CN105597088A - 一种制剂、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制剂,其包括外泌体、白蛋白和医学上可接受的溶剂,所述外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养和提取得到。本申请所述制剂中的外泌体含有多种活性细胞因子,可刺激和促进足部的血管、神经末梢的修复再生,改善足部营养和触感的恢复,从而使得溃烂的皮肤组织再生,因此对糖尿病足具有预防与治疗作用。本申请还提供了所述制剂的制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及再生医学和生物学技术领域,尤其涉及一种制剂、其制备方法及其应用。
背景技术
外泌体(exosomes)是一种由真核细胞的多泡内涵体(multivesicularbodies,MVBs)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的纳米量级的膜性小囊泡,可由多种类型细胞分泌,其内含有不同种类的蛋白质、脂质、mRNAs、microRNAs以及信号分子等具有生物学活性的物质,较易与邻近细胞的细胞膜发生融合,将生物学活性物质选择性地递送至受体细胞,在不同细胞间进行信息传递,调节细胞间的信号传导,发挥多种生物学功能。
糖尿病患者因周围神经病变与外周血管疾病合并过高的机械压力,可引起足部软组织及骨关节系统的破坏与畸形形成,进而引发一系列足部问题,从轻度的神经症状到严重的溃疡、感染、血管疾病、Charcot关节病和神经病变性骨折。对于糖尿病足的治疗,一般采用药物或手术治疗,更甚者采取截肢等手段,治疗效果一般,且对病人产生的创伤较大,糖尿病足的治疗还采用足静脉细胞注射,但在注射过程中细胞会随血液而流失,起效时间长,治疗效果一般。
现有研究已证明脐带干细胞(MSC)分泌的外泌体在减少心肌损伤范围、保护急性肾小管损伤、促进神经再生以及减少肺损伤等方面有重要作用。而对外泌体的生物特性与功能机制的深入研究对认识并解决MSC应用中产生的问题有重要作用。并且,外泌体的应用较之MSC直接应用更为安全,可以开启非细胞治疗的方法。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种制剂,本申请提供的制剂可用于预防和/或治疗糖尿病足。
有鉴于此,本申请提供了一种制剂,包括:外泌体、白蛋白与医学上可接受的溶剂,所述外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养和提取得到。
优选的,所述溶剂为生理盐水。
优选的,所述外泌体为所述制剂的2vol%~5vol%,所述白蛋白为所述制剂的0.5vol%~5vol%,所述生理盐水为余量,所述外泌体的含量为1×106~1×107cells所提取出来的外泌体总量。
优选的,所述外泌体的含量为5×106cells所提取出来的外泌体总量。
优选的,所述外泌体由所述脐带干细胞传代培养至3~5代后提取得到。
本申请还提供了一种制剂的制备方法,包括以下步骤:
在医学上可接受的溶剂中加入白蛋白;
在上述得到的溶液中加入外泌体;所述外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养和提取得到。
优选的,所述溶剂为生理盐水。
本申请还提供了上述方案所述的或上述方案所制备的所述的制备方法所制备的制剂在预防和/或治疗糖尿病足上的应用。
本申请提供了一种制剂,其包括外泌体、白蛋白和生理盐水,所述外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养和提取得到。本申请所述制剂中的外泌体中含有多种活性细胞因子,可刺激和促进足部的血管、神经末梢的修复再生,改善足部营养和触感的恢复,从而使得溃烂的皮肤组织再生,因此对糖尿病足具有预防与治疗作用。
附图说明
图1为本发明脐带干细胞2代培养后不同放大倍数下的形貌照片;
图2为本发明外泌体不同放大倍数下的形貌照片;
图3为本发明脐带干细胞对照组流式检测图;
图4为本发明脐带干细胞样品组流式检测图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述,但是应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点,而不是对本发明权利要求的限制。
本发明实施例公开了一种制剂,其包括:外泌体、白蛋白与医学上可接受的溶剂,所述外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养和提取得到。
本申请所述制剂包括外泌体、白蛋白与医学上可接受的溶剂,本申请所述制剂中由于包含外泌体,因此其可用于预防和/或治疗糖尿病足。
按照本发明,所述外泌体是由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养与提取制备得到。所述脐带干细胞的原代培养按照本领域技术人员熟知的方式进行。所述脐带干细胞经过原代培养后进行传代培养,所述传代培养的方式为本领域技术人员熟知的,本申请不进行特别的限制。作为优选方案,本申请所采用的脐带干细胞均为P2~P5代。所述脐带干细胞经过传代培养后进行提取,得到外泌体。本申请所述外泌体的提取优选按照invitrogen试剂盒说明书提取。脐带干细胞经过传代培养后提取,得到了外泌体。将所述外泌体进行保存以备用。
本申请提供的制剂,包括外泌体、白蛋白与医学上可接受的溶剂。由于本申请提供的制剂用于治疗糖尿病足,所述制剂的溶剂优选为生理盐水。在所述制剂中,所述外泌体为优选为所述制剂体积浓度的2%~5%,更优选为2.5%~4.5%,具体的,所述外泌体的含量为所述制剂体积浓度的2.5%、3%、3.2%、3.5%、4%、4.3%或4.5%。本申请所述外泌体的含量为1×106~1×107脐带干细胞所提取出来的外泌体总量,优选为5×106~1×107脐带干细胞所提取出来的外泌体总量。本领域技术人员熟知的,临床应用外泌体时,不会计算外泌体的具体数量,只对提取外泌体的细胞数目进行控制,这是由于用于提取外泌体的培养基都是基础培养基,其不含血清等营养物质,目的就是为了让细胞不再分裂增殖,使细胞“同步化”;在营养相对缺少的微环境下,干细胞自身会分泌很多的活性因子到胞外,即外泌体。所以,当细胞性质一致时,同种类型、相同数量的细胞分泌的外泌体的数量差异不大。
所述白蛋白为本领域技术人员熟知的人血白蛋白,其为市售产品或按照现有已知的方法提取得到。本申请所述白蛋白优选为所述制剂总体积浓度的0.5%~5%,更优选为1%~4%,具体的所述白蛋白的含量为所述制剂体积浓度的1%、1.2%、1.5%、1.8、2%、2.5%、2.8%、3%、3.2%、3.5%、3.8%或4%。如果人血白蛋白的浓度过大,制剂进入到人体组织中,会产生较大的渗透压,足部会形成局部水肿;如果人血白蛋白的浓度过小,不利于组织的愈合修复。
本申请还提供了所述制剂的制备方法,包括以下步骤:
在医学上可接受的溶剂中加入白蛋白;
在上述得到的溶液中加入外泌体。
在制备所述制剂的过程中,将保存的外泌体取出,在4℃环境中溶解。本申请所述制剂的溶剂优选为生理盐水。
按照本发明,首先在生理盐水中添加人血白蛋白,配制含有人血白蛋白的生理盐水,然后再含有人血白蛋白的生理盐水中添加外泌体,得到制剂。本申请所述制剂的剂型为本领域技术人员熟知的,对此本申请不进行特别的限制。
本申请提供了一种制剂,其包括外泌体、白蛋白与医学可接受的溶剂。本申请采用干细胞外泌体进行组织注射,其可避免血液流动而造成外泌体的损失,外泌体可直接修复损伤组织,增强未损伤组织的抵抗能力,大大缩短组织的修复时间上。同时外泌体制剂不具有免疫原性,可适用于任何个体,在提取后可长时间保存,在应用时制剂制备更为方便,避免了细胞治疗方案需要重新培养细胞等的操作。
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明提供的制剂及其应用进行详细说明,本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
1)脐带干细胞原代培养
取健康足月剖腹产婴儿的脐带,于超净台中进行无菌清洗,剥离脐带羊膜和动静脉,取出沃顿胶,用手术剪进行剪碎,用DMEM+10%FBS完全培养基重悬后接种至15cm平皿中,转移至5%CO2,37℃的环境中培养。
于5天后补液,直至细胞爬出,弃去组织块,补充新的完全培养基继续培养,待细胞形成较大的克隆,即可传代培养。
2)脐带干细胞传代培养
①取可传代的P0代细胞,弃掉皿内原培养液,加入10mLPBS缓冲液轻轻冲洗细胞生长面,弃去洗液。
②加入2mL0.25%胰蛋白酶,左右摇晃平皿使胰酶均匀覆盖于皿底;显微镜下观察可见细胞间隙增大,胞质回缩;当长梭形细胞变圆变亮时,立即加入10倍体积的完全培养基终止消化。
③反复吹打,直至细胞全部脱落成单细胞悬液,将悬液转移至离心管中,室温离心l500rpm/5min。
④弃上清,加入DMEM+10%FBS完全培养基重悬细胞,按密度为1×105cells传代培养。将培养瓶置于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中培养。
⑤待细胞生长至融合时,重复操作⑤进行细胞扩增培养。如无说明,本研究中所用人脐带干细胞均为P2至P5代,如图1所示,图1为脐带干细胞P2代在不同放大倍数下的细胞形态照片,其中图1a为脐带干细胞P2代在40倍放大倍数下的细胞形态照片,图1b为脐带干细胞P2代在100倍放大倍数下的细胞形态照片。图3和图4分别为脐带干细胞对照组与本实施例传代培养的脐带干细胞的流式检测图,由图3和图4可知,本实施例培养的脐带干细胞是合格的。
3)外泌体的分离
收集P2-P5代UC-MSCs培养上清,按照invitrogen试剂盒说明书提取外泌体。
具体步骤为:将培养上清转至高速离心管中,4℃,离心,2000g/30min,去除细胞碎片。取上清,转移至新的高速离心管中,以细胞上清液:试剂=2:1的比例加入试剂,用祸旋器充分混匀后,置于冰箱中4℃过夜孵育。在4℃坏境中10000g离心60min,弃去上清,用100μL4℃的PBS溶液缓冲液重悬即为外泌体悬液,置于-20℃保存。
4)外泌体鉴定
取分离纯化外泌体10μL,按体积比=1:1,加入4℃的PBS溶液稀释后滴加于2mm的载样铜网上,于室温静置1min后用滤纸将多余液体轻轻吸去,用3%(w/v)磷钨酸钠溶液(PH6.8)室温负染5分钟,用双蒸水轻轻洗一遍后室温晾干,于透射电镜观察并照相。随机选取20个外泌体测量其直径。如图2所示,图2为本发明外泌体在不同放大倍数下的形态照片,图2a为外泌体10000倍下的形态照片,图2b为外泌体在20000倍下的形态照片。
实施例2
从-20℃取出外泌体,4℃环境中溶解后,按组成:外泌体+1%人血白蛋白+生理盐水混匀,充分混匀后置于4℃环境中保存备用,外泌体的含量为:1×106~1×107cells所提取出来的外泌体总量,其中优选用量为5×106cells所提取出来的外泌体总量。
配制具体步骤:
①往生理盐水中添加20%的人血白蛋白,使其终体积浓度为1%,配制1%人血白蛋白的生理盐水体积为2~5mL。
②往含有1%人血白蛋白的生理盐水中添加体积为100μL、5×106cells所提取出来的外泌体总量。
实施例3
选取具有糖尿病足的裸鼠80只,随机分成4组,每组20只。分别注射下面四种制剂,分别于1个月和3个月后评价治疗糖尿病足的效果,其中间歇性跛行评分按照下述文章进行评价:王广宇,朱旅云,马利成.《干细胞移植治疗糖尿病足》,中国组织工程研究,2013,17(1):173-180。结果如表1所示。
按照实施例2提供的制备方法配制以下制剂:
A:外泌体(1×106cells)+1%人血白蛋白+生理盐水
B:外泌体(5×106cells)+1%人血白蛋白+生理盐水
C:外泌体(1×107cells)+1%人血白蛋白+生理盐水
D:1%人血白蛋白+生理盐水
表1不同制剂下糖尿病足的治疗效果数据表
表1不同制剂下糖尿病足的治疗效果数据表(续表)
从上述表格可知:组别A、组别B和组别C均起到改善糖尿病足的作用,而组别D的改善作用不明显。其中组别B和组别C对下肢间歇性跛行有较为明显(P<0.05)的提高,评分从2.6左右下降至1.5左右;对皮肤的温度和经皮氧分压改善也具有较为明显(P<0.05)的改善,皮肤温度平均提高了2℃,提示了可明显(P<0.05)的改善了血液循环,缺血性指标得到较明显的改善。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种制剂,包括:外泌体、白蛋白与医学上可接受的溶剂,所述外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养和提取得到。
2.根据权利要求1所述的制剂,其特征在于,所述溶剂为生理盐水。
3.根据权利要求2所述的制剂,其特征在于,所述外泌体为所述制剂的2vol%~5vol%,所述白蛋白为所述制剂的0.5vol%~5vol%,所述生理盐水为余量,所述外泌体的含量为1×106~1×107cells所提取出来的外泌体总量。
4.根据权利要求3所述的制剂,其特征在于,所述外泌体的含量为5×106cells所提取出来的外泌体总量。
5.根据权利要求1所述的制剂,其特征在于,所述外泌体由所述脐带干细胞传代培养至3~5代后提取得到。
6.一种制剂的制备方法,包括以下步骤:
在医学上可接受的溶剂中加入白蛋白;
在上述得到的溶液中加入外泌体;所述外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养和提取得到。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述溶剂为生理盐水。
8.权利要求1~5任一项所述的或权利要求6~7任一项所述的制备方法所制备的制剂在预防和/或治疗糖尿病足上的应用。
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