CN102920735A - 一种间充质干细胞注射液及其制备方法和在制备治疗糖尿病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种间充质干细胞注射液及其制备方法和在制备治疗糖尿病药物中的应用。本发明采用的间充质干细胞来源于人脐带和胎盘，间充质干细胞注射液成分由人间充质干细胞、人血白蛋白、低分子肝素钙、复方氨基酸、0.5%维生素C和溶解介质组成，溶液介质可以复方电解质溶液或葡萄糖或生理盐水组成。本发明用人间充质干细胞注射液来修复损伤的胰岛β细胞，依靠内源性胰岛素的分泌来降低血糖，从而达到从根本上治疗糖尿病的目的。本发明可以逆转糖尿病病程，使患者摆脱服用外源药物和注射胰岛素的不便、毒副反应以及血糖控制不佳导致的严重并发症，彻底治疗包括1型和2型的糖尿病。

Description

一种间充质干细胞注射液及其制备方法和在制备治疗糖尿病药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种间充质干细胞注射液及其制备方法和在制备治疗糖尿病药物中的应用。
背景技术
糖尿病的发病率越来越高，据统计，现在全球糖尿病病人有1.5亿，专家预测到2025年将达3个亿，其中75%在印度、中国等发展中国家，世界华人患糖尿病有上升趋势，中国大陆已由十几年前1%的发病率上升到目前的2.5~3.25%，城市成年人糖尿病的发病率接近10%。
糖尿病主要分为1型、2型、妊娠期和其他类型糖尿病。1型糖尿病（T1DM）以胰岛β细胞损害特点，其中1A型为T淋巴细胞介导自身免疫病，在遗传易感因素与环境因素相互作用下，体内的免疫调节逐渐失衡，以胰岛β细胞损害导致严重胰岛素分泌障碍为特点，血糖持续升高为标志。由于T1DM患者胰岛β细胞功能差，血糖难以控制，容易出现感染、糖尿病微血管病变和酮症酸中毒等危重并发症，严重影响青少年的生长发育。
英国糖尿病前瞻性研究(UKPDS)显示，2型糖尿病（T2DM）患者在确诊糖尿病时，其胰岛β细胞功能减退多达50％，胰岛素分泌已明显不足，同时随着病程的延长，胰岛B细胞功能每年以6％～8％的速度下降。持续高血糖可直接损伤β细胞功能及削弱胰岛β细胞对血糖升高的胰岛素分泌反应，并降低胰岛素介导的葡萄糖运转，致血糖进一步升高形成恶性循环。因此许多研究者致力于研究如何保护或恢复胰岛β细胞，以改变或延长2型糖尿病自然病程。
目前糖尿病的治疗主要依赖药物和胰岛素来控制血糖，不能治愈糖尿病，患者从发病开始就需使用药物治疗，需要终生服用降糖药物和/或注射胰岛素。胰岛移植为治愈糖尿病提供了可能性，但由于胰岛来源受限，且配型困难，手术成功率低，治疗后需要长期服用抗免疫排斥药物，限制了此技术的广泛应用。
而且，目前以胰岛素为主的治疗方法，虽可有效缓解糖尿病症状，但是胰岛素治疗并不能彻底解决胰岛β细胞损伤的问题，因此，寻找促进胰岛β细胞再生与修复的治疗方法成为医学界亟待解决的重大课题。
间充质干细胞（MSCs）是干细胞家族的重要成员，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入和自我复制等特点而日益受到人们的关注。MSCs在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为胰岛、神经、血管内皮、骨、软骨、肌肉、肝脏、心肌等多种组织细胞，除此之外，MSCs还具有低免疫原性和独特的免疫调节作用，能逃避免疫识别、抑制免疫应答。胎盘、脐带来源的MSCs具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，以上生物学特性使其有可能成为用于组织修复、抑制免疫排斥反应的发生和代谢性疾病细胞治疗最具临床应用前景的多能干细胞。
综上，目前糖尿病的治疗主要解决的是控制血糖，不能从根本上治疗糖尿病，患者需终生服药，药物的毒副作用对患者的生活影响也很大。而且随着糖尿病病程的进展，如果血糖控制不良，很快便会出现糖尿病相关的并发症，如：糖尿病视网膜病、糖尿病肾病、糖尿病周围神经病变、甚至是糖尿病足等危重并发症。目前的药物与胰岛素治疗并不能很好的避免这些情况的发生，修复并再生胰岛β细胞，恢复内源性胰岛素分泌，自主控制血糖才是治疗糖尿病的根本。
现有技术的缺点：目前糖尿病的治疗主要依赖于饮食控制、运动疗法、药物与胰岛素综合治疗。这些疗法的综合运用可以短时间内控制血糖稳定，但只是依赖外来药物降低血糖，不能有效修复损伤的胰岛功能，不能从根本上治疗糖尿病及阻止病情的进展。而且很多降血糖药物都有很严重的副作用，比如：严重的低血糖、腹泻、肝肾功损害等。
发明内容
针对现有技术中糖尿病的治疗方法存在的上述缺陷和不足，本发明提供了一种间充质干细胞注射液及其制备方法和在制备治疗糖尿病中的应用，通过本发明的技术方案，本发明解决了患者长期服药和注射胰岛素的困境，可以从根本上达到治疗糖尿病的目的。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种间充质干细胞注射液，它包括以下组分：间充质干细胞的数量为2×105-1×107个/ml、质量体积比为1-5%人血白蛋白、 质量体积比为0.5%低分子肝素钙、质量体积比为1-20%复方氨基酸、质量体积比为0.3-0.7%维生素 C、余量为溶液介质。 
对上述技术方案的进一步改进：所述溶液介质为复方电解质溶液、葡萄糖或生理盐水。
对上述技术方案的进一步改进：所述间充质干细胞来源于人脐带和/或人胎盘，干细胞活力保持在85%以上。
本发明还提供了所述的间充质干细胞注射液的制备方法，包括脐带间充质干细胞的制备和胎盘间充质干细胞的制备。
本发明还提供了所述的间充质干细胞注射液在制备治疗糖尿病药物中的应用。
对上述技术方案的进一步改进：所述糖尿病包括1型和2型糖尿病。
对上述技术方案的进一步改进：制备好的间充质干细胞注射液在1周内使用完毕。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明采用的间充质干细胞来源于人脐带和人胎盘，来源于胎盘和脐带的间充质干细胞产量较大，制备体系易于质控，易于产业化。间充质干细胞注射液成分由人间充质干细胞、人血白蛋白、低分子肝素钙、复方氨基酸、0.5%维生素 C和溶解介质组成，溶液介质可以是勃脉力(复方电解质溶液)或葡萄糖或生理盐水组成。本发明用人间充质干细胞注射液来修复损伤的胰岛β细胞，恢复糖尿病患者的胰岛功能，依靠内源性胰岛素的分泌来降低血糖，从而达到从根本上治疗糖尿病的目的。本发明可以逆转糖尿病病程，使患者摆脱服用外源药物和注射胰岛素的不便、毒副反应以及血糖控制不佳导致的严重并发症，彻底治疗糖尿病，所治疗的糖尿病包括1型和2型糖尿病。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1为本发明中三组小鼠体内的免疫细胞变化图。
图2为本发明中三组小鼠空腹血糖与餐后血糖的比较图。
图3为本发明中三组小鼠胰岛病理切片比较图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
    实施例1
一、脐带间充质干细胞的制备：
1.新鲜足月健康胎儿脐带，用PBS缓冲液冲洗，所述PBS缓冲液含100 kU/ L 青霉素及100 mg/ L 链霉素；
2. 剪取6-8cm长脐带，将脐带剪成2cm长的小段，用PBS缓冲液反复冲洗；
3.将脐带组织块剪碎成2-3mm3小块；
4. 将剪碎组织加入L-DMEM培养基洗涤，在500-700g条件下离心5分钟，弃上清；
5.将组织块和培养基按体积比2.5-3:1比例加入培养基，混匀组织块，接种至细胞培养皿中，置培养箱培养；所述的培养基为含1-10ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及体积百分比10%-15% 胎牛血清(FBS)的L-DMEM培养基；
6.24小时后补加步骤5所述的培养基；
7.每3天换一次培养基，第6天后换含体积比10%胎牛血清的L-DMEM培养基，至8-9天细胞达80%左右融合时传代；传代培养基为含体积比10%胎牛血清的L-DMEM培养基；
8.以后每3天传代一次。
二. 胎盘间充质干细胞的制备：
1. 用含100 kU/ L 青霉素及100 mg/ L 链霉素的PBS缓冲液冲洗胎盘，沿胎盘边缘将胎儿面羊膜慢慢剥离；
2. 再次冲洗胎盘源羊膜，将羊膜剪成1-5mm3小块；
3. 将羊膜组织块用含青霉素和链霉素的DMEM培养基混匀，在850g条件下离心10min；
4. 弃上清，每管加含体积比0.25%胰蛋白酶的DMEM培养基于37℃消化10min，在700-900g条件下离心10min；
5. 弃上清，每管加完全培养基后，在2200rpm条件下离心10min；所述完全培养基为含体积比10%的胎牛血清+100 kU/ L 青霉素+100 mg/ L 链霉素的DMEM培养基；
6. 弃上清，羊膜组织块接种于培养皿中，加完全培养基，在培养箱培养；每3天进行半量换液；
7. 至10-12天有细胞贴壁生长，细胞克隆形成后，弃掉组织块，加完全培养基进行培养；
8. 至15-17天细胞克隆融合至80-90%，进行细胞传代。
三、间充质干细胞注射液的制备 
一种间充质干细胞注射液，它包括以下组分：
间充质干细胞的数量为2×105-1×107个/ml；
质量体积比为1-5%人血白蛋白； 
质量体积比为0.5%低分子肝素钙；
质量体积比为1-20%复方氨基酸；
质量体积比为0.3-0.7%维生素 C；
余量为溶液介质。 
如配制100ml干细胞注射液，该注射液由人血白蛋白原液5ml（质量体积比终浓度为1%）、低分子肝素钙0.5ml（质量体积比终浓度为0.5%）、复方氨基酸1ml（质量体积比终浓度为1%）、维生素 C 0.5g（质量体积比终浓度为0.5%）、勃脉力(复方电解质溶液) 93ml和间充质干细胞组成。除间充质干细胞外，注射液其余成分需提前配制，4℃预冷备用，间充质干细胞最终重悬在此溶液中，制成单细胞悬液，每毫升注射液中间充质干细胞的数量为2×105。间充质干细胞在2-15℃环境温度中，48小时内细胞仍保持为单细胞悬液状态，细胞活力（台盼蓝染色计活力）保持在85%以上。本发明所述质量体积比均代表质量(g)与体积(ml)的比例。 
所述注射液可使间充质干细胞在2-15℃温度中48小时内细胞仍保持为单细胞悬液状态，细胞活力保持在85%以上。
人血白蛋白和复方氨基酸均为临床注射液成分，可为细胞提供营养，利于细胞的新陈代谢；维生素 C的添加可维持各种过氧化物酶的活性，亦有利于细胞代谢和活性的保持。
0.5%低分子肝素的添加保证细胞在保存过程中维持良好的细胞分散状态，减少了细胞间的黏附成团及细胞黏附容器壁的现象，降低了临床细胞输注时可能发生的血管内细胞成团栓塞的危险，同时也降低了细胞聚集而被输液滤器过滤导致的细胞损失，而微量的肝素添加不会引发临床出血等不良反应。
溶液介质为勃脉力(复方电解质溶液)或葡萄糖或生理盐水，可以保持细胞的渗透压，利于细胞的存活。该注射液组份可方便选择多种临床常用输注液体做溶液介质，以复方电解质溶液为最佳。
这种注射液非常利于间充质干细胞的存活，且临床输注安全，细胞可在此保存液中可长时间保持较高的活力，便于临床的运输而不受时间的苛刻限制，解决了异地患者使用，细胞需要长时间运输的问题。
四、间充质干细胞注射液对NOD小鼠(1型糖尿病模型)治疗的安全性和有效性实验
该实验选取8周龄雌性NOD小鼠60只，随机分成3组，每组20只，分别为对照组、预防组和治疗组。对照组给予生理盐水尾静脉注射；同时预防组给予间充质干细胞注射液1ml（内含间充质干细胞1.0×106）尾静脉注射；治疗组小鼠发病后（连续2次空腹血糖值≥11．1mmol/L者为发病）给予间充质干细胞注射液1ml（内含间充质干细胞1.0×106）尾静脉注射，每日监测小鼠血糖变化。观察三个月后，处死动物，心脏取血（约1ml）及胰腺组织病理切片进行相关的实验检查。
  结果显示：间充质干细胞注射液静脉注射未引起急性毒理反应及排斥反应。预防组小鼠发病时间明显迟于对照组，且发病率明显低于对照组。间充质干细胞注射液可以调节NOD小鼠体内的免疫紊乱，增加Treg细胞的比例，降低效应T细胞的作用，如图1所示，与对照组相比，预防组与治疗组的Treg细胞的比例明显升高，效应T细胞比例明显下降，P<0.05。
治疗组和预防组小鼠空腹血糖及餐后血糖明显低于对照组，如图2所示，与对照组相比，预防组与治疗组小鼠的空腹血糖与餐后血糖明显降低，P<0.05。
胰腺病理切片显示：治疗组小鼠胰腺β细胞功能较对照组明显恢复，胰岛素分泌量明显增加，如图3所示，与对照组相比，治疗组小鼠的胰岛β细胞功能明显恢复，胰岛素分泌量明显增加，P<0.05。
实施例2
脐带和胎盘间充质干细胞的制备同实施例1。
如配制100ml干细胞注射液，该注射液由人血白蛋白原液25ml（质量体积比终浓度为5%）、低分子肝素钙0.5ml（质量体积比终浓度为0.5%）、复方氨基酸20ml（质量体积比终浓度为20%）、维生素 C 0.5g（质量体积比终浓度为0.5%）、5%葡萄糖注射液54ml和间充质干细胞组成。除间充质干细胞外，注射液其余成分需提前配制，4℃预冷备用，间充质干细胞最终重悬在此溶液中，制成单细胞悬液，每毫升注射液中间充质干细胞的数量为1×107。间充质干细胞在2-15℃环境温度中，48小时内细胞仍保持为单细胞悬液状态，细胞活力保持在85%以上。
实施例3
脐带和胎盘间充质干细胞的制备同实施例1。
如配制100ml干细胞注射液，该注射液由人血白蛋白原液10ml（质量体积比终浓度为2%）、低分子肝素钙0.5ml（质量体积比终浓度为0.5%）、复方氨基酸10ml（质量体积比终浓度为10%）、维生素 C 0.5g（质量体积比终浓度为0.5%）、0.9%生理盐水注射液79ml和间充质干细胞组成。除间充质干细胞外，注射液其余成分需提前配制，4℃预冷备用，配好的注射液在1周内使用完毕。间充质干细胞最终重悬在此溶液中，制成单细胞悬液，每毫升注射液中间充质干细胞的数量为2×106。间充质干细胞在2-15℃环境温度中，48小时内细胞仍保持为单细胞悬液状态，细胞活力保持在85%以上。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种间充质干细胞注射液，其特征在于它包括以下组分：
间充质干细胞的数量为2×105-1×107个/ml；
质量体积比为1-5%人血白蛋白；
质量体积比为0.5%低分子肝素钙；
质量体积比为1-20%复方氨基酸；
质量体积比为0.3-0.7%维生素C；
余量为溶液介质。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞注射液，其特征在于：所述溶液介质为复方电解质溶液、葡萄糖或生理盐水。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞注射液，其特征在于：所述间充质干细胞来源于人脐带和/或人胎盘，干细胞活力保持在85%以上。
4.根据权利要求3所述的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于提前配制好质量体积比为1-5%人血白蛋白、质量体积比为0.5%低分子肝素钙、质量体积比为1-20%复方氨基酸、质量体积比为0.3-0.7%维生素C和溶液介质，然后将间充质干细胞重悬于上述溶液中制成单细胞悬液，使干细胞数量为2×105-1×107个/ml。
5.根据权利要求4所述的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于所述脐带间充质干细胞的制备包括以下步骤：
(1).取新鲜足月健康胎儿脐带，用含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素的PBS缓冲液冲洗；
(2).剪取6-8cm长脐带，将脐带剪成2cm长的小段，用PBS缓冲液反复冲洗；
(3).将脐带组织块剪碎成2-3mm3小块；
(4).将剪碎组织加入L-DMEM培养基洗涤，在500-700g条件下离心5分钟，弃上清；
(5).将组织块和培养基按体积比2.5-3:1比例加入培养基，混匀组织块，接种至细胞培养皿中，置培养箱培养，所述的培养基为含1-10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及体积百分比10%-15%胎牛血清(FBS)的L-DMEM培养基；
(6).24小时后补加步骤5所述的培养基；
(7).每3天换一次培养基，第6天后换含体积比10%胎牛血清的L-DMEM培养基，至8-9天细胞达80%左右融合时传代，传代培养基为含体积比10%胎牛血清的L-DMEM培养基；
(8).以后每3天传代一次。
6.根据权利要求4所述的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于所述胎盘间充质干细胞的制备包括以下步骤：
(1).用含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素的PBS缓冲液冲洗胎盘，沿胎盘边缘将胎儿面羊膜慢慢剥离；
(2).再次冲洗胎盘源羊膜，将羊膜剪成1-5mm3小块；
(3).将羊膜组织块用含青霉素和链霉素的DMEM培养基混匀，在850g条件下离心10min；
(4).弃上清，每管加含体积比0.25%胰蛋白酶的DMEM培养基于37℃消化10min，在700-900g条件下离心10min；
(5).弃上清，每管加完全培养基后，在2200rpm条件下离心10min；所述完全培养基为含体积比10%的胎牛血清+100kU/L青霉素+100mg/L链霉素的DMEM培养基；
(6).弃上清，羊膜组织块接种于培养皿中，加完全培养基，在培养箱培养；每3天进行半量换液；
(7).至10-12天有细胞贴壁生长，细胞克隆形成后，弃掉组织块，加完全培养基进行培养；
(8).至15-17天细胞克隆融合至80-90%，进行细胞传代。
7.根据权利要求1所述的间充质干细胞注射液在制备治疗糖尿病药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的间充质干细胞注射液在制备治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于：所述糖尿病包括1型和2型糖尿病。
9.根据权利要求7所述的间充质干细胞注射液在制备治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于：制备好的间充质干细胞注射液在1周内使用完毕。
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