CN105494315A

CN105494315A - 活细胞产品保存液及其制备、使用方法

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Publication number: CN105494315A
Application number: CN201610019127.7A
Authority: CN
Inventors: 葛啸虎; 陈海佳; 王一飞; 应杰; 王小燕
Original assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2016-01-11
Filing date: 2016-01-11
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2036-01-11
Also published as: CN105494315B

Abstract

本发明涉及提供一种活细胞产品保存液及其制备、使用方法。所述活细胞产品保存液包含下述组分：儿茶素、葡萄糖、人血白蛋白、碳酸氢钠和保存基础液，所述保存基础液由0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液组成。向基础保存液中加入儿茶素、葡萄糖、人血白蛋白、碳酸氢钠再经0.22μm滤膜过滤除菌，制得活细胞产品保存液。使用活细胞产品保存液重悬细胞，细胞浓度为0.5×10⁷cells/ml-5×10⁷cells/ml，常温保存0-72h。本发明活细胞产品保存液可以用于活细胞长时间保存，活细胞经本发明保存液保存72h后仍具有高活性和高活率。本发明活细胞产品保存液可以在常温下保存活细胞。

Description

活细胞产品保存液及其制备、使用方法

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种活细胞产品保存液及其制备、使用方法。

背景技术

活细胞产品一般指经体外诱导培养得到或直接从体内采集得到的具有一定治疗、保健等功效的活体细胞。目前最常见的活细胞产品为干细胞和免疫细胞，也包括神经细胞、肝细胞等人体活细胞。

随着对干细胞和免疫细胞功能作用的开发和疾病治疗的研究，特别是免疫细胞对肿瘤疾病的治疗效果的凸显，干细胞或免疫细胞等活细胞的临床应用也日趋广泛。干细胞、免疫细胞等活细胞在回输前的保存至关重要，特别涉及到活细胞的长途运输，如何保证活细胞的活率和稳定性，是细胞治疗效果的关键。

在以往的活细胞运输中涉及到的保存液主要有如下几种方案：

方案1、用生理盐水作为保存液直接在常温或2-8℃低温保存；

方案2、在无菌水中添加一定浓度比例的NaCl、KCl、柠檬酸钠、葡萄糖、CaCl₂、白蛋白、氨基酸和维生素；

方案3、保存液中以生理盐水、磷酸盐缓冲液等为溶液介质，同时添加一定浓度比例的白蛋白、肝素、维生素；

方案4、在保存基础液中添加一定浓度比例的白蛋白、葡萄糖、维生素C，保存基础液为复方电解质注射液与复方氨基酸注射液按1:1-1:2体积比配制而成。

现有保存液有很多不足之处。如方案1单纯以生理盐水作为保存液时，没有维持细胞代谢的营养成分和维持细胞稳定性的成分，故不能长时间保存活细胞，在24h之后细胞活率下降明显。方案2-4都通过添加维生素来维持细胞代谢的稳定性和清除细胞代谢产生的自由基等氧化物质，而维生素在空气或水溶液中容易失去抗氧化性，也不能过长时间保存细胞，且无菌密封保存的活细胞在代谢过程中引起保存液的酸碱度变化也会对细胞造成影响。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种活细胞产品保存液及其制备、使用方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

活细胞产品保存液，包含下述组分：儿茶素、葡萄糖、人血白蛋白、碳酸氢钠和保存基础液，所述保存基础液由0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液组成。

优选地，所述活细胞产品保存液包含下述质量百分浓度的下述组分：儿茶素0.5-5％，葡萄糖1-10％，人血白蛋白1-5％，碳酸氢钠1-10％；余量为保存基础液，所述保存基础液由0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液按照1:1-5:1体积比组成。

优选地，所述活细胞产品保存液包含下述质量百分浓度的下述组分：儿茶素2-5％，葡萄糖5-10％，人血白蛋白3-5％，碳酸氢钠5-10％；余量为保存基础液，所述保存基础液由0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液按照1:1-5:1体积比组成。

优选地，所述活细胞产品保存液包含下述质量百分浓度的下述组分：儿茶素4％，葡萄糖8％，人血白蛋白3％，碳酸氢钠8％；余量为保存基础液，所述保存基础液由0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液按照1:1-5:1体积比组成。

优选地，所述保存基础液由0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液按照1:1-3:1体积比组成。

优选地，所述复方电解质溶液包含氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁。

更优选地，所述复方电解质溶液由下述质量百分浓度的下述组分组成：氯化钠5.26％、葡萄糖酸钠5.02％、醋酸钠3.68％、氯化钾0.37％、氯化镁0.30％，水余量。

优选地，所述儿茶素通过以下方法制备：

S01、浸提：称取一定量茶叶，碾碎过20μm滤网，加入其重量15-25倍70-90℃的热水，搅拌下恒温浸提20-60min，过滤得到茶叶浸提液；

S02、盐析：向上述茶叶浸提液中加入氯化钠，使氯化钠的质量分数为2-6％，静置盐析0.5-1.5h后过滤；

S03、沉淀：向上述滤液中加入茶叶重量2-5％的亚硫酸氢钠，然后加入茶叶重量15-25％的硫酸铝饱和水溶液，加热至70-80℃，用质量百分浓度10-20％的碳酸氢钠溶液在快速搅拌下调节pH至5-6，大量沉淀析出，沉淀自然沉降一段时间后过滤，最后用等体积70℃的热水洗涤沉淀3次；

S04、酸溶：将沉淀在快速搅拌下加入pH2.5-4.5盐酸水溶液中溶解，所述盐酸水溶液的重量为茶叶重量的1-3倍，控制酸转溶液pH为2.5-4.5，酸溶时间10-50min；

S05、萃取：向酸转溶液中加入茶叶重量2-5％的碳酸氢钠，然后用其体积0.3-1.5倍的乙酸乙酯萃取3-5次，每次萃取时间2-10min，合并萃取液；

S06、洗涤：向萃取液体积0.4倍的水中加入茶叶重量1-3％的维生素C，用柠檬酸调节水溶液pH至2.5-3.0，等分成2份对乙酸乙酯萃取液洗涤2次；

S07、浓缩蒸发：将洗涤后的乙酸乙酯相在50-70℃下真空蒸发回收乙酸乙酯，待浓缩成膏状物时，加入膏状物体积2倍的无水乙醇洗涤挂在壁上的物料，继续浓缩成稠的膏状物；

S08、干燥：将膏状物放入真空干燥箱中，在60-90℃下真空干燥至物料成粉末或干的块状。

本发明活细胞产品保存液的制备方法，包括以下步骤：将0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液按体积比1:1-5:1混匀制得保存基础液；向基础保存液中加入儿茶素、葡萄糖、人血白蛋白、碳酸氢钠，使儿茶素的质量百分浓度为0.5-5％，葡萄糖的质量百分浓度为1-10％，人血白蛋白的质量百分浓度为1-5％，碳酸氢钠的质量百分浓度为1-10％，过滤除菌制得本发明活细胞产品保存液。

优选地，本发明活细胞产品保存液的制备方法，包含以下步骤：

S11、0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液按体积比1:1-5:1混匀制得保存基础液；

S12、向保存基础液中加入儿茶素，儿茶素的质量百分浓度为0.5-5％，0.22μm滤膜过滤；

S13、上步骤S12过滤后的溶液中加入葡萄糖、人血白蛋白和碳酸氢钠，使葡萄糖的质量百分浓度为1-10％，人血白蛋白的质量百分浓度为1-5％，碳酸氢钠的质量百分浓度为1-10％，制得保存液。

上述活细胞产品保存液保存细胞的使用方法，包括以下步骤：使用本发明活细胞产品保存液重悬细胞，细胞浓度为0.5×10⁷cells/ml-5×10⁷cells/ml，常温保存0-72h。

优选地，所述常温为15-30℃。

优选地，所述细胞为免疫细胞。

儿茶素又称儿茶精、茶单宁，为黄烷醇的衍生物。儿茶素最初由儿茶中提取出，为无色结晶形固体；能溶于水，和咖啡因同属茶叶中的两大重要机能性成分，但是又以儿茶素为茶汤中最主要的成分。儿茶素是良好的自由基清理成分，是天然的油脂抗氧化剂，抗氧化活性甚至比维他命E还高。儿茶素清理细胞代谢产生的自由基以保护细胞膜，延缓细胞老化或死亡。另外儿茶素类中其他化合物如没食子儿茶素等也都有类似的立体异构体，它们在热水溶液中容易发生差向异构化作用或变旋作用而相互转化。儿茶素类可与糖结合成苷或与有机酸缩合为酯类而存在。所以活细胞在溶液中能长时间保持活性。

人血白蛋白是肝脏分泌的一种蛋白，通常从人体血浆中提取，经一定温度和时间处理灭活病毒后获得，在细胞保存运输中能起到防止细胞结团和维持细胞膜稳定性的作用，也可以维持细胞液渗透压的稳定。碳酸氢钠(NaHCO₃)溶液是一种缓冲液，对保存液的酸碱度具有很好的缓冲作用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明活细胞产品保存液添加了儿茶素、人血白蛋白和碳酸氢钠，减小了细胞代谢过程对pH变化的影响，利于维持细胞膜稳定性，可以用于活细胞长时间保存，活细胞经本发明保存液保存72h后仍具有高活性和高活率。

2、本发明活细胞产品保存液可以在常温下保存活细胞，不需要低温运输环境，是活细胞产品的运输更简便。

3、本发明活细胞产品保存液组分简单，制备简便，可以使用0.9％氯化钠溶液可以使用0.9％氯化钠注射液，复方电解质溶液可以使用复方电解质注射液，便于本发明保存液快速大规模配制。

附图说明

图1为使用对比例1所述的保存液保存48h后NKT细胞的流式检测图。

图2为使用实施例4所述的保存液保存48h后NKT细胞的流式检测图。

具体实施方式

为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法第都是本领域所熟知的，在此不再赘述。

为了便于本发明保存液的配制，本发明中的质量百分浓度0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液均使用注射液。本发明中使用的人血白蛋白、葡糖糖、0.9％氯化钠溶液和复方电解质注射液均购自广州医药生物科技有限公司。其中每升复方电解质溶液含有氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g、氯化镁0.30g。

儿茶素可由茶叶提取，也可使用直接由市场上购买茶多酚成品(儿茶素约占茶多酚中的60-80％)，如：羌胡天远科技开发有限责任公司的的茶多酚98。

实施例1

一种活细胞产品保存液，包含下述质量百分浓度的下述组分：儿茶素0.5％，葡萄糖1％，人血白蛋白1％，碳酸氢钠1％；余量为保存基础液，所述保存基础液由0.9％氯化钠注射液和复方电解质注射液按照1:1体积比组成。

本实施例中使用的儿茶素通过以下方法制备：

S04、酸溶：将沉淀在快速搅拌下加入pH2.5-4.5盐酸水溶液中溶解，所述盐酸水溶液的重量为茶叶重量的1-3倍，控制酸转溶液pH为2.5-4.5，酸溶时间10-50min，少量胶状沉淀经过离心分离除去；

S08、干燥：将膏状物放入真空干燥箱中，在60-90℃下真空干燥至物料成粉末或干的块状。一般干燥时间为4-8h。

本发明活细胞产品保存液的制备方法，包含以下步骤：

S11、0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液按体积比1:1混匀制得保存基础液；

S12、向保存基础液中加入儿茶素，儿茶素的质量百分浓度为0.5％，0.22μm过滤；

S13、上步骤S12过滤后的溶液中加入葡萄糖、人血白蛋白和碳酸氢钠，使葡萄糖的质量百分浓度为1％，人血白蛋白的质量百分浓度为1％，碳酸氢钠的质量百分浓度为1％，制得本发明保存液。

实施例2

活细胞产品保存液，含量包含下述质量百分浓度的下述组分：儿茶素5％，葡萄糖10％，人血白蛋白5％，碳酸氢钠10％；余量为保存基础液，所述保存基础液由0.9％氯化钠注射液和复方电解质注射液按照3:1体积比组成。

本实施例中活细胞产品保存液通过以下方法制备：将0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液按体积比3:1混匀制得保存基础液；向基础保存液中加入儿茶素、葡萄糖、人血白蛋白、碳酸氢钠，使儿茶素的质量百分浓度为5％，葡萄糖的质量百分浓度为10％，人血白蛋白的质量百分浓度为5％，碳酸氢钠的质量百分浓度为10％，再经0.22μm滤膜过滤除菌，制得活细胞产品保存液。

本实施例中活细胞产品保存液的使用方法与实施例1相同。

实施例3

活细胞产品保存液，含量包含下述质量百分浓度的下述组分：儿茶素2％，葡萄糖5％，人血白蛋白3％，碳酸氢钠5％；余量为保存基础液，所述保存基础液由0.9％氯化钠注射液和复方电解质注射液按照2:1体积比组成。

本实施例中活细胞产品保存液的制备、使用方法与实施例1相同。

实施例4

活细胞产品保存液，含量包含下述质量百分浓度的下述组分：儿茶素4％，葡萄糖8％，人血白蛋白3％，碳酸氢钠8％；余量为保存基础液，所述保存基础液由0.9％氯化钠注射液和复方电解质注射液按照2:1体积比组成。其中儿茶素选用太阳绿宝科技有限公司的茶多酚成品(儿茶素含量75％)。

对比例1

本对比例中的保存液选用公开号为103783031A、名称为《一种细胞保存液》的中国专利申请中公开的方案，具体保存液组成如下：该保存液包含如下成分：NaCl128mM、KCl2.5mM、柠檬酸钠6mM、葡萄糖17.5mM、CaCl₂0.9mM、2.5％(w/v)白蛋白、0.5％(w/v)氨基酸和0.025％(w/v)维生素，余量为无菌水。使用该保存液保存活细胞产品的方法和实施例1相同。

效果实施例1

以免疫细胞为例，考察本发明活细胞产品保存液的效果。

按常规方法诱导培养NKT细胞，14天后收集NKT细胞，平均分成5组，分别加入实施例1-4和对比例1中的保存液重悬细胞，密度为1×10⁷cells/ml，在20℃，分别在0h、8h、24h、48h、72h采用台盼蓝染色法进行细胞活率检测，结果如表1所示。

表1、细胞活率结果

保存方案	0h	8h	24h	48h	72h
						实施例1	98.1％	95.5％	94.2％	88.8％	80.2％
实施例2	98.0％	97.2％	96.9％	90.8％	86.5％
						实施例3	97.7％	97.3％	96.5％	92.8％	88.6％
实施例4	97.8％	97.5％	96.9％	93.2％	90.1％
						对比例1	97.8％	90.5％	83.5％	71.2％	58.8％

由表1可知，本发明实施例1-4所述的保存液保存NKT细胞的效果明显优于比对比例1中的保存液。对比例1中的保存液保存NKT细胞时，随保存时间的延长，细胞活率迅速下降，在保存8h后细胞活率仅达90.5％，在保存72h后细胞活率仅为58.8％。本发明实施例1-4所述的保存液保存NKT细胞的活率基本相同，随着保存时间的延长，细胞活率缓慢下降，在保存72h后，细胞活率仍在80％以上，实施例4的保存液的保存效果更优于较实施例1-3，在保存72h后细胞活率还可以高达90.1％。因此，本发明可以用于活细胞的长时间保存。

效果实施例2

根据效果实施例1的结果，使用对比例1和实施例4中的保存液保存NKT细胞，在保存24h、48h后取细胞按照常规方法进行流式检测，检测CD3、CD56表达率，结果如表2和图1-2所示。

表2、流式检测结果

CD3⁺CD56⁺表达率	24h	48h
			对比例1	32.5％	29.6％
实施例4	49.9％	49.3％

由表2和图1-2可知，本发明实施例4中的保存液比对比例1中保存液的保存效果更好。使用对比例1中保存液保存的NKT细胞的CD3⁺CD56⁺表达率迅速下降，在24h时为32.5％，在48h时仅为29.6％。使用实施例4保存液保存的NKT细胞的CD3⁺CD56⁺表达率下降缓慢，在24h时为49.9％，在48h时仍然高达49.3％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.活细胞产品保存液，其特征在于，包含下述组分：儿茶素、葡萄糖、人血白蛋白、碳酸氢钠和保存基础液，所述保存基础液由0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液组成。

2.根据权利要求1所述的活细胞产品保存液，其特征在于，包含下述质量百分浓度的下述组分：儿茶素0.5-5％，葡萄糖1-10％，人血白蛋白1-5％，碳酸氢钠1-10％；余量为保存基础液，所述保存基础液由0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液按照1:1-5:1体积比组成。

3.根据权利要求2所述的活细胞产品保存液，其特征在于，包含下述质量百分浓度的下述组分：儿茶素2-5％，葡萄糖5-10％，人血白蛋白3-5％，碳酸氢钠5-10％；余量为保存基础液，所述保存基础液由0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液按照1:1-5:1体积比组成。

4.根据权利要求3所述的活细胞产品保存液，其特征在于，所述活细胞产品保存液包含下述质量百分浓度的下述组分：儿茶素4％，葡萄糖8％，人血白蛋白3％，碳酸氢钠8％；余量为保存基础液，所述保存基础液由0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液按照1:1-5:1体积比组成。

5.根据权利要求1所述的活细胞产品保存液，其特征在于，所述保存基础液由0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液按照1:1-3:1体积比组成。

6.根据权利要求1所述的活细胞产品保存液，其特征在于，所述复方电解质溶液包含氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁。

7.根据权利要求6所述的活细胞产品保存液，其特征在于，所述复方电解质溶液由下述质量百分浓度的下述组分组成：氯化钠5.26％、葡萄糖酸钠5.02％、醋酸钠3.68％、氯化钾0.37％、氯化镁0.30％，水余量。

8.权利要求1所述的活细胞产品保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将0.9％氯化钠溶液和复方电解质溶液按体积比1:1-5:1混匀制得保存基础液；向基础保存液中加入儿茶素、葡萄糖、人血白蛋白、碳酸氢钠，使儿茶素的质量百分浓度为0.5-5％，葡萄糖的质量百分浓度为1-10％，人血白蛋白的质量百分浓度为1-5％，碳酸氢钠的质量百分浓度为1-10％，再经0.22μm滤膜过滤除菌，制得活细胞产品保存液。

9.根据权利要求8所述的活细胞产品保存液的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

S12、向保存基础液中加入儿茶素，儿茶素的质量百分浓度为0.5-5％，0.22μm过滤；

S13、上步骤S12过滤后的溶液中加入葡萄糖、人血白蛋白和碳酸氢钠，使葡萄糖的质量百分浓度为1-10％，人血白蛋白的质量百分浓度为1-5％，碳酸氢钠的质量百分浓度为1-10％，制得活细胞产品保存液。

10.权利要求1所述的活细胞产品保存液保存细胞的使用方法，包括以下步骤：使用活细胞产品保存液重悬细胞，细胞浓度为0.5×10⁷cells/ml-5×10⁷cells/ml，常温保存0-72h。