CN109652366A - 用于治疗卵巢早衰的胎盘间充质干细胞制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗卵巢早衰的胎盘间充质干细胞制剂。具体地说，本发明一方面提供了从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法；另一方面，本发明提供了一种细胞制剂，其是通过使间充质干细胞(例如胎盘间充质干细胞)混悬于0.9％氯化钠溶液中配制成的细胞混悬液。该细胞制剂可以用于治疗卵巢早衰，特别是该细胞制剂是胎盘间充质干细胞制剂。本发明细胞制剂是通过包括方法制得的：将细胞传代所得间充质干细胞转移至离心管中，离心，弃上清，加入0.9％氯化钠溶液重悬，制得细胞制剂。本发明细胞制剂在治疗卵巢早衰方面呈现优异的生物学效果。

Description

用于治疗卵巢早衰的胎盘间充质干细胞制剂
技术领域
本发明属于生物技术和生物医药领域，涉及使用干细胞治疗卵巢早衰(prematureovarian failure，POF)的方法以及所用的细胞制剂。具体地说，本发明涉及从胎盘中分离干细胞，特别涉及从胎盘中分离间充质干细胞，进而使用此种胎盘间充质干细胞治疗卵巢早衰，更特别的是涉及一种使用本发明所述独特配方的消化酶组合物从而从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞，进而使用此种胎盘间充质干细胞治疗卵巢早衰。使用本发明方法可以有效的提高从胎盘分离间充质干细胞的效率，进而能够有效的提高使用此种胎盘间充质干细胞治疗卵巢早衰的效果。
背景技术
卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指卵巢功能衰竭所导致的40岁之前闭经的现象。是一种以闭经、不孕、雌激素缺乏、卵泡减少和促性腺激素增高为特征的疾病，并伴有一系列低雌激素症状如：潮热多汗、面部潮红、性欲低下等，严重影响女性的身心健康。此外，POF的女性，患骨质疏松症、心血管疾病和痴呆的风险增加。POF在女性中占1-3％，近年来发病率呈上升趋势。
POF病因复杂，尚未完全阐明，但与自身免疫应答、感染、遗传因素、化疗、放疗、手术等治疗效果及内分泌功能障碍有关。目前，POF的最常用的治疗方法是激素替代疗法(hormone replacement therapy，HRT)。该疗法虽然对POF的临床症状具有一定的缓解作用，然而，HRT不能从根本上修复受损的卵巢，恢复卵巢功能。此外，研究表明，长期HRT治疗增加心脏病和中风的风险，可能会增加乳腺癌和自身免疫性疾病的风险。因此，需要新的治疗策略来恢复POF患者的卵巢功能。
以干细胞特别是间充质干细胞为基础的治疗，为POF患者带来新的希望，可能改善其卵巢功能，恢复生育能力。
间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(Caplan AI.Mesenchymal stem cells.JOrthop Res.1991,9:641-650.Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells.Science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。
目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中MSC的含量极其稀少，每105～106个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。最新的研究表明胎盘中含有丰富的干细胞，从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。
现有的从胎盘中分离干细胞从而建立胎盘干细胞库的方法尚有诸多缺点，例如纯度不足、和/或数量不高，进而显示出这些方法尚不能满足人们的期待。例如CN101270349A(中国专利申请号200810061267.6，公开日2008年9月24日)公开的题为“胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法”的发明；CN101693884A(中国专利申请号200910117522.9，公开日2010年4月14日)公开的题为“一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法”的发明；CN102146359A(中国专利申请号201110005964.1，公开日2011年8月10日)公开的题为“从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法”的发明。另外，中国专利申请号201210044648X公开了一种从胎盘中分离间充质干细胞的方法。这些方法在提取物的纯度和/或回收率方面是有待进一步改善的。另外，本申请的发明人团队的发明公布CN107299082A(中国专利申请号201710653583.1，公开日2018年10月27日)中记载了一种获取胎盘间充质干细胞的方法已经显示呈现一些优良性能。
本领域仍然需要有新的从胎盘中分离干细胞的方法，特别是高效地从胎盘中分离间充质干细胞的方法。此外，本领域仍然需要的新的用于从胎盘中分离间充质干细胞方法中使用的消化酶组合物，以期提高从胎盘中分离间充质干细胞的方法效率。此外，本领域仍然需要有新的方法来治疗卵巢早衰，特别是期待有新的更有效的方法采用间充质干细胞来治疗卵巢早衰。
发明内容
本发明的目的包括如下一个或多个方面：一方面，解决现有获取胎盘间充质干细胞方法的不足，提供一种实用、简单、高效的从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法并任选地建立胎盘干细胞库的方法；另一方面，为上述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法提供一种消化酶组合物；再另一方面，为使用间充质干细胞治疗卵巢早衰而提供一种细胞制剂。。本发明人发现采用特别的操作方法以及特别组方的消化酶组合物，所获得的细胞纯度高和/或细胞回收率高，以及通过配制一种特定的细胞制剂能够更有效地用于卵巢早衰的治疗。本发明基于此类发现而得以完成。
因此，本发明第一方面提供了从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：
(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm3左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；
[其中，所述的组织清洗液是包含1％双抗的0.9％生理盐水]
(2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15～30ml(例如20～25ml，例如23ml)混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的FBS以终止消化；
[其中，所述的混合酶消化液中包含：15～30体积的Hank’s平衡盐溶液、0.2～0.6体积的Liberase MNP-S酶、0.2～2体积的DNA I型酶(例如20～25体积的Hank’s平衡盐溶液、0.3～0.5体积的Liberase MNP-S酶、0.5～1体积的DNA I型酶，例如22体积的Hank’s平衡盐溶液、0.4体积的Liberase MNP-S酶、0.7体积的DNA I型酶)；所述Liberase MNP-S酶例如是罗氏公司的Liberase MNP-S酶，例如购自西宝生物，其货号：5578582001]
(3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，细胞沉淀加DMEM-F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM-F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；
[此原代细胞的细胞悬液可以用sysmex血液分析仪进行细胞计数]
(4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；
[其中，所述冻存液的配方为：65％的DMEM-F12、15％的人血清白蛋白(HSA)、20％的DMSO例如WAK品牌的DMSO]
(5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm2时可进行接下来的传代；
[其中，所述完全培养基是包含10％FBS的DMEM-F12培养基]
(6)细胞传代：取P0代细胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm2，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上(通常培养5天左右)，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中还包括：
(7)针对步骤(6)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中还包括：
(8)将步骤(6)所得传代后的各代胎盘间充质干细胞于液氮中冻存。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中还包括：
(9)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(8)的冻存细胞进行关联。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所得各代胎盘间充质干细胞的细胞纯度大于90％。在一个实施方案中，所述胎盘间充质干细胞经3代以上传代后，细胞纯度大于95％。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述Hank's平衡盐溶液组成为：8.0g/L的NaCl、0.4g/L的KCl、0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的MgCl2·6H2O、0.06g/L的Na2HPO4·2H2O、0.06g/L的KH2PO4、1.0g/L的葡萄糖、0.14g/L的CaCl2、0.35g/L的NaHCO3、0.2g/L的酚红、盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述混合酶消化液中除了包含Hank's平衡盐溶液、Liberase MNP-S酶、DNA I型酶外，还添加有0.2～0.3g/L氯化锌。已经出人意料的发现，在使用添加此浓度范围氯化锌的混合酶消化液的情况下，所得原代细胞的CD73表达大于60％、CD45不表达，并且所得原代细胞中的间充质干细胞含量达60％-70％，显示极高的干细胞浓度；而当混合酶消化液中未添加此氯化锌时，原代细胞中的间充质干细胞含量小于38％，通常在31～38％范围内。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述细胞活性检测是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述细胞污染检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。在一个实施方案中，所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染：乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述遗传病检测是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述HLA-ABC/DR配型是检测细胞HLA-ABC/DR表型。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述胎盘间充质干细胞是经程序降温过程冻存于液氮中。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括但不限于：细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、细胞分子遗传学诊断结果、胎儿及其父母的详细资料。
此外，在本发明第一方面方法中，提供了一种胎盘间充质干细胞。因此本发明第二方面提供了一种胎盘间充质干细胞。
根据本发明第二方面的胎盘间充质干细胞，其是根据本发明第一方面任一实施方案所述方法获得的。
根据本发明第二方面的胎盘间充质干细胞，其各代的胎盘间充质干细胞的细胞纯度大于90％。在一个实施方案中，所述胎盘间充质干细胞经3代以上传代后，细胞纯度大于95％。
进一步，本发明第三方面提供了一种在从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中使用的混合酶消化液，该混合酶消化液中包含Hank's平衡盐溶液、Liberase MNP-S酶、DNA I型酶。
根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中包括：15～30体积的Hank’s平衡盐溶液、0.2～0.6体积的Liberase MNP-S酶、0.2～2体积的DNA I型酶(例如20～25体积的Hank’s平衡盐溶液、0.3～0.5体积的Liberase MNP-S酶、0.5～1体积的DNA I型酶，例如22体积的Hank’s平衡盐溶液、0.4体积的Liberase MNP-S酶、0.7体积的DNA I型酶)。
根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述Hank's平衡盐溶液组成为：8.0g/L的NaCl、0.4g/L的KCl、0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的MgCl2·6H2O、0.06g/L的Na2HPO4·2H2O、0.06g/L的KH2PO4、1.0g/L的葡萄糖、0.14g/L的CaCl2、0.35g/L的NaHCO3、0.2g/L的酚红、盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4。根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中除了包含Hank's平衡盐溶液、Liberase MNP-S酶、DNA I型酶外，还添加有如本文所述规定量的氯化锌。已经出人意料的发现，在使用添加此浓度范围氯化锌的混合酶消化液的情况下能够呈现如本发明所述优异技术效果。
根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法，其包括以下步骤：
(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm3左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；
[其中，所述的组织清洗液是包含1％双抗的0.9％生理盐水]
(2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15～30ml(例如20～25ml，例如23ml)混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的FBS以终止消化；
[其中，所述的混合酶消化液中包含：15～30体积的Hank’s平衡盐溶液、0.2～0.6体积的Liberase MNP-S酶、0.2～2体积的DNA I型酶(例如20～25体积的Hank’s平衡盐溶液、0.3～0.5体积的Liberase MNP-S酶、0.5～1体积的DNA I型酶，例如22体积的Hank’s平衡盐溶液、0.4体积的Liberase MNP-S酶、0.7体积的DNA I型酶)；所述Liberase MNP-S酶例如是罗氏公司的Liberase MNP-S酶，例如购自西宝生物，其货号：5578582001]
(3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，细胞沉淀加DMEM-F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM-F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；
[此原代细胞的细胞悬液可以用sysmex血液分析仪进行细胞计数]
(4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；
[其中，所述冻存液的配方为：65％的DMEM-F12、15％的人血清白蛋白(HSA)、20％的DMSO例如WAK品牌的DMSO]
(5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm2时可进行接下来的传代；
[其中，所述完全培养基是包含10％FBS的DMEM-F12培养基]
(6)细胞传代：取P0代细胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm2，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上(通常培养5天左右)，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。
根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中还包括：
(7)针对步骤(6)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。
根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中还包括：
(8)将步骤(6)所得传代后的各代胎盘间充质干细胞于液氮中冻存。
根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中还包括：
(9)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(8)的冻存细胞进行关联。
根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述细胞活性检测是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。
根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述细胞污染检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。在一个实施方案中，所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染：乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST。
根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述遗传病检测是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。
根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述HLA-ABC/DR配型是检测细胞HLA-ABC/DR表型。
根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述胎盘间充质干细胞是经程序降温过程冻存于液氮中。
根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括但不限于：细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、细胞分子遗传学诊断结果、胎儿及其父母的详细资料。
进一步的，本发明第四方面提供了一种例如可用于治疗卵巢早衰的细胞制剂，其是通过使间充质干细胞(例如胎盘间充质干细胞)混悬于0.9％氯化钠溶液中配制成的细胞混悬液。
根据本发明第四方面的细胞制剂，其中细胞浓度为1～10×106个细胞/ml，例如1～5×106个细胞/ml，例如1～3×106个细胞/ml。
根据本发明第四方面的细胞制剂，所述0.9％氯化钠溶液中还添加枸橼酸镁和磷脂。在一个实施方案中，添加枸橼酸镁的量是使镁离子浓度为5mmol/L。在一个实施方案中，添加磷脂的浓度为0.2mg/ml。在一个实施方案中，所述磷脂是注射级大豆来源的。已经出人意料地发现，通过同时添加少量的镁盐和磷脂可以显著提高本发明细胞制剂治疗卵巢早衰的生物学效果。本发明人另外还发现，当在本发明实施例4的细胞制剂中，仅添加镁盐、或者仅添加磷脂、或者将上述镁盐替换为其它盐例如钙盐、锌盐、铜盐等时，其结果远不及同时添加镁盐和磷脂的PD-MSC组a的效果，并且这些情形的结果与本发明实施例4中的PD-MSC组b的结果相近。
根据本发明第四方面的细胞制剂，其是通过包括方法制得的：将细胞传代所得间充质干细胞转移至离心管中，离心，弃上清，加入0.9％氯化钠溶液重悬，制得细胞制剂。
根据本发明第四方面的细胞制剂，其中所述间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm3左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；
[其中，所述的组织清洗液是包含1％双抗的0.9％生理盐水]
(2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15～30ml(例如20～25ml，例如23ml)混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的FBS以终止消化；
[其中，所述的混合酶消化液中包含：15～30体积的Hank’s平衡盐溶液、0.2～0.6体积的Liberase MNP-S酶、0.2～2体积的DNA I型酶(例如20～25体积的Hank’s平衡盐溶液、0.3～0.5体积的Liberase MNP-S酶、0.5～1体积的DNA I型酶，例如22体积的Hank’s平衡盐溶液、0.4体积的Liberase MNP-S酶、0.7体积的DNA I型酶)；所述Liberase MNP-S酶例如是罗氏公司的Liberase MNP-S酶，例如购自西宝生物，其货号：5578582001]
(3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，细胞沉淀加DMEM-F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM-F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；
[此原代细胞的细胞悬液可以用sysmex血液分析仪进行细胞计数]
(4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；
[其中，所述冻存液的配方为：65％的DMEM-F12、15％的人血清白蛋白(HSA)、20％的DMSO例如WAK品牌的DMSO]
(5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm2时可进行接下来的传代；
[其中，所述完全培养基是包含10％FBS的DMEM-F12培养基]
(6)细胞传代：取P0代细胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm2，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上(通常培养5天左右)，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。
根据本发明第四方面的细胞制剂，在制备间充质干细胞的过程中，还包括：
(7)针对步骤(6)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。
根据本发明第四方面的细胞制剂，在制备间充质干细胞的过程中，还包括：
(8)将步骤(6)所得传代后的各代胎盘间充质干细胞于液氮中冻存。
根据本发明第四方面的细胞制剂，在制备间充质干细胞的过程中，还包括：
(9)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(8)的冻存细胞进行关联。
根据本发明第四方面的细胞制剂，其中所得各代胎盘间充质干细胞的细胞纯度大于90％。在一个实施方案中，所述胎盘间充质干细胞经3代以上传代后，细胞纯度大于95％。
根据本发明第四方面的细胞制剂，其中所述Hank's平衡盐溶液组成为：8.0g/L的NaCl、0.4g/L的KCl、0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的MgCl2·6H2O、0.06g/L的Na2HPO4·2H2O、0.06g/L的KH2PO4、1.0g/L的葡萄糖、0.14g/L的CaCl2、0.35g/L的NaHCO3、0.2g/L的酚红、盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4。根据本发明第四方面的细胞制剂，其中所述混合酶消化液中除了包含Hank's平衡盐溶液、Liberase MNP-S酶、DNA I型酶外，还添加有0.2～0.3g/L氯化锌。已经出人意料的发现，在使用添加此浓度范围氯化锌的混合酶消化液的情况下，所得原代细胞的CD73表达大于60％、CD45不表达，并且所得原代细胞中的间充质干细胞含量达60％-70％，显示极高的干细胞浓度；而当混合酶消化液中未添加此氯化锌时，原代细胞中的间充质干细胞含量小于38％，通常在31～38％范围内。
根据本发明第四方面的细胞制剂，其中所述细胞活性检测是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。
根据本发明第四方面的细胞制剂，其中所述细胞污染检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。在一个实施方案中，所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染：乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST。
根据本发明第四方面的细胞制剂，其中所述遗传病检测是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。
根据本发明第四方面的细胞制剂，其中所述HLA-ABC/DR配型是检测细胞HLA-ABC/DR表型。
根据本发明第四方面的细胞制剂，其中所述胎盘间充质干细胞是经程序降温过程冻存于液氮中。
根据本发明第四方面的细胞制剂，其中所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括但不限于：细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、细胞分子遗传学诊断结果、胎儿及其父母的详细资料。
进一步的，本发明第五方面提供了细胞制剂(例如本发明第四方面所述细胞制剂)在制备用于治疗和/或预防卵巢早衰的药物中的用途。
在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
在本发明中，术语“胎盘间充质干细胞”是指来源于胎盘的间充质干细胞。因此在本发明中，特别是涉及本发明的语境中，术语“胎盘间充质干细胞”可以与“胎盘干细胞”、“干细胞”、“间充质干细胞”互换使用，除非另有明确指明。
在本发明中，术语“PBS缓冲液”或者“PBS”是指磷酸盐缓冲液。本领域技术人员熟知在本发明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它们的一般性质例如pH值或pH范围，并且这些PBS缓冲液通常是可以通过商业途径获得的预配液(或预配粉)，例如用于本发明领域的PBS通常是pH7.4(±0.1)的商品化缓冲液，例如HyClone品牌的PBS缓冲液；本领域经典的应用时的PBS缓冲液组成中包括137mM氯化钠、2.7nM氯化钾和10mM磷酸根，在本发明中如未另外特别说明，所用PBS使用时的组成均为该组成。
在本发明中，术语“胎盘”是指新生儿胎盘，特别是指产后4小时之内的胎盘。
间充质干细胞是一类具有自我复制和多向分化潜能的成体干细胞，具有易分离、培养、扩增，免疫原性低，不表达II型主要组织相容性复合物(MHC)的优势，可以异体使用，具有强大的迁移、免疫调节能力，通过旁分泌方式促进组织损伤修复再生，是再生医学理想的种子细胞。
卵巢早衰(POF)，是以妇女在40岁之前出现闭经、雌激素缺乏、促性腺激素水平升高为特征的一种疾病。一般人群中发病率为1％～3％，在继发性闭经妇女中占4％～8％，在20岁以前的发病率为0.01％。近年来卵巢早衰在育龄妇女中的发生率有逐年升高且向年轻化发展的趋势，而其机制尚不明确，主要诱因有遗传因素、自身免疫因素、医疗手术创伤、环境感染等。没有一种有效的治疗方法能够根治POF，间充质干细胞(MSCs)是属于中胚层的一类多能干细胞，具有强大的增殖能力和多向分化潜能、免疫调节功能、异体移植排异较轻、配型要求不严格、易于分离和培养等优势。目前主要有三种典型来源的MSCs用于治疗卵巢早衰，例如是脐带间充质干细胞(UCMSCs)、骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脂肪干细胞(ADSCs)。近年来，国内外应用间充质干细胞在卵巢早衰治疗中取得初步的研究成果。
孙麟论文(孙麟，人胎盘间充质干细胞治疗小鼠卵巢早衰的分子机制研究，实用妇科内分泌杂志(电子版)，2016年19期)探究人胎盘间充质干细胞治疗小鼠卵巢早衰的分子机制研究，其方法是，取足月剖腹产胎儿的胎盘，分离纯化得到胎盘间充质干细胞，将20只C57卵巢早衰小鼠随机分成2组，对照组注射生理盐水，实验组注射胎盘间充质干细胞悬液，连续注射10d，检测Zcchc11，Angpt1，Cxcr4种卵巢相关基因的变化。结果显示，流式细胞术检测CD29、CD44、CD90呈阳性表达，CD45、HLA-DR呈阴性表达。荧光定量聚合酶链反应法检测结果显示，与对照组相比，观察组的Zcchc11和Angpt1基因的表达上升，Cxcr4基因表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)。这些结果表明，人胎盘间充质干细胞可以调节卵巢生长相关基因的表达，对治疗卵巢早衰有重要作用。
付霞霏论文(付霞霏，等，脐带间充质干细胞卵巢局部移植在卵巢早衰大鼠体内的分布，临床医学工程，2013年09期)观察脐带间充质干细胞(UCMSCs)卵巢局部移植在卵巢早衰大鼠体内的分布，其方法是，建立模型移植标记UCMSCs，观察各脏器绿色荧光细胞分布情况。结果显示，卵巢内发现移植细胞，肺、脾可见到较多移植细胞，心、肝、肾可见到散在分布移植细胞。这些结果表明，UCMSCs能在卵巢组织内存活，部分滞留在肺、脾等组织。
朱少芳论文(朱少芳，等，PKH26标记的人脐带间充质干细胞在大鼠化疗性卵巢早衰模型中的卵巢迁移，现代妇产科进展，2011年02期)对人脐带间充质干细胞用PKH26标记，探讨人脐带间充质干细胞在大鼠化疗性卵巢早衰模型中的卵巢迁移示踪，其方法是，提取并培养人脐带间充质干细胞，按PKH26标记程序进行细胞标记，透射电镜观察标记组和未标记组细胞的超微结构，测定细胞增殖、周期、凋亡情况。荧光显微镜下观察PKH26标记的人脐带间充质干细胞移植后的卵巢情况。结果显示，标记后细胞的形态无明显差别，均为成纤维细胞样，细胞增殖未见明显影响，细胞生长状态良好，PKH26标记阳性的细胞主要存在卵巢血管中。这些结果表明，PKH标记技术可用于人脐带间充质干细胞移植治疗化疗所致卵巢早衰中的归巢、分化、增殖的研究。
李永丽论文(李永丽，等，人胎盘间充质干细胞移植修复大鼠卵巢早衰的实验研究，世界最新医学信息文摘，2016年90期)为探讨尾静脉注射移植人胎盘间充质干细胞(hpMSCs)对化疗导致的卵巢早衰模型大鼠卵巢功能的修复作用，其方法是，经鉴定的人胎盘间充质干细胞经尾静脉注射移植给卵巢早衰模型大鼠，实验分为hpMSCs组和干细胞培养液移植组(对照组)，每组10只，分别通过尾静脉等体积注射，注射后观察大鼠卵巢结构损伤情况，比较血清性激素(E2、AMH、INHB)浓度。结果显示，大鼠卵巢激素水平与对照组相比，hpMSCs移植前后血清E2和INHB水平有统计学差异；血清AMH水平无统计学差异(P＝0.051)；大鼠卵巢组织形态学结果表明，与模型组大鼠卵巢皮质损伤严重，尾静脉注射hpMSCs后Bcl-2表达显著降低。这些结果表明，hAMSCs大鼠尾静脉移植改善激素水平，减少卵巢细胞凋亡，从而修复卵巢功能。
范雪论文(范雪，等，骨髓间充质干细胞移植对卵巢早衰模型小鼠卵巢功能的影响，中国老年学杂志，2016年21期)探讨了骨髓间充质干细胞对卵巢早衰模型小鼠的影响，其方法是，取ICR小鼠骨髓间充质干细胞用于细胞移植。健康ICR小鼠60只随机分为对照组、模型组、治疗组。对照组小鼠不进行任何干预，模型组和治疗组小鼠腹腔注射顺铂建立化疗性损伤小鼠卵巢早衰动物模型。治疗组造模后一次性原位注射骨髓间充质干细胞进行治疗。观察大鼠一般情况、动情周期，并测定血清中E2、FSH含量以及卵巢组织形态改变。结果显示，模型组小鼠动情周期紊乱，经过干细胞治疗后的小鼠动情周期基本恢复正常。与对照组比较，模型组E2下降，FSH水平升高(P<0.05)。经骨髓间充质干细胞治疗后E2上升，FSH水平下降，几近恢复正常水平。模型组滤泡大部分受到破坏，滤泡数量明显少于对照组(P<0.01)。骨髓间充质干细胞治疗后滤泡及黄体数目均明显增加(包括新形成的黄体)，与模型组比较差异显著(P<0.01)。这些结果表明，顺铂可致卵泡颗粒细胞凋亡，造成卵巢功能过早衰退，骨髓间充质干细胞通过调节血清中各激素含量，可降低顺铂对卵巢的损害，促进卵泡发育，改善并增强卵巢功能。
王琰论文(王琰，等，骨髓间充质干细胞移植对VCD所致卵巢损伤的修复研究，现代生物医学进展，2011年10期)探讨了小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对去氧乙烯基环己烯(VCD)所致卵巢早衰治疗的可行性，其方法是，采用VCD(160mg/kg/d)连续腹腔注射来诱导小鼠卵巢早衰。每侧卵巢注射转染了绿色荧光基因小鼠骨髓来源的MSCs，于移植后14、28天及45天，取各组血液标本及卵巢组织，同时观察小鼠动情周期的变化；酶联免疫法检测血清FSH、LH水平，显微镜下观察MSC在卵巢的分布。结果显示，MSCs移植后各组均可见绿色荧光，并且主要分布于卵巢间质区，卵巢泡膜细胞区也可见绿色荧光细胞。MSCs组动情周期较实验对照组缩短，FSH与LH水平较实验对照组低，差异具有显著性。这些结果表明，骨髓间充质干细胞可改善卵巢早衰小鼠的卵巢内分泌功能，并且长时间存在于卵巢组织。骨髓间充质干细胞可能成为卵巢早衰治疗的新方法。
张莹莹论文(张莹莹，等，骨髓间充质干细胞移植在卵巢早衰小鼠卵巢功能重建中应用，安徽农业大学学报，2017年01期)探讨了骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植在卵巢早衰小鼠卵巢功能重建中的应用价值。通过一次性腹腔注射环磷酰胺和白消安建立小鼠卵巢早衰(POF)模型，并随机分为建模组、BMSCs移植组和空白对照组。移植组于建模14d经尾静脉注射绿色荧光蛋白(GFP)转基因鼠BMSCs悬液(5×107个/mL)，每4d重复1次，共5次；建模组和空白对照组注射等量生理盐水。观察建模后及BMSCs移植后小鼠的一般情况、血清FSH和E2水平、卵巢组织学变化以及GFP荧光信号在卵巢内的分布。结果发现，建模组小鼠食欲明显减退，活动减少，与空白对照组相比体重显著减轻(P<0.05)，FSH水平显著增高(P<0.05)，E2水平显著降低(P<0.05)，卵巢体积减小，间质纤维化严重，始基卵泡、生长卵泡和成熟卵泡数均显著减少(P<0.05)。BMSCs移植后，移植组小鼠体重增加，食欲增强，活动增多；28d后FSH浓度显著低于建模组(P<0.05)，E2浓度、始基卵泡、生长卵泡数及成熟卵泡数均显著高于建模组(P<0.05)，但各项指标仍与空白对照组间存在显著性差异；荧光显微镜下可见绿色荧光信号散在分布于卵泡周围。此结果提示，BMSCs可在小鼠损伤卵巢组织中定位存活，对卵巢组织结构及内分泌功能有修复作用。
陈英霞论文(陈英霞，等，GDF-9转染的脂肪间充质干细胞治疗化疗性卵巢早衰大鼠，现代妇产科进展，2017年11期)研究上调生长分化因子-9(GDF-9)表达的大鼠脂肪间充质干细胞(ASC)输注治疗化疗性卵巢早衰(POF)大鼠的效果，其方法是，酶解贴壁法从大鼠脂肪中培养ASC，脂质体法转染pEGFP-N3-GDF-9质粒入ASC，并验证GDF-9表达。腹腔注射顺铂建立大鼠POF模型，1周后通过尾静脉分别回输ASC和ASC-GDF-9细胞，观察大鼠体重、卵巢重量、血清中雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)和促黄体激素(LH)值，并分析卵泡形成情况。结果显示，ASC细胞生长旺盛能向成骨和脂肪细胞分化，转染后可顺利表达GDF-9蛋白，转染效率为(43±9.68)％。顺铂腹腔注射可降低大鼠体重伴随卵巢体积缩小，各级卵泡减少，E2降低，FSH和LH明显升高。输注ASC-GDF-9细胞4次后，可显著增加各级卵泡数目和基质细胞密度，降低LH和FSH激素水平。这些结果表明，转染GDF-9的ASC经尾静脉输注后，可更好地改善卵巢功能，恢复各级卵泡的发育，改善激素紊乱状态。
陈京京论文(陈京京，等，骨髓间充质干细胞移植在卵巢早衰小鼠卵巢及生育功能重建中的作用，安徽医科大学学报，2017年11期)探讨了骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植在卵巢早衰小鼠卵巢及生育功能重建中的作用，其方法是，一次性腹腔注射环磷酰胺和白消安建立卵巢早衰小鼠模型，将实验动物分为建模组、移植组和空白对照组。建模后14d，将绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠的BMSCs经尾静脉注射至移植组小鼠体内，取等量生理盐水经尾静脉注射至建模组和空白对照组小鼠体内。建模后14d及BMSCs移植2个月检测各组血清卵泡刺激素(FSH)和雌二醇(E2)水平，BMSCs移植2个月观察BMSCs在卵巢组织的定位及卵巢颗粒细胞凋亡情况，记录各组超促排卵后的获卵数、受精率、卵裂率、囊胚形成率，以及与雄性小鼠合笼后妊娠及生育子代数量。结果显示，BMSCs移植后2个月，移植组卵巢间质内可见大量绿色荧光细胞和标记的BMSCs，但并不表达FSH受体；FSH水平和颗粒细胞凋亡指数显著低于建模组(P<0.05)，E2水平及获卵数及受精率、卵裂率、囊胚形成率均显著高于建模组(P<0.05)，但各项指标仍显著低于空白对照组(P<0.05)；建模组无小鼠妊娠，移植组中2只小鼠妊娠，分别生育外观正常仔鼠4、2只。这些结果表明，BMSCs可定位于卵巢间质，显著降低卵巢颗粒细胞凋亡指数，改善卵巢内分泌功能，提高小鼠生育能力。
王璐璐论文(王璐璐，等，热休克预处理间充质干细胞移植治疗化疗性卵巢早衰的效果，广东医学，2018年13期)探讨了热休克预处理间充质干细胞(MSCs)对环磷酰胺损伤大鼠卵巢的修复作用，其方法是，分离、培养大鼠骨髓MSCs，移植前以42℃预处理1h。实验分为4组：正常组、模型组、MSCs组、热休克组，每组25只大鼠。正常组不处理，其余3组建立化疗性卵巢早衰动物模型，MSCs组大鼠双侧卵巢内注射1×106个MSCs，热休克组大鼠双侧卵巢内注射1×106个热休克预处理的MSCs。阴道涂片监测大鼠的动情周期，以化学发光法检测雌二醇(E2)，放射免疫法检测卵泡刺激素(FSH)。每组在建模后第1、15、30、45、60天采血及各组分别处死5只大鼠，观察卵巢重量、卵巢结构及各级卵泡数。结果显示，热休克组大鼠比MSCs组更快恢复动情周期；热休克组、MSCs组的卵巢重量、卵泡总数及各级卵泡数与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)，热休克组与MSCs组间相比亦差异有统计学意义(P<0.05)；移植后第30、45、60天，MSCs组、热休克组E2浓度、FSH浓度与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，热休克组与MSCs组之间比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。这些结果表明，热休克预处理MSCs对化疗性卵巢早衰具有更强的修复作用。
张灵俐论文(张灵俐，等，人脐带间充质干细胞治疗POF大鼠可行性及其机制的实验研究，重庆医学，2018年31期)探讨人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)治疗卵巢早衰(POF)大鼠可行性及可能机制，其方法是，将62只健康SD大鼠分为对照组(A组)、模型组(B组)和hUCMSCs移植组(C组)，B、C组大鼠腹腔注射环磷酰胺建立化疗药物性大鼠POF动物模型，A组大鼠注射等体积灭菌水，建模成功后，C组通过尾静脉注射hUCMSCs进行治疗。比较各组大鼠血清中雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、抑制素B(INHB)、抗苗勒管激素(AMH)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)水平，以及人ALU基因在大鼠卵巢内分布情况，并比较各组大鼠HE染色后卵巢组织形态、卵泡数及黄体数。结果显示，建模完成后1d，B组INHB、AMH水平低于A组；干细胞移植后17d，C组INHB、AMH水平升高，卵巢体积增大、生长卵泡增多、闭锁卵泡减少，与B组比较差异有统计学意义(P<0.05)。卵巢间质、颗粒及卵子细胞中观察到人ALU基因，caspase-3信号表达量[(4.40±1.46)×10-3]明显低于B组(P<0.05)。这些结果表明，hUCMSCs通过修复颗粒细胞和直接合化成颗粒细胞卵子细胞两种途径作用于卵巢，达到治疗POF型大鼠作用。
杜静论文(杜静，等，人脐带间充质干细胞对卵巢早衰大鼠卵巢超微结构和功能的影响，现代妇产科进展，2018年02期)探讨人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)对卵巢早衰模型大鼠卵巢超微结构和储备功能的影响，其方法是，将62只健康SD大鼠随机分成阴性对照组(18例)、模型对照组(22例)和hUCMSCs移植组(22例)。阴性对照组大鼠不进行任何处理，模型对照组和hUCMSCs移植组大鼠腹腔注射环磷酰胺(CTX)建立卵巢早衰动物模型。建模成功后，hUCMSCs移植组通过尾静脉注射hUCMSCs进行治疗。观察大鼠的一般情况，观察大鼠卵巢颗粒细胞超微结构的改变，测定血清中雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、抑制素B(INHB)和抗苗勒管激素(AMH)水平，并分析卵巢储备功能的变化。结果显示，电镜下显示，模型对照组颗粒细胞核溶解、核膜消失、线粒体空泡化，线粒体与内质网数量逐渐减少；hUCMSCs移植组颗粒细胞细胞核膜逐渐修复，核仁出现，内质网与线粒体少量存在。造模后1d，与阴性对照组比较，模型对照组和hUCMSCs移植组E2含量降低，FSH含量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；hUCMSCs移植后1d，模型对照组和hUCMSCs移植组INHB、AMH含量均较阴性对照组低，差异有统计学意义(P<0.05)；hUCMSCs移植后17d，hUCMSCs移植组的INHB水平高于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。这些结果表明，hUCMSCs移植对POF大鼠的卵巢超微结构及储备功能具有一定的修复作用。
相丽论文(相丽，等，人胎盘间充质干细胞移植通过降低超氧化物歧化酶1和解耦联蛋白-2的表达提高卵巢功能，中华生殖与避孕杂志，2018年02期)探讨人胎盘间充质干细胞(hPMSC)移植治疗对环磷酰胺所致卵巢早衰(POF)模型SD大鼠超氧化物歧化酶1(SOD1)和解耦联蛋白-2(UCP-2)表达的影响。其方法是将60只雌性SD大鼠随机分为4组(n＝15)：空白对照组，POF模型组，治疗对照组，hPMSC移植组。以首计量50mg/kg、维持剂量8mg/kg连续14d给大鼠腹腔注射环磷酰胺溶液建立POF模型，观察大鼠动情周期变化，采用ELISA方法测定血清中雌二醇(E2)、促卵泡生成素(FSH)、抗苗勒氏管激素(AMH)、活性氧族(ROS)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)水平；HE染色方法检测卵巢组织形态学及卵泡计数，VG染色法观察卵巢组织纤维化情况；采用免疫组织化学和Western blotting法测定SOD1和UCP-2蛋白表达。结果显示，ELISA结果显示：模型组血清FSH水平[(10.60±1.0)IU/L]明显高于空白对照组[(5.83±0.92)IU/L](P<0.01)，而E2、AMH水平[(35.52±10.27)ng/L、(2090.6±397.5)ng/L]则明显低于空白对照组[(65.62±3.76)ng/L、(3636.39±204.46)ng/L]，差异有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组相比hPMSC移植组血清中ROS和8-OHdG升高(P<0.05)。卵泡计数显示hMSC移植组闭锁卵泡数(5.36±1.11)显著低于治疗对照组(8.01±2.22)和POF模型组(11.21±1.69)(P<0.05)。与治疗对照组相比，hPMSC移植组中ROS和8-OHdG显著下降(P<0.05)。VG染色显示，与治疗对照组比，hPMSC移植组纤维化面积比例显著降低(P<0.05)。Western blotting结果显示，与治疗对照组相比，hPMSC移植组中SOD1和UCP-2蛋白表达量显著下降(P<0.05)，而hPMSC移植组与对照组则差异无统计学意义(P>0.05)；免疫组织化学结果显示模型组中SOD1和UCP-2蛋白表达相较于治疗对照组是降低的，而hPMSC移植组相较于空白对照组则差异无统计学意义。这些结果表明，hPMSC移植改善POF模型SD大鼠氧化应激，降低SOD1及UCP-2表达，起到保护卵巢线粒体功能的作用。
本发明的发明人曾利用灌流法从胎盘中分离培养间充质干细胞，获得了纯度很高的间充质干细胞。但是经过灌流后仍然会有大量干细胞滞留在胎盘组织中，不能有效地被分离出来。因此可以认为，采用灌流法不能最大限度的得到间充质干细胞。
本发明公开了一种从胎盘中大量分离间充质干细胞的方法，并利用这种方法保存胎盘间充质干细胞并建立胎盘干细胞库。本发明的发明人在总结以往分离培养间充质干细胞的基础上，利用多种组织消化酶混合消化胎盘小叶组织块，结合贴壁培养法，成功自胎盘中分离得到大量间充质干细胞。本发明方法得到的间充质干细胞纯度高、数量多，具有与骨髓间充质干细胞相同的生物学特性，能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞等分化。由于胎盘中干细胞较成体干细胞幼稚，含量丰富，在临床上具有广泛的应用前景，我们运用常规的细胞冻存方法将间充质干细胞像脐血一样冻存起来，建立胎盘干细胞库，为以后干细胞的深入研究和临床治疗奠定基础。
由于脐血中含有丰富的造血干细胞，人们建立脐血库把脐血造血干细胞这一重要的生物资源储存起来，为多种血液系统疾病和免疫系统疾病提供一种治疗手段。同样胎盘间充质干细胞作为一种更加重要的干细胞资源，我们运用常规的细胞冻存方法将其冷冻在-196摄氏度的深低温液氮中长期保存，建立胎盘干细胞库，为日后的干细胞治疗保存种子。
特别需要说明的是，通过本发明方法，可以在P0代获得间充质干细胞纯度极高的原代细胞，这些原代细胞的CD73表达大于60％、CD45不表达，并且这些原代细胞中间充质干细胞含量达60％-70％。
本发明的方法的技术效果是显而易见的。例如，本发明选取足月的胎盘样本，剪取胎盘小叶特定位置组织15g，用一种混合酶体系将之消化，得到细胞后进行提纯，即可得到一群较纯的间充质干细胞(CD73表达大于60％，CD45不表达)，每克组织获取细胞数可达2.5×107，且得率稳定，大大降低了样本特异性。将该批原代间充质干细胞冻存后复苏培养，使用经典的完全培养基配方进行培养，4天左右即可镜检到较多纺锤型贴壁细胞，10天细胞融合率达到70-80％，即可传到P1代。连续传代至P5代后，进行流式表型鉴定，细胞周期检测和诱导分化等实验，结果表明P1-P5代细胞均为间充质干细胞，阳性表达(CD73，CD90，CD105)大于98％，阴性表达(CD34，CD45，CD19，CD11b，HLA-DR)小于2％；P5代细胞G2期细胞小于1％，增殖能力强，未进入分裂期；在特异性诱导培养基刺激下，有向成骨细胞，成脂细胞，成软骨细胞分化的能力。
本发明操作简单，方便实用，能得到大量的间充质干细胞，分化性能好，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、神经细胞等细胞分化的能力。与现有方法的比较：目前MSC主要采用手术法抽取供者骨髓或灌流法分离胎盘，贴壁培养获得。该法分得细胞数量少，而且供者在取髓中和取髓后均有感染的可能。本发明成功自胎盘中分离获得大量纯度较高的间充质干细胞，并运用此法建立胎盘干细胞库来储备这种极具应用前景的干细胞。该法简便易行，且由于胎盘与脐血一样，细胞成份较幼稚，来源广泛，方便易得，因此本发明的方法在干细胞的临床应用上将具有广泛的前景。
附图说明
图1：本发明所得原代细胞的流式表型鉴定结果图。
图2：样本在P0传代过程中的显微图。
图3：样本在P5传代过程中的显微图。
图4：样本在P5代流式表型鉴定结果。
图5：样本P5代细胞的DNA含量-细胞数关系图。
图6：P5代细胞的诱导分化测试，显示其具有向成骨、成脂、成软骨细胞分化的能力。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
实施例1、胎盘全细胞处理：
1、混合合酶消化液的预配制：分别移取22ml含钙镁离子的HBSS(Hank's平衡盐溶液)、0.4ml罗氏Liberase MNP-S酶(例如购自西宝生物，货号：5578582001)、0.7ml的DNA I型酶于50ml离心管中，再添加氯化锌(添加浓度为0.2g/L、0.25g/L、或0.3g/L)，混均，37℃预热20min以上。所述Hank's平衡盐溶液组成为：8.0g/L的NaCl、0.4g/L的KCl、0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的MgCl2·6H2O、0.06g/L的Na2HPO4·2H2O、0.06g/L的KH2PO4、1.0g/L的葡萄糖、0.14g/L的CaCl2、0.35g/L的NaHCO3、0.2g/L的酚红、盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4。
2、胎盘小叶的准备：从采集袋中取出胎盘于白瓷盘中，组织清洗液冲洗后，去除胎盘瘀血，剪取少量胎盘小叶组织(20g左右)于钢杯中。使用组织清洗液(0.9％生理盐水+双抗(双抗为青链霉素，含量1％))清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g±1g较好的组织于100mm玻璃皿中。
3、血细胞的去除：加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm3左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再用组织清洗液清洗两次(每次将小叶组织移到钢杯中加100ml组织清洗液搅匀后，300目过滤)。
4、混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入已预热的23ml混合酶消化液中充分混匀后，摇床37度100rpm振荡消化30min。消化结束后，组织液+2ml FBS终止。
5、原代细胞的收集：
加50ml组织清洗液稀释混匀组织液，300目过滤，收集细胞液，两次洗涤消化后的组织(每次使用50ml组织清洗液)，滤液合并至1只250ml离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；
移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；
移去上清，细胞沉淀加DMEM-F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM-F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；取1ml悬液，用于sysmex血液分析仪进行细胞计数，经测定，该原代细胞纯度较高，间充质干细胞含量约为60％-70％。
6、原代细胞冻存：
现配冻存液，冻存液的配方为：65％的DMEM-F12、15％的人血清白蛋白(HSA)、20％的DMSO例如WAK品牌的DMSO，现用现配；使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml(另上清10ml留样)，重悬后缓缓加入已配制的冻存液，边加边摇匀；
将细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml(程序降温盒预冷)。剩余细胞悬液+留样上清用于无菌检测；使用程序降温仪器程序降温，细胞转入液氮存储罐中，对所得原代细胞进行冻存。
通过上述实施例1的胎盘全细胞处理过程，选取足月的胎盘样本，剪取胎盘小叶特定位置组织15g，用所述的混合酶消化液体系将之消化，得到细胞后进行提纯，即可得到一群较纯的原代间充质干细胞(CD73表达大于60％，CD45不表达)，这些原代细胞中的间充质干细胞含量达60％-70％，每克胎盘小叶组织获取的原代细胞数可达(2.4～2.8)×107个，且得率稳定，大大降低了样本特异性。然而，当所述混合酶消化液中未添加此氯化锌时，原代细胞中的间充质干细胞含量小于38％，通常在31～38％范围内，并且每克胎盘小叶组织获取的原代细胞数小于5×105个；另外，本发明人在参照其它现有技术进行原代细胞制备时发现每克胎盘小叶组织获取的原代细胞数小于2×106个，是本发明方法的1/10以下。本发明上述对胎盘进行全细胞处理能够高效的获得原代的间充质干细胞，为其后续传代培养成具有极高医学价值的间充质干细胞奠定良好的基础。
例如，在本实施例中，胎盘组织处理后细胞得率非常稳定，一些试验的典型数据见表1。
表1：从胎盘组织获取原代细胞的细胞收率
处理日期 样本注册号 组织量(g) 细胞数(×10<sup>8</sup>) 细胞得率(10<sup>8</sup>/g)
2016.7.22 9004116082279 15 3.8 0.25
2016.7.25 9004116082301 15.9 3.9 0.25
2016.7.26 9004116082311 14.9 3.8 0.26
2016.7.27 9004116082319 14.9 3.8 0.26
2016.8.25 9004116082539 15 3.75 0.25
另外，上述胎盘处理后所得原代细胞流式表型鉴定结果显示CD73表达高达60％以上，CD45不表达，表明原代细胞是一群比较纯的间充质干细胞，不含血细胞。流式表型鉴定结果如图1所示。
实施例2、原代细胞复苏和传代培养
1、细胞复苏：
取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；如未另外说明，本文所用的完全培养基是包含10％FBS的DMEM-F12培养基；
接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm2时可进行接下来的传代；
2、细胞传代：取复苏后的P0代细胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm2，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上(通常培养5天左右)，完成从P0代至P1代的细胞传代；
依次重复上述P0代至P1代的传代操作，以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。
在本实施例中原代接种密度约为5×105cells/cm2，接种4天镜检视野内有很多贴壁细胞，呈纺锤型。接种后10天即可传至P1代。细胞生长速度快，量多，形态呈梭形，饱满。从P0代至P1代的传代过程中，一些试验的细胞计数示意性结果如下表2所示。其中PS162279样本在传代过程中的显微图如图2所示。
表2：P0代至P1代的传代过程中的细胞计数结果
样本注册号 P0-P1 P0计数
PS162311 D10 8*10<sup>5</sup>(ADAM)
PS162319 D10 1.4*10<sup>6</sup>(ADAM)
PS162279 D9 1.5*10<sup>6</sup>(ADAM)
另外，在P1-P5接种传代过程中，通常培养4～5天即收获并传代至下一代。示例性的，PS162279样本在P5传代过程中的显微图如图3所示。
在本试验中，进行了P1-P5代的流式表型鉴定，结果显示，CD73、CD90、CD105阳性表达均>98％，同时鉴定了CD34、CD45、CD19、HLA-DR，结果如表3所示，这些结果证明胎盘中分离培养出的细胞为间充质干细胞，且纯度高。
表3：P1-P5代细胞的流式表型鉴定结果
示例性的，PS162279样本P5代流式表型鉴定结果如图4所示。
另外，针对一些样本的P5代细胞测定它们的生长周期，结果显示G2期细胞<1％，S期细胞>10％，证明这些细胞增殖能力强，未进入分裂期，具体结果见表4。
表4：P5代细胞生长周期测定结果
样本注册号 GO/G1期 S期 G2/M期
PS162311-P5 84.60％ 14.80％ 0.64％
PS162319-P5 82.30％ 16.80％ 0.93％
PS162279-P5 87.00％ 11.90％ 0.80％
另外，针对PS162311-P5细胞，绘制其DNA含量-细胞数关系图，典型的结果显示于图5。
实施例3、胎盘MSC的生物学特性鉴定
参照已经授权的专利CN102676451A之[0062]至[0089]的方法进行胎盘间充质干细胞的生物学特性鉴定，结果显示，应用本发明方法分离得到的MSC，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化的能力，证实本发明方法获得的MSC具有干细胞特性。
例如，示例性的，对P5代细胞进行诱导分化测试，结果显示这些细胞具有向成骨、成脂、成软骨细胞分化的能力。典型的成脂分化、成骨分化、和成软骨分化的显微图见图6。
实施例4、间充质干细胞治疗POF的有效性
(1)6周龄雌性C57BL/6小鼠，腹腔注射50mg/kg/天环磷酰胺(CTX)，连续15d，每天同一时间注射，建立POF小鼠模型。通过卵泡数、激素水平、发情周期和生育测试等指标来评估卵巢的储备功能。
(2)6周龄雌性C57BL/6小鼠，随机分为：对照组(n＝20)、POF模型组(n＝20)、胎盘间充质干细胞治疗组a(PD-MSC组a，n＝20)、胎盘间充质干细胞治疗组b(PD-MSC组b，n＝20)。治疗组小鼠，分别于POF建模后第1天和14天，注射给予2次胎盘间充质干细胞制剂，每只小鼠2×105个胎盘间充质干细胞尾静脉注射。POF模型组注射等体积生理盐水。在本实验中，使用的是胎盘间充质干细胞注射制剂是这样配制的：将实施例2之步骤2细胞传代所得间充质干细胞(本例使用PS162279样本P5代)转移至离心管中，1500rpm离心5min，弃上清，加入0.9％氯化钠溶液重悬，制得细胞浓度为1～3×106个胎盘间充质干细胞/ml的细胞制剂；其中，所述0.9％氯化钠溶液中额外添加枸橼酸镁和磷脂(使镁离子浓度达到5mmol/L，磷脂浓度为0.2mg/ml，磷脂是注射级大豆来源的，加枸橼酸镁和磷脂组标记为PD-MSC组a)或不添加枸橼酸镁和磷脂(不加枸橼酸镁和磷脂组标记为PD-MSC组b)。
(3)激素水平
经胎盘间充质干细胞第二次移植后14天和28天，每组分别取10只小鼠，眼眶采血，分离血清，保存-20℃。酶联免疫吸附试验(ELISA)分析雌二醇(E2)、促卵泡素(FSH)、抗苗勒氏管激素(AMH)的水平(具体方法参考相丽论文方法进行)。结果显示：与POF模型组相比，胎盘间充质干细胞组小鼠血清中E2水平在各时间点均升高、FSH水平均下降，差异显著(p<0.05)，具体结果见下表。
与同一检测日的POF模型组比较，*p<0.05，**p<0.01。
(4)小鼠卵巢组织的卵泡计数
胎盘间充质干细胞第二次移植后28天，每组分别取10只小鼠，处死，取小鼠左侧卵巢组织于4％多聚甲醛固定，将固定后的组织进行系列酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，切片厚度5um，进行HE染色，显微镜下观察。
结果显示：相比于对照组，POF模型组小鼠初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数量明显减少，闭锁卵泡数量明显增加；胎盘间充质干细胞治疗后28天，各级卵泡数均有不同程度的恢复，颗粒细胞生长增加，凋亡减少，卵巢上皮细胞形态稳定，初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数量明显增加，闭锁卵泡数量明显减少。胎盘间充质干细胞移植后28天各级卵泡计数，与POF组比较有显著差异，P<0.01，具体结果见下表。
对照组 POF模型组 PD-MSC组a PD-MSC组b
初级卵泡 26.64±3.26 7.12±1.94 22.14±4.07** 10.64±1.93
次级卵泡 24.87±4.34 7.41±2.82 21.68±3.92** 13.26±2.24*
成熟卵泡 23.92±2.62 6.86±2.11 20.92±3.84** 9.83±1.74
闭锁卵泡 2.64±1.04 6.03±1.36 2.68±0.99** 5.26±1.16
与POF模型组比较，*p<0.05，**p<0.01。
(5)小鼠生育能力观察：
在胎盘间充质干细胞移植后第28天，将雌雄小鼠按2：1比例合笼饲养，统计小鼠的生育率，并对小鼠的产仔数进行比较，观察胎盘间充质干细胞移植对小鼠卵巢功能的修复作用，胎盘间充质干细胞组与POF组比较有显著差异，P<0.01。具体结果见下表。
对照组 POF模型组 PD-MSC组a PD-MSC组b
产仔数 14.3±1.8 4.6±1.3 10.2±1.7** 6.4±1.9
与POF模型组比较，*p<0.05，**p<0.01。
根据上述结果可知，胎盘间充质干细胞移植治疗可明显改善POF小鼠受损卵巢的储备功能，卵泡数增加，雌孕激素升高，部分小鼠生育力得到恢复，为胎盘间充质干细胞应用于POF的临床治疗提供了实验依据。
实施例5、胎盘干细胞库的建立
1、细胞活性的检测：利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。
2、细胞污染的检测：利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。利用病原学方法，检测细胞是否受到乙肝两对半、丙肝、艾滋、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST感染。
3、遗传病的检测：利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。
4、HLA-ABC/DR配型：检测细胞HLA-ABC/DR表型，并记录在案。
5、细胞来源的调查：记录胎儿及其父母的详细资料，并记录在案。
6、胎盘干细胞数据库的建立：在保存正常的胎盘干细胞后，建立胎盘干细胞的数据库，其中包括前六项资料，并建立与冻存细胞的关联。

Claims (10)

1.从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：
(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm3左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；
(2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15～30ml(例如20～25ml，例如23ml)混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的FBS以终止消化；
(3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，细胞沉淀加DMEM-F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM-F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；
(4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；
(5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm2时可进行接下来的传代；
(6)细胞传代：取P0代细胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm2，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上(通常培养5天左右)，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞，
该方法还任选的包括如下步骤：
(7)针对步骤(6)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；
(8)将步骤(6)所得传代后的各代胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；
(9)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(8)的冻存细胞进行关联。
2.一种细胞制剂，其是通过使间充质干细胞(例如胎盘间充质干细胞)混悬于0.9％氯化钠溶液中配制成的细胞混悬液。
3.根据权利要求2的细胞制剂，其中细胞浓度为1～10×106个细胞/ml，例如1～5×106个细胞/ml，例如1～3×106个细胞/ml；和/或，所述0.9％氯化钠溶液中还添加枸橼酸镁；例如，添加枸橼酸镁的量是使镁离子浓度为5mmol/L。
4.根据权利要求2的细胞制剂，其是通过包括方法制得的：将细胞传代所得间充质干细胞转移至离心管中，离心，弃上清，加入0.9％氯化钠溶液重悬，制得细胞制剂。
5.根据权利要求2的细胞制剂，其中所述间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm3左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；
[其中，所述的组织清洗液是包含1％双抗的0.9％生理盐水]
(2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15～30ml(例如20～25ml，例如23ml)混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的FBS以终止消化；
[其中，所述的混合酶消化液中包含：15～30体积的Hank’s平衡盐溶液、0.2～0.6体积的Liberase MNP-S酶、0.2～2体积的DNA I型酶(例如20～25体积的Hank’s平衡盐溶液、0.3～0.5体积的Liberase MNP-S酶、0.5～1体积的DNA I型酶，例如22体积的Hank’s平衡盐溶液、0.4体积的Liberase MNP-S酶、0.7体积的DNA I型酶)；所述Liberase MNP-S酶例如是罗氏公司的Liberase MNP-S酶，例如购自西宝生物，其货号：5578582001]
(3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，细胞沉淀加DMEM-F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM-F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；
[此原代细胞的细胞悬液可以用sysmex血液分析仪进行细胞计数]
(4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；
[其中，所述冻存液的配方为：65％的DMEM-F12、15％的人血清白蛋白(HSA)、20％的DMSO例如WAK品牌的DMSO]
(5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm2时可进行接下来的传代；
[其中，所述完全培养基是包含10％FBS的DMEM-F12培养基]
(6)细胞传代：取P0代细胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm2，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上(通常培养5天左右)，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。
6.根据权利要求2的细胞制剂，在制备间充质干细胞的过程中，还包括：
(7)针对步骤(6)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。
7.根据权利要求2的细胞制剂，在制备间充质干细胞的过程中，还包括：
(8)将步骤(6)所得传代后的各代胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；和/或
(9)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(8)的冻存细胞进行关联。
8.根据权利要求2的细胞制剂，其中所得各代胎盘间充质干细胞的细胞纯度大于90％；例如，所述胎盘间充质干细胞经3代以上传代后，细胞纯度大于95％。
9.根据权利要求2的细胞制剂，其特征在于，
所述Hank's平衡盐溶液组成为：8.0g/L的NaCl、0.4g/L的KCl、0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的MgCl2·6H2O、0.06g/L的Na2HPO4·2H2O、0.06g/L的KH2PO4、1.0g/L的葡萄糖、0.14g/L的CaCl2、0.35g/L的NaHCO3、0.2g/L的酚红、盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4；
所述混合酶消化液中除了包含Hank's平衡盐溶液、Liberase MNP-S酶、DNA I型酶外，还添加有0.2～0.3g/L氯化锌；
所述细胞活性检测是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目；
所述细胞污染检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染；
所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染：乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST；
所述遗传病检测是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病；
所述HLA-ABC/DR配型是检测细胞HLA-ABC/DR表型；
所述胎盘间充质干细胞是经程序降温过程冻存于液氮中；和/或
所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括但不限于：细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、细胞分子遗传学诊断结果、胎儿及其父母的详细资料。
10.权利要求2～9任一项的细胞制剂在制备用于治疗和/或预防卵巢早衰的药物中的用途。
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