CN107550935A - 一种治疗关节疾病的生物凝胶剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种治疗关节疾病的生物凝胶剂及其应用，所述生物凝胶剂是利用含有特殊干细胞培养添加剂的生物相容性可降解凝胶包裹脐带间充质干细胞制备得到的，所述的干细胞培养添加剂由脐带间充质干细胞、中药提取物和血清组成。本发明的生物凝胶剂可促进正常机体细胞增殖，降低缺氧、化疗等常见负面刺激对正常机体细胞的影响，延长细胞生长时间，促进细胞因子的分泌，有效治疗关节疾病，显著降低骨骼肌失神经纤维化的纤维化率，降低膝骨关节炎动物模型的病理组织评分，且安全、高效、副作用小，生产简单、成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及一种治疗关节疾病的生物凝胶剂及其应用。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制的多潜能细胞，间充质干细胞是其中被认为最具有医学价值的干细胞种类。这种细胞一方面具备干细胞自我复制分化的能力，另一方面富含各种类型的细胞因子，不仅可以调节局部免疫水平，促进血管等机体组织新生，从而有效治疗各种组织损伤和自身免疫疾病。而脐带间充质干细胞被认为是其中功能最强的细胞类型，这种细胞不仅来源简便、组织相容性更好并且增殖能力更强。
目前已有大量研究表明，脐带间充质干细胞的提取物对组织再生具有良好的促进作用。有研究指出，这种细胞的提取物富含各种促进组织和血管新生的细胞因子，例如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、干细胞生长因子等。而文献和我们的动物实验也指出，当这种因子被注射到破损皮肤表面后，大大促进了皮肤的再生，而进一步研究也发现，这种提取液对多种器官及组织损伤例如骨折、关节劳损、冠心病、肝硬化及神经系统损伤具有良好的修复效果。
但是，目前对于干细胞治疗仍存在诸多问题，其中最主要的问题就在于体外培养的干细胞无法稳定在患者体内长期生存。一般脐带间充质干细胞在移植受体内生存时间仅72小时，超过这个时间就几乎没有作用。这对于病程长达数年的关节疾病作用有限。并且，短时间内大量细胞的死亡不仅起不到修复作用，反而会导致局部炎性反应。反复注射干细胞固然能够解决这个问题，但这会导致治疗成本的急剧增加，同时会加重感染风险。因此，对于干细胞治疗来说，干细胞的持续生存是治疗成功与否的关键。
然而，目前未见能用于治疗关节疾病，且疗效、力学强度、安全性等各方面性能均十分优异的生物凝胶剂。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种治疗关节疾病的生物凝胶剂。
本发明的第二个目的是，提供如上所述生物凝胶剂的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种治疗关节疾病的生物凝胶剂，所述生物凝胶剂的制备方法如下：
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将分离的脐带间充质干细胞使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含4％-6％FBS和体积浓度8％-12％干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含体积浓度8％-12％干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即进行液氮保存或后续使用；
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一制备的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为(1-5)*104个/ml；所述的凝固剂选自葡聚糖和壳聚糖配方、透明质酸和甲基纤维素配方以及改性聚乙二醇配方中的一种或几种；
所述的葡聚糖和壳聚糖配方包括：
凝固剂A：制备方法如下：明胶用磷酸盐缓冲液溶解，终浓度4％-6％，加入12-18ml乙二胺，调整pH至4.5-6.5，加入2-2.5g EDC，室温反应过夜，用PBS透析后冻干并液氮保存；
凝固剂B：主要成分为氧化葡聚糖和酸化壳聚糖，氧化葡聚糖制备方法如下：将葡萄糖制备成8％-12％水溶液，加入6-6.5g过氧碘酸钠，避光反应3.5-4.5小时后加入1.5-2.5ml乙二醇，用水透析66-78小时后冻干并液氮保存；酸化壳聚糖制备方法如下：将壳聚糖用1.8％-2.2％丙烯酸溶解，55-65摄氏度反应42-54小时后用丙酮沉淀提纯，产物用水溶解后加入0.4％-0.6％京尼平，避光反应20-28小时后超滤，冻干并液氮保存；上述两种成分按(18-22):1的比例混合即为凝固剂B；
所述的透明质酸和甲基纤维素配方包括：
凝固剂A：由II型胶原蛋白、透明质酸和矿物油组成，三者重量比为：(3-3.5):(6-7):1；
凝固剂B：制备方法如下：将甲基纤维素用pH＝11-13的氢氧化钠溶液溶解，调整浓度至3.5％-4.5％，55-65摄氏度反应3.5-4.5小时；
所述改性聚乙二醇配方包括：
凝固剂A：为含有细胞维持剂的三乙醇胺溶液，细胞维持剂包括10μg/LTernessin-C和细胞因子，所述的细胞因子包括10μg/L血管内皮生长因子、20μg/L成纤维细胞生长因子、5μg/L表皮生长因子和5μg/L干细胞生长因子，还包括三乙醇胺磷酸盐缓冲液，三乙醇胺浓度为0.49％，pH7.0；
凝固剂B：4臂-聚乙二醇-乙烯砜；
所述步骤一中干细胞培养添加剂由干细胞提取物、中药提取物和血清组成，三者体积比为1:15～30:2～4；所述干细胞提取物的制备方法为：将华通氏块碎块用含胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，再换用无血清DMEM培养基传代培养，2天传代一次，收集传代3-5代的细胞进行后续处理；用含EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗，再用无血清DMEM培养基重悬，超声波裂解破碎细胞，破碎产物离心后取上清；将上清用孔径为5000埃的滤器过滤；所述中药提取物制备方法如下：取原料药，木槿花5-10份、甘草1-5份、芦根10-20份、菊花5-10份，用75％-85％乙醇浸泡浸泡50-70分钟，并用组织破碎器磨碎，用超声波破碎，功率500-700W，时间20-40分钟，10000-15000rpm离心10-20min，取上清，然后用乙醇定容，用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取4-6次，将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干，残留物用无水乙醇溶解；所述血清选自去蛋白胎牛血清、健康人血清和患者自体血清中的一种或几种。
作为本发明的一个优选实施方案，所述的超声波裂解破碎细胞，其具体参数是100-150W，10-20S，15-25次，10-20S间隔。
作为本发明的一个优选实施方案，所述的用孔径为5000埃的滤器过滤，具体是使用超滤管超滤提纯和浓缩，时间为25-40min，压力为0.25-0.35MPa。
作为本发明的一个优选实施方案，当所述的凝固剂为葡聚糖和壳聚糖配方时，步骤二具体为：将4.5-6ml细胞悬液中加入凝固剂A约180-220mg，充分溶解后加入凝固剂B约270-330mg，充分混匀。
作为本发明的一个优选实施方案，当所述的凝固剂为透明质酸和甲基纤维素配方时，步骤二具体为：将4.5-6ml细胞悬液中加入凝固剂A约180-220mg，充分溶解后加入凝固剂B约1.10-1.15ml，充分混匀。
作为本发明的一个优选实施方案，当所述的凝固剂为改性聚乙二醇配方时，步骤二具体为：取1.2-1.6ml凝固剂A与0.12-0.16g凝固剂B进行混合，混合充分后加入4.5-6ml细胞悬液，混匀。
作为本发明的一个优选实施方案，获取患者外周血10ml，离心获取血清后放入生物安全柜，用20um滤器过滤除菌后，作为干细胞添加剂的一部分混入干细胞培养体系，然后再加入凝固剂，充分混匀后吸入无菌针管并移出培养室，然后注入患处。
作为本发明的一个优选实施方案，细胞中加入DMSO冻存，然后配制含添加剂的培养基，将培养基、凝固剂灭菌后封入安倍瓶，至于-80摄氏度保存。使用时携带恒温金属浴和微型离心机至患者处，用恒温金属浴加热解冻后离心，取出细胞上清后用无菌针管依次加入培养基和凝固剂，充分混匀注入患处。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述的生物凝胶剂在制备治疗关节疾病的药物中的应用。
作为本发明的一个优选实施方案，所述关节疾病具体为骨关节炎或关节损伤。
本发明的生物凝胶剂治疗关节疾病的方法为：将制备好的生物凝胶剂注射到患处，形成可支持细胞生长的凝胶，通过凝胶自带和细胞生长时分泌的细胞因子，对关节炎、关节损伤等进行治疗持续的治疗。本发明生物凝胶注射后，可形成支持细胞短期生长的凝胶，通过凝胶自带和细胞生长时分泌的细胞因子，关节疾病进行治疗。
本发明优点在于：
1、本发明提供了一种治疗关节疾病的新方法，制备了一种新型生物凝胶剂，该生物凝胶剂具备一定强度，携带各种水溶性成分，可以给干细胞提供一个稳定的生存环境。
2、本发明的生物凝胶剂兼具组织相容性和可降解性，不仅不会造成组织的局部排异反应，而且可在干细胞周期到达界限后逐步降解并被人体吸收，从而无需通过二次治疗来取出。
3、细胞实验证实，本发明的生物凝胶剂可以有效促进正常机体细胞增殖，并降低缺氧、化疗等常见负面刺激对正常机体细胞的影响，有效延长干细胞的生长时间。
4、动物实验证实，本发明的生物凝胶剂可以有效治疗关节疾病，显著降低骨骼肌失神经纤维化的纤维化率，降低膝骨关节炎动物模型的病理组织评分，对骨关节炎动物模型具有显著的改善作用。
5、本发明对中药原料及提取方法进行筛选，获得了可有效抑制成纤维细胞等细胞聚集，且有效维持其他细胞生长，促进脐带间充质干细胞分泌细胞因子的提取物。
6、本发明制备了特殊成分的干细胞培养添加剂，为脐带间充质干细胞在体表皮肤破损部位的生存提供了有利条件，从而持续释放细胞因子，以此大幅延长干细胞治疗的有效时间和治疗效果。
7、本发明所有原料均简便易得，可在制成半成品后分装保存，因此可实现规模化生产，大幅降低治疗成本；全套制备流程仅耗时7日即可完成制备工艺，使用前仅需15分钟的简单操作就可完成治疗；其生产成本和周期均远远低于国外同类产品，从而能促进干细胞治疗的临床应用。
8、本发明对细胞培养基的组分进行优化，使细胞处于休眠状态，降低代谢率，同时维持细胞稳定存活生长，大幅延长细胞存活时间，提高治疗效果。
附图说明
附图1为本发明实施例7生物凝胶剂形态图，A：1天，B：4天，C：7天，D：14天。活细胞用染料标记为绿色。
附图2为用本发明凝胶包裹骨髓间充质干细胞治疗小鼠骨关节损伤实验。A：HE染色，上侧：对照组，下侧：治疗一组；B及C：上述实验的WesternBlot实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1中药提取物的制备(一)
1.准确称取已充分干燥的原料，包括木槿花8份、甘草3份、芦根15份、菊花7份，用80％乙醇浸泡60分钟，并用组织破碎器磨碎。
2.用超声波破碎，功率600W，时间30分钟，12000rpm离心15min，取上清，然后用乙醇定容。
3.用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取5次。
4.将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干，残留物用无水乙醇溶解。
5.取1ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。
实施例2中药提取物的制备(二)
1.准确称取已充分干燥的原料，包括木槿花10份、甘草5份、芦根10份、菊花5份，用80％乙醇浸泡50分钟，并用组织破碎器磨碎。
2.用超声波破碎，功率500W，时间40分钟，15000rpm离心10min，取上清，然后用乙醇定容。
3.用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取5次。
4.将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干，残留物用无水乙醇溶解。
5.取1ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。
实施例3中药提取物的制备(三)
1.准确称取已充分干燥的原料，包括木槿花5份、甘草2份、芦根20份、菊花10份，用80％乙醇浸泡70分钟，并用组织破碎器磨碎。
2.用超声波破碎，功率600W，时间50分钟，10000rpm离心20min，取上清，然后用乙醇定容。
3.用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取4次；
4.将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干，残留物用无水乙醇溶解。
5.取1ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。
实施例4本发明的干细胞培养添加剂(一)
一种干细胞培养添加剂，包括干细胞提取物、中药提取物和血清，所述干细胞提取物、中药提取物和血清组成，三者体积比为1:22:3。
所述干细胞提取物的制备方法如下：
1.将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代3代的一瓶细胞进行后续处理；
2.用含0.05M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；
3.将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(120W，15S*20次，15S间隔)，将破碎产物用12000rpm离心15分钟，取上清；
4.将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为35min，压力为0.3Mpa；
5.用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；
6.将产物置于-80摄氏度长期保存；
7.所述的中药提取物的制备方法如实施例1所述；
8.所述的血清选自去蛋白胎牛血清(购于Gibco)。
实施例5本发明的干细胞培养添加剂(二)
一种干细胞培养添加剂，包括干细胞提取物、中药提取物和血清，所述干细胞提取物、中药提取物和血清组成，三者体积比为1:15:4。
所述干细胞提取物的制备方法如下：
1.将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.2％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代4代的一瓶细胞进行后续处理；
2.用含0.07M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；
3.将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(110W，10S*25次，15S间隔)，将破碎产物用10000rpm离心20分钟，取上清；
4.将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为30min，压力为0.4Mpa；
5.用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；
6.将产物置于-80摄氏度长期保存；
7.所述的中药提取物的制备方法如实施例2所述；
8.所述的血清为健康人血清。
实施例6本发明的干细胞培养添加剂(三)
一种干细胞培养添加剂，包括干细胞提取物、中药提取物和血清，所述干细胞提取物、中药提取物和血清组成，三者体积比为1:30:2。
所述干细胞提取物的制备方法如下：
1.将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代4代的一瓶细胞进行后续处理；
2.用含0.03M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；
3.将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(140W，20S*10次，10S间隔)，将破碎产物用15000rpm离心10分钟，取上清；
4.将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为20min，压力为0.5Mpa；
5.用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；
6.将产物置于-80摄氏度长期保存；
7.所述的中药提取物的制备方法如实施例2所述；
8.所述的血清选自去蛋白胎牛血清(购于Gibco)、健康人血清和患者自体血清，三者体积比为1:1:1。
实施例7本发明的生物凝胶剂(一)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为3*104个/ml。所述的凝固剂选自葡聚糖和壳聚糖配方：
凝固剂A：主要成分为胺化明胶，起环境稳定和促凝结作用，制备方法如下：明胶用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，终浓度5％，加入16ml乙二胺，调整pH至5.5，加入2.3g EDC(1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，室温反应过夜，用PBS透析48小时后冻干并液氮保存。
凝固剂B：主要成分为氧化葡聚糖和酸化壳聚糖，起支架作用。氧化葡聚糖制备方法如下：将葡萄糖制备成10％水溶液，加入6.34g过氧碘酸钠，避光反应4小时后加入2ml乙二醇，用水透析72小时后冻干并液氮保存。酸化壳聚糖制备方法如下：将壳聚糖用2％丙烯酸溶解，60摄氏度反应48小时后用丙酮沉淀提纯，产物用水溶解后加入0.5％京尼平，避光反应24小时后超滤，冻干并液氮保存。上述两种成分按20:1的比例混合即为凝固剂B。
使用方法：将5ml细胞悬液中加入凝固剂A约200mg，充分溶解后加入凝固剂B约300mg，反应液将在充分混匀后的10分钟左右凝结。
实施例8本发明的生物凝胶剂(二)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例5所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例5所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为4*104个/ml。所述的凝固剂选自透明质酸和甲基纤维素配方：
凝固剂A：主要成分为II型胶原蛋白、透明质酸和矿物油，用来保持细胞活性。具体由50mg II型胶原蛋白、100mg透明质酸和15mg环氧乙烷组成。
凝固剂B：主要成分为羟甲基纤维素，制备方法如下：将甲基纤维素用pH＝12的氢氧化钠溶液溶解，调整浓度至4％，60摄氏度反应4小时。
使用方法：将5ml细胞悬液中加入凝固剂A200mg，充分溶解后加入凝固剂B1.14ml，反应液将在充分混匀后的30分钟左右凝结。
实施例9本发明的生物凝胶剂(三)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例6所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例6所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为5*104个/ml。所述的凝固剂选自改性聚乙二醇配方：
凝固剂A：主要成分为含有细胞维持剂的三乙醇胺溶液，细胞维持剂包括Ternessin-C(10μg/L)和各种细胞因子，包括血管内皮生长因子(10μg/L)、成纤维细胞生长因子(20μg/L)、表皮生长因子(5μg/L)和干细胞生长因子(5μg/L)。此外包括三乙醇胺磷酸盐缓冲液(含三乙醇胺0.49％，pH7.0)。
凝固剂B：4臂-聚乙二醇-乙烯砜(4-Arms-PEG-VS)。
使用方法：取1.4ml凝固剂A与0.14g凝固剂B进行混合，混合充分后加入5ml细胞悬液，混匀后约10分钟左右凝结。
实施例10本发明的生物凝胶剂(四)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为2*104个/ml。所述的凝固剂选自葡聚糖和壳聚糖配方：
凝固剂A：制备方法如下：明胶用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，终浓度4％，加入18ml乙二胺，调整pH至4.5，加入2.5g EDC(1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，室温反应过夜，用PBS透析48小时后冻干并液氮保存。
凝固剂B：主要成分为氧化葡聚糖和酸化壳聚糖，氧化葡聚糖制备方法如下：将葡萄糖制备成8％水溶液，加入6.5g过氧碘酸钠，避光反应3.5小时后加入2.5ml乙二醇，用水透析66小时后冻干并液氮保存；酸化壳聚糖制备方法如下：将壳聚糖用2.2％丙烯酸溶解，55摄氏度反应54小时后用丙酮沉淀提纯，产物用水溶解后加入0.4％京尼平，避光反应28小时后超滤，冻干并液氮保存；上述两种成分按18:1的比例混合即为凝固剂B。
使用方法：将6ml细胞悬液中加入凝固剂A约180mg，充分溶解后加入凝固剂B约330mg，充分混匀。
实施例11本发明的生物凝胶剂(五)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例5所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例5所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为4*104个/ml。所述的凝固剂选自葡聚糖和壳聚糖配方：
凝固剂A：制备方法如下：明胶用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，终浓度6％，加入12ml乙二胺，调整pH至6.5，加入2g EDC(1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，室温反应过夜，用PBS透析48小时后冻干并液氮保存。
凝固剂B：主要成分为氧化葡聚糖和酸化壳聚糖，氧化葡聚糖制备方法如下：将葡萄糖制备成12％水溶液，加入6g过氧碘酸钠，避光反应4.5小时后加入1.5ml乙二醇，用水透析78小时后冻干并液氮保存；酸化壳聚糖制备方法如下：将壳聚糖用1.8％丙烯酸溶解，65摄氏度反应42小时后用丙酮沉淀提纯，产物用水溶解后加入0.6％京尼平，避光反应20小时后超滤，冻干并液氮保存；上述两种成分按22:1的比例混合即为凝固剂B。
使用方法：将4.5ml细胞悬液中加入凝固剂A约220mg，充分溶解后加入凝固剂B约270mg，充分混匀。
实施例12本发明的生物凝胶剂(六)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为3*104个/ml。所述的凝固剂选自透明质酸和甲基纤维素配方：
凝固剂A：由II型胶原蛋白、透明质酸和矿物油组成，三者重量比为：3:7:1。
凝固剂B：制备方法如下：将甲基纤维素用pH＝11的氢氧化钠溶液溶解，调整浓度至4.5％，55摄氏度反应4.5小时。
使用方法：取1.2ml凝固剂A与0.16g凝固剂B进行混合，混合充分后加入4.5ml细胞悬液，混匀。
实施例13本发明的生物凝胶剂(七)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例6所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例6所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为4*104个/ml。所述的凝固剂选自透明质酸和甲基纤维素配方：
凝固剂A：由II型胶原蛋白、透明质酸和矿物油组成，三者重量比为：3.5:6:1。
凝固剂B：制备方法如下：将甲基纤维素用pH＝13的氢氧化钠溶液溶解，调整浓度至3.5％，65摄氏度反应3.5小时。
使用方法：取1.6ml凝固剂A与0.12g凝固剂B进行混合，混合充分后加入6ml细胞悬液，混匀。
实施例14本发明的生物凝胶剂(八)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为3*104个/ml。所述的凝固剂选自改性聚乙二醇配方：
凝固剂A：为含有细胞维持剂的三乙醇胺溶液，细胞维持剂包括10μg/LTernessin-C和细胞因子，所述的细胞因子包括10μg/L血管内皮生长因子、20μg/L成纤维细胞生长因子、5μg/L表皮生长因子和5μg/L干细胞生长因子，还包括三乙醇胺磷酸盐缓冲液，三乙醇胺浓度为0.49％，pH7.0。
凝固剂B：4臂-聚乙二醇-乙烯砜。
使用方法：取1.2ml凝固剂A与0.16g凝固剂B进行混合，混合充分后加入4.5ml细胞悬液，混匀。
实施例15本发明的生物凝胶剂(九)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例5所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例5所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为2*104个/ml。所述的凝固剂选自改性聚乙二醇配方：
凝固剂A：为含有细胞维持剂的三乙醇胺溶液，细胞维持剂包括10μg/LTernessin-C和细胞因子，所述的细胞因子包括10μg/L血管内皮生长因子、20μg/L成纤维细胞生长因子、5μg/L表皮生长因子和5μg/L干细胞生长因子，还包括三乙醇胺磷酸盐缓冲液，三乙醇胺浓度为0.49％，pH7.0。
凝固剂B：4臂-聚乙二醇-乙烯砜。
使用方法：取1.6ml凝固剂A与0.12g凝固剂B进行混合，混合充分后加入6ml细胞悬液，混匀。
实施例16本发明生物凝胶剂促进细胞增殖、提高细胞耐力和延长细胞生长期的细胞实验
1、实验方法
(1)复苏培养小鼠皮肤成纤维细胞MC3T3-L1细胞、表皮干细胞和血管内皮细胞，并用含5％FBS的RPMI1640培养基进行传代培养。
(2)用胰蛋白酶消化制备成单细胞悬液。
(3)在实施例7、8或9的生物凝胶剂的制备过程中，分别加入上述单细胞悬液，制成与脐带间充质干细胞共培养的生物凝胶，上述单细胞悬液和脐带间充质干细胞悬液的添加量相同，细胞数目相同。
(4)将制备的生物凝胶注入6孔板进行培养。
(5)在第1、4、7、14天观察细胞状态。
2、实验结果
当与脐带间充质干细胞凝胶共培养4天后，在实施例7的生物凝胶培养体系中，皮肤成纤维细胞的增殖能力相比于对照(即常规的RPMI1640培养体系)下降1.5倍，而血管内皮细胞和表皮干细胞增殖能力分别提升71％和65％；在实施例8的生物凝胶培养体系中，皮肤成纤维细胞的增殖能力相比于对照下降1.6倍，而血管内皮细胞和表皮干细胞增殖能力分别提升62％和70％；在实施例9的生物凝胶培养体系中，皮肤成纤维细胞的增殖能力相比于对照下降1.4倍，而血管内皮细胞和表皮干细胞增殖能力分别提升71％和62％。
对共培养体系下进行化疗刺激，在实施例7的生物凝胶培养体系中，血管内皮细胞和表皮干细胞的耐受能力分别提升62％；在实施例8的生物凝胶培养体系中，血管内皮细胞和表皮干细胞的耐受能力分别提升58％；在实施例9的生物凝胶培养体系中，血管内皮细胞和表皮干细胞的耐受能力分别提升54％。
在缺氧培养体系中，在实施例7的生物凝胶培养体系中，血管内皮细胞和表皮干细胞的耐受能力分别提升42％和45％；在实施例8的生物凝胶培养体系中，血管内皮细胞和表皮干细胞的耐受能力分别提升37％和39％；在实施例9的生物凝胶培养体系中，血管内皮细胞和表皮干细胞的耐受能力分别提升35％和38％。
观察各处理的细胞生长时间，在模仿人体的恒温培养环境下，对于实施例7的生物凝胶培养体系，各类细胞的培养时间均可以达到13天，对于实施例8和9的生物凝胶培养体系，各类细胞的培养时间均可以达到15天，而在无凝胶情况下(即使用常规的RPMI1640培养体系)，其培养时间约为3天。
实施例17本发明生物凝胶剂的动物实验(膝骨关节炎动物模型)
1、实验方法
(1)取5-6周龄健康雄性C57小鼠50只，分笼饲养1周。
(2)将4％木瓜蛋白酶与0.03mol/L的L-半胱氨酸，按2：1的比例混匀，静置30min后对小鼠进行膝关节腔注射。
(3)在第一次注射后的第7天，将小鼠麻醉，按同等剂量再次注射作为加强剂。
(4)在第一次注射后的第28天，将剩余小鼠随机分为4组，治疗一组注射实施例7制备的生物凝胶，治疗二组注射实施例8制备的生物凝胶，治疗三组注射实施例9制备的生物凝胶，对照组注射安慰剂生理盐水
(5)在第一次注射后的第42天，处死小鼠，打开膝关节，取出踝关节软骨，进行HE染色和Western Blot实验，并进行观察，观察指标包括一般情况、局部炎症红肿及行为学改变，取指定区域的关节软骨行组织病理学检测。病理组织评分及形态学观察评分：0分，关节软骨表面光滑平整，软骨细胞分布均匀，未见细胞成簇及分布密度改变；1分：关节软骨表面稍粗糙，局部软骨面损伤，关节组织增生，局部纤维化，细胞核有少量聚集；2分，关节软骨表面中度粗糙，关节软骨表面均被破坏，为纤维结缔组织替代，细胞核有中度聚集；3分：关节软骨表面组织增生，呈绒毛状伸入关节腔内，绒毛内有炎细胞浸润，胶原纤维少量断裂；4分，关节软骨表面组织严重增生，呈粗指状突向关节腔内，滑膜下组织充血、水肿、炎细胞浸润，大量细胞核聚集，胶原纤维大量变形、断裂。
2、结果
实验结果显示，经过治疗后，治疗一组(n＝10)骨骼肌失神经纤维化的纤维化率相比于对照组(n＝10)降低38％，治疗二组(n＝10)骨骼肌失神经纤维化的纤维化率相比于对照组(n＝10)降低42％，治疗三组(n＝5)骨骼肌失神经纤维化的纤维化率相比于对照组(n＝10)降低39％。
表1不同生物凝胶对鼠骨关节炎模型病例组织学评分的影响
| 组别 | N | 剂量(mg/kg) | 病理组织评分 |
| 对照组 | 10 | - | 2.8±0.9 |
| 治疗一组 | 10 | 15 | 1.2±0.7* |
| 治疗二组 | 10 | 15 | 1.3±0.6* |
| 治疗三组 | 10 | 15 | 1.3±0.4* |
与对照组比较：*P<0.01
从表中的结果可以看出，本发明的生物凝胶可显著降低膝骨关节炎动物模型的病理组织评分，且具有显著性差异(P<0.05)，说明本发明的生物凝胶对骨关节炎动物模型具有显著的改善作用。
实施例18对比试验
本案发明人在前期探索过程中。还进行了如下对比试验。
试验组1：制备生物凝胶剂，方法同实施例7，不同之处在于，步骤一的具体方法为：将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第7代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
试验组2：制备生物凝胶剂，方法同实施例8，不同之处在于，步骤一的具体方法为：将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和14％实施例5所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含14％实施例5所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
试验组3：制备生物凝胶剂，方法同实施例7，不同之处在于，干细胞培养添加剂中的中药提取物的制备方法为：(1)准确称取已充分干燥的物料，包括木槿花8份、甘草3份、芦根15份、菊花7份，用90％乙醇浸泡60分钟，并用组织破碎器磨碎；(2)用超声波破碎，功率600W，时间30分钟，12000rpm离心15min，取上清，然后用乙醇定容；(3)用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取5次；(4)将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干(-30mmHg，45摄氏度)，残留物用无水乙醇溶解；(5)取1ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。
膝骨关节炎动物实验显示，经过治疗后，试验组1(n＝10)骨骼肌失神经纤维化的纤维化率相比于对照组(n＝10)降低12％，试验组2(n＝10)骨骼肌失神经纤维化的纤维化率相比于对照组(n＝10)降低15％，试验组3(n＝10)骨骼肌失神经纤维化的纤维化率相比于对照组(n＝10)降低14％。
表2不同生物凝胶对鼠骨关节炎模型病例组织学评分的影响
| 组别 | N | 剂量(mg/kg) | 病理组织评分 |
| 对照组 | 10 | - | 2.8±0.9 |
| 试验组1 | 10 | 15 | 1.8±0.5 |
| 试验组2 | 10 | 15 | 2.0±0.7 |
| 试验组3 | 10 | 15 | 1.9±0.6 |
从上述结果可以看出，试验组1-3生物凝胶剂对于骨关节炎的治疗效果要显著弱于实施例7-9，表明脐带间充质干细胞的培养过程、干细胞培养添加剂的浓度和中药提取物的提取过程都对生物凝胶剂的成分产生了影响，进一步影响了脐带间充质干细胞的生长状态，尤其是活性细胞因子的释放，对骨关节炎的疗效产生了显著的影响。
从表中的结果可以看出，本发明的生物凝胶可显著降低膝骨关节炎动物模型的病理组织评分，且具有显著性差异(P<0.01)，说明本发明的生物凝胶对骨关节炎动物模型具有显著的改善作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种治疗关节疾病的生物凝胶剂，其特征在于，所述生物凝胶剂的制备方法如下：
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将分离的脐带间充质干细胞使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含4％-6％FBS和体积浓度8％-12％干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含体积浓度8％-12％干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即进行液氮保存或后续使用；
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一制备的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为(1-5)*104个/ml；所述的凝固剂选自葡聚糖和壳聚糖配方、透明质酸和甲基纤维素配方以及改性聚乙二醇配方中的一种或几种；
所述的葡聚糖和壳聚糖配方包括：
凝固剂A：制备方法如下：明胶用磷酸盐缓冲液溶解，终浓度4％-6％，加入12-18ml乙二胺，调整pH至4.5-6.5，加入2-2.5g EDC，室温反应过夜，用PBS透析后冻干并液氮保存；
凝固剂B：主要成分为氧化葡聚糖和酸化壳聚糖，氧化葡聚糖制备方法如下：将葡萄糖制备成8％-12％水溶液，加入6-6.5g过氧碘酸钠，避光反应3.5-4.5小时后加入1.5-2.5ml乙二醇，用水透析66-78小时后冻干并液氮保存；酸化壳聚糖制备方法如下：将壳聚糖用1.8％-2.2％丙烯酸溶解，55-65摄氏度反应42-54小时后用丙酮沉淀提纯，产物用水溶解后加入0.4％-0.6％京尼平，避光反应20-28小时后超滤，冻干并液氮保存；上述两种成分按(18-22):1的比例混合即为凝固剂B；
所述的透明质酸和甲基纤维素配方包括：
凝固剂A：由II型胶原蛋白、透明质酸和矿物油组成，三者重量比为：(3-3.5):(6-7):1；
凝固剂B：制备方法如下：将甲基纤维素用pH＝11-13的氢氧化钠溶液溶解，调整浓度至3.5％-4.5％，55-65摄氏度反应3.5-4.5小时；
所述改性聚乙二醇配方包括：
凝固剂A：为含有细胞维持剂的三乙醇胺溶液，细胞维持剂包括10μg/L Ternessin-C和细胞因子，所述的细胞因子包括10μg/L血管内皮生长因子、20μg/L成纤维细胞生长因子、5μg/L表皮生长因子和5μg/L干细胞生长因子，还包括三乙醇胺磷酸盐缓冲液，三乙醇胺浓度为0.49％，pH7.0；
凝固剂B：4臂-聚乙二醇-乙烯砜；
所述步骤一中干细胞培养添加剂由干细胞提取物、中药提取物和血清组成，三者体积比为1:15～30:2～4；所述干细胞提取物的制备方法为：将华通氏块碎块用含胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，再换用无血清DMEM培养基传代培养，2天传代一次，收集传代3-5代的细胞进行后续处理；用含EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗，再用无血清DMEM培养基重悬，超声波裂解破碎细胞，破碎产物离心后取上清；将上清用孔径为5000埃的滤器过滤；所述中药提取物制备方法如下：取原料药，木槿花5-10份、甘草1-5份、芦根10-20份、菊花5-10份，用75％-85％乙醇浸泡浸泡50-70分钟，并用组织破碎器磨碎，用超声波破碎，功率500-700W，时间20-40分钟，10000-15000rpm离心10-20min，取上清，然后用乙醇定容，用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取4-6次，将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干，残留物用无水乙醇溶解；所述血清选自去蛋白胎牛血清、健康人血清和患者自体血清中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述治疗关节疾病的生物凝胶剂，其特征在于，所述的超声波裂解破碎细胞，其具体参数是100-150W，10-20S，15-25次，10-20S间隔。
3.根据权利要求1所述治疗关节疾病的生物凝胶剂，其特征在于，所述的用孔径为5000埃的滤器过滤，具体是使用超滤管超滤提纯和浓缩，时间为25-40min，压力为0.25-0.35MPa。
4.根据权利要求1所述治疗关节疾病的生物凝胶剂，其特征在于，当所述的凝固剂为葡聚糖和壳聚糖配方时，步骤二具体为：将4.5-6ml细胞悬液中加入凝固剂A约180-220mg，充分溶解后加入凝固剂B约270-330mg，充分混匀。
5.根据权利要求1所述治疗关节疾病的生物凝胶剂，其特征在于，当所述的凝固剂为透明质酸和甲基纤维素配方时，步骤二具体为：将4.5-6ml细胞悬液中加入凝固剂A约180-220mg，充分溶解后加入凝固剂B约1.10-1.15ml，充分混匀。
6.根据权利要求1所述治疗关节疾病的生物凝胶剂，其特征在于，当所述的凝固剂为改性聚乙二醇配方时，步骤二具体为：取1.2-1.6ml凝固剂A与0.12-0.16g凝固剂B进行混合，混合充分后加入4.5-6ml细胞悬液，混匀。
7.权利要求1-6任一所述的生物凝胶剂在制备治疗关节疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述关节疾病具体为骨关节炎或关节损伤。
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