CN115089610A - 骨骼干细胞在制备用于治疗骨关节炎的产品中的应用 - Google Patents

骨骼干细胞在制备用于治疗骨关节炎的产品中的应用 Download PDF

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CN115089610A CN202210743135.1A CN202210743135A CN115089610A CN 115089610 A CN115089610 A CN 115089610A CN 202210743135 A CN202210743135 A CN 202210743135A CN 115089610 A CN115089610 A CN 115089610A
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Abstract

本发明公开了骨骼干细胞在制备用于治疗骨关节炎的产品中的应用。实验证明，由骨骼干细胞和磷酸盐缓冲液组成的制剂可以改善骨关节炎骨质病变、保护关节软骨结构、促进软骨基质形成和提高膝关节软骨组织中II型胶原蛋白的表达量，即由骨骼干细胞和磷酸盐缓冲液组成的制剂可以减轻骨关节炎的病理损害，进而治疗或减轻骨关节炎。本发明具有重要的应用价值。

Description

骨骼干细胞在制备用于治疗骨关节炎的产品中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及骨骼干细胞在制备用于治疗骨关节炎的产品中的应用。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节疼痛和关节功能障碍为主要症状的慢性退行性关节疾病。不当运动、过度劳累和意外事故带来的关节创伤及后继的炎症反应是骨关节炎发生和进展的重要原因。中华医学会颁布的骨关节炎治疗指南提到，现有骨关节炎治疗方式包括康复训练、药物和手术。但是骨关节炎发生进展到手术之前的治疗方式效果不佳，因此迫切需要研发新的治疗方式来干预骨关节的进展，提升患者生活质量。
干细胞由于具有多向分化和免疫调节等特性，已经被尝试应用于治疗骨关节炎。目前处于科学研究和临床研究阶段治疗骨关节炎的干细胞包括脐带干细胞、脂肪干细胞、牙髓干细胞等。但是，值得关注的是，不同组织来源的干细胞除了具有多向分化和自我更新的共性之外，还具有与其来源组织相关的特性，如脂肪来源的干细胞向脂肪组织分化能力强等。因此，应用干细胞时应该要强调发挥干细胞组织特异性的优势。
骨骼干细胞是新发现的骨骼系统内源性的多潜能干细胞，在适宜的环境中具有重建骨、软骨和骨髓基质的能力。以往的研究表明骨骼干细胞在骨骼系统发育中发挥重要作用。此外，骨骼干细胞的组织特异性能力在疾病治疗中的作用值得被探索。目前，国内外未见将骨骼干细胞应用于骨关节炎治疗的报道。
发明内容
本发明的目的为治疗骨关节炎。
本发明首先保护含有骨骼干细胞的制剂在制备用于治疗或减轻骨关节炎的产品中的应用。
本发明还保护含有骨骼干细胞的制剂在制备用于改善骨关节炎骨质病变的产品中的应用。
本发明还保护含有骨骼干细胞的制剂在制备用于减轻骨关节炎的病理损害的产品中的应用。
上述应用中，所述减轻骨关节炎的病理损害可表现为保护关节软骨结构、促进软骨基质形成和提高膝关节软骨组织中II型胶原蛋白的表达量中的至少一种。
上述任一所述含有骨骼干细胞的制剂具体可由骨骼干细胞和磷酸盐缓冲液组成；所述含有骨骼干细胞的制剂中，骨骼干细胞的浓度可为1.0×106-1.0×107/mL(如1.0×106-5.0×106/mL、5.0×106-1.0×107/mL、1.0×106/mL、5.0×106/mL或1.0×107/mL)。
上述任一所述含有骨骼干细胞的制剂具体可为实施例中的低剂量骨骼干细胞制剂或高剂量骨骼干细胞制剂。
本发明还保护一种由骨骼干细胞和磷酸盐缓冲液组成的制剂；所述制剂中，骨骼干细胞的浓度可为1.0×106-1.0×107/mL(如1.0×106-5.0×106/mL、5.0×106-1.0×107/mL、1.0×106/mL、5.0×106/mL或1.0×107/mL)；
所述制剂的功能可为治疗或减轻骨关节炎、改善骨关节炎骨质病变和减轻骨关节炎的病理损害中的至少一种。
上述制剂中，所述减轻骨关节炎的病理损害可表现为保护关节软骨结构、促进软骨基质形成和提高膝关节软骨组织中II型胶原蛋白的表达量中的至少一种。
上述任一所述骨关节炎可为创伤性骨关节炎。
上述任一所述磷酸盐缓冲液具体可为武汉赛维尔生物科技有限公司的产品，产品目录号为G4202-500ML。
本发明的发明人通过手术切断大鼠膝关节的前交叉韧带，造成关节不稳定性破坏，进而建立创伤性骨关节炎大鼠模型；之后分离培养大鼠骨骼干细胞，将骨骼干细胞悬浮于磷酸盐缓冲液中，局部注入创伤性骨关节炎大鼠模型；之后采用microCT检测评价膝关节骨影像学结构，以苏木素伊红染色、甲苯胺蓝染色、番红O-固绿染色、抗II型胶原蛋白染色评价骨骼干细胞对于创伤性骨关节炎的保护作用，以染色体标记技术检测骨骼干细胞是否有植入，以转录组测序技术检测骨骼干细胞分泌的免疫调节因子。结果表明，骨骼干细胞可以改善骨关节炎骨质病变，保护关节软骨结构，促进软骨基质形成，提高膝关节软骨组织中II型胶原蛋白的表达量，并且表达多种免疫调节因子；另外，注入的骨骼干细胞并没有直接参与分化为膝关节骨和软骨。综上所述，本发明的发明人通过大量实验证明，骨骼干细胞可以有效治疗或减轻创伤性骨关节炎，减轻骨关节炎的病理损害，即对创伤性骨关节炎具有显著的保护作用。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为骨骼干细胞改善创伤性骨关节炎动物模型的骨影像学结构。
图2为骨骼干细胞改善创伤性骨关节炎的软骨组织学形态且促进II型胶原蛋白的表达。标尺均代表100μm，*为P＜0.05，**为P＜0.01。
图3为注射入关节腔的骨骼干细胞在体内的分布和存活情况。标尺代表100μm。
图4为转录组测序分析骨骼干细胞表达的免疫调节因子。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
SD大鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司的产品。
骨骼干细胞培养基：向α-MEM培养基中添加胎牛血清(美国GIBCO公司)，得到骨骼干细胞培养基；骨骼干细胞培养基中，胎牛血清的浓度为10％(v/v)。
下述实施例中的α-MEM培养基为美国GIBCO公司的产品，产品目录号为C12571500BT。
实施例、
一、骨骼干细胞(skeletal stem cell，SSC)的分离培养和骨骼干细胞制剂的制备
1、骨骼干细胞的分离培养
(1)分离1周龄SD大鼠的胫骨和股骨(冲洗掉骨髓)，之后剪碎并置于0.1％II型胶原酶中37℃消化30min，得到碎骨片。
(2)将步骤(1)得到的碎骨片转移至培养瓶(规格为25ml)，加入6ml骨骼干细胞培养基，之后37℃、5％CO2培养，1周左右即可观察到从骨片中爬出的骨骼干细胞；待从骨片中爬出的骨骼干细胞的细胞融合率达到80％左右时，进行细胞传代。培养期间，每隔3天更换新的骨骼干细胞培养基。
细胞传代的步骤如下：弃培养基，先加入PBS缓冲液(pH7.4)洗3遍；再加入适量体积的0.25％胰蛋白酶，37℃、5％CO2培养箱中消化3-5min；之后加入2倍胰蛋白酶体积的骨骼干细胞培养基以终止消化；最后1200rpm/min离心5min，弃上清，加入适量骨骼干细胞培养基吹打细胞以混匀，以1：3的传代比将细胞传入新的培养瓶中，继续培养。
2、骨骼干细胞制剂的制备
(1)低剂量骨骼干细胞制剂的制备
取第2-4代生长状态良好的骨骼干细胞，先加入PBS缓冲液(pH7.4)洗3遍；再加入适量体积的0.25％胰蛋白酶，37℃、5％CO2培养箱中消化3-5min；再加入2倍胰蛋白酶体积的骨骼干细胞培养基以终止消化；之后1200rpm/min离心5min，弃上清，用磷酸盐缓冲液(武汉赛维尔生物科技有限公司的产品，产品目录号为G4202-500ML)稀释骨骼干细胞的浓度至106/mL，得到低剂量骨骼干细胞制剂。
(2)高剂量骨骼干细胞制剂的制备
取第2-4代生长状态良好的骨骼干细胞，先加入PBS缓冲液(pH7.4)洗3遍；再加入适量体积的0.25％胰蛋白酶，37℃、5％CO2培养箱中消化3-5min；再加入2倍胰蛋白酶体积的骨骼干细胞培养基以终止消化；之后1200rpm/min离心5min，弃上清，用磷酸盐缓冲液稀释骨骼干细胞的浓度至107/mL，得到高剂量骨骼干细胞制剂。
二、创伤性骨关节炎大鼠模型的构建
1、采用前交叉韧带离断的方法构建创伤性骨关节炎大鼠模型。具体步骤如下：首先腹腔注射2％戊巴比妥钠(注射剂量为45mg/kg)麻醉SD大鼠；然后将SD大鼠仰卧位置于手术台上，常规备皮消毒双侧后肢膝关节，从髌骨旁内侧切开暴露膝关节；之后髌骨脱位，打开关节腔；随后，切断前交叉韧带，行前抽屉实验确定前交叉韧带是否被切断，随后复位髌骨；最后，彻底止血后缝合切口。术中确保关节面无损伤。术后所有SD大鼠每天肌内注射20万单位青霉素预防感染，持续3天。
2、构建假手术对照组模型
参照创伤性骨关节炎大鼠模型的构建方法，构建构建假手术对照组模型。具体步骤如下：首先腹腔注射2％戊巴比妥钠(注射剂量为45mg/kg)麻醉SD大鼠；然后将SD大鼠仰卧位置于手术台上，常规备皮消毒双侧后肢膝关节，从髌骨旁内侧切开暴露膝关节；之后髌骨脱位，打开关节腔，保持前交叉韧带完整，随后复位髌骨；最后，彻底止血后缝合切口。术中确保关节面无损伤。术后所有SD大鼠每天肌内注射20万单位青霉素预防感染，持续3天。
三、注射骨骼干细胞制剂
待步骤二中的SD大鼠术后1周，随机取18只创伤性骨关节炎大鼠模型，平均分为OA模型组、低剂量SSC组和高剂量SSC组共3组，每组6只；随机取6只假手术对照组模型，作为对照组；之后进行如下实验：
OA模型组：每只SD大鼠术侧关节腔注射0.1mL磷酸盐缓冲液；
低剂量SSC组：每只SD大鼠术侧关节腔注射0.1mL低剂量骨骼干细胞制剂；
高剂量SSC组：每只SD大鼠术侧关节腔注射0.1mL高剂量骨骼干细胞制剂；
对照组：每只SD大鼠术侧关节腔注射0.1mL磷酸盐缓冲液。
四、microCT系统检测骨影像学结构
完成步骤三4周后，将各组SD大鼠处死，收集完整的膝关节组织样本；用4％多聚甲醛将收集的膝关节组织样本固定1周，之后用microCT系统(Scanco Medical，Bassersodrf，Zurich，Switzerland)检测骨影像学结构，即对膝关节组织样本进行成像。扫描时间为14min，设置为70kVp和114μA。三维图像的重建使用标准的卷积反投影进行。基于骨质增生形成和关节破坏程度进行半定量分析以评估创伤性骨关节炎的严重程度(用OA CT评级表示)(Kim JE，Lee SM，Kim SH，Tatman P，Gee AO，Kim DH，Lee KE，Jung Y，Kim SJ.Effectof self-assembled peptide-mesenchymal stem cell complex on the progression ofosteoarthritis in a rat model.Int J Nanomedicine.2014May 7；9Suppl 1：141-57.doi：10.2147/IJN.S54114.eCollection 2014.)。
检测结果见图1(OA为OA模型组，低剂量为低剂量SSC组，高剂量为高剂量SSC组，对照为对照组)：对照组关节面平整，无明显的骨质破坏和增生；OA模型组关节有明显的骨质破坏和增生的情况，OA CT评级严重；低剂量骨骼干细胞治疗的情况下，关节的骨质破坏程度有所减轻，在一定程度上能够改善OA骨质病变，并且这种改善在高剂量骨骼干细胞治疗时更加明显。由此可见，骨骼干细胞可以改善创伤性骨关节炎大鼠模型的骨影像学结构，并且具有剂量依赖性。
五、采用组织病理技术检测软骨组织学形态和II型胶原蛋白的表达量
(1)完成步骤四后，将各组的膝关节组织样本置于10％EDTA脱钙液(溶剂为中性磷酸盐缓冲液)中脱钙30天，嵌入石蜡中，切成厚度为6μm的切片。
(2)完成步骤(1)后，通过苏木素伊红染色观察组织结构。
检测结果见图2中A：OA模型组相对于对照组关节软骨层明显变薄，细胞排列紊乱，关节面不平整；在低剂量骨骼干细胞治疗的情况下，关节软骨层明显增厚，但是关节面仍不平整；在高剂量骨骼干细胞治疗的情况下，关节软骨层明显增厚，关节面平整，更大程度上保护关节软骨结构。由此可见，骨骼干细胞可以改善创伤性骨关节炎大鼠模型的软骨组织学结构，并且具有剂量依赖性。
(3)完成步骤(1)后，通过甲苯胺蓝和番红O-固绿染色评估软骨基质的分布，并以此进行Mankin评分。
检测结果见图2中A和B：OA模型组相对于对照组关节软骨层染色程度明显变浅，软骨基质减少，Mankin评分增加，OA骨质病变严重；在低剂量骨骼干细胞治疗的情况下，关节软骨层染色程度明显加深，软骨基质增多，Mankin评分下降，OA骨质病变减轻，并且这些OA骨质病变改善的变化在高剂量骨骼干细胞治疗时更加显著，更大程度上促进软骨基质形成。由此可见，骨骼干细胞可以促进创伤性骨关节炎大鼠模型的软骨基质形成，并且具有剂量依赖性。
(4)完成步骤(1)后，采用II型胶原抗体(Abcam，1：200)通过免疫组化分析膝关节组织样本中II型胶原蛋白的表达量。
检测结果见图2中A和C：OA模型组相对于对照组关节软骨层II型胶原蛋白染色程度明显减少；在低剂量骨骼干细胞治疗的情况下，关节软骨层II型胶原蛋白染色程度加深不明显；然而在高剂量骨骼干细胞治疗时，关节软骨层II型胶原蛋白染色程度明显加深，更大程度上促进关节软骨II型胶原蛋白形成。由此可见，骨骼干细胞可以促进创伤性骨关节炎大鼠模型关节软骨II型胶原蛋白的表达，并且具有剂量依赖性。
上述结果表明，骨骼干细胞可以改善创伤性骨关节炎的软骨组织学形态(具体为保护关节软骨结构和促进软骨基质形成)，且提高膝关节软骨组织中II型胶原蛋白的表达量。
六、观察注射入关节腔的骨骼干细胞在体内的分布和存活情况
1、观察骨骼干细胞是否能够植入大鼠膝关节组织
(1)随机取12只术后1周的创伤性骨关节炎大鼠模型(雌性)，分为第1天组、第4天组、第7天组和第10天组共4组，每组3只，之后进行如下实验：
第1天组：每只雌性SD大鼠术侧关节腔注射0.1mL雄性SD大鼠乳鼠来源的骨骼干细胞制剂，并分别在注射后第1天处死大鼠并收集完整的膝关节组织样本。
第4天组：每只雌性SD大鼠术侧关节腔注射0.1mL雄性SD大鼠乳鼠来源的骨骼干细胞制剂，并分别在注射后第4天处死大鼠并收集完整的膝关节组织样本。
第7天组：每只雌性SD大鼠术侧关节腔注射0.1mL雄性SD大鼠乳鼠来源的骨骼干细胞制剂，并分别在注射后第7天处死大鼠并收集完整的膝关节组织样本。
第10天组：每只雌性SD大鼠术侧关节腔注射0.1mL雄性SD大鼠乳鼠来源的骨骼干细胞制剂，并分别在注射后第10天处死大鼠并收集完整的膝关节组织样本。
雄性SD大鼠乳鼠来源的骨骼干细胞制剂的制备方法如下：从1周龄雄性SD大鼠的胫骨和股骨分离培养得到骨骼干细胞；取P2-P4代生长良好的骨骼干细胞，先加入PBS缓冲液(pH7.4)洗3遍；再加入适量体积的0.25％胰蛋白酶，37℃、5％CO2培养箱中消化3-5min；再加入2倍胰蛋白酶体积的骨骼干细胞培养基以终止消化；之后1200rpm/min离心5min，弃上清，用磷酸盐缓冲液稀释感染荧光素酶的骨骼干细胞的浓度至106/mL，得到雄性SD大鼠乳鼠来源的骨骼干细胞制剂。
(2)用4％多聚甲醛将步骤(1)收集的膝关节组织样本固定1周，之后置于10％EDTA溶液(溶剂为中性磷酸盐缓冲液)中脱钙30天，嵌入石蜡中，切成厚度为6μm的切片。
(3)完成步骤(2)后，采用Sry抗体(Santa Cruz，1:200)进行免疫荧光染色，之后在荧光显微镜(Olympus CKX53)下观察软骨和滑膜位置的染色情况。
检测结果见图3中A：在各个时间点的关节软骨和滑膜处均未看见Sry阳性染色。结果表明，注射入关节腔的骨骼干细胞均不能够植入关节软骨和滑膜。
2、观察注射入关节腔的骨骼干细胞在体内的分布和存活情况
(1)取步骤一中生长状态良好的骨骼干细胞，按照5×104/ml的密度将骨骼干细胞种植于6孔板，37℃、5％CO2培养24h。
(2)完成步骤(1)后，去除液相，加入1mL骨骼干细胞培养基、携带嘌呤霉素抗性和荧光素酶的慢病毒阴性对照(MOI＝50)和浓度为5μg/mL的polybrene溶液(溶剂为骨骼干细胞培养基)，37℃、5％CO2培养24h。
携带嘌呤霉素抗性和荧光素酶的慢病毒阴性对照购于上海吉凯基因，载体为GV260，载体元件顺序Ubi-MCS-firefly_Luciferase-IRES-Puromycin。加入该慢病毒阴性对照的目的为用慢病毒使骨骼干细胞感染荧光素酶，并且使转染成功的骨骼干细胞带有嘌呤霉素抗性，便于筛选。
(3)完成步骤(2)后，去除液相，加入2mL含3μg/mL嘌呤霉素的骨骼干细胞培养基，37℃、5％CO2培养48h。
(4)完成步骤(3)后，去除液相，加入2mL骨骼干细胞培养基，37℃、5％CO2培养至细胞融合率达到90％左右，细胞传代2-3次，得到感染荧光素酶的骨骼干细胞。培养期间，每隔3天更换新的骨骼干细胞培养基。
细胞传代的步骤如下：弃培养基，先加入PBS缓冲液(pH7.4)洗3遍；再加入适量体积的0.25％胰蛋白酶，37℃、5％CO2培养箱中消化3-5min；之后加入2倍胰蛋白酶体积的骨骼干细胞培养基以终止消化；最后1200rpm/min离心5min，弃上清，加入适量骨骼干细胞培养基吹打细胞以混匀，以1：3的传代比将细胞传入新的培养瓶中，继续培养。
(5)随机取12只术后1周的创伤性骨关节炎大鼠模型，分为4组，每组3只，之后进行如下实验：
每只SD大鼠术侧关节腔注射0.1mL感染荧光素酶的骨骼干细胞制剂。
感染荧光素酶的骨骼干细胞制剂的制备方法如下：取感染荧光素酶的骨骼干细胞，先加入PBS缓冲液(pH7.4)洗3遍；再加入适量体积的0.25％胰蛋白酶，37℃、5％CO2培养箱中消化3-5min；再加入2倍胰蛋白酶体积的骨骼干细胞培养基以终止消化；之后1200rpm/min离心5min，弃上清，用磷酸盐缓冲液稀释感染荧光素酶的骨骼干细胞的浓度至106/mL，得到感染荧光素酶的骨骼干细胞制剂。
(6)分别于完成步骤(5)后的第1天、第4天、第7天和第12天，用生物发光成像法跟踪细胞的分布和存活情况，具体步骤如下：用2％异氟烷麻醉SD大鼠，之后腹腔注射D-luciferase(注射剂量为150μg/只)，10min后，放入活体成像仪成像暗箱平台，进行成像监测；生物信号获得后应用活体成像软件(Living Image Software 4.0)进行分析。
检测结果见图3中B。结果表明，注射入关节腔的骨骼干细胞不会迁移到其他部位，存活时间大约为1周。
七、采用转录组测序分析骨骼干细胞表达的免疫调节因子
为了进一步研究骨骼干细胞的生物学特性，首先将骨骼干细胞接种至6孔培养板，37℃、5％CO2培养3天；然后收集细胞进行高通量RNA测序分析。下一代测序文库的制备和Illumina MiSeq测序在GENEWIZ，Inc(中国苏州)进行。DNA文库由Agilent2100Bioanalyzer(Agilent Technologies，Palo Alto，California，U.S.)进行质控，并用Qubit 2.0Fluorometer进行定量。根据制造商的说明，DNA文库被复用并加载到IlluminaMiSeq仪器(Illumina，San Diego，California，U.S.)。测序采用2×300配对末端(PE)配置；图像分析和碱基调用由MiSeq控制软件(MCS)进行。所有检测到的表达的基因(FPKM≥1)被用于基因本体论(GO)分析和基因集富集分析(GSEA)。
检测结果见图4。结果表明，骨骼干细胞表达多种免疫调节因子，如Ptgs2、Tgfb3和Arg1等；骨骼干细胞表达的基因参与免疫抑制的作用。
由此可见，骨骼干细胞可以减轻创伤性骨关节炎，即减轻创伤性骨关节炎的病理损害。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (9)

1.含有骨骼干细胞的制剂在制备用于治疗或减轻骨关节炎的产品中的应用。
2.含有骨骼干细胞的制剂在制备用于改善骨关节炎骨质病变的产品中的应用。
3.含有骨骼干细胞的制剂在制备用于减轻骨关节炎的病理损害的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述减轻骨关节炎的病理损害表现为保护关节软骨结构、促进软骨基质形成和提高膝关节软骨组织中II型胶原蛋白的表达量中的至少一种。
5.根据权利要求1至4任一所述的应用，其特征在于：所述骨关节炎为创伤性骨关节炎。
6.根据权利要求1至3任一所述的应用，其特征在于：所述含有骨骼干细胞的制剂由骨骼干细胞和磷酸盐缓冲液组成；所述含有骨骼干细胞的制剂中，骨骼干细胞的浓度为1.0×106-1.0×107/mL。
7.一种制剂，由骨骼干细胞和磷酸盐缓冲液组成；所述制剂中，骨骼干细胞的浓度为1.0×106-1.0×107/mL；
所述制剂的功能为治疗或减轻骨关节炎、改善骨关节炎骨质病变和减轻骨关节炎的病理损害中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于：所述减轻骨关节炎的病理损害表现为保护关节软骨结构、促进软骨基质形成和提高膝关节软骨组织中II型胶原蛋白的表达量中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于：所述骨关节炎为创伤性骨关节炎。
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