR+HSC，以确定GD2+MSC及脐带血KDR+HSC在小鼠各脏器的植入情况。检测治疗前后衰老相关指标：包括小鼠体重、胸腺、脾脏、血清、肝组织、肺脏、脑组织过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量的变化。

治疗组第一个疗程：经小鼠尾静脉输注人源GD2+胎盘MSC单细胞悬液2×10⁶/0.2mL/只，每周给药一次，共给药4次为一个疗程。第二个疗程：第一周经小鼠尾静脉输注人源GD2+胎盘MSC单细胞悬液2×10⁶/0.2mL/只，第二周输注人源KDR+脐带血HSC单细胞悬液2×10⁶/0.2mL/只，以后每疗程均输注GD2+胎盘MSC；对照组和衰老模型组给予同等剂量的细胞培养液。

四、方法

l、用尾静脉注射架固定小鼠。

2、用酒精棉球擦尾巴使血管扩张；注射状态为尾巴发白，紧靠白色的尾骨两侧清晰可见两根红色静脉。

3、用左手的食指，中指，无名指及大拇指将小鼠尾巴固定。握住1ml注射器前面0.1CM处。右手小指搭在拽着鼠尾的左手拇指处，按此手形进针。

4、注射：注射时左手扯尾，使尾巴紧贴桌面，尾巴与桌边紧贴转弯处为进针部位，一般选择距离尾尖1/4或l/3处进针。针头入皮肤后马上把针头略往上，平行进针，针扎入时有落空感，缓慢推注。

五、结果：

1.治疗组在受体小鼠中定植，治疗组小鼠胸腺、脾脏、血清、肝组织、肺脏、脑组织MDA及CAT含量明显低于对照组、SOD活力明显高于对照组并且存在显著性差异(P≤0.05)，与模型组相比，则存在极显著性差异(P≤0.01)，有统计学意义。

2.各组小鼠的组织病理切片显示，模型组小鼠的各脏器结构严重破坏，而细胞治疗组小鼠的各脏器损伤有明显修复。结果可见MSC对衰老小鼠的脏器损伤有修复作用，从而发挥其抗衰老作用。

六、结论：GD2+MSC与KDR+HSC联合治疗明显改善D-半乳糖诱导亚急性衰老模型小鼠的衰老相关指标，表明GD2+MSC和KDR+HSC二者组合使用具有显著的修复机体机能老化和脏器功能衰退的作用。

补充试验1a：参照以上实施例1，但是在治疗时仅使用GD2+MSC以及仅使用KDR+HSC治疗，却发现均未呈现任何治疗作用。

本发明人在充分的生物学试验基础上，使用本发明方法尝试治疗患者早老症的患者，结果显示本发明方法具有对早老症优异的治疗作用，这种治疗作用还体现在其能够修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退。

补充试验1b：参考实施例1的方法，使用胎盘间充质干细胞即GD2+基质细胞与KDR+胎盘造血干细胞治疗衰老小鼠，结果显示与实施例1呈现基本相同的治疗效果。

补充试验1c：参考实施例1的方法，使用脐带间充质干细胞即GD2+基质细胞与KDR+胎盘造血干细胞治疗衰老小鼠，结果显示与实施例1呈现基本相同的治疗效果。

补充试验1d：参考实施例1的方法，使用脐带间充质干细胞即GD2+基质细胞与KDR+脐带血造血干细胞治疗衰老小鼠，结果显示与实施例1呈现基本相同的治疗效果。

实施例2：使用胎盘间充质干细胞即GD2+基质细胞与脐带血KDR+造血干细胞治疗 衰老小鼠

本实施例2及其补充试验中，如未另外说明，所用的间充质干细胞悬液中添加了甘氨酸和甘露醇。

一、动物的选择和分组

1、动物的选择：模型小鼠为健康C57BL/6J小鼠，雌性，8周龄，重18～22g，60只。

2、动物分组：单纯随机分为对照组、模型组、治疗组三组，每组20只。

二、建立小鼠衰老模型

模型组和治疗组每日颈背部皮下注射5％的D-半乳糖，注射量为0.25ml/10g，连续给药8-16周建立衰老动物模型。对照组则给予相同体积的生理盐水。

三、输注

衰老模型建成两周之后，治疗组注射GD2+胎盘MSC和KDR+脐带血HSC。采用表达绿色荧光蛋白的慢病毒载体标记GD2+MSC及脐带血KDR+HSC，以确定GD2+MSC及脐带血KDR+HSC在小鼠各脏器的植入情况。检测治疗前后衰老相关指标：包括小鼠体重、胸腺、脾脏、血清、肝组织、肺脏、脑组织过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量的变化。

治疗组第一个疗程：经小鼠尾静脉输注人源GD2+胎盘MSC单细胞悬液2×10⁴/0.2mL/只，每周给药一次，共给药4次为一个疗程。第二个疗程：第一周经小鼠尾静脉输注人源GD2+胎盘MSC单细胞悬液2×10⁴/0.2mL/只，第二周输注人源KDR+脐带血HSC单细胞悬液2×10⁶/0.2mL/只，以后每疗程均输注GD2+胎盘MSC；对照组和衰老模型组给予同等剂量的细胞培养液。上述经小鼠尾静脉输注人源GD2+胎盘MSC单细胞悬液2×10⁴/0.2mL/只，折算成人的剂量(小鼠剂量通常是人用剂量的10倍)时，约为1×10⁵/kg体重。

四、方法

l、用尾静脉注射架固定小鼠。

2、用酒精棉球擦尾巴使血管扩张；注射状态为尾巴发白，紧靠白色的尾骨两侧清晰可见两根红色静脉。

3、用左手的食指，中指，无名指及大拇指将小鼠尾巴固定。握住1ml注射器前面0.1CM处。右手小指搭在拽着鼠尾的左手拇指处，按此手形进针。

4、注射：注射时左手扯尾，使尾巴紧贴桌面，尾巴与桌边紧贴转弯处为进针部位，一般选择距离尾尖1/4或l/3处进针。针头入皮肤后马上把针头略往上，平行进针，针扎入时有落空感，缓慢推注。

五、结果：

1.治疗组在受体小鼠中定植，治疗组小鼠胸腺、脾脏、血清、肝组织、肺脏、脑组织MDA及CAT含量明显低于对照组、SOD活力明显高于对照组并且存在显著性差异(P≤0.05)，与模型组相比，则存在极显著性差异(P≤0.01)，有统计学意义；另外，对于上述结果，本实施例2结果与实施例1同一参数的结果基本相同并且无统计学差异。

2.各组小鼠的组织病理切片显示，模型组小鼠的各脏器结构严重破坏，而细胞治疗组小鼠的各脏器损伤有明显修复。结果可见MSC对衰老小鼠的脏器损伤有修复作用，从而发挥其抗衰老作用；另外，对于上述结果，本实施例2结果与实施例1同一指标的结果基本无差异。

六、结论：GD2+MSC与KDR+HSC联合治疗明显改善D-半乳糖诱导亚急性衰老模型小鼠的衰老相关指标，表明GD2+MSC和KDR+HSC二者组合使用具有显著的修复机体机能老化和脏器功能衰退的作用；另外，在仅是在细胞中补充添加微量甘氨酸和甘露醇而其它试验条件不变的情况下，本实施例2采用显著更少量的间充质干细胞就能获得与实施例1所用细胞数量那样的生物学效应。

补充试验2a：参照以上实施例2，但是在治疗时仅使用GD2+MSC以及仅使用KDR+HSC治疗，却发现均未呈现任何治疗作用。

本发明人在充分的生物学试验基础上，使用本发明方法尝试治疗患者早老症的患者，结果显示本发明方法具有对早老症优异的治疗作用，这种治疗作用还体现在其能够修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退。

补充试验2b：参考实施例2的方法，使用胎盘间充质干细胞即GD2+基质细胞与KDR+胎盘造血干细胞治疗衰老小鼠，结果显示与实施例2呈现基本相同的治疗效果。

补充试验2c：参考实施例2的方法，使用脐带间充质干细胞即GD2+基质细胞与KDR+胎盘造血干细胞治疗衰老小鼠，结果显示与实施例2呈现基本相同的治疗效果。

补充试验2d：参考实施例2的方法，使用脐带间充质干细胞即GD2+基质细胞与KDR+脐带血造血干细胞治疗衰老小鼠，结果显示与实施例2呈现基本相同的治疗效果。

补充试验2e：参考实施例2的方法，不同的仅是在间充质干细胞悬液中未添加甘氨酸(但仍添加相应量的甘露醇)，结果在MSC单细胞悬液以2.8×10⁶/0.2mL/只的剂量时才能达到实施例1的效果，这表明在间充质干细胞悬液中只添加甘露醇而不添加甘氨酸不能获得减少间充质干细胞用量的效果。

补充试验2f：参考实施例2的方法，不同的仅是在间充质干细胞悬液中未添加甘露醇(但仍添加相应量的甘氨酸)，结果在MSC单细胞悬液以3.5×10⁶/0.2mL/只的剂量时才能达到实施例1的效果，这表明在间充质干细胞悬液中只添加甘氨酸而不添加甘露醇不能获得减少间充质干细胞用量的效果。

实施例3：MSC+HSC治疗衰老小鼠的机制研究

对实施例1所得生物学样本，进行衰老相关B-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性检测。

1、细胞标本收集分别取对照组和治疗组治疗后ld、3d、5d、7d、14d、28d MSC，以3％中性甲醛室温固定5min后染色。

2、SA-β-Gal染色

先将X-Gal以20/L的浓度溶入二甲基甲酰胺配成X-Gal储存液，常温储存备用。新鲜染液的配制：1mg/mL X-Gal+40mmol/L柠檬酸缓冲液(PH 6.0)+5mmol/L亚铁氰化钾+5mmol/L铁氰化钾+150mmol/L NaCl+2mmol/L MgCl₂。

染色：将标本浸入新鲜染液室温染色12～16h，蒸馏水漂洗，中性红或Giemsa染液复染，光镜下观察。

3、SA-β-Gal显色结果观察

SA-β-Gal染色阳性细胞比率以显微镜下随机所选5个视野/玻片的阳性染色细胞均数作为每张玻片的阳性率，阳性率以3张玻片的均数±标准差计算。

4、衰老相关B-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性检测结果

对照组SA-β-Gal染色阳性率为3.03±0.66％；而GD2+MSC和KDR+HSC治疗后1d、3d、7d、14d、28d后MSC的SA-β-Gal染色阳性率分别为2.92±0.58％，3.17±0.76％，3.13±0.76％，2.37±0.76％，2.61±0.76％；它们分别与对照组比较，均无显著差异(p>0.05)。实验组和对照组间无显著差异，说明GD2+MSC与KDR+HSC不能引起MSC衰老。

5.细胞衰老相关基因p16Ink4a、p53、p21cipl/wafl的相对表达

(1)p16：GD2+MSC与KDR++HSC治疗后1d、3d、7d、14d的MSC的p16未见明显升高，与对照组间无显著差异(p>0.05)。GD2+MSC与KDR+HSC治疗后28d的p16与对照组间的差异有极显著意义(p<0.001)，明显降低。

(2)p21：GD2+MSC与KDR+HSC治疗后ld、7d、14d、28d的MSC的p2l未见明显升高，与对照组间无显著差异(p>0.05)。GD2+MSC与KDR+HSC治疗后3d的p21与对照组间的差异有显著意义(p<0.05)，明显降低。

(3)p53：GD2+MSC与KDR+HSC治疗后ld、3d、7d、14d、28d的MSC的p53与对照组相比明显降低，组间差异有显著意义(p<0.05)。

以上结果显示GD2+MSC与KDR+HSC组合治疗对于衰老小鼠有显著的治疗作用。

另外，在参照上述实施例3所进行的补充实验3a中，对实施例2所得生物学样本，进行衰老相关B-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性检测，结果显示各项检测参数和指标与上述实施例3的结果基本相同，无明显差异。

产业实用性

本发明属于细胞治疗技术领域，涉及一种用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂，特别是涉及一种包括GD2+基质细胞和KDR+造血干细胞的治疗剂。进一步的，本发明涉及GD2+基质细胞和KDR+造血干细胞二者组合在制备用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂中的用途。本发明治疗剂可以有效地用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退。

Claims (4)

1.间充质干细胞与造血干细胞组合在制备用于治疗早老症或早衰症或者用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂中的用途；所述治疗剂呈药盒的形式，该药盒中包括单独密封包装的间充质干细胞和单独密封包装的造血干细胞；所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的GD2+基质细胞，且GD2阳性表达率大于95%；在注射使用的间充质干细胞的细胞悬液中添加有甘氨酸和甘露醇，每10⁶个细胞添加0.5μmol甘氨酸和0.05μmol甘露醇；所述造血干细胞是KDR阳性表达的造血干细胞，该KDR阳性表达的造血干细胞中KDR阳性表达率大于90%；所述造血干细胞中CD34阳性表达率大于85%。

2.根据权利要求1的用途，所述造血干细胞来源于：脐带血、胎盘血。

3.用于治疗早老症或早衰症或者用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂，其呈药盒的形式，该药盒中包括单独密封包装的间充质干细胞和单独密封包装的造血干细胞；所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的GD2+基质细胞，且GD2阳性表达率大于95%；在注射使用的间充质干细胞的细胞悬液中添加有甘氨酸和甘露醇，每10⁶个细胞添加0.5μmol甘氨酸和0.05μmol甘露醇；所述造血干细胞是KDR阳性表达的造血干细胞，该KDR阳性表达的造血干细胞中KDR阳性表达率大于90%；所述造血干细胞中CD34阳性表达率大于85%。

4.根据权利要求3的治疗剂，所述造血干细胞来源于：脐带血、胎盘血。