CN105106238A - 一种用于治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物，所述细胞治疗组合物由干细胞和黄原胶溶液或凝胶组成，其中每2？ml黄原胶溶液或凝胶至少含有2×10⁷个原代至第10代的干细胞，所述干细胞包括脂肪组织来源干细胞、骨髓来源干细胞、脐带血来源干细胞和胎盘来源干细胞等。本组合物中的干细胞在关节腔内存活率高，能有效改善骨关节炎和软骨缺损的病情，修复受损的软骨。

Description

一种用于治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物

技术领域

本发明涉及一种能用于治疗骨关节炎和软骨缺损的以黄原胶为媒介的干细胞细胞治疗组合物，属于生物医药领域。

背景技术

骨关节炎(简称OA)是一种伴随有炎症的慢性关节软骨退变性疾病。病理特征为关节软骨破坏，滑液及滑膜有炎症、关节边缘有骨刺形成和软骨下骨硬化等，可导致严重的疼痛、功能障碍，严重影响患者生活质量。骨关节炎易发生于膝关节、肩关节、髋关节和手指关节等部位，是发病率较高的一种疾病，尤其老年人发病率很高。随着全球老龄化，骨关节炎的发病率和患者人数正逐年增加。骨关节炎的病因及发病机制尚不清楚，车祸、创伤等原因引起的软骨缺损也会演变为骨关节炎。而且由于关节软骨没有血管和神经，且软骨细胞自我修复能力弱，受损的软骨很难自己修复等，导致骨关节炎治疗困难，到目前尚无能根本上治愈骨关节炎的方法。

目前，骨关节炎临床治疗方法主要有：早期可用控制重量、有氧运动等非药物治疗法，非甾体类抗炎药物和黏弹性补充剂等药物治疗法；病情较严重者用关节置换等手术治疗；新型的微骨折、自体或异体软骨或软骨细胞移植术、干细胞治疗等。其中药物治疗仅能缓解疼痛和病情，并不能根本上治愈骨关节炎，且部分药物副作用较多；关节置换给患者带来很大的痛苦；自体软骨和软骨细胞来源有限，且软骨细胞扩增能力有限，导致其应用受到限制。干细胞具有很强的自我更新能力和多项分化潜能，其来源丰富、可从骨髓、脂肪组织、脐带血、胎盘、滑膜等多种组织分离得到，免疫原性低，因此干细胞治疗是一种具有潜力的治疗骨关节炎的手段。已有文献报道关节腔注射骨髓来源间充质干细胞、脐带血来源干细胞和脂肪组织来源干细胞均能缓解骨关节炎的病情(KohYGetal,TheNhee,2012；DavatchiFetal,IntJRheumDis,2015；VegaAetal,Transplantation,2015.)。但是关节部位炎症环境和磨损的微环境对注入的干细胞的生存很不利，故找到一种合适的媒介物保护关节腔注射的干细胞，提高干细胞体内生存率很有必要。

黄原胶是黄原胶(Xanthan)又称汉生胶，是由野油菜黄单胞杆菌(Xanthomonascampestris)分泌的一种胞外酸性多糖。黄原胶因其优良的物化性质，如分散液的高黏度、触变性、稳定性等被关注和研究，并在食品工业、医药工业、采油、涂料等诸多方面得到了广泛的应用。最近研究发现，关节腔注射黄原胶能有效改善骨关节炎的病情，并保护软骨(ShaoHetal,CarbohydratePolymers,2013；ShaoHRetal,Biorheology,2014.)，但并不能修复已受损的软骨组织。基于黄原胶缓解骨关节炎的病情和改善骨关节炎微环境的特性，及干细胞修复受损软骨的特性，本发明提供一种以黄原胶为媒介的关节腔注射治疗骨关节炎和软骨缺损的干细胞治疗组合物，与生理盐水为媒介的干细胞相比，本组合物干细胞体内存活率高，改善骨关节炎病情和修复受损软骨组织的效果优于单独的干细胞和单独的黄原胶。

发明内容

本发明的目在于提供一种治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物。

本发明的另一目在于提供一种治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物，该组合物用于关节腔注射治疗骨关节炎和软骨缺损。

本发明一种治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物，其特征在于该细胞治疗组合物由干细胞和黄原胶组成，将干细胞混悬于黄原胶溶液或凝胶，其中每2ml黄原胶溶液或凝胶至少包含2×10⁷个原代至第10代的干细胞。

本发明所述的细胞治疗组合物，其中干细胞是指由患有骨关节炎和软骨缺损的患者或细胞捐赠者的包括脂肪组织、骨髓和脐带等组织中分离的原代至第10代的多能性间充质干细胞。

本发明所述的细胞治疗组合物，优选由患有骨关节炎和软骨缺损的患者或捐赠者的脂肪组织或骨髓中分离的原代至第10代的多能性间充质干细胞。

获取脂肪组织来源干细胞的方法如下：取患者自体或脂肪捐赠者腹部、臀部或膝盖脂肪垫等脂肪组织，用PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.4，以下均同)洗3次(如果是脂肪块先剪碎)，加同体积0.15％I型胶原酶，于37℃，200r/min条件下震荡消化1h，消化液加PBS稀释一倍，1800r/min离心10min得到沉淀，沉淀加红细胞裂解液于37℃条件下放置5min，除去红细胞，1200r/min离心5min得到沉淀。沉淀再用PBS洗1次，用含10％胎牛血清(FBS)的L-DMEM培养基(或人间充质干细胞无血清培养基)混悬，用200目细胞筛过滤，5×10⁴细胞/cm²接种于10cm细胞培养皿中，于37℃，5％CO₂和饱和蒸汽压标准条件进行培养，培养24h后大部分干细胞贴壁，弃去未贴壁的细胞，加入新的培养基继续培养。前两天每天换一次新的培养基，往后每隔两天换一次新的培养基，待细胞长满80％底面积时1:2进行传代。

获取骨髓来源干细胞的方法如下：取患者自体或捐赠者的骨髓，1200r/min离心10min，沉淀加红细胞裂解液，裂解红细胞，1200r/min离心5min。细胞用10％FBS的L-DMEM培养基(或人间充质干细胞无血清培养基)混悬接种到培养皿中并在37℃、5％CO₂和饱和蒸汽压标准条件进行培养。过24h大部分干细胞已贴壁，将未贴壁的细胞弃去，加入新的培养基继续培养。培养前两天每天换一次培养基，后期每隔一天换一次培养基，待细胞长满80％底面积时1:2进行传代。

本发明所述的细胞治疗组合物，其制备方法是将原代至第10代的单层培养的干细胞用PBS洗3次，再用0.25％的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化3min，加适量的含10％FBS的L-DMEM培养基(或人间充质干细胞无血清培养基)，轻轻吹打细胞使其脱落，混悬为单细胞混悬液，计数，1200r/min离心3min，弃上清，再用PBS洗2次，按至少1×10⁷细胞/ml的量加入适量的已灭菌的黄原胶溶液或凝胶慢慢搅拌，细胞均匀后即得。

本发明所述的细胞质治疗组合物，其中2mL黄原胶溶液或凝胶至少包含2×10⁷个原代至第10代的干细胞。

本发明所述的黄原胶溶液或凝胶是将黄原胶溶于生理盐水或PBS，并经加热灭菌，制成浓度为10～30000μg/ml，优选100～10000μg/ml黄原胶溶液。

本发明所述的黄原胶，其平均相对分子量为200万～2000万，优选1000万～2000万。

本发明所述的细胞治疗组合物用于关节腔注射治疗骨关节炎和软骨缺损。

本发明的有益之处在于，细胞治疗组合物中的干细胞在关节腔内存活率高，治疗骨关节炎的效果明显优于生理盐水混悬的干细胞和单独的黄原胶。黄原胶作为干细胞媒介，解决了关节腔注射的干细胞关节腔内存活率低的问题。

附图说明

图1原代脂肪组织来源干细胞(100X)

图2第1代脂肪组织来源干细胞(100X)

图3第10代脂肪组织来源干细胞(100X)

图4黄原胶对脂肪组织来源干细胞增殖的影响

图5关节股骨软骨表面大体观察评分结果

图6关节胫骨软骨表面大体观察评分结果

图7关节软骨组织Mankin评分结果

图8软骨缺损修复组织学评分结果

具体实施方式

实施例1提取和培养脂肪组织来源干细胞

本实施例用于说明脂肪组织来源干细胞提取和培养方法，具体步骤如下。

取患者自体或脂肪捐赠者腹部脂肪组织，用PBS洗3次，用同体积的0.15％I型胶原酶消化1h，消化液加PBS稀释一倍1800r/min离心10min，得到沉淀；沉淀用PBS混悬，加红细胞裂解液，除去红细胞，1200r/min离心5min得到沉淀；沉淀再用PBS洗一遍，用10％FBS的L-DMEM培养基(或人间充质干细胞无血清培养基)悬接种到培养皿中并在37℃、5％CO₂和饱和蒸汽压标准条件进行培养；过24h大部分干细胞已贴壁，将未贴壁的细胞弃去，加入新的培养基继续培养；培养前两天每天换一次培养基，后期每隔一天换一次培养基；待细胞汇至80％进行传代培养。

传代培养方法如下：单层培养的干细胞用PBS洗3次，再用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化3min，加适量的含10％FBS的L-DMEM培养基(或人间充质干细胞无血清培养基)，轻轻吹打细胞使其脱落混悬为单细胞混悬液，按1:2比例进行传代培养。原代细胞、第1代细胞和第10代细胞形状见图1～3。

实施例2分离和培养骨髓来源干细胞干细胞

本实施例用于说明骨髓来源干细胞提取和培养方法，具体步骤如下。

采集患者自体或骨髓捐赠者骨髓，1200r/min离心10min，沉淀加红细胞裂解液，裂解红细胞，1200r/min离心5min。细胞用10％FBS的L-DMEM培养基(或人间充质干细胞无血清培养基)混悬接种到培养皿中并在37℃、5％CO₂和饱和蒸汽压标准条件进行培养。过24h大部分干细胞已贴壁，将未贴壁的细胞弃去，加入新的培养基继续培养。培养前两天每天换一次培养基，后期每隔一天换一次培养基；待细胞汇至80％进行传代培养。

传代培养方法：同实施例1。

实施例3

本实施例用于说明一种治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物的组方及制备方法。

组方：

黄原胶生理盐水溶液2mL

(平均分子量140万、浓度10000μg/ml)

脂肪组织来源干细胞(原代至第10代)2×10⁷个细胞

制备方法：取实施例1中原代至第10代的单层培养的干细胞用PBS洗3次，再用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化3min加适量的含10％FBS的L-DMEM培养基(或人间充质干细胞无血清培养基)，轻轻吹打细胞使其脱落，混悬为单细胞混悬液，计数，1200r/min离心3min，弃上清，再用PBS洗2次，按至少1×10⁷细胞/ml的量加入适量的已灭菌黄原胶溶液或凝胶慢慢搅拌，使细胞均匀分布后即得。

实施例4

本实施例用于说明一种治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物的组方及制备方法。

组方：

黄原胶生理盐水溶液2mL

(平均分子量140万、浓度为10000μg/ml)

骨髓来源干细胞(原代至第10代)2×10⁷个细胞

制备方法：取实施例2中原代至第10代的单层培养的干细胞，其他步骤同实施例3。

本发明实验研究数据

实验例1脂肪组织来源干细胞的免疫表型鉴定

对脂肪组织来源干细胞的免疫表型进行鉴定：取第二代培养的干细胞，PBS洗3次，再用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化3min，加干细胞培养基吹打细胞使其脱落，混悬为单细胞混悬液，1200r/min离心3min，弃上清再用PBS洗2次，再用PBS调整浓度为1×10⁶细胞/mL，加大鼠血清封闭，加入荧光标记的待检测单克隆抗体，包括CD44、CD90、CD45和CD11b，4℃孵育1h，用PBS洗2次，将细胞转移至流式管中上流失细胞仪检测。

检测结果见表1。

表1脂肪组织来源干细胞表面标志物表达量

结果表明，分离所得ADSC高表达间充质干细胞表面标志物CD44和CD90，不表达内皮细胞表面标志物CD45和造血干细胞表面标志物CD11b，表明其纯度较高。

实验例2干细胞在含黄原胶培养基中扩增

取第2代的脂肪组织来源干细胞用完全培养基混悬，按5000细胞每孔的量接种于96孔板中，培养24h使细胞贴壁。吸去完全培养基，加入用含10～10000μg/mL浓度范围内不同浓度黄原胶的无血清培养基，继续培养24，48和72h。用MTT法检测细胞的存活率。实验结果见图4。

由图4可见，在不同的时间点，不同浓度黄原胶对脂肪组织来源干细胞没有毒性，不同浓度黄原胶均能明显的提高干细胞的存活率。

实验例3对膝关节骨关节炎的疗效研究

本实验选用实施例3制备的细胞治疗组合物，考察其对膝骨关节炎的疗效。

取48只健康Wistar大鼠，随机分组4组，组合物组：实施例3细胞治疗组合物，含黄原胶-干细胞；对照组1：干细胞组；对照组2：黄原胶组；阴性对照组：生理盐水组；关节腔注射碘乙酸钠溶液建立骨关节炎模型。造模后，组合物组关节腔注射实施例3制备干细胞治疗组合物100μL，对照组1关节腔注射含1×10⁶干细胞的生理盐水混悬液100μL，对照组2关节腔注射注射100μL不含干细胞的黄原胶溶液，阴性对照组关节腔注射100μL生理盐水。细胞注射治疗12周后，处死实验动物，对关节软骨表面进行大体观察和软骨组织病理学观察，并根据关节软骨表面大体观察评分标准和Mankin软骨组织病理学评分标准进行评分，(其评分标准见表2和表3)。对各实验组评分结果进行组间t检验，P<0.05有统计学意义。评分结果见图5、6、7。

表2关节软骨表面的大体评分标准

表3Mankin软骨组织病理学评分标准

组合物组和干细胞组软骨表面评分和软骨组织Mankin评分结果明显低于生理盐水组；黄原胶组对照组软骨表面评分和软骨组织Mankin评分结果略低于生理盐水组；组合物组软骨表面评分和软骨组织Mankin评分结果明显低于干细胞组和黄原胶组；表明关节腔注射实施例3细胞治疗组合物和干细胞均能明显的改善骨关节炎的病情，而本组合物治疗效果明显优于单独的干细胞组，黄原胶为干细胞媒介能明显的提高干细胞治疗骨关节炎的作用。

实验例4对家兔关节软骨缺损的疗效研究

本实验选用实施例4制备的细胞治疗组合物，考察其对膝骨关节软骨缺损的疗效。

取32只成年新西兰大白兔，股骨滑车表面造成直径3.5mm、深2.5mm软骨缺损，软骨缺损处用以下方法进行处理。实验组：填补实施例4细胞治疗组合物，含黄原胶和干细胞；对照组：填补单纯的黄原胶。过12周后处死动物，观察软骨缺损修复情况和及新生组织类型，用组织学评分标准对其进行评分并两组数据间t检验，P<0.05为差异有统计学意义。评分标准见表4，评分结果见图8。

表4软骨组织病理学评分标准(wakitani评分)

手术12周后实验组软骨缺损处被半透明软骨样组织修复，细胞排列趋于正常，与周围组分界不明显。对照组软骨缺损处被纤维组织修复，有很少量的细胞，周围分界较明显。实验组软骨组织学评分明显低于对照组，表明实施例4细胞治疗组合物能较有效地修复软骨缺损。

Claims (7)

1.一种治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物，其特征在于该细胞治疗组合物由干细胞和黄原胶组成，将干细胞混悬于黄原胶溶液或凝胶，其中每2ml黄原胶溶液或凝胶至少包含2×10⁷个原代至第10代的干细胞。

2.权利要求1所述的细胞治疗组合物，其特征在于干细胞是指由患有骨关节炎和软骨缺损的患者或细胞捐赠者的包括脂肪组织、骨髓和脐带等组织中分离的原代至第10代的多能性间充质干细胞。

3.权利要求1和2任一所述的细胞治疗组合物，其特征在于优选由患有骨关节炎和软骨缺损的患者或细胞捐赠者的脂肪组织或骨髓分离的原代至第10代的多能性间充质干细胞。

4.权利要求1所述的细胞治疗组合物，其特征在于黄原胶溶液或凝胶是将黄原胶溶于生理盐水或PBS，并经加热灭菌，制成浓度为10~30000μg/ml黄原胶溶液或凝胶，优选100~10000μg/ml黄原胶溶液。

5.权利要求1和4任一所述的细胞治疗组合物，其特征在于黄原胶平均相对分子量为200万~2000万，优选1000万~2000万。

6.权利要求1所述的细胞治疗组合物，其特征在于通过以下方法制备：将原代至第10代的单层培养的干细胞用PBS洗3次，再用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（乙二胺四乙酸）消化液消化3min，加适量的含10%胎牛血清的L-DMEM培养基（或人间充质干细胞无血清培养基），轻轻吹打细胞使其脱落，混悬为单细胞混悬液，并计数，1200r/min离心3min，弃上清再用PBS洗2次，按至少1×10⁷细胞/ml的量加入适量的黄原胶溶液或凝胶慢慢搅拌，细胞均匀后即得。

7.权利要求1所述的细胞治疗组合物，其特征在于其用于关节腔注射治疗骨关节炎和软骨缺损。