CN107951904A - 一种脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用，属于生物医药技术领域，利用脂肪间充质干细胞及其分泌的细胞因子，与一定比例的其它成分组成脂肪间充质干细胞药物，再将该脂肪间充质干细胞药物分别制成注射液和药贴两种药剂，先将注射液通过局部靶向注射的方式注射到病灶所在区域，再将药贴贴至患者肚脐处，并通过电磁脉冲发生器间歇刺激药物，促进卵泡刺激素的分泌，能够有效修复卵巢子宫内膜，促进功能性排卵，有效治疗卵巢早衰。总之，本发明具有安全有效，可控性更高，实用性强等优点。

Description

一种脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用。
背景技术
卵巢早衰(POF)又称高激素性性腺机能减退症，指的是40岁前的妇女发生4-6个月的闭经，该症状与血清促性腺激素的闭经水平(促卵泡素(FSH)>40IU/L)和低雌性激素分泌相关。POF会导致生育能力丧失，也可能与医疗问题如血块、骨质疏松症和心脏病有关。
POF的成因较为复杂，一些患者由于遗传性疾病而产生卵巢异常，如脆性X(染色体)综合征、特纳综合征和某些常染色体基因突变。某些POF病例可能是自身免疫性疾病所导致。化疗和放射治疗癌症也可能导致卵巢功能衰竭。卵巢早衰的基本类型有两个：一种是卵巢内仅有少数甚至没有卵泡，另一种是卵泡数量过多。在第一种情况下，该病症产生的原因包括遗传性疾病、化疗、对盆腔区域的放射以及手术等；然而，大多数情况下，该病症的产生原因未知。在第二种情况下，该病症产生的原因是自身免疫性卵巢疾病，该疾病可以损害成熟的卵泡，但会留下原始的完整的卵泡细胞。目前，尚没有可靠的治疗方法可以帮助恢复女性卵巢的功能。治疗女性卵巢早衰最常用的方法之一是激素替代疗法(HRT)，但HRT会增加静脉中的血块、卵巢癌和乳腺癌的风险.
近年来，干细胞技术不仅作为医学界的尖端科技，也成为卵巢早衰(POF)治疗领域的新亮点，通过正规先进的干细胞治疗，不仅能给卵巢早衰(POF)带来治愈希望，更能够确保治疗的安全性和有效性。目前应用干细胞技术治疗卵巢早衰(POF)在国内外均以开展。常用的干细胞来源为胚胎干细胞、成体干细胞包括骨髓造血干细胞、脐带间充质干细胞以及脂肪干细胞等。由于应用胚胎干细胞存在伦理道德问题，且研究发现可存在长期的致瘤危险，因而应用成体干细胞得到更广泛的重视。特别是自体脂肪间充质干细胞，研究证实，其基本不存在致瘤性的，且无免疫排斥反应及其它副作用，有望成为一种安全可靠的治疗卵巢早衰(POF)的细胞治疗新方法。
发明内容
本发明提供一种脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用，通过提取患者自身脂肪组织分离出可诱导成卵泡刺激素分泌细胞的脂肪间充质干细胞，并以脂肪间充质干细胞为主制备治疗卵巢早衰的药物，治疗效果良好。
本发明的技术方案为：一种脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用，所述脂肪间充质干细胞药物按照重量百分比计包括：8-12％脂肪间充质干细胞、6-8％卵泡刺激素分泌细胞、20-22％磁性纳米缓释微球、4-6％人血白蛋白原液、5-7％薏苡仁油、1-1.5％黄酮醇苷、1-2％维生素E、0.5-1％紫杉醇、0.4-0.8％谷胱甘肽、0.5-1.5％透明质酸钠、0.3-1.2％藻青素、0.4-1.8％葡萄糖酸锌、0.5-0.8％肝素钙、0.5-1％乳化剂、0.5-1％稳定剂、0.3-0.5％PH调节剂，余量为生理盐水，所述磁性纳米缓释微球负载率高，能缓释药效，并且含有磁性，靶向性更强；所述人血白蛋白原液可为脂肪间充质干细胞及卵泡刺激素分泌细胞提供适宜的微环境，提高细胞的活性；所述薏苡仁油具有益气养阴的功效，可起到一定辅助调理的作用；所述黄酮醇苷可用于消除细胞产生的自由基，并可起到抗炎抑菌的作用；所述维生素E与谷胱甘肽具有良好的抗氧化作用，防止细胞被氧化而损伤；所述葡萄糖酸锌可补充女性所缺乏的锌元素，所述肝素钙具有抗凝血、消血栓功能，防止药物注射时产生瘀点和血肿硬结。
进一步地，所述脂肪间充质干细胞药物的制备方法包括以下步骤：
S1：从患者抽取自体脂肪组织5-10ml，利用清洗液冲洗所述脂肪组织中的血液，并将脂肪组织利用剪刀破碎至直径为3-5mm的脂肪粒，在所述脂肪粒中加入体积比为1:1的0.25％胰蛋白酶与0.1％胶原酶的混合酶液，在37℃温度下消化30-60min，再利用震荡器以1500-2000rpm震荡5-10min，静置10-20min，吸出下层液体移至装有细胞诱导培养液的培养瓶中；
S2：将所述培养瓶放入二氧化碳培养箱中，在37℃恒温下培养3-10天，诱导脂肪间充质干细胞在所述细胞诱导培养液的诱导下，生成卵泡刺激素分泌细胞；
S3：利用人卵泡刺激素(FSH)ELISA检测试剂盒鉴定培养瓶内是否含有卵泡刺激素，以此确定脂肪间充质干细胞是否诱导为卵泡刺激素分泌细胞，再使用流式细胞仪检测卵泡刺激素分泌细胞的数量与质量；
S4：将培养瓶中的液体移至离心管内，以1500r/min离心8-10min，弃上清液，并提取下层细胞，得到卵泡刺激素分泌细胞与脂肪间充质干细胞的混合细胞；
S5：将所述混合细胞用所述人血白蛋白原液进行稀释，得到稀释混合细胞溶液，将稀释混合细胞溶液添加到所述磁性纳米缓释微球中，直至磁性纳米缓释微球完全浸没，在37℃恒温下，通过超声波分散辅助进行药物装载，时间为30-60min，待磁性纳米缓释微球充分溶胀后，得到卵泡刺激素缓释单体；
S6：将所述薏苡仁油、葡萄糖酸锌、肝素钙、透明质酸钠分别用1/4的所述生理盐水进行溶解，分别得到薏苡仁油溶液、葡萄糖酸锌溶液、肝素钙溶液、透明质酸钠溶液；首先将所述卵泡刺激素缓释单体与所述薏苡仁油溶液混合，并搅拌均匀，得到卵泡刺激素缓释单体-薏苡仁油溶液；在所述卵泡刺激素缓释单体-薏苡仁油溶液中，依次加入葡萄糖酸锌溶液、肝素钙溶液、透明质酸钠溶液，搅拌均匀，得到混合溶液A；
S7：将所述黄酮醇苷、维生素E、紫杉醇、谷胱甘肽、藻青素依次添加到所述混合溶液A中，搅拌均匀，得到混合溶液B；
S8：在所述混合溶液B中加入所述乳化剂、稳定剂，搅拌均匀，同时在搅拌下，加入所述PH调节剂至混合溶液B至PH＝7.2-7.5；即得含有脂肪间充质干细胞药物的注射液。
更进一步地，所述细胞诱导培养液按重量百分比计包括：6-8％转化生长因子、7-10％表皮生长因子、10-12％人体血红蛋白、1-4％全反式维甲酸、5-9％卵泡刺激素生长因子、2-4％吡哆素、1-3％神经肽、2-4％己烯雌酚、0.5-1.5％孕酮、1-2％抗氧化剂，余量为DMEM-高糖培养液。
更进一步地，所述抗氧化剂为维生素E、L-抗坏血酸、α-硫辛酸、还原性谷胱甘肽中任意一种或几种组合。
进一步地，用中药组分及辅料替所述生理盐水并制成药贴，所述中药组分占比10-20％，辅料为余量，所述药贴用于贴至患者肚脐处。其中，中药组分是由炙甘草、麝香、丹参、血竭、红藤以质量百分比为3:1:1:1:2配比而成，炙甘草具有补脾和胃，益气复脉的功效，所述药贴用于贴至患者肚脐处，肚脐与子宫及卵巢距离进，并且更加有利于药物的有效成分的吸收，大大提高了药物的疗效。
更进一步地，所述药贴还配套设有电极贴和电磁脉冲发生器，药贴为双面一次性，一面贴在所述电极贴底部，另一面贴至患者肚脐，电极贴通过导线与所述电磁脉冲发生器相连。
更进一步地，所述治疗卵巢功能早衰的步骤为：第一步，先向患者体内局部靶向注射1-2ml的所述注射液；第二步，将所述药贴的一面贴至所述电极贴底部，另一面贴至患者肚脐处，并通过所述电磁脉冲发生器每隔2-4h进行电磁脉冲刺激，电磁脉冲频率为20-150HZ，工作时间为3-10min。
本发明的有益效果为：本发明用脂肪间充质干细胞及其分泌的细胞因子，与一定比例的其它成分组成脂肪间充质干细胞药物，再将该脂肪间充质干细胞药物分别制成注射液和药贴两种药剂，先将注射液通过局部靶向注射的方式注射到病灶所在区域，再将药贴贴至患者肚脐处，并通过电磁脉冲发生器间歇刺激药物，尤其是负载细胞的磁性纳米缓释微球，使其在振动发热，促进卵泡刺激素的分泌，间歇定时对患者进行高刺激治疗，相对于普通的缓释，可控性更高，能够有效修复卵巢子宫内膜，促进功能性排卵，有效治疗卵巢早衰。总之，本发明安全有效，实用性强。
具体实施方式
实施例1
一种脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用，脂肪间充质干细胞药物按照重量百分比计包括：8％脂肪间充质干细胞、6％卵泡刺激素分泌细胞、20％磁性纳米缓释微球、4％人血白蛋白原液、5％薏苡仁油、1％黄酮醇苷、1％维生素E、0.5％紫杉醇、0.4％谷胱甘肽、0.5％透明质酸钠、0.3％藻青素、0.4％葡萄糖酸锌、0.5％肝素钙、0.5％乳化剂、0.5％稳定剂、0.3％PH调节剂，余量为生理盐水，磁性纳米缓释微球负载率高，能缓释药效，并且含有磁性，靶向性更强；人血白蛋白原液可为脂肪间充质干细胞及卵泡刺激素分泌细胞提供适宜的微环境，提高细胞的活性；薏苡仁油具有益气养阴的功效，可起到一定辅助调理的作用；黄酮醇苷可用于消除细胞产生的自由基，并可起到抗炎抑菌的作用；维生素E与谷胱甘肽具有良好的抗氧化作用，防止细胞被氧化而损伤；葡萄糖酸锌可补充女性所缺乏的锌元素，肝素钙具有抗凝血、消血栓功能，防止药物注射时产生瘀点和血肿硬结。
脂肪间充质干细胞药物的制备方法包括以下步骤：
S1：从患者抽取自体脂肪组织5ml，利用清洗液冲洗脂肪组织中的血液，并将脂肪组织利用剪刀破碎至直径为3mm的脂肪粒，在脂肪粒中加入体积比为1:1的0.25％胰蛋白酶与0.1％胶原酶的混合酶液，在37℃温度下消化30min，再利用震荡器以1500rpm震荡5min，静置10min，吸出下层液体移至装有细胞诱导培养液的培养瓶中；
S2：将培养瓶放入二氧化碳培养箱中，在37℃恒温下培养3天，诱导脂肪间充质干细胞在细胞诱导培养液的诱导下，生成卵泡刺激素分泌细胞；其中，细胞诱导培养液按重量百分比计包括：6％转化生长因子、7％表皮生长因子、10％人体血红蛋白、1％全反式维甲酸、5％卵泡刺激素生长因子、2％吡哆素、1％神经肽、2％己烯雌酚、0.5％孕酮、1％抗氧化剂，余量为DMEM-高糖培养液，其中，抗氧化剂为维生素E。
S3：利用人卵泡刺激素(FSH)ELISA检测试剂盒鉴定培养瓶内是否含有卵泡刺激素，以此确定脂肪间充质干细胞是否诱导为卵泡刺激素分泌细胞，再使用流式细胞仪检测卵泡刺激素分泌细胞的数量与质量；
S4：将培养瓶中的液体移至离心管内，以1500r/min离心8min，弃上清液，并提取下层细胞，得到卵泡刺激素分泌细胞与脂肪间充质干细胞的混合细胞；
S5：将所述混合细胞用人血白蛋白原液进行稀释，得到稀释混合细胞溶液，将稀释混合细胞溶液添加到磁性纳米缓释微球中，直至磁性纳米缓释微球完全浸没，在37℃恒温下，通过超声波分散辅助进行药物装载，时间为30min，待磁性纳米缓释微球充分溶胀后，得到卵泡刺激素缓释单体；
S6：将薏苡仁油、葡萄糖酸锌、肝素钙、透明质酸钠分别用1/4的生理盐水进行溶解，分别得到薏苡仁油溶液、葡萄糖酸锌溶液、肝素钙溶液、透明质酸钠溶液；首先将卵泡刺激素缓释单体与薏苡仁油溶液进行混合，并搅拌均匀，得到卵泡刺激素缓释单体-薏苡仁油溶液；在卵泡刺激素缓释单体-薏苡仁油溶液中，依次加入葡萄糖酸锌溶液、肝素钙溶液、透明质酸钠溶液，搅拌均匀，得到混合溶液A；
S7：将黄酮醇苷、维生素E、紫杉醇、谷胱甘肽、藻青素依次添加到混合溶液A中，搅拌均匀，得到混合溶液B；
S8：在混合溶液B中加入乳化剂、稳定剂，搅拌均匀，同时在搅拌下，加入PH调节剂至混合溶液B至PH＝7.2；即得含有脂肪间充质干细胞药物的注射液。
用中药组分及明胶替换生理盐水并制成药贴，中药组分占比10％，明胶为余量，药贴用于贴至患者肚脐处。其中，中药组分是由炙甘草、麝香、丹参、血竭、红藤以质量百分比为3:1:1:1:2配比而成，炙甘草具有补脾和胃，益气复脉的功效，药贴用于贴至患者肚脐处，肚脐与子宫及卵巢距离进，并且更加有利于药物的有效成分的吸收，大大提高了药物的疗效。药贴还配套设有电极贴和电磁脉冲发生器，药贴为双面一次性，一面贴在电极贴底部，另一面贴至患者肚脐，电极贴通过导线与电磁脉冲发生器相连。
治疗卵巢功能早衰的步骤为：第一步，先向患者体内局部靶向注射1ml的注射液；第二步，将药贴的一面贴至电极贴底部，另一面贴至患者肚脐处，并通过电磁脉冲发生器每隔2h进行电磁脉冲刺激，电磁脉冲频率为20HZ，工作时间为3min。
实施例2
一种脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用，脂肪间充质干细胞药物按照重量百分比计包括：10％脂肪间充质干细胞、7％卵泡刺激素分泌细胞、21％磁性纳米缓释微球、5％人血白蛋白原液、6％薏苡仁油、1.2％黄酮醇苷、1.5％维生素E、0.8％紫杉醇、0.6％谷胱甘肽、1％透明质酸钠、0.9％藻青素、1.2％葡萄糖酸锌、0.6％肝素钙、0.7％乳化剂、0.8％稳定剂、0.4％PH调节剂，余量为生理盐水，磁性纳米缓释微球负载率高，能缓释药效，并且含有磁性，靶向性更强；人血白蛋白原液可为脂肪间充质干细胞及卵泡刺激素分泌细胞提供适宜的微环境，提高细胞的活性；薏苡仁油具有益气养阴的功效，可起到一定辅助调理的作用；黄酮醇苷可用于消除细胞产生的自由基，并可起到抗炎抑菌的作用；维生素E与谷胱甘肽具有良好的抗氧化作用，防止细胞被氧化而损伤；葡萄糖酸锌可补充女性所缺乏的锌元素，肝素钙具有抗凝血、消血栓功能，防止药物注射时产生瘀点和血肿硬结。
脂肪间充质干细胞药物的制备方法包括以下步骤：
S1：从患者抽取自体脂肪组织8ml，利用清洗液冲洗脂肪组织中的血液，并将脂肪组织利用剪刀破碎至直径为4mm的脂肪粒，在脂肪粒中加入体积比为1:1的0.25％胰蛋白酶与0.1％胶原酶的混合酶液，在37℃温度下消化45min，再利用震荡器以1800rpm震荡7min，静置15min，吸出下层液体移至装有细胞诱导培养液的培养瓶中；
S2：将培养瓶放入二氧化碳培养箱中，在37℃恒温下培养6天，诱导脂肪间充质干细胞在细胞诱导培养液的诱导下，生成卵泡刺激素分泌细胞；其中，所述细胞诱导培养液按重量百分比计包括：7％转化生长因子、8％表皮生长因子、11％人体血红蛋白、3％全反式维甲酸、7％卵泡刺激素生长因子、3％吡哆素、2％神经肽、3％己烯雌酚、1.2％孕酮、1.5％抗氧化剂，余量为DMEM-高糖培养液，其中，抗氧化剂为L-抗坏血酸。
S3：利用人卵泡刺激素(FSH)ELISA检测试剂盒鉴定培养瓶内是否含有卵泡刺激素，以此确定脂肪间充质干细胞是否诱导为卵泡刺激素分泌细胞，再使用流式细胞仪检测卵泡刺激素分泌细胞的数量与质量；
S4：将培养瓶中的液体移至离心管内，以1500r/min离心9min，弃上清液，并提取下层细胞，得到卵泡刺激素分泌细胞与脂肪间充质干细胞的混合细胞；
S5：将所述混合细胞人血白蛋白原液进行稀释，得到稀释混合细胞溶液，将稀释混合细胞溶液添加到磁性纳米缓释微球中，直至磁性纳米缓释微球完全浸没，在37℃恒温下，通过超声波分散辅助进行药物装载，时间为45min，待磁性纳米缓释微球充分溶胀后，得到卵泡刺激素缓释单体；
S6：将薏苡仁油、葡萄糖酸锌、肝素钙、透明质酸钠分别用生理盐水进行溶解，分别得到薏苡仁油溶液、葡萄糖酸锌溶液、肝素钙溶液、透明质酸钠溶液；首先将卵泡刺激素缓释单体与薏苡仁油溶液进行混合，并搅拌均匀，得到卵泡刺激素缓释单体-薏苡仁油溶液；在卵泡刺激素缓释单体-薏苡仁油溶液中，依次加入葡萄糖酸锌溶液、肝素钙溶液、透明质酸钠溶液，搅拌均匀，得到混合溶液A；
S7：将黄酮醇苷、维生素E、紫杉醇、谷胱甘肽、藻青素依次添加到混合溶液A中，搅拌均匀，得到混合溶液B；
S8：在混合溶液B中加入乳化剂、稳定剂，搅拌均匀，同时在搅拌下，加入PH调节剂至混合溶液B至PH＝7.3；即得含有脂肪间充质干细胞药物的注射液。
用中药组分及明胶替换生理盐水并制成药贴，中药组分占比15％，明胶为余量，药贴用于贴至患者肚脐处。其中，中药组分是由炙甘草、麝香、丹参、血竭、红藤以质量百分比为3:1:1:1:2配比而成，炙甘草具有补脾和胃，益气复脉的功效，药贴用于贴至患者肚脐处，肚脐与子宫及卵巢距离进，并且更加有利于药物的有效成分的吸收，大大提高了药物的疗效。药贴还配套设有电极贴和电磁脉冲发生器，药贴为双面一次性，一面贴在电极贴底部，另一面贴至患者肚脐，电极贴通过导线与电磁脉冲发生器相连。
治疗卵巢功能早衰的步骤为：第一步，先向患者体内局部靶向注射1.5ml的注射液；第二步，将药贴的一面贴至电极贴底部，另一面贴至患者肚脐处，并通过电磁脉冲发生器每隔3h进行电磁脉冲刺激，电磁脉冲频率为80HZ，工作时间为8min。
实施例3
一种脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用，脂肪间充质干细胞药物按照重量百分比计包括：12％脂肪间充质干细胞、8％卵泡刺激素分泌细胞、22％磁性纳米缓释微球、6％人血白蛋白原液、7％薏苡仁油、1.5％黄酮醇苷、2％维生素E、1％紫杉醇、0.8％谷胱甘肽、1.5％透明质酸钠、1.2％藻青素、1.8％葡萄糖酸锌、0.8％肝素钙、1％乳化剂、1％稳定剂、0.5％PH调节剂，余量为生理盐水，磁性纳米缓释微球负载率高，能缓释药效，并且含有磁性，靶向性更强；人血白蛋白原液可为脂肪间充质干细胞及卵泡刺激素分泌细胞提供适宜的微环境，提高细胞的活性；薏苡仁油具有益气养阴的功效，可起到一定辅助调理的作用；黄酮醇苷可用于消除细胞产生的自由基，并可起到抗炎抑菌的作用；维生素E与谷胱甘肽具有良好的抗氧化作用，防止细胞被氧化而损伤；葡萄糖酸锌可补充女性所缺乏的锌元素，肝素钙具有抗凝血、消血栓功能，防止药物注射时产生瘀点和血肿硬结。
脂肪间充质干细胞药物的制备方法包括以下步骤：
S1：从患者抽取自体脂肪组织10ml，利用清洗液冲洗脂肪组织中的血液，并将脂肪组织利用剪刀破碎至直径为5mm的脂肪粒，在脂肪粒中加入体积比为1:1的0.25％胰蛋白酶与0.1％胶原酶的混合酶液，在37℃温度下消化60min，再利用震荡器以2000rpm震荡10min，静置20min，吸出下层液体移至装有细胞诱导培养液的培养瓶中；
S2：将培养瓶放入二氧化碳培养箱中，在37℃恒温下培养10天，诱导脂肪间充质干细胞在细胞诱导培养液的诱导下，生成卵泡刺激素分泌细胞；其中，所述细胞诱导培养液按重量百分比计包括：8％转化生长因子、10％表皮生长因子、12％人体血红蛋白、4％全反式维甲酸、9％卵泡刺激素生长因子、4％吡哆素、3％神经肽、4％己烯雌酚、1.5％孕酮、2％抗氧化剂，余量为DMEM-高糖培养液，其中，抗氧化剂为α-硫辛酸。
S3：利用人卵泡刺激素(FSH)ELISA检测试剂盒鉴定培养瓶内是否含有卵泡刺激素，以此确定脂肪间充质干细胞是否诱导为卵泡刺激素分泌细胞，再使用流式细胞仪检测卵泡刺激素分泌细胞的数量与质量；
S4：将培养瓶中的液体移至离心管内，以1500r/min离心10min，弃上清液，并提取下层细胞，得到卵泡刺激素分泌细胞与脂肪间充质干细胞的混合细胞；
S5：将所述混合细胞人血白蛋白原液进行稀释，得到稀释混合细胞溶液，将稀释混合细胞溶液添加到磁性纳米缓释微球中，直至磁性纳米缓释微球完全浸没，在37℃恒温下，通过超声波分散辅助进行药物装载，时间为60min，待磁性纳米缓释微球充分溶胀后，得到卵泡刺激素缓释单体；
S6：将薏苡仁油、葡萄糖酸锌、肝素钙、透明质酸钠分别用1/4的生理盐水进行溶解，分别得到薏苡仁油溶液、葡萄糖酸锌溶液、肝素钙溶液、透明质酸钠溶液；首先将卵泡刺激素缓释单体与薏苡仁油溶液进行混合，并搅拌均匀，得到卵泡刺激素缓释单体-薏苡仁油溶液；在卵泡刺激素缓释单体-薏苡仁油溶液中，依次加入葡萄糖酸锌溶液、肝素钙溶液、透明质酸钠溶液，搅拌均匀，得到混合溶液A；
S7：将黄酮醇苷、维生素E、紫杉醇、谷胱甘肽、藻青素依次添加到混合溶液A中，搅拌均匀，得到混合溶液B；
S8：在混合溶液B中加入乳化剂、稳定剂，搅拌均匀，同时在搅拌下，加入PH调节剂至混合溶液B至PH＝7.5；即得含有脂肪间充质干细胞药物的注射液。
用中药组分及辅料替换生理盐水并制成药贴，中药组分占比20％，明胶为余量，药贴用于贴至患者肚脐处。其中，中药组分是由炙甘草、麝香、丹参、血竭、红藤以质量百分比为3:1:1:1:2配比而成，炙甘草具有补脾和胃，益气复脉的功效，药贴用于贴至患者肚脐处，肚脐与子宫及卵巢距离进，并且更加有利于药物的有效成分的吸收，大大提高了药物的疗效。药贴还配套设有电极贴和电磁脉冲发生器，药贴为双面一次性，一面贴在电极贴底部，另一面贴至患者肚脐，电极贴通过导线与电磁脉冲发生器相连。
治疗卵巢功能早衰的步骤为：第一步，先向患者体内局部靶向注射2ml的注射液；第二步，将药贴的一面贴至电极贴底部，另一面贴至患者肚脐处，并通过电磁脉冲发生器每隔4h进行电磁脉冲刺激，电磁脉冲频率为150HZ，工作时间为10min。
本发明脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用
选取患有卵巢早衰的患者共100人，按照随机方法分为实验组1、实验组2、实验组3和对照组，每组25例，年龄均在35-65岁之间，其中实验组1、实验组2、实验组3为使用本发明药物进行治疗，对照组为普通方法治，症状改善疗效对比如下表所示。
组别 人数/人 显效/人 有效/人 无效/人 总有效率/％
对照组 25 4 10 11 56
实验组1 25 7 13 5 80
实验组2 25 13 10 2 92
试验组3 25 14 8 3 88
从表1和表2可以看出，本发明药物组合物对于卵巢早衰的治疗效果明显优于对照组。
尽管已参照其具体实施方案描述和阐明了本发明，但本领域技术人员会认识到，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下对其作出各种改变、修改和取代。例如，由于被治疗特定病症的人的响应能力的变化，如上阐述的优选剂量以外的有效剂量可能适用。同样地，观察到的药理学响应可能根据和依赖所选特定活性化合物或是否存在药用载体以及制剂类型和所用给药模式而变，根据本发明的目的和实践预想到结果中的这类预期变化或差异。因此，本发明意在仅受下列权利要求的范围限制且这些权利要求应在合理的程度上尽可能广义地解释。

Claims (7)

1.一种脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞药物按照重量百分比计包括：8-12％脂肪间充质干细胞、6-8％卵泡刺激素分泌细胞、20-22％磁性纳米缓释微球、4-6％人血白蛋白原液、5-7％薏苡仁油、1-1.5％黄酮醇苷、1-2％维生素E、0.5-1％紫杉醇、0.4-0.8％谷胱甘肽、0.5-1.5％透明质酸钠、0.3-1.2％藻青素、0.4-1.8％葡萄糖酸锌、0.5-0.8％肝素钙、0.5-1％乳化剂、0.5-1％稳定剂、0.3-0.5％PH调节剂，余量为生理盐水。
2.如权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞药物的制备方法包括以下步骤：
S1：从患者抽取自体脂肪组织5-10ml，利用清洗液冲洗所述脂肪组织中的血液，并将脂肪组织利用剪刀破碎至直径为3-5mm的脂肪粒，在所述脂肪粒中加入体积比为1:1的0.25％胰蛋白酶与0.1％胶原酶的混合酶液，在37℃温度下消化30-60min，再利用震荡器以1500-2000rpm震荡5-10min，静置10-20min，吸出下层液体移至装有细胞诱导培养液的培养瓶中；
S2：将所述培养瓶放入二氧化碳培养箱中，在37℃恒温下培养3-10天，诱导脂肪间充质干细胞在所述细胞诱导培养液的诱导下，生成卵泡刺激素分泌细胞；
S3：利用人卵泡刺激素(FSH)ELISA检测试剂盒鉴定培养瓶内是否含有卵泡刺激素，以此确定脂肪间充质干细胞是否诱导为卵泡刺激素分泌细胞，再使用流式细胞仪检测卵泡刺激素分泌细胞的数量与质量；
S4：将培养瓶中的液体移至离心管内，以1500r/min离心8-10min，弃上清液，并提取下层细胞，得到卵泡刺激素分泌细胞与脂肪间充质干细胞的混合细胞；
S5：将所述混合细胞用所述人血白蛋白原液进行稀释，得到稀释混合细胞溶液，将稀释混合细胞溶液添加到所述磁性纳米缓释微球中，直至磁性纳米缓释微球完全浸没，在37℃恒温下，通过超声波分散辅助进行药物装载，时间为30-60min，待磁性纳米缓释微球充分溶胀后，得到卵泡刺激素缓释单体；
S6：将所述薏苡仁油、葡萄糖酸锌、肝素钙、透明质酸钠分别用1/4的所述生理盐水进行溶解，分别得到薏苡仁油溶液、葡萄糖酸锌溶液、肝素钙溶液、透明质酸钠溶液；首先将所述卵泡刺激素缓释单体与所述薏苡仁油溶液进行混合，并搅拌均匀，得到卵泡刺激素缓释单体-薏苡仁油溶液；在所述卵泡刺激素缓释单体-薏苡仁油溶液中，依次加入葡萄糖酸锌溶液、肝素钙溶液、透明质酸钠溶液，搅拌均匀，得到混合溶液A；
S7：将所述黄酮醇苷、维生素E、紫杉醇、谷胱甘肽、藻青素依次添加到所述混合溶液A中，搅拌均匀，得到混合溶液B；
S8：在所述混合溶液B中加入所述乳化剂、稳定剂，搅拌均匀，同时在搅拌下，加入所述PH调节剂至混合溶液B至PH＝7.2-7.5；即得含有脂肪间充质干细胞药物的注射液。
3.如权利要求2所述的一种脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用，其特征在于，所述细胞诱导培养液按重量百分比计包括：4-6％转化生长因子、4-6％表皮生长因子、10-12％人体血红蛋白、3-9％全反式维甲酸、5-9％卵泡刺激素生长因子、2-4％吡哆素、1-3％神经肽、2-4％己烯雌酚、0.5-1.5％孕酮、1-2％抗氧化剂，余量为DMEM-高糖培养液。
4.如权利要求3所述的一种脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用，其特征在于，所述抗氧化剂为维生素E、L-抗坏血酸、α-硫辛酸、还原性谷胱甘肽中任意一种或几种组合。
5.如权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用，其特征在于，用中药组分及辅料替换权利要求1中的所述生理盐水并制成药贴，所述中药组分占比10-20％，余量为辅料。
6.如权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用，其特征在于，用中药组分及辅料替换权利要求1中的所述生理盐水并制成药贴，所述中药组分占比10-20％，余量为辅料，中药组分是由炙甘草、麝香、丹参、血竭、红藤以质量百分比为3:1:1:1:2配比而成，所述药贴用于贴至患者肚脐处。
7.如权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞药物在治疗卵巢功能早衰中的应用，其特征在于，所述药贴还配套设有电极贴和电磁脉冲发生器。
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