KR20230054625A - 주입이 가능한 동물 연골유래 주사제 조성물의 제조 방법 및 이의 이용 - Google Patents
주입이 가능한 동물 연골유래 주사제 조성물의 제조 방법 및 이의 이용 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 주입이 가능한 동물 연골유래 주사제 조성물의 제조 방법, 상기 방법으로 제조한 주사제 조성물 및 이의 이용에 관한 것이다.
본 발명에 따른 주사제는 관절강내 주사 가능한 제형의 콜라겐 함유 생체 재료를 포함하여 외과적 절개 없이 적용 부위에 직접 주사함으로써 조직 수복을 도모하여 연골 조직 재생을 유도할 수 있다. 또한, 상기 주사제에 함유된 동물 연골유래 세포외기질이 관절 연골 조직을 보호해주는 역할뿐 아니라 관절내 줄기세포를 연골세포로 분화하도록 유도함으로써 손상된 관절 조직을 재생할 수 있는 환경으로 자극하여 골관절염을 치료할 수 있는바, 관절염 치료제로 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제는 관절강내 주사 가능한 제형의 콜라겐 함유 생체 재료를 포함하여 외과적 절개 없이 적용 부위에 직접 주사함으로써 조직 수복을 도모하여 연골 조직 재생을 유도할 수 있다. 또한, 상기 주사제에 함유된 동물 연골유래 세포외기질이 관절 연골 조직을 보호해주는 역할뿐 아니라 관절내 줄기세포를 연골세포로 분화하도록 유도함으로써 손상된 관절 조직을 재생할 수 있는 환경으로 자극하여 골관절염을 치료할 수 있는바, 관절염 치료제로 적용될 수 있다.
Description
본 발명은 주입이 가능한 동물 연골유래 주사제 조성물의 제조 방법, 상기 방법으로 제조한 주사제 조성물 및 이의 이용에 관한 것이다.
종래의 손상된 연골을 치료하기 위한 방법으로는 연골변연절제술(Debridement), 골수유도재생술(Bone marrow stimulating technique), 자가연골이식술(Osteochondral autograft) 그리고 자가연골세포이식술 등이 있다. 이러한 방법은 주로 연골 손상이 상당히 진행된 상태에서 진행되는 침습적인 방법이며, 연골 손상 초기에 적용 가능한 치료법으로는 관절강 내에 히알루론산 제품을 주입하는 방법이 주로 사용되고 있다. 대부분의 침습적인 치료방법들은 수술을 위한 절제, 골막의 채취, 사용의 복잡성, 고가의 치료비용, 골수를 자극하는 과정에서 유도된 성체줄기세포의 누수 그리고 지혈 문제에 의한 비정상적인 섬유화연골 생성 등의 문제점이 있다. 더불어 히알루론산 제품 주입 방법의 경우는 윤활작용을 통한 통증을 완화하는 단순 역할만을 한다(Frizziero L, et al., Clinical and Experimental Rheumatology, 01 Jul 1998, 16(4):441-449).
따라서 상기와 같은 문제들을 개선하기 위해 최소 침습 시술이 가능하면서, 단순 윤활작용 이상의 치료 효능이 있는 치료제 개발이 절실히 필요하다.
한편, 세포외기질(extracellular matrix; ECM)은 조직에서 세포를 제외한 나머지 부분으로, 세포와 세포 사이의 틈을 메워 물리적으로 조직을 지지하는 역할을 함으로써 생체조직 본연의 구조를 유지할 수 있는 환경을 조성해주는 생체고분자의 집합체이다. 특히 연골조직의 세포외기질 중 주요 성분인 콜라겐은 연골에서 조직구성과 더불어 세포 성장 및 분화를 위한 미세환경을 조성하는 주요 성분으로 알려져 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 손상된 연골을 치료하기 위해 예의 노력한 결과, 주사 가능한 제형의 동물 연골유래 콜라겐 및 세포외기질 함유 생체 재료를 외과적 절개 없이 적용 부위에 직접 주사함으로써 조직 수복을 도모하여 연골 조직 재생을 유도할 수 있는 동물 연골유래 주사제를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 골관절염의 예방 또는 치료용 주사제 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 방법으로 제조된 골관절염의 예방 또는 치료용 주사제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 방법으로 제조된 주사제 조성물을 개체의 관절강내에 투여하는 단계를 포함하는, 골관절염의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 골관절염의 예방 또는 치료용 주사제 조성물의 제조 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은
a) 동물 연골유래 무세포 세포외기질(cartilage acellular marix; CAM)을 포함하는 조성물을 30℃ 초과 55℃ 미만의 온도에서 교반하여 수용화하는 단계; 및
b) 상기 a)의 수용액을 원심분리하고 용액을 수집하여 주사제 조성물을 제조하는 단계;를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 a) 단계는 CAM을 포함하는 조성물을 30℃ 초과 및 55℃ 미만의 온도에서 교반하여 수용화하는 단계일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "무세포 세포외기질(cartilage acellular marix; CAM)"은 본 발명의 주사제 조성물의 원료로 사용될 수 있다. 이는 공지된 공정과 같이 동물로부터 연골을 분리하고 효소 또는 물리화학적 방법을 통해 탈세포화함으로써 제조하거나, 또는 상업적으로 입수가능한 것을 사용할 수 있다. 일예로, 에이템즈(ATEMS) 사의 제품을 사용할 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CAM은 분말, 스폰지 등 다양한 형태일 수 있으며, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 CAM을 수득할 수 있는 동물은 연골조직을 갖는 동물이라면 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로 돼지일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CAM은 멸균된 것일 수 있다.
상기 멸균 방법은 당업계에서 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들면, 건열 멸균, 습열 멸균, EO(Ethylene oxide) 가스 멸균, 플라즈마 멸균, 여과 멸균, X-ray, 전자선 혹은 감마선 등의 방사선 조사 멸균 방법일 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 전자선(E-beam) 또는 감마선 멸균 방법으로 멸균하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 전자선 멸균 방법으로 멸균하는 경우에는 약 15 내지 25 kGy의 E-beam을 조사하여 멸균하는 것일 수 있으며, 상기 약 15 내지 25 kGy의 E-beam은 VDmax15 E-beam일 수 있다. 또한, 감마선 멸균 방법으로 멸균하는 경우에는 약 25 내지 40 kGy의 감마선을 조사하여 멸균하는 것일 수 있으며, 상기 약 25 내지 40 kGy의 감마선은 VDmax25 감마선일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 25~40 kGy을 나타내는 VDmax25의 감마선을 조사하여 멸균된 CAM은 특정 온도 조건 및 특정 시간 조건으로 수용화할 경우 주사가 용이한 제형을 나타내었으며, 미멸균된 경우에는 수용화되지 않아 주사 가능하지 않음을 확인하였다(도 1 및 도 2).
본 발명에서, 용어 "약(about)"은 특정 숫자 값 앞에 제시될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "수용화"는 주사 불가능한 제형을 주사 가능한 제형으로 변경하기 위해 물에 녹는 형태로 제조하는 공정을 의미한다. 상기 수용화는 특정 온도 및 시간 조건에서 교반하여 이루어질 수 있다.
상기 교반 방법은 당업계에서 공지된 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있고, 예를 들면 교반 배양기를 사용하여 교반할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, a) 단계의 온도 조건은 약 30℃ 초과 및 55℃ 미만, 약 33℃ 내지 41℃, 구체적으로는 약 37℃ 내외일 수 있다.
전술한 조건보다 낮은 온도 조건에서는 제조된 용액의 점도가 높아져 주사 가능한 제형이 생성되지 않을 수 있으며, 높은 온도 조건에서는 제조된 용액 내 콜라겐 함량이 현저히 감소하고 줄기세포의 연골세포로의 분화가 유도되지 않아 골관절염의 예방 또는 치료 효과가 감소될 수 있다.
본 발명에 있어서, a) 단계의 수용화는 약 24 시간 미만, 약 20 시간 미만, 구체적으로는 약 6 내지 18시간으로 수행되는 것일 수 있다.
전술한 조건보다 짧은 시간으로 수행될 경우 수용화가 이루어지지 않아 제조된 용액의 점도가 높아져 주사 가능한 제형이 생성되지 않을 수 있으며, 상기 시간을 초과할 경우 주사제 내 유효성분인 콜라겐 함량이 현저히 감소하여 이에 따라 주사제 조성물의 골관절염 개선 효과가 감소할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 다양한 온도(37℃, 55℃) 및 시간(6시간, 24시간) 조건에서 수용화된 주사제 조성물 내 콜라겐 함량을 확인한 결과, 6시간 및 24시간 수용화 조건에서 수용화 온도 37℃(37℃ 및 6시간 조건에서 138.3 μg/㎎, 37℃ 및 24시간 조건에서 117.7 μg/㎎)에 비해 55℃(55℃ 및 6시간 조건에서 87.3 μg/㎎, 55℃ 및 24시간 조건에서 61.8 μg/㎎)에서 낮게 측정되어, 수용화 시간이 24시간 이상, 수용화 온도가 55℃ 미만인 경우 콜라겐 함량이 낮아지는 것을 확인하였다(도 6).
본 발명에서 b) 단계는 a)의 수용액을 원심분리하고 용액을 수집하여 주사제 조성물을 제조하는 단계일 수 있다.
상기 원심분리는 약 100 내지 500g에서 1 내지 10분간 수행되는 것일 수 있고, 구체적으로 약 300g에서 5분간 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 제조된 본 발명의 주사제 조성물은 CAM 용액 또는 CAM-용액과 혼용될 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 b) 단계 이후에 제조된 본 발명의 주사제 조성물을 동결시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 동결 단계를 통해 보관 및 취급이 용이해질 수 있다.
상기 동결 방법은 당업계에서 공지된 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 b) 단계 이후에 제조된 본 발명의 주사제 조성물을 멸균하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 멸균 방법은 전술한 바와 같으며, 상기 단계에서는 약 15 내지 25 kGy의 E-beam을 조사하여 멸균하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 멸균 방법에 의해, 본 발명의 주사제 조성물 내 유효성분인 콜라겐의 소실 또는 파괴 없이 불순물만이 제거될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 33℃ 및 35℃의 수용화 온도 조건에서 본 발명의 주사제 조성물이 제조될 경우 15~25 kGy를 나타내는 VDmax15의 E-beam을 이용한 멸균 전후의 용액이 모두 주사 가능함을 확인하였다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 멸균 전후의 본 발명의 주사제 조성물 내 단백질을 SDS-page로 확인한 결과, 미멸균 상태의 주사제 조성물은 약 130kDa 전후에 해당하는 콜라겐 타입 2 알파체인 단백질을 주로 함유함을 확인할 수 있으며, VDmax15의 E-beam을 이용한 멸균 공정 후 미미한 감소는 있으나 주 함유 단백질에는 변함이 없음을 확인하였다(도 5).
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 방법으로 제조된 골관절염의 예방 또는 치료용 동물 연골유래 주사제 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 주사제 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 콜라겐을 약 120 μg/㎎ 이상의 농도로 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 주사제 조성물은 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 것일 수 있다.
본 발명의 주사제 조성물은 조직 수복 및 연골 조직 재생 효과가 있는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 다양한 온도(37℃, 55℃) 및 시간(6시간, 24시간) 조건에서 수용화된 주사제 조성물을 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 분화 배지에 첨가하여 2주간 연골세포 분화를 유도한 결과, 분화 배지에 37℃ 및 6 시간 수용화 공정으로 제조된 주사제 조성물 첨가시 줄기세포에서 연골세포로의 분화가 유도되었으나, 37℃ 및 24 시간, 55℃ 및 6 시간 그리고 55℃ 및 24 시간 조건에서 수용화된 주사제 조성물은 분화 배지에 첨가시 연골세포로의 분화가 유도되지 않았음을 확인하였다(도 7).
본 발명의 주사제 조성물은 줄기세포와 혼합 투여되는 것일 수 있다.
상기 혼합 투여는 질병의 예방, 치료, 증상의 경감 또는 완화를 위해 본 발명의 약학 조성물과 줄기세포를 동시에 또는 시간차를 두고, 독립적 또는 비독립적으로 투여하는 것을 의미한다. 상기 혼합 투여는 병용 투여와 혼용될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "줄기세포"는 다양한 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 미분화 세포이다. 상기 줄기세포는 만능줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells), 배아줄기세포 또는 성체줄기세포일 수 있다.
상기 줄기세포는 인간 또는 동물 유래 일 수 있고, 제대, 제대혈, 연골, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 줄기세포는, 구체적으로 성체줄기세포일 수 있다. 성체줄기세포는 필요한 때에 특정한 조직의 세포로 분화하게 되는 미분화상태의 세포로, 골수나 뇌세포 등 이미 성장한 신체조직에서 추출될 수 있다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 간엽 줄기세포 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 줄기세포는 보다 구체적으로 중간엽 줄기세포일 수 있고, 보다 더욱 구체적으로 제대혈로부터 유래한 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 혼합 투여되는 줄기세포는 약 1.0x105 cells 내지 1.0x108 cells일 수 있고, 구체적으로 약 2.5x105 cells 내지 1.0x108 cells, 약 1.0x107 cells 내지 1.0x108 cells, 또는 약 1.0x107 cells 내지 5.0x107 cells일 수 있으며, 보다 구체적으로 약 2.5x107 cells일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기와 같이 본 발명의 주사제 조성물이 줄기세포와 혼합 투여될 경우, 투여되는 혼합 조성물 전체 중량에 대하여 주사제 조성물은 약 1 내지 5중량%로 함유되는 것일 수 있고, 구체적으로 약 1.5 내지 3중량%, 보다 구체적으로 약 2중량%로 함유될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 랫트 전십자인대 절단술로 유도된 골관절염 모델의 관절강내에 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(hUCB-MSC) 2.5x105 cells/군을 8주간 투여하거나(줄기세포 투여군), hUCB-MSC(2.5x105 cells/군)와 본 발명의 주사제 조성물인 CAM 용액(2중량%, 1mg/군)을 함께 8주간 투여하였을 경우(줄기세포+CAM 용액 투여군)의 연골 조직 재생능을 확인한 결과, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 단독으로 처리한 줄기세포 투여군에 비해 줄기세포를 본 발명의 주사제 조성물과 혼합 투여한 군에서 연골 조직 재생능이 현저히 우수한 것을 확인하였다(도 8).
본 발명의 주사제 조성물은 약학 조성물일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 골관절염의 "예방(prevention)" 및/또는 "치료(treatment)"의 용도를 갖는다. 예방적 용도에 있어, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명에 기술된 질환 또는 증상을 가지고 있거나 발병 위험이 있는 것으로 의심되는 개체에 투여될 수 있다. 치료적 용도에 있어, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명에 기술된 질환을 이미 앓고 있는 환자와 같은 개체에 본 발명에 기술된 질병 또는 증상을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지시키기 위해 충분한 양으로 투여된다. 이러한 사용에 효과적인 양은 질환 또는 증상의 심각도 및 경과, 이전의 치료, 개체의 건강 상태와 약물에 대한 반응성 및 의사 또는 수의사의 판단에 따라 달려있을 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 약학 조성물에 포함되는 유효성분인 본 발명의 주사제 조성물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 약학 조성물 총 중량에 대하여 약 1 내지 5중량%, 구체적으로 약 1.5 내지 3 중량%로 함유될 수 있다.
상기 약학 조성물은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 내용액제, 유제, 시럽제, 유제, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 비경구 또는 경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제로 제제화될 수 있으며, 구체적으로 주사제로 제제화될 수 있다.
본 발명의 주사제 조성물은 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 주사제 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 혼합하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 주사제 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 주사제 조성물은 줄기세포와 혼합 투여될 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 주사제 조성물은 골관절염의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고 투여 가능하다. 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함한다. 상기 주사제 조성물은 관절강내(예컨대, 연골내), 피하, 복강내, 폐내 및 비강내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변, 즉, 관절강내(예컨대, 연골내) 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 일예로, 관절강내 주사에 의해 투여(주입)될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 주사제 조성물은 일반적으로 약 1 내지 5중량%의 농도, 구체적으로 약 1.5 내지 3중량%의 농도로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 하나의 양태는 본 발명의 주사제 조성물을 개체의 관절강내에 투여하는 단계를 포함하는, 골관절염의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "개체"는 골관절염이 발생하였거나 발생할 수 있는 가능성이 있는 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 주사제 조성물을 골관절염의 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 상기 개체는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 동물, 조류 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 골관절염의 의심 개체에게 본 발명의 주사제 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 주사제 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있으며, 상기 약학적으로 유효한 양은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명에 있어서, 본 발명의 주사제 조성물은 줄기세포와 혼합 투여될 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 주사제는 관절강내 주사 가능한 제형의 콜라겐 함유 생체 재료로써 외과적 절개 없이 주사침으로 적용 부위에 직접 주입함으로써 조직 수복을 도모하여 연골 조직 재생을 유도할 수 있다. 또한, 상기 주사제에 함유된 동물 연골유래 세포외기질이 관절 연골 조직을 보호해주는 역할뿐 아니라 관절내 줄기세포를 연골세포로 분화하도록 유도함으로써 손상된 관절 조직을 재생할 수 있는 환경으로 자극하여 골관절염을 치료할 수 있는바, 관절염 치료제로 적용될 수 있다.
도 1은 주사 가능 원재료 및 수용화 조건을 확인한 도이다.
도 2는 3가지 수용화 온도 조건(4℃, 25℃, 37℃) 에서 6시간 동안 제조한 CAM 용액의 사진이다.
도 3은 주사 가능 멸균 조건을 확인한 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 주사 가능한 돼지 연골유래 주사제(CAM 용액)의 제조 방법을 나타낸 모식도이다.
도 5는 주사 가능한 돼지 연골유래 주사제의 멸균 전 후의 단백질 함량을 SDS-page로 확인한 도이다.
도 6은 수용화 공정 조건에 따른 콜라겐 함량을 확인한 결과이다.
도 7은 수용화 공정 조건에 따른 연골 분화능을 나타낸 결과이다.
도 8은 랫트 전십자인대 절단술로 유도된 골관절염 모델에서 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 8주간 투여하거나(줄기세포 투여군), 줄기세포와 도 5의 공정으로 제조된 CAM 용액을 함께 8주간 투여하였을 경우(줄기세포+CAM 용액 투여군)의 연골 조직 재생능을 확인한 결과이다. Scale bar = 100 ㎛.
도 2는 3가지 수용화 온도 조건(4℃, 25℃, 37℃) 에서 6시간 동안 제조한 CAM 용액의 사진이다.
도 3은 주사 가능 멸균 조건을 확인한 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 주사 가능한 돼지 연골유래 주사제(CAM 용액)의 제조 방법을 나타낸 모식도이다.
도 5는 주사 가능한 돼지 연골유래 주사제의 멸균 전 후의 단백질 함량을 SDS-page로 확인한 도이다.
도 6은 수용화 공정 조건에 따른 콜라겐 함량을 확인한 결과이다.
도 7은 수용화 공정 조건에 따른 연골 분화능을 나타낸 결과이다.
도 8은 랫트 전십자인대 절단술로 유도된 골관절염 모델에서 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 8주간 투여하거나(줄기세포 투여군), 줄기세포와 도 5의 공정으로 제조된 CAM 용액을 함께 8주간 투여하였을 경우(줄기세포+CAM 용액 투여군)의 연골 조직 재생능을 확인한 결과이다. Scale bar = 100 ㎛.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예 1. 주사 가능 원재료 및 수용화 조건 확인
주사 가능한 형태의 CAM 용액 제조공정을 확보하기 위해, 3가지 원재료 (멸균 CAM-WS 분말, 미멸균 CAM-WS 스폰지, 멸균 CAM-WS 스폰지)(에이템즈(ATEMS), 한국)를 3가지 수용화 온도 조건(4℃, 25℃, 37℃) 그리고 3가지 수용화 시간 조건(3시간, 6시간, 18시간)에서 교반배양기로 용출한 후 300g로 5분간 원심분리하여 CAM 용액을 제조하고, 각 용액의 주사 가능 여부를 분석하였다. 상기에서 멸균은 25~40 kGy을 나타내는 VDmax25의 감마선을 조사하여 수행하였다.
그 결과, 도 1 및 3가지 수용화 온도 조건(4℃, 25℃, 37℃) 에서 6시간 동안 제조한 CAM 용액을 도시한 도 2에서와 같이 미멸균 CAM-WS 스폰지의 원재료로는 주사 가능한 CAM 용액을 제조할 수 없었으며, 멸균 CAM-WS 분말 및 멸균 CAM-WS 스폰지 원재료에서 제조할 경우 37℃의 수용화 온도 조건에서 주사 가능한 형태의 CAM 용액이 제조됨을 확인하였다.
실시예 2. 주사 가능 멸균 조건 확인
멸균 후에도 주사 가능한 형태의 CAM 용액 제조공정을 확보하기 위해, 멸균 CAM-WS 스폰지를 이용하여 3가지 수용화 온도 조건(30℃, 33℃, 35℃) 그리고 2가지 수용화 시간 조건(6시간 동안 용출, 18시간 동안 용출)으로 CAM 용액을 제조하고, 15~25 kGy를 나타내는 VDmax15의 E-beam을 조사하여 멸균한 후 주사 가능 여부를 분석하였다.
그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 30℃에서 CAM 용액이 제조될 경우 멸균 전후 모두 주사가 어려움을 확인하였고, 33℃ 및 35℃에서 CAM 용액이 제조될 경우 멸균 전후 모두 주사 가능함을 확인하였다.
이를 통해, 30℃가 넘는 온도 조건에서 수용화하는 단계를 포함하여 CAM 용액을 제조하는 경우, 제조된 CAM 용액이 멸균에 대한 안정성을 가지는 것을 확인하였다.
상기 실시예 2의 결과로부터 멸균 후에도 주사 가능한 형태의 CAM 용액 제조공정을 확보하고, 상기 제조공정의 대표예를 도 4에 도시하였다.
실시예 3. 주사 가능 공정에서의 멸균 전후 콜라겐 함량 확인
도 4의 공정으로 제조된 멸균 전후의 CAM 용액 내 단백질을 SDS-page로 확인하였다.
그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 미멸균 상태의 CAM 용액은 약 130kDa 전후에 해당하는 콜라겐 타입 2 알파체인 단백질을 주로 함유함을 확인할 수 있으며, VDmax15의 E-beam 멸균 공정 후 미미한 감소는 있으나 주 함유 단백질에는 변함이 없음을 확인하였다.
이를 통해, 주사 가능한 제형으로 CAM 용액을 제조하는 공정으로서 수용화 최적 온도는 30℃ 초과 및 55℃ 미만, 최적 시간은 24 시간 미만으로 선정하였다.
실시예 4. 수용화 공정 조건에 따른 콜라겐 함량 확인
수용화 공정 조건에 의한 콜라겐 함량의 차이를 확인하기 위해, 멸균 CAM-WS 스폰지를 2가지 수용화 온도 조건(37℃, 55℃) 그리고 2가지 수용화 시간 조건(6시간, 24시간)에서 교반배양기로 용출한 후 300g로 5분간 원심분리하여 CAM 용액을 제조하고, 각 용액의 콜라겐 함량을 확인하였다.
그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 6시간 및 24시간 수용화 조건에서 수용화 온도 37℃(37℃ 및 6시간 조건에서 138.3 μg/㎎, 37℃ 및 24시간 조건에서 117.7 μg/㎎)에 비해 55℃(55℃ 및 6시간 조건에서 87.3 μg/㎎, 55℃ 및 24시간 조건에서 61.8 μg/㎎)에서 낮게 측정되어, 수용화 시간이 24시간 이상, 수용화 온도가 55℃ 이상인 경우 콜라겐 함량이 낮아지는 것을 확인하였다.
실시예 5. 수용화 공정 조건에 따른 연골 분화능 비교
상기 실시예 4와 동일한 수용화 조건으로 제조된 CAM 용액을 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 분화 배지에 첨가하여 2주간 연골세포 분화를 유도한 후 세포를 Safranin-O 염색을 통해 관찰하였다.
그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 분화 배지에 37℃ 및 6 시간 수용화 공정으로 제조된 CAM 용액 첨가시 줄기세포에서 연골세포로의 분화가 유도되었다. 반면, 37℃ 및 24 시간, 55℃ 및 6 시간 그리고 55℃ 및 24 시간 조건에서 수용화된 CAM 용액은 분화 배지에 첨가시 연골세포로의 분화가 유도되지 않았다.
상기 결과로부터 알 수 있듯이 앞선 실시예에서 도출한 공정을 통해 제조된 주사제가 연골 분화 효능을 가지는 바, 골관절염 치료제로 사용하기 적합함을 확인하였다.
실시예 6. 연골 재생능 증진 효과
상기 실시예 4와 동일한 수용화 조건으로 제조된 CAM 용액의 연골 재생능 증진 효과를 확인하기 위해, 랫트 전십자인대 절단술로 유도된 골관절염 모델을 제작하였다.
구체적으로, 순화기간 중 검역상 이상이 없다고 판정된 랫드 65수를 대상으로 ketamine 20mg/kg(Yuhan Corp., Seoul, Korea)과 xylazine 3mg/kg(Rompun; Bayer Korea Corp., Seoul, Korea)을 혼합하여 복강주사하여 마취하였다. 각 개체의 우측 슬관절 및 경골근위부의 털을 제모기를 이용하여 제모하고 betadine으로 소독한 후, 슬관절 내측부위에서 경골 결절 부위(medial parapatellar approach)를 중심으로 종으로 약 1cm를 절개하였다. 절개된 부위 아래로 관절낭을 노출시켜 절개하고, 슬개골을 외측방향으로 위치시킨 후 무릎을 굽혀 전방십자인대와 반월판을 술야에 노출시켰다. Micro-scissor를 이용하여 전방십자인대의 중간 실질부위를 완전히 절개하고 앞당김검사(positive anterior drawer's test)를 통해 인대에 의한 경골지지가 느슨해진 것을 확인하였다. 그 다음, 흡수성 봉합사 4-0 Monosyn®(B. Braun Surgical SA, Rubi, Spain)를 사용하여 관절낭과 피하조직을 각각 연속봉합하고, 피부는 비흡수성봉합사 4-0 Nylon(Blue nylon, Ailee Co., Ltd., South Korea)를 사용하여 단순결절 봉합하였다. 상기의 수술 후 감염방지를 위하여 수술부위를 3~4일간 betadine으로 소독하고 세파졸린(세파졸®, ㈜이-글벳, Korea)를 1일 1회씩 3일간 100 mg/kg의 용량으로 근육주사 하였다. 모든 실험동물은 수술부위에 별도의 bandage 처리 없이 8주간 사육 케이지내에서 자유롭게 활동하도록 하였다.
상기와 같이 제작한 랫트 전십자인대 절단술로 유도된 골관절염 모델의 관절강내에 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(hUCB-MSC) 2.5x105 cells/군을 8주간 투여하거나(줄기세포 투여군), hUCB-MSC(2.5x105 cells/군)와 도 4의 공정으로 제조된 CAM 용액(2중량%, 1mg/군)을 함께 8주간 투여하였을 경우(줄기세포+CAM 용액 투여군)의 연골 조직 재생능을 확인하였다. 투여 8 주차에 연골 조직을 Safranin-O 염색을 통해 관찰하였다.
그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이 hUCB-MSC를 단독으로 처리한 줄기세포 투여군에 비해 hUCB-MSC를 CAM 용액과 혼합 투여한 군에서 연골 조직 재생능이 현저히 우수한 것을 확인하였다.
상기 실시예의 결과로부터, 본 발명에 따른 주사제는 돼지 연골유래 세포외기질 및 콜라겐을 함유하여 관절 연골 조직을 보호해주는 역할뿐 아니라 관절내 줄기세포를 연골세포로 분화하도록 유도하여 손상된 관절 조직을 재생할 수 있는 환경으로 자극하여 골관절염을 개선할 수 있는바, 관절염 치료제로 적용될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (9)
- a) 동물 연골유래 무세포 세포외기질(cartilage acellular marix; CAM)을 포함하는 조성물을 30℃ 초과 및 55℃ 미만의 온도에서 교반하여 수용화하는 단계; 및
b) 상기 a)의 수용액을 원심분리하고 용액을 수집하여 주사제 조성물을 제조하는 단계;를 포함하는, 골관절염의 예방 또는 치료용 주사제 조성물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 a) 단계는 24 시간 미만으로 수행되는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 동물 연골유래 CAM은 멸균된 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 제조된 주사제 조성물을 멸균하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 동물은 돼지인 것인, 방법.
- 제1항의 방법으로 제조된 골관절염의 예방 또는 치료용 주사제 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 주사제 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 콜라겐을 120 μg/㎎ 이상의 농도로 함유하는 것인, 주사제 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 주사제 조성물은 조직 수복 및 연골 조직 재생 효과가 있는 것인, 주사제 조성물.
- 제6항의 주사제 조성물을 개체의 관절강내에 투여하는 단계를 포함하는, 골관절염의 예방 또는 치료 방법.
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