CN106237313A - 一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞技术领域，特别涉及一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。该脐带间充质干细胞注射液包括脐带间充质干细胞、人血白蛋白、低分子肝素钙、维生素C、珠子参皂苷和溶媒。本发明采用脐带间充质干细胞制备干细胞注射液，取材方便，不违反伦理问题；本发明制备的注射液能有效延长细胞的保存时间，并且保存干细胞的活性较高，使用方便；本发明制备的注射液在回输后能促进间充质干细胞向肝细胞分化成熟，降低GVHD的发生率。

Description

一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，特别涉及一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。
背景技术
我国乙型肝炎病毒(HBV)感染人数达1.2亿，慢性肝炎患者高达3000多万，其中乙型病毒性肝炎(乙肝)是导致肝硬化、原发性肝细胞癌(肝癌)的主要原因，每年因肝硬化、肝癌、肝功能衰竭等死亡的人数高达30～50万，严重威胁着人们的健康。对于终末期的肝炎、肝硬化，以及遗传性、代谢性肝病，原位肝移植是目前唯一确定有效的治疗手段，但肝移植术后伴有各种并发症，主要有感染并发症、排斥反应、胆道并发症、原发病复发及免疫抑制剂相关疾病等，严重影响着患者的生活质量及移植肝的长期存活率。据国内外研究报道，大约有30％～70％的肝移植受者在移植术后1年内发生过一次急性排斥反应，是导致移植物丢失的最重要的原因之一。
移植物抗宿主反应(GVHD，graft-versus-host disease)是一种特异的免疫现象，是由于移植物组织中的免疫活性细胞与免疫受抑制的、组织不相融性抗原受者的组织之间的反应。肝移植术后发生GVHD很罕见，其发生率为0.1～0.2％，显著低于骨髓移植后GVHD的发生率，但病死率极高，超过75％。目前除再次肝移植外，常规治疗方法往往疗效欠佳甚至无效，再次移植肝给患者带来了较大的经济负担和精神肉体上的痛苦。
随着干细胞生物学研究不断的发展，MSC具有低免疫原性和很强的免疫调节作用(能逃避免疫识别、抑制免疫应答)、炎症趋化、组织修复等生物特性，国内外研究发现，输注MSC可以提高移植术后的免疫耐受力，延长移植物的存活时间，在治疗移植物抗宿主病上也得到有效应用，尤其在肾移植、骨髓移植等免疫排斥反应治疗中已取得较好效果，但在治疗肝移植术后急性排斥反应中的应用还较少。间充质干细胞具备干细胞的特性及多向分化潜能，可向炎症或损伤部位定向迁移并抗炎或修复损伤组织，还因其低免疫原性、较强的免疫调节及抗微生物作用而成为治疗肝移植术后急性排斥反应的重要研究方向。因此，提供一种新型的能够有效治疗GVHD的干细胞制剂具有重要的医学价值。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。该脐带间充质干细胞注射液能有效的维持干细胞的活力，在回输后能促进间充质干细胞向肝细胞分化成熟，降低GVHD的发生率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种脐带间充质干细胞注射液，包括脐带间充质干细胞、人血白蛋白、低分子肝素钙、维生素C、珠子参皂苷和溶媒。
本发明制备的脐带间充质干细胞注射液，采用脐带来源的MSCs，其具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，以上生物学特性使其有可能成为用于组织修复、抑制免疫排斥反应的发生和代谢性疾病细胞治疗最具临床应用前景的多能干细胞，尤其是在肝移植后治疗GVHD有着重要的应用前景。
其中，人血白蛋白为临床注射级成分，为细胞提供营养；维生素C可维持过氧化物酶的活性，从而保存细胞的活性；低分子肝素能有效减少细胞结团，防止细胞输注时堵塞输液过滤器并减少细胞损失；珠子参皂苷可促进输注的干细胞在体内能更好的分化成成熟的肝细胞；溶液介质可为勃脉力(复方电解质溶液)或葡萄糖或生理盐水，其可保持细胞的渗透压，利于细胞的保持活性，临床输注以复方电解质溶液为最佳。
作为优选，每100mL脐带间充质干细胞注射液中包括：
脐带间充质干细胞：(0.5～1)×108个；
人血白蛋白：1～5g；
低分子肝素钙：0.1Ml；
维生素C：0.3～0.7g；
珠子参皂苷：5～20g；
溶媒：补足。
优选地，每100mL脐带间充质干细胞注射液中包括：
脐带间充质干细胞：1×108个；
人血白蛋白：1～5g；
低分子肝素钙：0.1mL；
维生素C：0.3～0.7g；
珠子参皂苷：5～20g；
溶媒：补足。
在本发明提供的一实施例中，每100mL脐带间充质干细胞注射液中包括：
脐带间充质干细胞：1×108个；
人血白蛋白：1g；
低分子肝素钙：0.1mL；
维生素C：0.3g；
珠子参皂苷：5g；
溶媒：补足。
在本发明提供的另一实施例中，每100mL脐带间充质干细胞注射液中包括：
脐带间充质干细胞：1×108个；
人血白蛋白：3g；
低分子肝素钙：0.1mL；
维生素C：0.5g；
珠子参皂苷：12.5g；
溶媒：补足。
在本发明提供的另一实施例中，每100mL脐带间充质干细胞注射液中包括：
脐带间充质干细胞：1×108个；
人血白蛋白：5g；
低分子肝素钙：0.1mL；
维生素C：0.7g；
珠子参皂苷：20g；
溶媒：补足。
作为优选，溶媒为复方电解质注射液、葡萄糖注射液或生理盐水。临床输注以复方电解质注射液为最佳。
作为优选，复方电解质注射液为勃脉力A复方电解质注射液。
在本发明提供的实施例中，生理盐水为0.9％氯化钠注射液。
作为优选，脐带间充质干细胞为第2～5代脐带间充质干细胞。
优选地，脐带间充质干细胞为第3代脐带间充质干细胞。
本发明还提供了该脐带间充质干细胞注射液在制备治疗移植物抗宿主反应的药物中的应用。
本发明还提供了该脐带间充质干细胞注射液的制备方法，包括：将人血白蛋白、低分子肝素钙、维生素C、珠子参皂苷和溶媒混匀，过滤除菌，得到混合液；
采用混合液重悬脐带间充质干细胞，得到脐带间充质干细胞注射液。
作为优选，过滤除菌采用除菌级亲水性过滤器过滤除菌。
作为优选，除菌级亲水性过滤器的孔径为0.1～1μm。
本发明提供了一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。该脐带间充质干细胞注射液包括脐带间充质干细胞、人血白蛋白、低分子肝素钙、维生素C、珠子参皂苷和溶媒。本发明具有如下有益效果之一：
1、本发明采用脐带间充质干细胞制备干细胞注射液，取材方便，不违反伦理问题；
2、本发明制备的注射液能有效的保存干细胞的活性，保存时间长，细胞活率高；
3、本发明制备的注射液在回输后能促进间充质干细胞向肝细胞分化成熟，降低GVHD的发生率。
附图说明
图1示脐带间充质干细胞的鉴定结果；其中1-1示P2代细胞培养96h后在显微镜下放大40倍的图片；1-2示P2代细胞培养96h后在显微镜下放大100倍的图片；1-3示P5代细胞培养96h后在显微镜下放大40倍的图片；1-4示P5代细胞培养96h后在显微镜下放大100倍的图片；
图2示脐带间充质干细胞成骨分化的染色鉴定结果；2-1示P2代脐带间充质干细胞诱导分化为成骨细胞后在显微镜下放大40倍的图片；2-2示P2代脐带间充质干细胞诱导分化为成骨细胞后在显微镜下放大100倍的图片；2-3示P5代脐带间充质干细胞诱导分化为成骨细胞后在显微镜下放大40倍的图片；2-4示P5代脐带间充质干细胞诱导分化为成骨细胞后在显微镜下放大100倍的图片；2-5示P2代脐带间充质干细胞诱导分化为成脂细胞后在显微镜下放大40倍的图片；2-6示P2代脐带间充质干细胞诱导分化为成脂细胞后在显微镜下放大100倍的图片；2-7示P5代脐带间充质干细胞诱导分化为成脂细胞后在显微镜下放大40倍的图片；2-8示P5代脐带间充质干细胞诱导分化为成脂细胞后在显微镜下放大100倍的图片。
具体实施方式
本发明公开了一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为胰岛、神经、血管内皮、骨、软骨、肌肉、肝脏、心肌等多种组织细胞。
脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞。
移植物抗宿主病(GVHD)是肝移植术后发生的以发热、皮疹、腹泻以及骨髓抑制等为主要表现的全身性免疫疾病，患者最终因全身感染或骨髓衰竭而死亡。
本发明提供的脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用中所用原料药或辅料均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 脐间充质干细胞的制备方法
在无菌条件下，取离开母体时间不超过2h的新鲜脐带，并筛查产妇是否携带传染性疾病病原体(乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体和艾滋病抗体阴性)，将新鲜脐带置于含有双抗的PBS中于4℃保温箱中运回实验室。
将新鲜脐带用无菌的PBS清洗，再用75％乙醇消毒，然后用PBS清洗干净，前后清洗消毒所用溶液体积均为能将脐带浸泡在其中为宜，去除脐带最外层膜及静、动脉后，将脐带剪碎至1～3cm3大小的块，将其以0.5～1cm的间距均匀接种于培养皿中，缓慢加入50μL～100μL/cm2完全培养基，置于37℃、CO2浓度为5％的培养箱中静止培养。
细胞贴壁融合后，使用胰酶进行消化，离心，分装至多个培养皿中进行传代培养，传至2～5代后，观察细胞生长状态，用胰酶消化后使用PBS缓冲溶液洗涤，离心收集。
对上述制得的2～5代脐带间充质干细胞进行鉴定，包括：
1)显微镜观察
显微镜下观察，可以看出96h后的细胞已经形成较典型的脐带间充质样，并有明显的贴壁现象，如图1所示。
2)流式检测
取第3代脐带间充质干细胞进行流式细胞仪检测，结果显示制得的脐带间充质干细胞表达CD105、CD73、CD90和HLA-ABC(表达量高于90％)，不表达CD34、CD45和HLA-DR等(表达量低于1％)，检测结果如表1所示：
表1 脐带间充质干细胞的流式检测结果
3)诱导分化
取第3代脐带间充质干细胞进行体外诱导分化为成软脂肪细胞和成骨细胞，染色观察，可看出本发明制备的脐带间充质干细胞经过适宜条件可向成脂肪细胞和成骨细胞分化(图2)，证明本发明制备的脐带间充质干细胞具有多向分化能力。
以上鉴定结果参照“国际细胞治疗协会(ISCT)”所定制的标准，可证明本发明所制备的细胞具备间充质干细胞的特性。
实施例2
配制100mL干细胞注射液：将白蛋白浓度为10％的人血白蛋白原液30mL(质量体积比终浓度为3％)、低分子肝素钙0.1mL(体积百分含量为0.1％)、维生素C 0.5g(质量体积比终浓度为0.5％)、珠子参皂苷12.5g(质量体积比终浓度为12.5％)和0.9％氯化钠注射液69.9mL混匀，将收集的P5代脐带间充质干细胞(细胞终浓度1×106个/mL)于混合液中重悬，分装于细胞冻存袋中，制备完毕。
上述制备的脐带间充质干细胞注射液留样进行内毒素检测、细菌真菌检测、支原体检测，检测结果均为阴性为合格。
实施例3
配制100mL干细胞注射液：将白蛋白浓度为20％的人血白蛋白原液5mL(质量体积比终浓度为1％)、低分子肝素钙0.1mL(体积百分含量为0.1％)、维生素C 0.3g(质量体积比终浓度为0.3％)、珠子参皂苷5g(质量体积比终浓度为5％)和0.9％氯化钠注射液94.9mL混匀，将收集的P5代脐带间充质干细胞(细胞终浓度1×106个/mL)于混合液中重悬，分装于 细胞冻存袋中，制备完毕。
上述制备的脐带间充质干细胞注射液留样进行内毒素检测、细菌真菌检测、支原体检测，检测结果均为阴性为合格。
实施例4
配制100mL干细胞注射液：将白蛋白浓度为20％的人血白蛋白原液25mL(质量体积比终浓度为5％)、低分子肝素钙0.1mL(体积百分含量为为0.1％)、维生素C 0.7g(质量体积比终浓度为0.7％)、珠子参皂苷20g(质量体积比终浓度为20％)和勃脉力74.9mL混匀，将收集的P5代脐带间充质干细胞(细胞终浓度1×106个/mL)于混合液中重悬，分装于 细胞冻存袋中，制备完毕。
上述制备的脐带间充质干细胞注射液留样进行内毒素检测、细菌真菌检测、支原体检测，检测结果均为阴性为合格。
试验例 功能鉴定
试验分组：
试验组1：实施例2制备的脐带间充质干细胞注射液；
试验组2：实施例3制备的脐带间充质干细胞注射液；
试验组3：实施例4制备的脐带间充质干细胞注射液；
对照组1：与实施例2基本相同，只是不添加维生素C，其制备方法为：配制100mL干细胞注射液，将白蛋白浓度为10％的人血白蛋白原液30mL(质量体积比终浓度为3％)、低分子肝素钙0.1mL(体积百分含量为1％)、珠子参皂苷25g(质量体积比终浓度为25％)和0.9％氯化钠注射液69.9mL混匀，将收集的P5代脐带间充质干细胞(细胞终浓度1×106个/mL)于混合液中重悬，分装于 细胞冻存袋中，制备完毕。
对照组2：与实施例2基本相同，只是不添加维生素C和珠子参皂苷，其制备方法为：配制100mL干细胞注射液，将白蛋白浓度为10％的人血白蛋白原液30mL(质量体积比终浓度为3％)、低分子肝素钙0.1mL(体积百分含量为1％)和0.9％氯化钠注射液69.9mL混匀，将收集的P5代脐带间充质干细胞(细胞终浓度1×106个/mL)于混合液中重悬，分装于 细胞冻存袋中，制备完毕。
对照组3：只添加维生素C，其制备方法为：配制100mL干细胞注射液，将维生素C 1g(质量体积比终浓度为1％)和0.9％氯化钠注射液100mL混匀，将收集的P5代脐带间充质干细胞(细胞终浓度1×106个/mL)于混合液中重悬，分装于 细胞冻存袋中，制备完毕。
功能鉴定试验方法及结果如下：
1)保存试验
上述各实施例及对比例使用的干细胞均为同一管样本，注入保存液中时活力均为98.26％，将实施例2～4的脐带间充质干细胞注射液、对照组1～3制备的间充质干细胞同样的方法置于4℃冰箱中保存。
从冰箱中取出保存的细胞制剂，混匀后，抽取少量的细胞悬液进行台盼蓝染色计数，同样方法分别测定0.5h、1h、2h、4h、6h、12h的细胞活率，测定其细胞活率，结果如表2、表3所示：
表2 各试验组细胞活率检测结果
保存时间(h) 实施例2 实施例3 实施例4
0.5 97.88％±0.3％ 97.89％±0.4％ 98.16％±0.1％
1 97.51％±0.3％ 97.20％±0.2％ 98.02％±0.2％
2 96.10％±0.2％ 95.34％±0.3％ 97.88％±0.5％
4 94.30％±0.2％ 92.68％±0.3％ 95.17％±0.5％
6 91.00％±0.2％ 90.12％±0.3％ 92.34％±0.5％
12 86.58％±0.2％ 85.51％±0.3％ 87.23％±0.5％
表3 各对照组细胞活率检测结果
保存时间(h) 对照组1 对照组2 对照组3
0.5 96.50％±0.2％ 96.32％±0.1％ 90.21％±0.1％
1 94.98％±0.2％ 92.05％±0.2％ 88.51％±0.2％
2 94.70％±0.3％ 90.31％±0.2％ 80.62％±0.4％
4 93.36％±0.4％ 88.68％±0.3％ 73.52％±0.3％
6 89.32％±0.3％ 80.57％±0.4％ 68.76％±0.1％
12 85.24％±0.2％ 75.34％±0.4％ 51.22％±0.3％
从表2、3可以看出，本发明的脐带间充质干细胞注射液经过长时间保存，其活力依旧较高，并且达到国家要求的一般细胞治疗活率大于等于85％，并且细胞活率经过4℃保存12h后细胞活率高于对比例。
2)流式检测
将实施例2注射液冻存48个月后复苏的细胞进行流式检测，检测结果如下表4：
表4 脐带间充质干细胞保存12h后流式检测结果
标记抗体 阳性比率(％) 标记抗体 阳性比率(％)
CD34 0.1 CD105 98.21
CD90 99.36 HLA-ABC 98.79
CD45 0.54 HLA-DR 0.69
CD73 96.8 / /
从以上流式结果可以看出经过保存12h后的脐带间充质干细胞与新鲜制备的间充质干细胞表型一致，证明本发明制备的脐带间充质干细胞长时间的保存对细胞表型及干性无影响。
3)脐带间充质干细胞注射液对治疗大鼠肝移植术后GVHD的效果实验
购买已经建立原位肝移植模型的大鼠30只，将其平均分为A、B、C三组，A组注射本发明实施例2的脐带间充质干细胞注射液、B组注射实对比例1的脐带间充质干细胞注射液、C组注射生理盐水，A、B两组分别回输4个疗程，1个星期为一个疗程，每个星期连续回输3天，1剂/天，按1×106个/kg量输注。经过连续30天的观察：
A组：全部都存活，其中有3只发生轻微的排斥反应，其它恢复正常。
B组：有5只出现不同程度的术后并发症，其它恢复正常。
C组：10只大鼠中的80％，即8只出现不同程度的术后并发症。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，包括脐带间充质干细胞、人血白蛋白、低分子肝素钙、维生素C、珠子参皂苷和溶媒。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，每100mL脐带间充质干细胞注射液中包括：
脐带间充质干细胞：(0.5～l)×108个；
人血白蛋白：1～5g；
低分子肝素钙：0.1mL；
维生素C：0.3～0.7g；
珠子参皂苷：5～20g；
溶媒：补足。
3.根据权利要求1或2所述的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，每100mL脐带间充质干细胞注射液中包括：
脐带间充质干细胞：1×108个；
人血白蛋白：1～5g；
低分子肝素钙：0.1mL；
维生素C：0.3～0.7g；
珠子参皂苷：5～20g；
溶媒：补足。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，所述溶媒为复方电解质注射液、葡萄糖注射液或生理盐水。
5.根据权利要求4所述的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，所述复方电解质注射液为勃脉力A复方电解质注射液。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，所述脐带间充质干细胞为第2～5代脐带间充质干细胞。
7.如权利要求1至6中任一项所述脐带间充质干细胞注射液在制备治疗移植物抗宿主反应的药物中的应用。
8.如权利要求1至6中任一项所述脐带间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，包括：将人血白蛋白、低分子肝素钙、维生素C、珠子参皂苷和溶媒混匀，过滤除菌，得到混合液；
采用所述混合液重悬脐带间充质干细胞，得到脐带间充质干细胞注射液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述过滤除菌采用除菌级亲水性过滤器过滤除菌，所述除菌级亲水性过滤器的孔径为0.1～1μm。
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