KR20050014817A - 자가 섬유아세포를 이용한 치료 - Google Patents

자가 섬유아세포를 이용한 치료

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KR20050014817A
KR20050014817A KR10-2004-7018105A KR20047018105A KR20050014817A KR 20050014817 A KR20050014817 A KR 20050014817A KR 20047018105 A KR20047018105 A KR 20047018105A KR 20050014817 A KR20050014817 A KR 20050014817A
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muscle cells
muscle
autologous
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KR10-2004-7018105A
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올가 말코
윌리암케이.주니어. 보스
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아이솔라겐 테크놀로지스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 계대배양된 자가 섬유아세포 및 선택적으로 계대배양된 자가 근육 세포, 생분해성 무세포 매트릭스 성분 및/또는 생분해성 무세포 충진제를 함유하는 조성물을 제시한다. 또한, 본 발명은 이들 조성물을 제조하는 방법 및 요실금, 방광 요관 환류, 위식도 역류와 같은 질환을 치료하기 위하여 이들 조성물을 투여하는 장치와 방법을 제시한다.

Description

자가 섬유아세포를 이용한 치료{TREATMENTS WITH AUTOLOGOUS FIBROBLAST}
요실금은 미국 전역에서 극히 일반적인 질환이다. U.S. Department of Health and Human Service는 1996년에 13백만명의 미국인이 요실금을 앓고 있다고 보고하였다. 이 질환은 남성보다 여성에서 훨씬 빈번하게 발병한다. 15 내지 64세 의 전체 인구에서, 여성의 10-30% vs. 남성의 1.5-5%가 영향을 받는다. 양로원 거주자의 적어도 50%가 영향을 받는데, 이들 중에서 70%가 여성이다.
요실금은 해부학적, 생리학적 또는 병리적 요인에 기인할 수 있다. 급성의 일시적인 요실금은 출산, 제한된 움직임, 치료 부작용, 요로 감염에 의해 주로 발생한다. 만성 요실금은 선천성 기형, 방광 근육 약화, 폐쇄된 요도(예로써 양성 전립선 비대증 또는 종양에 기인), 뇌 또는 척수 손상, 신경 질환(예, 근위축성 측삭 경화증, 척추이분증 또는 다발성 경화증과 같은 선천적ㆍ후천적 질환), 골반상 근육 약화에 의해 주로 발생한다.
여러 유형의 요실금이 존재한다. 스트레스 요실금은 복부 압력을 증가시키는 신체 활동(예, 기침, 재채기 또는 웃음)동안 요실(urine loss)을 의미한다. 절박성요실금은 소변의 절박한 요구 및 비자발적 방광 수축으로 요실을 유발한다. 복합 요실금은 스트레스 요실금과 절박성 요실금을 동반한다. 일출성 요실금은 방광이 더 이상 소변을 저장할 수 없음에도 수축되지 않아 소변의 지속적인 적하(dribbling)를 유발한다. 이들 요실금 유형 중에서, 스트레스 요실금, 절박성 요실금, 복합 요실금이 90% 이상을 차지한다. 일출성 요실금은 척수의 상부에서 기원하는 신경 분포(nerve supply)에 영향을 주는 질환을 앓는 사람 및 양성 전립선 비대증을 앓는 노령 남성에서 좀더 빈번하게 발생한다.
요실금 문제는 요도에서 전형적으로 기원하고, 방광 경부에서 요도 괄약 기전의 불능에 주로 기인한다. 이런 불능으로 인하여, 소변 유출에 대한 저항이 비자발적 요실이 발생하는 수준까지 낮아진다.
방광 요관 역류는 소변 유출에 대한 불충분한 저항과 연관된 질환이다. 상기 질환은 방광으로부터 요관으로 소변의 부적절한 역류를 수반하는데, 이는 신장내 역류(intrarenal reflux)를 동반하고 역류성 신증(reflux nephropathy)에 의해 악화될 수 있다.
위식도 역류 질환(GERD)은 유사한 기전의 질환으로, 위 내용물이 식도로 역류한다. 위 내용물은 삼키기(swallowing) 동안을 제외하고 긴장된 수축 상태로 존재하는 하부 식도 괄약근의 작용을 통하여 위에 유지된다. GERD는 상기 괄약근이 기능적으로 불능하거나 간헐적으로 이완되거나 또는 교란될 때 발생한다. 방광으로부터 부적절한 소변 역류 및 음식물의 식도로의 부적절한 역류를 조절하는데 효과적인 방법은 요실금, 방관 요관 역류, GERD를 치료하는데 유용하다.
미국 특허 5,858,390, 5,665,372, 5,660,850, 5,591,444 및 공동-출원 미국 출원 09/678,047은 본원에 순전히 참조한다.
요약
본 발명은 조직 적합한 계대배양된 자가 섬유아세포와 근육 세포의 부유물을 주사하여 요실금, 방관 요관 역류, 식도 역류와 같은 질환을 치료하는 방법을 제시한다. 본 발명은 배양 배지에 존재하는 면역원성 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 섬유아세포와 근육 세포를 제공하는 방법을 제시한다. 또한, 본 발명은 자가 섬유아세포와 근육 세포를 함유하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 물성 개량제(bulking agent) 및/또는 생분해가능 무세포 매트릭스 성분을 추가로 함유할 수 있다. 이들 조성물은 요실금, 방관 요관 역류, 식도 역류와 같은 질환을 치료하기 위하여 개체에 주사될 수 있다. 이에 더하여, 본 발명은 이런 조성물을 주사하는 장치를 제시한다. 요도주위(periurethral) 또는 경요도(transurethral) 주사로 투여되는 조직 적합한 계대배양된 자가 섬유아세포와 근육 세포의 부유물은 요도에 압력을 증가시키고 요도강을 압축하여 소변 흐름에 대한 요도 저항을 강화시킴으로써 요실금을 완화시킬 수 있다. 유사하게, 요관구에 인접한 조직으로의 주사에 의해 투여되는 이들 세포의 부유물은 역류성 방광내 요관(refluxing intravesical ureter)에 대한 지지를 증가시켜 소변 역류에 저항을 제공함으로써 방관 요관 역류를 완화시킬 수 있다. GERD는 하부 식도 괄약근에 인접한 조직으로 세포 부유물을 주사하여 치료할 수 있다. 주사된 섬유아세포는 전형적으로, 개체로부터 취한 생검 견본의 배양액으로부터 유래된 섬유아세포(예, 진피 섬유아세포)이다. 근육 세포(예, 횡문근 세포) 역시 개체로부터 수득할 수 있다. 세포의 집중적인 세척으로, 세포 부유물의 개체 투여 직후에 면역원성을 나타내는 모든 혈청-유래된 단백질을 제거한다.
본 발명은 자가 세포가 요실금과 방관 요관 역류와 같은 질환을 치료하는 물성 개량제로써 이상적이고, 치료 수주전에 개체로부터 취한 생검 견본을 배양함으로써 이들 세포의 풍부한 공급을 달성할 수 있다는 발견에 기초한다. 또한, 본 발명은 개체 투여에 앞서, 배양된 자가 세포로부터 항원성 단백질을 제거함으로써 개체에서 원치않는 면역 반응(예, 염증성 면역 반응)을 피할 수 있다는 발견에 기초한다.
한 측면에서, 본 발명은 개체에서 질환, 장애 또는 결함의 결과로 퇴화된 조직을 회복시키는 조성물에 관한다. 상기 조성물은 계대배양된 자가 섬유아세포와 계대배양된 자가 근육 세포를 함유하고, 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다. 상기 질환, 장애 또는 결함은 요실금, 방광 요관(vesicoureteral) 역류 또는 위식도 역류와 연관될 수 있다. 자가 섬유아세포는 잇몸, 구개, 피부, 점막 고유판(lamina propria), 연결 조직, 골수 또는 지방 조직으로부터 유래될 수 있다. 자가 근육 세포는 횡문근 세포(예, 혀, 구개설근, 측두근, 가자미근, 비복근 또는 흉쇄유돌근으로부터 유래된 횡문근 세포)일 수 있다. 자가 근육 세포는 평활근 세포일 수 있다.
상기 조성물은 생분해성 무세포 매트릭스를 추가로 함유할 수 있는데, 섬유아세포와 근육 세포는 상기 매트릭스 내에서 통합된다. 상기 매트릭스는 섬유아세포 및 근육 세포와 병합이전에, 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 젤라틴, 폴리글리콜산, 장선(cat gut), 탈염된 골, 수산화인회석, 무기질 골에서 선택되는 한가지이상의 물질을 함유할 수 있다. 콜라겐은 예로써 I형 돼지 콜라겐 또는 Ⅲ형 돼지 콜라겐일 수 있다. 섬유아세포와 근육 세포는 매트릭스 내에서 통합되어 세포에 이용가능한 매트릭스내 공간을 실질적으로 보충할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 질환, 장애 또는 결함의 결과로 퇴화된 조직을 회복시키는 조성물을 제조하는 방법에 관한다. 상기 방법은 아래의 단계를 포함할 수 있다: (a) 개체로부터 섬유아세포-포함 조직의 생검을 제공하고; (b) 생검으로부터 자가 섬유아세포를 분리하고; (c) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 자가 섬유아세포를 생산하는 조건하에 자가 섬유아세포를 배양하고; (d) 상기 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 배양된 자가 섬유아세포를 노출시키고; (e) 개체로부터 근육 조직의 생검을 제공하고; (f) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 근육 세포를 생산하는 조건하에 근육 조직으로부터 자가 근육 세포를 배양하고; (g) 상기 근육 세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 배양된 자가 근육 세포를 노출시키고; (h) 상기 섬유아세포와 상기 근육 세포를 병합시킨다. 상기 질환, 장애 또는 결함은 요실금, 방광 요관 역류 또는 위식도 역류와 연관될 수 있다.
섬유아세포-포함 조직의 생검을 제공하는 단계는 개체의 잇몸, 구개, 피부, 점막 고유판, 연결 조직, 골수 또는 지방 조직의 생검을 제공하여 실시할 수 있다. 근육 조직의 생검을 제공하는 단계는 개체의 혀, 구개설근, 측두근, 가자미근, 비복근 또는 흉선유돌근의 생검을 제공하여 실시할 수 있다. 섬유아세포 또는 근육 세포의 배양은 (1) 대략 0.1% 내지 20% 사람이나 비-사람 혈청을 함유하는 배양 배지에서 배양, 이후 (2) 혈청없는 배양 배지에서 배양으로 달성할 수 있다. 섬유아세포 또는 근육 세포의 배양은 혈청없는 배지에서 배양으로 달성할 수 있다. 섬유아세포 또는 근육 세포의 배양은 마이코플라스마(mycoplasma)의 성장을 예방하는 한가지이상의 시제(reagent), 예를 들면 타일로신, 플라스모신, 마이코플라스마 제거제, 젠타마이신, 시프로플록사신, 알라트로플록사신, 아지트로마이신 또는 테트라사이클린을 함유하는 배지에서 실시할 수 있다. 섬유아세포 또는 근육 세포의 부유를 유도하는 조건은 단백분해 효소를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 질환, 장애 또는 결함의 결과로 퇴화된 조직을 회복시키는 조성물을 제조하는 방법에 관한다. 상기 방법은 아래의 단계를 포함할 수 있다: (a) 계대배양된 자가 섬유아세포와 계대배양된 자가 근육 세포를 제공하고; (b) 생분해성 무세포 매트릭스를 제공하고; (c) 상기 섬유아세포와 근육 세포를 상기 생분해성 무세포 매트릭스와 함께 배양하여 상기 섬유아세포와 근육 세포를 생분해성 무세포 매트릭스 내에서 통합시키고, 이런 배양은 조직을 회복하는 조성물을 유도하고, 이런 배양의 조건에서 조성물은 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다. 상기 질환, 장애 또는 결함은 요실금, 방광 요관 역류 또는 위식도 역류와 연관될 수 있다.
상기 생분해성 무세포 매트릭스는 섬유아세포 및 근육 세포의 부유물과 병합이전에, 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 젤라틴, 폴리글리콜산, 장선, 탈염된 골, 수산화인회석, 무기질 골에서 선택되는 한가지이상의 물질을 함유할 수 있다. 콜라겐은 소 콜라겐, I형 돼지 콜라겐 또는 Ⅲ형 돼지 콜라겐일 수 있다. 섬유아세포와 근육 세포는 배양이전에 병합될 수 있다. 섬유아세포와 근육 세포는 배양과 별개로 첨가될 수 있다. 대안으로, 배양은 (1) 대략 0.1% 내지 20% 사람이나 비-사람 혈청을 함유하는 배양 배지에서 배양, 이후 (2) 혈청없는 배양 배지에서 배양으로 달성할 수 있다. 배양은 혈청없는 배지에서 배양으로 달성할 수 있다. 섬유아세포와 근육 세포는 생분해성 무세포 매트릭스 내에서 통합되어 세포에 이용가능한 생분해성 무세포 매트릭스내 공간을 실질적으로 보충할 수 있다.
계대배양된 자가 섬유아세포 및 계대배양된 자가 근육 세포를 제공하는 단계는 아래의 단계를 포함할 수 있다: (a) 개체로부터 섬유아세포-포함 조직의 생검을 제공하고; (b) 생검으로부터 자가 섬유아세포를 분리하고; (c) 상기 섬유아세포를 배양하고; (d) 상기 섬유아세포를 부유시키고; (e) 개체로부터 근육 조직의 생검을 제공하고; (f) 상기 근육 조직으로부터 근육 세포를 분리하고; (g) 상기 근육 세포를 배양하고; (h) 상기 근육 세포를 부유시킨다. 섬유아세포-포함 조직의 생검을 제공하는 단계는 개체의 잇몸, 구개 또는 피부의 생검을 제공하여 실시할 수 있다. 근육 조직의 생검을 제공하는 단계는 개체의 혀, 구개설근, 측두근, 가자미근, 비복근 또는 흉선유돌근의 생검을 제공하여 실시할 수 있다. 섬유아세포 또는 근육 세포의 배양은 마이코플라스마(mycoplasma)의 성장을 예방하는 한가지이상의 시제, 예를 들면 타일로신, 마이코플라스마 제거제, 플라스모신, 젠타마이신, 시프로플록사신, 알라트로플록사신, 아지트로마이신 또는 테트라사이클린을 함유하는 배지에서 실시할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 조직을 회복시키는 방법에 관한다. 상기 방법은 아래의 단계를 포함할 수 있다: (a) 본 발명의 조성물을 제공하고; (b) 개체에서 조직 결함이나 조직 퇴행의 부위를 확인하고; (c) 상기 부위에 상기 조성물을 위치시켜 조직 결함이나 조직 퇴행을 회복시킨다. 조직 결함이나 조직 퇴행은 요실금, 방광 요관 역류 또는 위식도 역류를 유발할 수 있다. 자가 섬유아세포는 잇몸, 구개, 피부, 점막 고유판, 연결 조직, 골수 또는 지방 조직으로부터 유래될 수 있다. 자가 근육 세포는 혀, 구개설근, 측두근, 가자미근, 비복근 또는 흉쇄유돌근으로부터 유래될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 조직 결함을 회복시키는 방법에 관한다. 상기 방법은 아래의 단계를 포함할 수 있다: (a) (1) 계대배양된 자가 섬유아세포, (2) 계대배양된 자가 근육 세포, (3) 제약학적으로 수용가능한 담체를 함유하는 제약학적 조성물을 제공하고, 상기 제약학적 조성물은 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고; (b) 개체에서 요실금, 방관 요관 역류, 위식도 역류에서 선택되는 질환과 연관된 조직 결함이나 조직 퇴행의 부위를 확인하고; (c) 조직 결함이나 퇴행의 부위에 인접하여 상기 제약학적 조성물의 치료요법적 효과량을 주사하고, 상기 주사는 조직 결함이나 퇴행의 회복을 유도한다.
주사 단계는 요도강(urethral lumen)이 압축되도록 일정 부피의 제약학적 조성물을 요도 또는 요도에 인접한 조직에 주사하여 실행할 수 있다. 주사 단계는 요관구(ureteral orifice)가 압축되도록 일정 부피의 제약학적 조성물을 요관구에 인접한 조직에 주사하여 실행할 수 있다. 주사 단계는 식도가 압축되도록 일정 부피의 제약학적 조성물을 하부 식도 괄약근에 인접한 조직에 주사하여 실행할 수 있다.
제약학적 조성물을 제공하는 단계는 아래의 단계를 포함할 수 있다: (a) 개체로부터 섬유아세포-포함 조직의 생검을 제공하고; (b) 생검으로부터 섬유아세포를 분리하여 세포외 매트릭스 및 비-섬유아세포 세포가 실질적으로 존재하지 않는 섬유아세포를 제공하고; (c) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 섬유아세포를 생산하는 조건하에 상기 섬유아세포를 배양하고; (d) 상기 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 계대배양된 섬유아세포를 노출시키고; (e) 개체로부터 근육 조직 생검을 제공하고; (f) 상기 근육 조직으로부터 근육 세포를 분리하고; (g) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 근육 세포를 생산하는 조건하에 상기 근육 세포를 배양하고; (h) 상기 근육 세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 근육 세포를 노출시키고; (i) 섬유아세포 부유물과 근육 세포 부유물 및 제약학적으로 수용가능한 담체와 병합하여 제약학적 조성물을 형성한다.
섬유아세포-포함 조직의 생검은 개체의 잇몸, 구개 또는 피부로부터 취할 수 있다. 근육 조직 생검은 혀, 구개설근, 측두근, 가자미근, 비복근 또는 흉쇄유돌근으로부터 취할 수 있다. 섬유아세포 또는 근육 세포의 배양은 (1) 대략 0.1% 내지 20% 사람이나 비-사람 혈청을 함유하는 배양 배지에서 배양, 이후 (2) 혈청없는 배양 배지에서 배양으로 달성할 수 있다. 섬유아세포 또는 근육 세포의 배양은 혈청없는 배지에서 배양으로 달성할 수 있다. 섬유아세포 또는 근육 세포의 부유를 유도하는 조건은 단백분해 효소를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 개체에서 질환, 장애 또는 결함의 결과로 퇴화된 조직을 회복시키는 주사가능 조성물에 관한다. 상기 주사가능 조성물은 (a) 계대배양된 자가 섬유아세포와 계대배양된 자가 근육 세포, 상기 섬유아세포와 근육 세포는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고; (b) 생분해가능한 무세포 주사가능 충진제를 함유할 수 있다. 자가 섬유아세포는 개체의 잇몸, 구개, 피부, 점막 고유판, 연결 조직, 골수 또는 지방 조직으로부터 유래될 수 있다. 자가 근육 세포는 개체의 혀, 구개설근, 측두근, 가자미근, 비복근 또는 흉쇄유돌근으로부터 유래될 수 있다. 섬유아세포 및 근육 세포와 병합이전에 생분해성 무세포 주사가능 충진제는 (a) 자가 콜라겐 섬유의 주사가능 분산액; (b) 콜라겐; (c) 용해된 젤라틴; (d) 용해된 폴리글리콜산; (e) 용해된 장선; (f) 돼지 젤라틴 분말에서 선택되는 한가지이상의 물질 및 염화나트륨 용액과 혈장 분량에 분산된 아미노 카프로산을 포함할 수 있다. 주사가능 분산액에서 자가 콜라겐 섬유의 농도는 적어도 24 ㎎/㎖이다. 콜라겐은 소 콜라겐, 예를 들면 글루타르알데하이드와 교차-결합된 재구성된 소 콜라겐 섬유일 수 있다. 염화나트륨 용액과 혈청 분량의 비율은 용적당 1:1이다. 염화나트륨 용액은 용적당 0.9% 염화나트륨을 함유할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 질환, 장애 또는 결함의 결과로 퇴화된 조직을 회복시키는 주사가능 조성물을 제조하는 방법에 관한다. 상기 방법은 아래의 단계를 포함할 수 있다: (a) 계대배양된 자가 섬유아세포와 계대배양된 자가근육 세포를 제공하고, 상기 섬유아세포와 근육 세포는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고; (b) 생분해성 무세포 충진제를 제공하고; (c) 상기 계대배양된 자가 섬유아세포, 상기 계대배양된 자가 근육 세포, 상기 생분해성 무세포 충진제를 병합한다. 상기 질환, 장애 또는 결함은 요실금, 방광 요관 역류 또는 위식도 역류, 구강 점막의 결함, 구강 점막에 외상, 치주 질환, 당뇨병, 피부 궤양, 혈관내 울혈, 피부 상처 또는 피부 주름과 연관될 수 있다.
계대배양된 자가 섬유아세포와 계대배양된 자가 근육 세포를 제공하는 단계는 아래의 단계를 포함할 수 있다: (a) 개체로부터 섬유아세포-포함 조직의 생검을 제공하고; (b) 생검으로부터 자가 섬유아세포를 분리하고; (c) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 섬유아세포를 유도하는 조건하에 상기 자가 섬유아세포를 배양하고; (d) 상기 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 배양된 자가 섬유아세포를 노출시키고; (e) 개체로부터 근육 조직 생검을 제공하고; (f) 상기 근육 조직 생검으로부터 근육 세포를 분리하고; (g) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 근육 세포를 유도하는 조건하에 상기 근육 세포를 배양하고; (h) 상기 근육 세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 근육 세포를 노출시킨다.
섬유아세포-포함 조직의 생검을 제공하는 단계는 개체의 잇몸, 구개, 피부, 점막 고유판, 연결 조직, 골수 또는 지방 조직의 생검을 제공하여 실시할 수 있다. 근육 조직의 생검을 제공하는 단계는 개체의 혀, 구개설근, 측두근, 가자미근, 비복근 또는 흉선유돌근의 생검을 제공하여 실시할 수 있다. 섬유아세포 또는 근육세포의 배양은 (1) 대략 0.1% 내지 20% 사람이나 비-사람 혈청을 함유하는 배양 배지에서 배양, 이후 (2) 혈청없는 배양 배지에서 배양으로 달성할 수 있다. 섬유아세포 또는 근육 세포의 배양은 혈청없는 배지에서 배양으로 달성할 수 있다. 섬유아세포 또는 근육 세포의 배양은 마이코플라스마(mycoplasma)의 성장을 예방하는 시제, 예를 들면 타일로신, 플라스모신, 마이코플라스마 제거제, 젠타마이신, 시프로플록사신, 알라트로플록사신, 아지트로마이신 또는 테트라사이클린을 함유하는 배지에서 실시할 수 있다. 섬유아세포 또는 근육 세포의 부유를 유도하는 조건은 단백분해 효소를 포함할 수 있다.
생분해성 무세포 주사가능 충진제는 섬유아세포 및 근육 세포와 병합이전에 (a) 자가 콜라겐 섬유의 주사가능 분산액; (b) 콜라겐; (c) 용해된 젤라틴; (d) 용해된 폴리글리콜산; (e) 용해된 장선; (f) 돼지 젤라틴 분말에서 선택되는 한가지이상의 물질 및 염화나트륨 용액과 혈장 분량에 분산된 아미노 카프로산을 포함할 수 있다. 주사가능 분산액에서 자가 콜라겐 섬유의 농도는 적어도 24 ㎎/㎖이다. 콜라겐은 소 콜라겐, 예를 들면 글루타르알데하이드와 교차-결합된 재구성된 소 콜라겐 섬유일 수 있다. 염화나트륨 용액과 혈청 분량의 비율은 용적당 1:1이다. 염화나트륨 용액은 용적당 0.9% 염화나트륨을 함유할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 질환, 장애 또는 결함의 결과로 퇴화된 조직을 회복시키는 방법에 관한다. 상기 방법은 본 발명에 따른 주사가능 조성물의 효과량을 개체의 퇴화 부위에 주사하여 조직을 회복시키는 단계를 포함할 수 있다. 주사 단계는 요도강이 압축되도록 일정 부피의 제약학적 조성물을 요도 또는요도에 인접한 조직에 주사하여 실행할 수 있다. 주사 단계는 요관구가 압축되도록 일정 부피의 제약학적 조성물을 요관구에 인접한 조직에 주사하여 실행할 수 있다. 주사 단계는 식도가 압축되도록 일정 부피의 제약학적 조성물을 하부 식도 괄약근에 인접한 조직에 주사하여 실행할 수 있다.
생분해성 무세포 주사가능 충진제는 섬유아세포 및 근육 세포와 병합이전에 (a) 자가 콜라겐 섬유의 주사가능 분산액; (b) 콜라겐; (c) 용해된 젤라틴; (d) 용해된 폴리글리콜산; (e) 용해된 장선; (f) 돼지 젤라틴 분말에서 선택되는 한가지이상의 물질 및 염화나트륨 용액과 혈장 분량에 분산된 아미노 카프로산을 포함할 수 있다. 콜라겐은 소 콜라겐일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 질환, 장애 또는 결함의 결과로 퇴화된 조직을 회복시키는 방법에 관한다. 상기 방법은 아래의 단계를 포함할 수 있다: (a) 계대배양된 자가 섬유아세포를 개체의 조직 퇴행 부위에 주사하고, 상기 섬유아세포는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고; (b) 계대배양된 자가 근육 세포를 개체의 조직 결함 부위 또는 원하는 조직 증폭 부위에 주사하고, 상기 근육 세포는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고; (c) 생분해가능한 무세포 충진제를 상기 부위에 주사하고, 상기 충진제는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다. 각 주사 단계 (a)-(c)는 개체의 요도 또는 요도에 인접한 조직에 주사를 포함하고, 요도강의 압축을 유도할 수 있다. 각 주사 단계 (a)-(c)는 개체의 요관구에 인접한 조직에 주사를 포함하고, 요관구의 압축을 유도할 수 있다. 각 주사 단계 (a)-(c)는 개체의 하부 식도괄약근에 인접한 조직에 주사를 포함하고, 식도의 압축을 유도할 수 있다. 상기 질환, 장애 또는 결함은 구강 점막의 결함, 구강 점막에 외상, 치주 질환, 당뇨병, 피부 궤양, 혈관내 울혈, 피부 상처 또는 피부 주름을 포함할 수 있다.
자가 섬유아세포는 잇몸, 구개, 피부, 점막 고유판, 연결 조직, 골수 또는 지방 조직으로부터 유래될 수 있다. 자가 근육 세포는 혀, 구개설근, 측두근, 가자미근, 비복근 또는 흉쇄유돌근으로부터 유래될 수 있다. 섬유아세포와 근육 세포는 동시에 주사될 수 있다. 섬유아세포, 근육 세포, 생분해성 무세포 충진제는 동시에 주사될 수 있다. 섬유아세포와 근육 세포는 개별적으로 주사될 수 있다. 섬유아세포와 근육 세포는 생분해성 무세포 충진제와 개별적으로 주사될 수 있다. 섬유아세포와 근육 세포를 개체에 투여하는 주사 단계 및 생분해성 무세포 충진제를 개체에 주사하는 단계 사이의 기간은 대략 2주이다.
생분해성 무세포 주사가능 충진제는 섬유아세포 및 근육 세포와 병합이전에 (a) 자가 콜라겐 섬유의 주사가능 분산액; (b) 콜라겐; (c) 용해된 젤라틴; (d) 용해된 폴리글리콜산; (e) 용해된 장선; (f) 돼지 젤라틴 분말에서 선택되는 한가지이상의 물질 및 염화나트륨 용액과 혈장 분량에 분산된 아미노 카프로산을 포함할 수 있다. 주사가능 분산액에서 자가 콜라겐 섬유의 농도는 적어도 24 ㎎/㎖이다. 콜라겐은 소 콜라겐, 예를 들면 글루타르알데하이드와 교차-결합된 재구성된 소 콜라겐 섬유일 수 있다. 염화나트륨 용액과 혈청 분량의 비율은 용적당 1:1이다. 염화나트륨 용액은 용적당 0.9% 염화나트륨을 함유할 수 있다. 계대배양된 자가 섬유아세포 및 계대배양된 자가 근육 세포 대 생분해가능 무세포 충진제의 비율은 용적당 대략 1:1이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 질환, 장애 또는 결함의 결과로 퇴화된 조직을 회복시키는 장치에 관한다. 상기 장치는 (a) 주사기 챔버, 여기에 배치된 피스톤, 상기 챔버와 소통하는 구멍을 보유하는 피하 주사기; (b) 계대배양된 자가 섬유아세포, 계대배양된 근육 세포, 제약학적으로 수용가능한 담체를 함유하는 부유물을 포함하고, 상기 부유물은 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고 상기 챔버 내에 배치된다.
달리 명시하지 않는 경우에, 본 명세서에서 모든 기술적, 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 널리 인식되는 의미를 갖는다. 본원에 기술된 바와 유사하거나 동등한 방법과 재료를 이용하여 본 발명을 실시할 수 있긴 하지만, 적절한 방법과 재료는 후술한다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 참고문헌은 본원에 순전히 참조한다. 상충하는 경우에, 정의를 비롯한 본 발명의 명세서가 우선한다. 이에 더하여, 본원에 기술된 재료, 방법, 실시예는 설명을 목적으로 할 뿐 본 발명을 제한하지 않는다.
본 발명의 한가지이상 구체예에 관한 세부적 내용은 하기 상세한 설명에서 제시한다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 이점은 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백하다.
본 발명은 요실금, 방광 요관(vesicoureteral) 역류, 위식도 역류의 치료에 관한다.
본 발명은 요실금, 방관 요관 역류, 식도 역류와 같은 질환을 치료하는 방법을 제시한다. 이들 발명은 조직 적합한 계대배양된 자가 섬유아세포를 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 상기 조성물은 근육 세포(예, 조직적합성 또는 자가 근육 세포)를 함유하고, 생분해성 물성 개량제(예, 생분해성 무세포 충진제) 및/또는 생분해가능 무세포 매트릭스 성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명은 배양 배지에 존재하는 면역원성 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 주사가능 세포를 제공하는 방법을 제시한다. 이에 더하여, 본 발명은 요실금, 방관 요관 역류, 식도 역류와 같은 질환을 앓는 개체에 투여용으로 자가 섬유아세포를 함유하고, 근육 세포, 생분해성 무세포 매트릭스 성분 및/또는 물성 개량제를 함유하거나 함유하지 않는 조성물을 제시한다. 더 나아가, 본 발명은 이런 조성물을 제조하는 방법 및 주사하는 장치를 제시한다.
1. 자가 섬유아세포를 함유하는 조성물
본 발명은 요실금, 방관 요관 역류, 식도 역류와 같은 질환을 치료하는데 유용한 조성물을 제시한다. 본 발명의 조성물은 면역원성 단백질(예, 배양 배지 혈청-유래된 단백질)이 실질적으로 존재하지 않는 계대배양된 자가 섬유아세포를 함유한다. 본 명세서에서 "자가"는 공여자로부터 이전되어 수용자에 투여되며 공여자와 수용자가 동일한 개체인 세포를 의미한다. 본 명세서에서, "배야 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는" 세포(예, 계대배양된 자가 섬유아세포)는 세포를 둘러싸며 이들 세포를 병합하는 유체가 이들 세포가 배양되는 조직 배양 배지에 포함되는 이종 또는 동종 혈청을 0.1% 미만(예, 0.05% 미만, 0.01% 미만, 0.005% 미만, 또는 0.001% 미만)으로 함유하는 세포이다. 유사하게, "배야 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는" 조성물은 상기 조성물에서 세포를둘러싸는 유체가 이들 세포가 배양되는 조직 배양 배지에 포함되는 이종 또는 동종 혈청을 0.1% 미만(예, 0.05% 미만, 0.01% 미만, 0.005% 미만, 또는 0.001% 미만)으로 함유하는 조성물이다.
섬유아세포는 임의의 포유동물 종(예, 사람, 사람아닌 영장류, 개, 소, 말, 돼지, 양, 고양이, 토끼, 생쥐, 쥐, 기니 피그, 햄스터 또는 게르빌루스 쥐로부터 유래될 수 있는데, 이들 세포는 자가이다. 자가 사람 섬유아세포가 특히 유용하다. 동물이 동종 번식하고 동일 기원(예, 쥐 및 생쥐와 같은 동물의 동일한 실험 계통에서처럼)이면, "자가"는 동일 종의 다른 개체로부터 유래됨을 의미할 수 있다.
조성물은 배양으로 확대될 수 있는 미분화된 중간엽 세포를 함유할 수 있다. 진피 조직으로부터 분리된 섬유아세포가 특히 유용한데, 그 이유는 이들이 수득하고 증폭하기 용이하고 요도 괄약근, 요관구, 하부 식도 괄약근에 인접한 조직에 정상적으로 존재하는 세포형이기 때문이다. 자가 진피 섬유아세포는 예로써 개체의 잇몸, 구개 또는 피부의 생검으로부터 수득할 수 있다. 진피는 상피 바로 아래에 위치하고, 전형적으로 0.5 내지 3 ㎜ 두께를 갖는다. 진피의 주요 세포 구성요소는 섬유아세포와 대식세포이지만, 지방 세포와 근육 섬유 역시 존재할 수 있다. 진피 이외에, 섬유아세포는 제한없이 근막(fascia), 점막 고유판, 모망의 모근 부위, 골수, 또는 임의의 연결 조직원으로부터 수득할 수 있다. 이에 더하여, 섬유아세포는 미분화된 중간엽 세포로부터 유래될 수 있다. 당분야에 공지된 방법을 비롯하여 미분화된 중간엽 세포를 배양하고 분화시키는데 적합한 임의의 방법을 이용할 수 있다.
이식 전문의와 면역학자에게 잘 알려진 동종이식편 거부반응으로 인하여, 배양된 섬유아세포는 수용체와 조직 적합해야 한다. 조직적합성은 치료되는 개체로부터 생검을 수득함으로써 담보할 수 있다. 하지만, 이런 세포는 개체의 동일한 쌍둥이로부터, 또는 개체와 주요 조직적합성 복합체(MHC)에서 동일한 개체로부터 수득할 수도 있다. 생검 견본으로부터 섬유아세포는 생성된 세포에서 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않도록 배양할 수 있는데, 이는 개체에서 원치않는 면역 반응을 활성화시키는 세포 능력을 감소시킨다. 본 발명의 조성물을 발생시키기 위하여, 섬유아세포 배양은 조직 퇴행(예, 요실금, 방관 요관 역류 또는 GERD)을 앓는 개체의 잇몸, 구개 또는 피부의 진피 생검 견본의 전층(full thickness)(예, 1-5 ㎜, 또는 충분한 조직이 가용한 경우 5 ㎜ 초과)으로부터 시작할 수 있다. 이런 생검 견본은 예로써 펀치 생검 과정을 이용하여 수득할 수 있다. 진피 또는 점막 고유판의 생검 역시 자가 섬유아세포를 수득하는데 특히 유용하다. 피부 생검은 예로써 귀 뒤 피부로부터 취할 수 있다.
배양의 시작에 앞서, 생검은 항생제와 항진균제로 반복적으로 세척할 수 있다. 적절한 "세척 배지"는 예로써 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)과 같은 조직 배양 배지 및 아래 약물의 전체 또는 일부: 젠타마이신, 암포테리신 B (Fungizone®), 마이코플라스마 제거제(MRA; Dianippon Pharmaceutical Company, Japan), 플라스모신(plasmocin), 타일로신(예로써 Serva, Heidelberg, Germany로부터 입수 가능)을 함유할 수 있다. 젠타마이신은 1O 내지 100 ㎍/㎖(예, 25 내지 75 ㎍/㎖, 또는 대략 5O ㎍/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 암포테리신 B는 0.5 내지12.5 ㎍/㎖(예, 1.0 내지 10.0 ㎍/㎖, 또는 대략 2.5 ㎍/㎖) 농도로 사용될 수 있다. MRA는 0.1 내지 1.5 ㎍/㎖(예, 0.25 내지 1.0 ㎍/㎖, 또는 대략 0.5 ㎍/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 플라스모신은 1 내지 50 ㎍/㎖(예, 10 내지 40 ㎍/㎖, 또는 대략 25 ㎍/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 타일로신은 0.012 내지 1.2 ㎎/㎖(예, 0.06 내지 0.6 ㎎/㎖, 또는 대략 0.12 ㎎/㎖) 농도로 사용될 수 있다.
원하는 경우, 무균 현미경적 절개를 이용하여 각화된 조직-포함 진피와 피하 지방세포-포함 피하 조직으로부터 생검에서 진피 조직을 분리할 수 있다. 이후, 생검 견본은 조직을 잘게 절단하는 외과용 메스 또는 가위를 이용하여 작은 조각으로 분리할 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 작은 조직 조각은 프로테아제(예, 콜라게나제, 트립신, 키모트립신, 파파인 또는 키모파파인)로 분해시킨다. 200-1000 U/㎖의 Ⅱ형 콜라게나제로 30분 내지 24시간동안 분해가 특히 유용하다. 효소 분해를 이용하는 경우, 세포는 원심분리로 수거하고 조직 배양 플라스크에 도말할 수 있다.
조직을 효소 분해하지 않으면, 잘게 절단된 조직 조각은 조직 배양 플라스크의 건조 표면에 개별적으로 위치시키고 대략 2 내지 10분동안 부착되도록 방치한다. 부착된 조작 단편이 이탈하지 않도록 소량의 배지를 천천히 첨가한다. 분해된 세포의 경우에, 이들 세포는 배양 배지에 부유시키고 하나이상의 플라스크에 위치시킬 수 있다. 대략 48-72시간 배양이후, 플라스크는 추가의 배지를 공급할 수 있다. 배양을 시작하는데 T-25 플라스크를 이용하는 경우, 배지의 초기량은 전형적으로 대략 1.5-2.0 ㎖이다. 생검 견본으로부터 세포주의 확립은 대략 2-3주가 소요될수 있는데, 이 시점에서 세포는 증폭을 위하여 최초 배양 용기로부터 이전될 수 있다.
초기 배양 단계동안, 조직 단편은 배양 용기 바닥에 부착된 상태로 유지시키는 것이 바람직하다. 이탈된 단편은 새로운 용기로 재이식할 수 있다. 이들 섬유아세포는 표준 기술에 EDTA-트립신에 짧은 노출로 성장을 자극할 수 있다. 트립신에 대한 이런 노출은 배양 용기 벽에 부착으로부터 섬유아세포를 방출시키지 않도록 짧게 실시한다. 배양액이 확립되고 합류 수준에 근접한 직후에, 섬유아세포 시료는 예로써 액체 질소에서 동결 보관을 위하여 가공할 수 있다. 추후 사용을 위하여 세포를 성공적으로 동결시키는 분야에 공지된 다양한 방법을 비롯하여 세포를 동결하는데 적절한 임의의 방법을 이용할 수 있다. 후기보다는 초기 계대배양 섬유아세포의 동결과 보관이 바람직한데, 그 이유는 정상적인 세포 배양액에서 사람 섬유아세포의 계대배양 횟수가 제한되기 때문이다.
섬유아세포는 섬유아세포를 보관하는데 적합한 임의의 동결 배지(예, 임의의 상업적으로 가용한 동결 배지)에서 동결할 수 있다. 대략 70%(v/v) 성장 배지, 대략 20%(v/v) 소 태아 혈청(FBS), 대략 10%(v/v) 디메틸설폭사이드(DMSO)로 구성되는 배지가 특히 유용하다. DMSO는 예로써 글리세롤로 대체될 수도 있다. 해동된 세포를 이용하여 동일 개체에서 추후 사용되는 추가 부유물의 제조를 위한 2차 배양을 시작함으로써 2차 견본을 수득하는 불편함을 덜 수 있다.
생검 견본으로부터 진피 섬유아세포의 증식에 적합한 임의의 조직 배양 기술을 이용하여 세포를 증폭할 수 있다. 유용한 기술은 예로써 R.I. Freshney, Ed.,Animal Cell Culture: A Practical Approach, (IRL Press, Oxford, England, 1986) 및 R.I. Freshney, Ed., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, (Alan R. Liss & Co., New York, 1987)에서 발견할 수 있다.
세포 배양 배지는 일차 섬유아세포 배양액의 성장에 적합한 임의의 배지일 수 있다. 배지는 사람이나 비-사람 혈청(예, 자가 사람 혈청, 비-자가 사람 A/B 혈청, 말 혈청, 또는 소 태아 혈청(FBS))으로 보충하여 섬유아세포의 성장을 조장할 수 있다. 배지에 포함된 혈청은 전형적으로 대략 0.1% 내지 20% v/v(예, 0.5% 내지 19%, 1% 내지 15%, 또는 5% 내지 12%) 양으로 존재한다. 좀더 높은 농도의 혈청을 사용하여 섬유아세포의 좀더 빠른 성장을 조장할 수도 있다. 특히 유용한 배지는 대략 2 mM 글루타민, 대략 10 ㎎/ℓ 소디움 피루베이트, 대략 10%(v/v) FBS, 항생제로 보충된 글루코오스 DMEM(종종, "완전 배지")을 함유하는데, 여기서 글루코오스의 농도 범위는 대략 1,000 ㎎/ℓ 내지 4,500 ㎎/ℓ이다. 섬유아세포는 혈청-없는 배지에서 증폭될 수도 있다. 이런 방식으로, 섬유아세포는 이종 또는 동종 혈청 단백질에 절대 노출되지 않고, 비-자가 혈청을 함유하는 배지에서 섬유아세포가 증폭되는 경우에 실행되는 혈청-없는 배지에서 추가 배양을 요하지 않는다.
섬유아세포를 배양하는데 사용되는 성장 배지는 예로써 박테리아, 진균, 효모, 마이코플라스마에 의한 배양액의 오염을 예방하는 항생제로 보충할 수 있다. 마이코플라스마 오염은 조직 배양에서 빈번하게 발생하는 문제점이다. 마이코플라스마 오염을 예방 또는 최소화하기 위하여, 타일로신과 같은 약물을 배양 성장 배지에 첨가할 수 있다. 배지는 한가지이상의 항생제/항진균제(예, 젠타마이신, 시프로플록사신, 알라트로플록사신, 아지트로마이신, MRA, 플라스모신, 테트라사이클린)로 추가로 보충할 수 있다. 타일로신은 0.006 내지 0.6 ㎎/㎖(예, 0.01 내지 0.1 ㎎/㎖, 또는 대략 0.06 ㎎/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 젠타마이신은 0.01 내지 0.1 ㎎/㎖(예, 0.03 내지 0.08 ㎎/㎖, 또는 대략 0.05 ㎎/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 시프로플록사신은 0.002 내지 0.05 ㎎/㎖(예, 0.005 내지 0.03 ㎎/㎖, 또는 대략 0.01 ㎎/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 알라트로플록사신은 0.2 내지 5.0 ㎍/㎖(예, 0.5 내지 3.0 ㎍/㎖, 또는 대략 1.0 ㎍/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 아지트로마이신은 0.002 내지 0.05 ㎎/㎖(예, 0.005 내지 0.03 ㎎/㎖, 또는 대략 0.01 ㎎/㎖) 농도로 사용될 수 있다. MRA는 0.1 내지 1.5 ㎍/㎖(예, 0.2 내지 1.O ㎍/㎖, 또는 대략 0.75 ㎍/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 플라스모신은 1 내지 50 ㎍/㎖(예, 10 내지 40 ㎍/㎖, 또는 대략 25 ㎍/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 테트라사이클린은 0.004 내지 0.1 ㎎/㎖(예, 0.008 내지 0.05 ㎎/㎖, 또는 대략 0.02 ㎎/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 이들 항생제는 전체 배양 기간 동안 또는 일부 배양 기간 동안 존재할 수 있다.
마이코플라스마 오염은 예로써 bioMerieux(Marcy I'Etiole, France)로부터 입수가능한 마이코플라스마 아가 평판과 같은 장치를 이용한 아가 배양 방법으로 분석하거나 기업(in house)에서 PCR로 제조할 수 있다. American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA) 역시 PCR "Mycoplasma Detection Kit"를 시판하고 있다. 타일로신(0.06 ㎎/㎖), 젠타마이신(0.1 ㎎/㎖), 시프로플록사신(0.01 ㎎/㎖), 알라트로플록사신(1.0 ㎍/㎖), 아지트로마이신(0.01 ㎎/㎖), 테트라사이클린(0.02 ㎎/㎖)을 함유하는 배양 배지는 마이코플라스마 오염을 예방하는데 특히 유용하다. 마이크로플라스마 오염을 예방하는데 유용한 다른 약물은 4-옥소-퀴놀린 카르복실산(OQCA)의 유도체인데, 이는 ICN Pharmaceuticals, Inc.(Costa Mesa, CA)로부터 "마이코플라스마 제거제"로 구입가능하다. 상기 약물은 전형적으로 0.1 내지 2.5 ㎎/㎖(예, 0.2 내지 2.0 ㎎/㎖, 또는 0.5 ㎎/㎖)로 사용된다. 항생제 혼합물 또는 다른 약물은 시작이후 첫 2주동안 섬유아세포에 존재할 수 있다. 2주 배양이후, 항생제-함유 배지는 전형적으로 항생제-없는 배지로 교체된다. 충분한 수의 세포가 배양액에 존재하면(예, 세포가 70%-90% 합류되면), 이들은 마이코플라스마, 박테리아, 진균 오염을 검사할 수 있다. 감지가능한 오염이 없는 세포만 본 발명의 방법에 사용된다.
자가 섬유아세포는 트립신처리(trypsinization)로 새로운 플라스크에 계대배양할 수 있다. 증폭을 위하여, 개별 플라스크는 1:3 내지 1:5의 비율로 분할할 수 있다. 450 ㎠의 총 배양 면적(total culture area)을 보유하는 삼중 바닥 T-150 플라스크는 섬유아세포를 증폭하는데 적합하다. 삼중 바닥 T-150 플라스크는 세포의 크기에 따라, 예로써 대략 1x106내지 3x106세포로 접종할 수 있다. 이런 플라스크는 전형적으로 대략 8x106내지 1.0x107세포를 산출하는 능력을 갖는다. 대략 5-7일의 배양을 요하는 플라스크의 수용 능력에 도달하면, 성장 배지는 혈청-없는 배지로 교체할 수 있다. 이들 세포는 전형적으로, 적어도 4시간(예, 하룻밤동안 또는 대략 18시간)동안 대략 30℃ 내지 37.5℃에서 배양한다. 혈청-없는 배지에서 세포의 배양은 배양 배지에 첨가된 비-자가 혈청(예, FBS)로부터 유래된 단백질을 실질적으로 제거할 수 있는데, 이들 단백질은 개체에 주사되는 조성물에 존재하면 바람직하지 않은 면역 반응을 초래할 수 있다. 혈청-없는 배지는 예로써 대략 2 mM 글루타민으로 보충되고 대략 110 ㎎/ℓ소디움 피루베이트가 존재하거나 존재하지 않는 글루코오스 DMEM을 함유하는데, 여기서 글루코오스의 농도 범위는 대략 1,000 ㎎/ℓ 내지 4,500 ㎎/ℓ이다. 대략 4,500 ㎎/ℓ의 글루코오스 농도가 특히 유용하다. 혈청-없는 배지는 전술한 항생제중 한가지이상을 함유할 수도 있다.
혈청-없는 배지에서 배양의 종결 시점에서, 이들 세포는 예로써 트립신-EDTA를 사용하여 조직 배양 플라스크로부터 제거할 수 있다. 개체 투여에 앞서, 섬유아세포는 전형적으로, 혈청과 페놀 레드가 존재하지 않는 배지, 또는 식염수에서 2 내지 4회 세척한다. 세포는 원심분리와 재부유로 세척하고, 이후 적절한 생리 몰삼투압농도(osmolarity)를 보유하고 발열원과 외래 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 동등 부피의 주사가능 등장성 용액에서 주사용으로 부유시킬 수 있다. 등장성 식염수는 특히 유용한 등장성 용액이다. 수용 능력까지 성장된 5개의 삼중 바닥 T-150 플라스크는 대략 1.2 ㎖ 내지 1.4 ㎖ 부유물을 구성할 만큼 충분한 대략 3.5x107내지 7x107세포를 산출할 수 있다. 이후, 제약학적으로 수용가능한 담체를 계대배양된 자가 섬유아세포에 첨가하여 제약학적 조성물을 형성할 수 있다. 본 명세서에서 "제약학적으로 수용가능한"은 세포에 유해하지 않고 생리학적으로 관용되며 알레르기 반응이나 유사한 의도하지 반응, 예를 들면 위 역류, 졸음 등을 유발하지 않는 분자 부분과 조성물을 의미한다. 이들 조성물은 다양한 완충 내용물(예, Tris-HCI, 아세테이트, 포스페이트), pH, 이온 강도의 생리학적으로 수용가능한 희석제를 함유한다.
투여에 앞서, 섬유아세포는 활성화 화합물, 예를 들면 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 리놀레산, C-Med 100®(Optigene-XLLC, Shrewsbury, NJ), CoEnzyme Q-10, 글리콜산, L-하이드록시산, L-리포산, 칼슘 모노포스페이트, 또는 다른 촉진 첨가제, 예를 들면 성장 인자와 함께 배양할 수 있다. 이런 화합물과의 배양은 섬유아세포를 자극하고 이들의 콜라겐 생산을 강화시킬 수 있다. 한가지이상의 활성화 화합물 역시 계대배양된 자가 섬유아세포를 함유하는 화합물과 함께 개체에 투여될 수 있다. 대안으로, 계대배양된 섬유아세포의 부재하에 활성화 화합물의 투여를 이용하여 생체내에서 섬유아세포를 자극할 수 있다.
즉시 투여할 필요가 없는 섬유아세포는 최대 24-48시간동안 대략 4℃에서 얼음 위에서 배양할 수 있다. 세포는 적절한 몰삼투압농도를 보유하는 생리 용액에 부유시키고 발열원과 내독소 수준을 검사할 수 있다. 이런 용액은 전형적으로 페놀 레드 pH 지시약을 함유하지 않고, 혈청은 FBS 또는 다른 이종 혈청보다는 개체의 혈청이다. 섬유아세포는 예로써 5% 덱스트로스를 함유하는 Krebs-Ringer 용액, 또는 임의의 다른 생리 용액(예, 생리 식염수)에 부유시킬 수 있다. 세포는 흡기하고 배양 배지에 녹여 개체에 투여할 수 있다. 세포가 부유되는 식염수 또는 배양 배지의 부피는 전형적으로, 주사되는 섬유아세포의 수 및 조직 손상이나 결함으로 인한 손상의 정도에 연관한다.
또한, 임의의 다른 적합한 방법을 이용하여 계대배양된 자가 섬유아세포를 함유하는 조성물을 제조할 수도 있다(U.S. Patent No. 5,858,390; 5,665,372; 5,660,850; 5,591,444; WO 99/60951).
2. 섬유아세포와 근육 세포를 함유하는 조성물
본 발명의 조성물은 계대배양된 근육 세포와 함께, 계대배양된 자가 섬유아세포를 함유할 수 있다. 근육 세포는 자가 또는 비-자가(예, 다른 개체 또는 세포주로부터 유래됨)일 수 있지만, 자가 근육 세포가 특히 유용하다. 근육 세포는 횡문근 세포 또는 평활근 세포일 수 있다. 자가 횡문근 세포는 예로써 머리(예, 혀, 구개설근 또는 측두근), 목, 몸통(예, 흉쇄유동근), 또는 사지(예, 가자미근 또는 비복근)로부터 근육 조직의 생검에서 분리할 수 있다. 자가 근육 생검은 전형적으로, 접근이 용이하지만 미용적 견지에서 눈에 잘 띄지 않는 부위로부터 수득된다. 평활근 세포는 전형적으로 비-자가이고, 예로써 장기(예, 심장) 이식 공여자의 동맥 생검으로부터 분리될 수 있다. 비-자가 근육 세포는 근육 세포주로부터 분리될 수도 있다. 이런 세포는 예로써 ATCC 및 Clonetics Corp.(San Diego, CA)로부터 구입할 수 있다. 대안으로, 근육 세포는 예로써 진피 생검으로부터 분리된 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 당분야에 공지된 방법을 비롯하여 줄기 세포를 배양하고 분화시키는데 적합한 임의의 방법을 이용할 수 있다.
계대배양된 근육 세포의 부유물을 준비하기 위하여, 자가 또는 비-자가 근육 조직은 근육 생검으로부터 수득할 수 있다. 시료는 전형적으로 대략 0.5-1.0 ㎤ 크기 및 대략 0.5-1 g 중량을 보유한다. 조직은 예로써 자가 섬유아세포 배양액을 산출하는 생검 과정에서와 동일한 항생제를 함유하는 배양 배지에서 부드러운 교반으로 분리할 수 있다. 눈에 잘 띄는 연결 조직이나 지방 조직은 겸자로 떼어낼 수 있다. 남아있는 조직 시료는 좀더 작은 조각(예, 1 ㎜3보다 크지 않은 조각)으로 잘게 절단할 수 있다. 트립신에서 레이저 블레이드로 잘게 절단이 특히 유용하다. 잘게 절단된 부유물은 트립신/EDTA에서 부드럽게 교반하여 세포를 분리할 수 있는데, 이후 이들 세포는 새로운 플라스크 이동시키고 나머지 조직 조각은 남겨둔다. FBS를 첨가하여 트립신을 중화시킬 수 있다. 트립신처리 단계는 최대 3회, 또는 핑크색 조직 조각이 남지 않을 때까지 반복할 수 있고, 근육 세포는 원심분리로 수거할 수 있다. 근육 세포 및/또는 근육 조직(예, 생검 시료)은 배양된 섬유아세포에서 전술한 바와 같이 항생제와 항진균제를 함유하는 배지에서 광범위하게 세척할 수 있다.
근육 세포는 임의의 적절한 배지에서 배양할 수 있다. 사람 근육 성장 배지:조건 배지의 1:1 혼합물(HuGM/CM)이 특히 유용하다. HuGM/CM은 전형적으로 Ham's F10, 10% FBS, 5% FBS(규정되고 철로 보충됨; Hyclone, Logan, UT), 0.5% 병아리 배 추출물(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유한다. CM은 MRC-5 섬유아세포(예로써 ATCC로부터 입수가능)와 함께 배양으로 조절된 HuGM이다. 이종 혈청 단백질을 함유하지 않는 다른 유용한 배지(예, 혈청-없는 배지)는 자가 섬유아세포에서 전술한 바와 동일하다. 배양 배지는 또한, 자가 섬유아세포에서 전술한 바와 동일한 항생제를 함유할 수 있다.
근육 세포는 임의의 적절한 크기의 조직 배양 평판 또는 플라스크(예, 96-웰평판, 24-웰 평판, 12-웰 평판; 35 ㎜, 60 ㎜ 또는 100 ㎜ 접시; 또는 T-25, T-75, T-150 또는 T-500 플라스크)에 도말하고, 이들 세포가 대략 40% 합류되면 새로운 배지(예, 1:1 HuGM/CM)를 제공할 수 있다. 이후, 세포는 매 2 내지 3일 마다 성장 배지(예, HuGM)를 제공할 수 있다. 근육 세포가 대략 70 내지 80% 합류 수준에 도달하면, 이들 세포는 트립신처리하고 새로운 조직 배양 접시(예, 100 ㎜ 접시)에 5x105-10x105세포/접시로 접종할 수 있다. 접시는 전형적으로 계대배양이후 대략 20% 합류된다. 세포는 적절한 수가 달성될 때까지 증폭하고 계대배양할 수 있다. 세포는 전술한 바와 같이 박테리아, 진균, 효모 또는 마이코플라스마에 의한 오염을 모니터할 수 있다. 적절한 수의 근육 세포가 달성되면, 이들 세포는 2-18시간동안 혈청-없는 배지에서 배양하여 면역원성 단백질을 제거할 수 있다(다시 말하면, 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 세포를 제공할 수 있다). 투여에 앞서, 근육 세포는 전형적으로 혈청-없는 배지 또는 PBS에서 2 내지 4회 세척한다. Ca+2또는 Mg+2를 함유하지 않는 PBS가 특히 유용하다. 세포는 전형적으로 원심분리와 재부유로 세척하고, 이후 적절한 생리 몰삼투압농도(osmolarity)를 보유하고 발열원과 외래 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 동등 부피의 등장성 용액에서 주사용으로 부유시킨다. 등장성 식염수는 특히 유용한 등장성 용액이다.
개체에 투여하기에 앞서, 제약학적으로 수용가능한 담체를 근육 세포에 첨가할 수 있다. 대안으로, 즉시 투여할 필요가 없는 섬유아세포는 최대 24-48시간동안대략 4℃에서 얼음 위에서 배양할 수 있다. 이런 배양을 위하여, 세포는 적절한 몰삼투압농도를 보유하는 생리 용액에 부유시키고 발열원과 내독소 수준을 검사할 수 있다. 이런 용액은 전형적으로 페놀 레드 pH 지시약을 함유하지 않고, 혈청은 FBS 또는 다른 이종 혈청보다는 개체의 혈청이다. 근육 세포는 예로써 5% 덱스트로스를 함유하는 Krebs-Ringer 용액, 또는 임의의 다른 생리 용액에 부유시킬 수 있다. 세포는 흡기하고 배양 배지에 녹여 개체에 투여할 수 있다. 근육 세포가 부유되는 식염수 또는 배양 배지의 부피는 전형적으로, 주사되는 세포의 수 및 조직 손상이나 결함으로 인한 손상의 정도에 연관한다.
근육 세포는 추후 사용을 위하여 동결할 수 있다. 세포는 트립신처리하고 임의의 적절한 동결 배지(예, 90% 소 혈청과 10% DMSO를 함유하는 배지)에서 재부유시킬 수 있다. 이후, 근육 세포 부유물은 극저온 동결 바이알에 분량하고 액체 질소로 이전에 앞서 대략 -70℃ 내지 -86℃로 동결하거나, 액체 질소 동결-보존 단위에서 동결시킬 수 있다. 세포는 해동하고, 이들 해동된 세포는 동일 개체에서 추후 사용되는 추가 부유물의 제조를 위한 2차 배양을 시작하는데 사용하여 2차 견본을 수득하는 불편함을 덜 수 있다.
본 발명은 개체에서 조직 결함을 회복하거나 보강하는 조성물을 제조하는 방법을 제시한다. 전형적으로, 이들 방법은 진피 생검을 수득하고 면역원성 단백질(예, 배양 배지 혈청-유래된 단백질)이 실질적으로 존재하지 않는 계대배양된 자가 섬유아세포의 부유물을 준비하며, 근육 생검을 수득하고 면역원성 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 계대배양된 자가 근육 세포의 부유물을 준비하며, 상기 섬유아세포와 상기 근육 세포를 병합하여 요실금, 방관 요관 역류 또는 식도 역류와 같은 질환을 치료하는데 사용될 수 있는 조성물을 산출하는 단계를 포함한다. 대안으로, 비-자가 근육 세포의 부유물을 준비하고, 이를 섬유아세포와 병합할 수도 있다.
3. 생분해성 무세포 매트릭스 성분을 함유하는 조성물
계대배양된 자가 섬유아세포를 함유하고 계대배양된 근육 세포를 함유하거나 함유하지 않는 본 발명의 조성물은 생분해성 무세포 매트릭스 성분을 함유할 수도 있다. 이들 조성물은 퇴화된 조직을 회복시키기 위한 개체로의 주사 또는 이식에 적합하다. 본 명세서에서 "생분해성"은 생리학적으로 무해하고 자연 주효체(예, 날씨, 토양 박테리아, 식물, 동물)에 의해 화학적으로 분해될 수 있는 조성물을 의미한다. 본 발명에 사용될 수 있는 매트릭스의 예에는 자가와 비-자가 단백질을 함유하는 무세포 매트릭스, 생분해성 중합체를 함유하는 무세포 매트릭스 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
비-자가 단백질을 함유하는 다양한 생분해성 무세포 매트릭스가 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 생분해성 무세포 매트릭스의 예에는 임의 유형의 콜라겐, 또는 예로써 글루타르알데하이드로 교차-결합된 글리코사미노글리칸(GAG)을 보유하는 임의 유형의 콜라겐을 함유하는 매트릭스가 포함된다. 유용한 생분해성 무세포 매트릭스를 제조할 수 있는 다른 물질에는 히알루론, 히알루론산, 레스탈린, 파를레안(parleane) 등이 포함된다. 콜라겐을 함유하는 매트릭스에는 흡수가능 콜라겐 스펀지, 콜라겐 막, 골 해면질(bone spongiosa) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 유용한 유형의 콜라겐에는 예로써 소 콜라겐(예, Zyderm® 과Zyplast®, McGhan Medical Corporation, Santa Barbara, CA), 돼지 콜라겐, 사람 시체 콜라겐(예, FascianTM(Fascia Biosystems, LLC, Beverly Hills, CA), Cymetra(LifeCell Corp., Branchburg, NJ), DermalogenTM(Collagenesis Corp.), 자가 사람 콜라겐(Autologen®,) 등이 포함된다. FascianTM이 특히 유용하다. 상기 산물은 5가지 상이한 입자 크기로 가용한데, 이들은 본 발명의 조성물과 방법에 사용될 수 있다. 0.25 ㎜ 크기의 입자가 특히 유용하다.
흡수가능 콜라겐 스펀지는 예로써 Sulzer Calcitek, Inc.(Carlsbad, CA)로부터 구입할 수 있다. CollaTape®, CollaCote®, CollaPlug®의 상표로 판매되는 이들 콜라겐 스펀지 드레싱은 소 심부 굴근(Achilles) 힘줄과 GAG로부터 추출된 교차-결합된 콜라겐으로부터 만들어진다. 이들 산물은 부드럽고 유연하며 부서지지 않고 비-발열성이다. 콜라겐 스펀지의 90% 이상은 전형적으로 개방 구멍으로 구성된다.
생분해성 무세포 매트릭스는 예로써 박막으로 형성되는 콜라겐(예, I형 소 또는 돼지 콜라겐)을 함유할 수 있다. 이런 한가지 막은 Sulzer Calcitek에 의해 제조되고 BioMendTM으로 시판되고 있다. 다른 막 매트릭스는 Geistlich Sohne AG (Wolhusen, Switzerland)에 의해 Bio-Gide®로 시판되고 있고, I형과 Ⅱ형 돼지 콜라겐으로 구성된다. Bio-Gide®은 이중층 구조를 갖는데, 한 표면은 다공성이고 세포의 내생을 가능하게 하며, 다른 표면은 밀집되고 섬유성 조직의 내생을 차단한다.
생분해성 무세포 매트릭스는 과립이나 블록으로 형성된 골 해면질로부터 만들어질 수 있다. 상기 물질은 실질적으로 모든 유기 물질(예, 단백질, 지질, 핵산, 탄수화물 및 소형 유기 분자, 예를 들면 비타민과 비-단백질 호르몬)이 제거된 동물(예, 사람, 사람아닌 영장류, 소, 양, 돼지 또는 염소) 골로 구성된다. 이런 유형의 매트릭스는 "무기질 매트릭스"라고 한다. 이런 한가지 매트릭스는 Geistlich Sohne AG에 의해 Bio-Oss® 해면질 과립과 Bio-Oss® 블록으로 시판되고 있다. Geistlich Sohne AG에서는 무기질 골을 함유하고 대략 10wt% 콜라겐 섬유를 추가로 함유하는 블록-형 매트릭스(Bio-Oss® 콜라겐)를 또한 제조한다.
다른 유용한 생분해성 무세포 매트릭스는 젤라틴, 폴리글리콜산, 장선, 탈염된 골, 무기질 골 또는 수산화인회석, 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 탈염된 사람 골로부터 만들어진 매트릭스는 예로써 소형 블록으로 형성되고, GenSci Regeneration Laboratories, Inc.(Toronto, Ontario)에 의해 DynaGrafto®로 시판되고 있다. 탈염된 골은 예로써 콜라겐과 혼합하여 스펀지, 블록 또는 막 형태의 매트릭스를 생산할 수 있다. 또한, 하나이상의 단량체로부터 만들어진 합성 중합체를 사용하여 본 발명에 유용한 생분해성 무세포 매트릭스를 만들 수 있다. 이들 매트릭스는 한가지이상의 이들 합성 중합체로부터 만들어질 수 있다. 합성 중합체는 임의의 전술한 물질중 한가지와 혼합하여 매트릭스를 형성할 수도 있다. 단일 매트릭스를 형성하는 서로 다른 중합체는 개별 구획이나 층에 존재할 수 있다. 가령, W. L. Gore & Associates, Inc.(Flagstaff, AZ)에서는 다공성 생분해성 무세포 매트릭스(GORE RESOLUT XT Regenerative Material)를 제조한다. 상기 매트릭스는 세포가 이동할 수 있는 합성 생흡수가능 글리콜리드와 트리메틸렌 카보네이트 공중합체 섬유로 구성되고, 세포의 내생을 허용하지 않는 합성 생흡수가능 글리콜리드와 락티드 공중합체로 구성되는 폐쇄성 막에 부착된다.
생분해성 무세포 매트릭스가 선택되면, 계대배양된 근육 세포를 함유하거나 함유하지 않는 계대배양된 자가 섬유아세포의 농축된 부유물은 매트릭스의 표면에 균일하게 분산될 수 있다. 전형적으로, 농축 부유물은 액체 부유물을 흡수하는 매트릭스의 능력 초과를 피하기 위하여 사용된다. 가령, GORE RESOLUT XT 매트릭스에 적용되는 세포 부유물은 대략 94 ㎕ 내지 125 ㎕의 부피를 보유하고, 매트릭스 제곱 센티미터당 대략 2.Ox106내지 4.0x106세포를 함유할 수 있다. 세포는 배지의 추가 첨가없이 매트릭스에 부착될 수 있다. 매트릭스와 함께 세포의 배양은 예로써 대략 37℃에서 1-2시간동안 진행될 수 있다. 전형적으로, 세포는 대략 60분 배양이후 전체 매트릭스에 부착되고 균일하게 분산된다. 이 시점에서, 세포-적하된 매트릭스를 보유하는 배양 용기는 추가의 성장 배지로 보충할 수 있고, 세포는 매트릭스에서 3 내지 4일동안 배양할 수 있다. 매트릭스 내에 공간을 실질적으로 보충하기 위하여 세포가 높은 밀도로 매트릭스에 부착되기 때문에, 3-4일 배양 기간 동안에는 증식이 발생하지 않는다. 실제로, 이 기간 동안 상당수의 세포 개체군이 바람직하지 않은데, 그 이유는 분열하는 섬유아세포가 매트릭스를 분해하거나 부분적으로 분해하는 효소(예, 콜라게나제)를 분비할 수 있기 때문이다.
전형적으로, 세포를 포함하는 매트릭스는 개체에 투여되면 면역 반응을 유발할 수 있는 면역원성 단백질(예, 비-자가 혈청을 함유하는 배지가 매트릭스 접종 단계에 사용되는 경우에 배양 배지 혈청-유래된 단백질)을 실질적으로 제거하기 위하여, 예로써 혈청과 페놀 레드가 존재하지 않는 식염수 또는 배지로 세척(예, 각 10분의 적어도 3회 세척)한다. 각 세척에 새로 만든 PBS를 사용할 수 있다. 이후, 매트릭스는 사용에 앞서 새로 만든 PBS에서 배양(예, 2시간 배양)할 수 있다. 배양이후, 계대배양된 자가 섬유아세포를 함유하고 계대배양된 근육 세포를 함유하거나 함유하지 않는 매트릭스는 조직 퇴행이나 결함 부위에 위치시킬 수 있다.
콜라겐 스펀지 매트릭스(예. CollaCote®)의 경우에, 대략 1.5 ㎖ 성장 배지에서 1.5x107내지 2.Ox107세포를 2 ㎝ x 4 ㎝ 얇은(대략 2.5 내지 3.0 ㎜ 두께) 스펀지에 접종할 수 있다. 이후, 스펀지는 배지의 추가없이 37℃에서 대략 1-2시간동안 배양하여, 거의 모든 섬유아세포가 매트릭스 물질에 부착될 수 있도록 한다. 세포 부착이후, 성장 배지를 매트릭스와 세포 조성물에 추가로 첨가하고, 이후 배지를 매일 변화시키면서 37℃에서 3-4일동안 배양할 수 있다. 비-자가 혈청을 함유하는 배지가 세포 접종 단계에 사용되면, 조성물은 이런 혈청을 함유하는 성장 배지로부터 이전하고 PBS로 반복적으로(예, 3회 이상) 세척할 수 있다. 최종 세척이후, 조성물은 개체에 직접 투여하거나, 또는 생리 용액(예, Kreb 링거 용액)을 포함하는 바이알에 이전하고 대략 4℃에서 최대 24-48시간동안 배양할 수 있다.
막 매트릭스(예, BioMendTM)의 경우에, 대략 100 ㎕ 성장 배지에서 3x106내지 8x106섬유아세포를 15 ㎜ x 20 ㎜ 얇은(대략 0.5 내지 1.0 ㎜ 두께) 막에 접종할 수 있다. 막은 배지의 추가없이 37℃에서 대략 30-60분동안 배양하여, 거의 모든 섬유아세포가 매트릭스 물질에 부착될 수 있도록 한다. 세포 부착이후, 성장 배지를 매트릭스와 세포 조성물에 추가로 첨가하고, 이후 배지를 매일 변화시키면서 37℃에서 2-3일동안 배양할 수 있다. 전형적으로, 이들 세포는 높은 밀도로 매트릭스에 첨가하여, 매트릭스 내에서 세포에 이용가능한 공간을 실질적으로 보충한다. 조성물의 세척 및 즉시 사용 또는 배양은 스펀지 매트릭스에서 전술한 바와 동일하다.
상기한 무기질 매트릭스(예, Bio-Oss® 블록) 또는 탈염된 골 매트릭스(예, DynagraftTM매트릭스)와 같은 블록 매트릭스의 경우에, 대략 100 내지 150 ㎕ 성장 배지에서 1.2x107내지 2.0x107세포를 1 ㎝ x 1 ㎝ x 2 ㎝ 입방 블록의 매트릭스 물질에 접종할 수 있다. 전형적으로, 세포는 블록 표면의 한 면에 서서히 접종한다. 배지와 세포가 블록에 흡수되면, 블록의 다른 면을 유사한 방식으로 접종할 수 있다. 이런 과정은 블록의 모든 면이 접종되고 블록이 배지로 완전히 포화될 때까지 반복할 수 있다. 과도한 배지가 첨가되어 블록으로부터 배지와 세포가 누출되지 않도록 주의한다. 이후, 조성물은 배지의 추가없이 37℃에서 대략 60-120분동안 배양하여, 거의 모든 섬유아세포가 매트릭스 물질에 부착될 수 있도록 한다. 세포 부착이후, 성장 배지를 매트릭스와 세포 조성물에 추가로 첨가하고, 이후 배지를 매일 변화시키면서 37℃에서 2-3일동안 배양할 수 있다. 전형적으로, 이들 세포는 높은 밀도로 매트릭스에 첨가하여, 전술한 바와 같이 매트릭스 내에서 세포에 이용가능한 공간을 실질적으로 보충한다. 조성물의 세척 및 즉시 사용 또는 배양은 스펀지 매트릭스에서 전술한 바와 동일하다.
계대배양된 자가 섬유아세포 및 소형 입자 생분해성 매트릭스(예, FascianTM, CymetraTM또는 DermalogenTM)를 함유하는 조성물은 흐름 방지 장치(luer lock)를 통하여 연결된 2개의 주사기 사이에서 이들 성분을 전후로 이동시켜 혼합함으로써 제조할 수 있다. 가령, FascianTM은 주사기(예, 3 cc 주사기)에서 80 ㎎/주사기로 가용하다. FascianTM입자는 소량(예, 1.5 ㎖)의 세척 완충액(예, 덱스트로스를 함유하는 등장성 식염수 또는 Kreb 링거 용액)을 주사기에 집어넣고, 흐름 방지 장치를 통하여 제 1 주사기를 제 2 주사기로 연결하며, 입자와 세척 용액을 두 주사기 사이에서 수회 전후로 이동시킴으로써 사용에 앞서 주사기에서 직접 세척할 수 있다. 입자를 세척 용액으로부터 분리하기 위하여, 상기 혼합물은 무균 튜브로 이전하고 FascianTM입자를 가라앉힌다. 용액은 제거하고(예, 흡기하거나 따라버린다), 세척 과정은 입자를 새로운 주사기로 집어넣어(예, 18 게이지 또는 20 게이지 바늘을 통하여) 원하는 만큼 반복할 수 있다.
충진제 입자는 적절히 세척한 이후, 세척에서와 동일한 과정을 이용하여 섬유아세포 및 선택적으로 근육 세포와 혼합할 수 있다. 세포(예, 1x107내지 3x107세포)는 용액(예, 5% 덱스트로스를 함유하는 1.5 ㎖ Kreb 링거 용액)에 부유시키고주사기에 집어넣을 수 있다. 세포를 포함하는 주사기는 흐름 방지 장치를 통하여 충진제 입자를 포함하는 주사기와 연결할 수 있고, 이들 두 성분은 주사기 사이에서 전후로 이동시켜 혼합할 수 있다. 이후, 혼합물은 T-25 조직 배양 플라스크, 조직 배양 접시 또는 튜브에 이전하여 이들 세포가 충진제 입자에 부착할 수 있도록 한다. 대안으로, 혼합물은 부착이 진행되는 동안 주사기에 유지시킬 수도 있지만, 이는 세포에 좀더 유해할 수 있다. 혼합물은 하룻밤동안 배양하고, 이후 의사에게 전달될 용기에 이전하거나 개체에 투여될 주사기에 이전할 수 있다. 의사에게 전달되는 용기는 전달 동안 얼음에 보관한다. 이런 소형 입자 무세포 생분해성 매트릭스가 사용되면, 세포-포함 입자의 부유물은 조직 퇴행이나 결함 부위에 이식되기 보다는 선택적으로 주사될 수 있다.
배양된 근육 세포가 섬유아세포와 생분해성 무세포 매트릭스를 함유하는 조성물에 포함되는 경우, 이들 근육 세포는 매트릭스 접종에 앞서 섬유아세포와 혼합될 수 있다. 대안으로, 이들 근육 세포는 섬유아세포의 접종에 앞서 또는 접종 이후에 매트릭스에 접종될 수 있다. 근육 세포가 섬유아세포보다 이전에 또는 이후에 접종되는 경우, 2차 접종은 1차 접종 직후에 또는 1차 접종의 세포가 매트릭스 물질에 현저하게 부착된 이후에 실시할 수 있다.
또한, 본 발명은 매트릭스 성분과 함께, 계대배양된 자가 섬유아세포를 함유하는 조성물을 제조하는 방법을 제시한다. 전형적으로, 이들 방법은 면역원성 단백질(예, 배양 배지 혈청-유래된 단백질)이 실질적으로 존재하지 않는 계대배양된 자가 섬유아세포의 부유물을 제공하고, 생분해성 무세포 매트릭스를 제공하며, 상기생분해성 무세포 매트릭스와 상기 섬유아세포 부유물을 함께 배양하여 섬유아세포가 매트릭스 내에 통합되도록 하고 조직을 회복시키거나 보강하는 조성물을 형성하는 단계를 포함한다. 이들 방법은 섬유아세포와 함께 또는 섬유아세포와 별도로, 계대배양된 근육 세포(예, 계대배양된 자가 근육 세포)의 부유물을 첨가하는 단계 역시 포함할 수 있다.
4. 물성 개량제를 함유하는 조성물
본 발명의 조성물은 한가지이상의 생분해성 무세포 주사가능 충진제 물질(즉, 물성 개량제)을 함유할 수 있다. 이들 조성물은 퇴화된 조직을 회복시키기 위한 개체로의 주사에 적합하다. 섬유아세포와 충진제 이외에, 조성물은 계대배양된 근육 세포(전형적으로, 자가 근육 세포) 역시 함유할 수 있다. 생분해성 무세포 충진제와 함께, 계대배양된 자가 섬유아세포를 함유하고 근육 세포를 함유하거나 함유하지 않는 주사가능 조성물에서, 세포는 전형적으로 용적당 대략 1:1 비율로 충진제와 혼합된다.
다양한 유형의 생분해성 무세포 주사가능 충진제를 본 발명의 조성물에 첨가할 수 있다. 충진제는 개체로부터 수득된 임의 유형의 콜라겐을 비롯한 자가 단백질로 구성될 수 있다. 이런 충진제의 예는 Collagenesis Corp.(Beverly, MA)에 의해 생산되는 Autologen®이다. Autologen®은 개체로부터 자가 진피 콜라겐 섬유의 분산액이고, 따라서 근육 세포 및/또는 섬유아세포와 함께 개체에 투여될 때 면역 반응을 유발하지 않는다. Autologen®을 수득하기 위하여, 개체로부터 수득된 조직(예, 진피, 태반 또는 제대) 견본은 Collagenesis Corp.,에 발송하는데, 여기서 콜라겐-풍부한 분산액으로 가공된다. 대략 1ㅍ 제곱 인치의 진피 조직은 1 입방 센티미터(cc)의 Autologen®을 산출할 수 있다. Autologen®의 농도는 개체 내에서 결함을 교정하거나 조직을 보강하는데 요구되는 함량에 따라 조정할 수 있다. 분산액에서 Autologen®의 농도는 예로써 적어도 25 ㎎/ℓ(예, 적어도 30 ㎎/ℓ, 적어도 40 ㎎/ℓ, 적어도 50 ㎎/ℓ 또는 적어도 100 ㎎/ℓ)일 수 있다.
무세포 주사가능 충진제 물질은 임의 유형의 콜라겐을 비롯한 비-자가 단백질 역시 함유할 수 있다. 다수의 콜라겐 산물이 상업적으로 입수가능하고 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 사람 콜라겐 산물 역시 상업적으로 입수가능하다. 상업적으로 입수가능한 콜라겐에는 글루타르알데하이드와 교차-결합되고, 0.3% 리도카인-함유 인산염 완충액에 부유되는 재구성된 소 콜라겐 섬유를 보유하는 재구성된 소 콜라겐 산물, 예를 들면 Zyderm®과 Zyplast®이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이들 산물은 McGhan Medical Corporation(Santa Barbara, CA)에 의해 생산된다. 돼지 콜라겐 산물 역시 상업적으로 입수가능하다.
다른 유용한 충진제의 예에는 용해된 젤라틴, 폴리글리콜산 또는 장선 봉합사가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 가령, 특정 젤라틴 매트릭스 이식물은 Fibril® 상표로 판매되고 있다. 상기 충진제는 동등 부피의 (1) 0.9%(용적당) 염화나트륨 용액에 분산된 돼지 젤라틴 분말과 o-아미노카프로산의 혼합물; (2) 개체로부터 혈장 분량을 함유한다. 충진제로 유용한 다른 물질은 히알루론, 히알루론산, 레스탈린, 파를레안 등이다.
또한, 본 발명은 계대배양된 자가 섬유아세포와 생분해성 무세포 충진제를함유하고 계대배양된 근육 세포를 함유하거나 함유하지 않는 조성물을 제조하는 방법을 제시한다. 전형적으로, 이들 방법은 면역원성 단백질(예, 배양 배지 혈청-유래된 단백질)이 실질적으로 존재하지 않는 계대배양된 자가 섬유아세포 및 선택적으로 근육 세포의 부유물을 제공하고, 한가지이상의 생분해성 무세포 충진제 물질을 제공하며, 상기 충전제를 상기 섬유아세포 및 근육 세포 부유물과 병합시키는 단계를 포함한다. 대안으로, 2가지 세포형의 개별 부유물을 충진제와 병합할 수도 있다.
5. 본 발명의 조성물을 투여하는 장치
또한, 본 발명은 계대배양된 자가 세포를 함유하는 조성물을 조직 퇴행이나 결함 부위(예, 요도, 요관구 또는 하부 식도 괄약근)에 인접한 지점에 전달하는 장치를 제시한다. 이런 장치는 주사기 챔버, 여기에 배치된 피스톤, 상기 챔버와 소통하는 구멍을 보유하는 피하 주사기 및 계대배양된 자가 섬유아세포를 함유하는 제약학적 조성물로 구성되고, 상기 제약학적 조성물은 상기 챔버 내에 위치한다. 제약학적 조성물은 계대배양된 자가 섬유아세포 및 아래의 성분중 한가지를 함유할 수 있다: 계대배양된 근육 세포(예, 계대배양된 자가 근육 세포), 제약학적으로 수용가능한 담체, 생분해성 무세포 충진제, 생분해성 무세포 매트릭스 성분. 피하 주사기는 적절한 크기(예, 1 cc, 3 cc, 10 cc 또는 10 cc 초과)의 수용 능력을 보유할 수 있다. 주사기는 또한, 적절한 크기(예, 14 게이지, 16 게이지, 18 게이지, 20 게이지, 23 게이지, 25 게이지, 27 게이지 또는 30 게이지)와 길이(예, 20 cm 미만, 20 cm, 25 cm, 30 cm, 35 cm, 40 cm 또는 40 cm 초과)를 갖는 바늘에 연결될수도 있다.
6. 조직을 회복하거나 보강하는 방법
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 조성물의 효과량을 투여하여 개체 내에서 조직을 회복하거나 보강하는데 이용될 수 있다. 본 명세서에서 "효과량"은 적절한 부피를 제공하여 개체에서 조직 결함을 교정하거나, 또는 개체에서 퇴화된 조직에서 조직 재생을 촉진할 수 있는 제약학적 조성물의 함량을 의미한다. 본 발명의 방법은 요실금, 방관 요관 역류 또는 GERD와 같은 질환과 연관된 조직 퇴행이나 결함을 치료하는 제약학적 조성물을 투여하는데 특히 유용하다.
전형적으로, 본 발명의 방법은 예로써 주사 또는 이식으로 본 발명의 한가지이상 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 계대배양된 자가 섬유아세포, 계대배양된 근육 세포(예, 계대배양된 자가 근육 세포), 충진제의 조합을 개체에 투여하는 경우, 이들 성분은 동시에 또는 개별적으로 투여될 수 있다. 가령, 계대배양된 자가 섬유아세포는 하나의 주사로 개체에 투여하고, 계대배양된 자가 근육 세포는 별도의 주사로 투여하며, 충진제 물질은 또 다른 주사로 투여할 수 있다. 이들 주사는 적절한 시간 간격(예, 5분, 30분, 1일, 3일, 1주, 2주 또는 2주 초과)으로 분리할 수 있다. 대안으로, 이들 성분은 주사에 앞서 병합할 수 있다. 가령, 계대배양된 자가 섬유아세포, 계대배양된 근육 세포, 충진제를 함유하는 조성물은 단일 주사로 투여할 수 있다. 대안으로, 계대배양된 자가 섬유아세포와 계대배양된 근육 세포의 혼합물은 하나의 주사로 투여하고, 충진제는 별도의 주사로 투여할 수 있다.
본 발명의 방법은 임의의 포유동물 종(예, 사람, 사람아닌 영장류, 개, 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 토끼, 생쥐, 쥐, 기니 피그, 햄스터 또는 게르빌루스 쥐)을 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 방법은 사람을 치료하는데 특히 유용하다.
본 발명의 방법은 요도, 요관, 식도를 둘러싸는 조직(예, 괄약근 구조)을 교정하거나 회복시켜 비정상적으로 팽창하고 흐트러진 내강의 크기를 감소시킴으로써 요실금 및/또는 방관 요관 역류를 치료하는데 이용될 수 있다. 이들 방법은 본 발명에 따른 조성물의 요도, 요관 또는 식도를 둘러싸는 부위로의 배치(예, 주사 또는 이식), 또는 회복되거나 보강되는 부위에 만들어진 포켓으로 본 발명에 따른 조성물의 직접적인 배치를 수반한다.
남성 요도는 전립선, 막양부, 음경으로 구분된다. 막양부는 요도에서 가장 두터운 부분이고, 비뇨기 격막을 통과한다. 막양부 요도의 골격 근육층은 외적(또는 자발적) 요도 괄약근을 보유하는데, 이는 요도 주변에 거의 완벽한 고리를 형성한다. 본 발명의 방법은 자가 섬유아세포를 함유하는 조성물을 요실금 개체에 투여(예, 요도 벽에 주사 또는 이식으로)하여 손상되거나 결함된 막양부 요도를 개선하는데 이용될 수 있다.
여성 요도는 대략 4 ㎝ 길이의 매우 짧은 팽창가능 관상 구조이다. 요도는 방광 출구에서 시작하고 샅막(perineal membrane)을 통하여 연장되며 치골 결합(pubic symphysis)이 부재하고 회음부의 외적 요관구에서 종결된다. 여성 요도는 방광에 대한 전체 괄약근 기전을 대표한다. 이는 내적으로 점막층으로 둘러싸여 있고, 이의 중심은 3가지 주요 근육 층으로 구성되는 강한 근육 벽이다. 중간층은 고리를 형성하는 밀집된 횡문근 섬유를 보유한다; 이들 근섬유가 부분적으로 불완전한 경우에 실금이 발생할 수 있다. 요도 기능은 요도 내에서 또는 인접한 장기, 예를 들면 질과 방광 내에서 해부학적 문제점에 의해 변화되거나 손상될 수 있다. 손상되거나 결함된 막양부 요도의 기능은 자가 섬유아세포 및 선택적으로 근육 세포(예, 자가 근육 세포)를 함유하는 조성물을 투여(예, 요도 벽에 주사 또는 주입)하는 본 발명의 방법을 이용하여 개선할 수 있다. 이들 조성물은 희석액(예, 식염수) 또는 생분해성 충진제 물질을 보유하는 부유물에 세포를 함유하거나, 또는 생분해성 무세포 매트릭스에 접종될 수 있다.
요관은 신장에서부터 방광까지 소변의 수송동안 신전 반사(stretch reflex)에 반응하여 수축하는 근육 도관(muscular conduit)이다. 원부 요관의 방광으로의 구멍은 요관 비도(ureteral meatus)라고 하는데, 기초 근육 및 방광 삼각부(vesical trigone)라고 하는 삼각 구조의 측면에서 방광 벽의 후외측 방향에 위치한다. 요관과 방광 삼각부의 근육조직은 연속되는데, 그 이유는 요관 근층(muscular coat)이 상기 비도를 통과하고 방광의 밑바닥에 퍼져있기 때문이다. 방광내 요관의 길이 및 표층 삼각부(superficial trigone)로 삽입되는 점막하 요관(submucosal ureter)의 고유 세로 근층은 원부 요관의 정상적인 기능에 극히 중요하다. 이들 인자는 요관구의 외형에 중요한데, 요관구가 변형된 외형을 갖는 경우 요관구의 이상위치, 짧아진 방광내 요관 부분, 역류의 경향이 증가한다.
요도 괄약근 또는 요관 근육조직의 기능을 향상시키는 과정은 선택적으로 국부 또는 전신 마취하에 실시할 수 있다. 요관 구조로 주사의 경우에, 방광경 검사(cystoscopy)는 전형적으로 통원 치료 또는 사무실 방문동안 실시할 수 있다. 방광경은 요도에 도입하고 이의 끝부분이 비정상적으로 팽창된 요도/요관 내강으로부터 적절한 가시 거리에 위치시킬 수 있다. 주사는 요도주위 또는 경요도로 실시할 수 있다.
요실금을 앓는 남성을 치료하기 위하여, 임의의 적절한 게이지와 길이의 바늘(예, 20 게이지 x 35 cm 바늘)은 방광경의 작업 채널을 통하여 도입하고 팽창된 내강으로부터 외부로 요도 주변 조직에 배향시키며 이들 조직으로 전진시킨다. 자가 섬유아세포 및 선택적으로 생분해성 무세포 충진제 또는 매트릭스를 함유하고 근육 세포(예, 자가 근육 세포)를 함유하거나 함유하지 않는 본 발명의 조성물은 내강이 원하는 수준으로 좁혀질 때까지 요도 주변 조직으로 주사할 수 있다.
요실금을 앓는 여성을 치료하기 위하여, 임의의 적절한 게이지와 길이의 바늘(예, 20 게이지 x 30 cm 바늘)은 요도주위로 삽입하고 방광경의 축에 의해 유도되는 바늘 배치의 배향으로 비스듬하게 아래로 지향시키며 방광 경부로 전진시킬 수 있다. 주변 점막 조직으로 이상적인 바늘 배치는 바늘에 연결된 주사기에 채워진 세포 개체군을 주사하기에 앞서, 방광경 시야로부터 관찰된 바늘의 부드러운 움직임으로 달성될 수 있다. 주사는 "3시 및/또는 9시 위치"에 실시될 수 있다. 내강의 좁혀짐은 주사가 완결될 때까지 방광경으로 지속적으로 모니터할 수 있다.
방관 요관 역류를 치료하기 위하여, 개체는 등쪽이나 변형된 쇄석위치(lithotomy position)로 눕히고, 방광경은 요관이 보일 때까지 삽입하고 전진시킬 수 있다. 대략 25 내지 40 cm 길이(예, 25 cm, 30 cm, 35 cm 또는 40 cm)의 바늘(예, 18 게이지 바늘, 20 게이지 바늘, 23 게이지 바늘, 25 게이지 바늘 또는 27 게이지 바늘)은 작업 채널을 통하여 전진시킬 수 있다. 바늘 끝부분은 요관구에서 대략 4 내지 6 ㎜ 이격된 요관하(subureteral) 공간으로 "6시 위치"에서 직시(direct vision)하에 방광 점막으로 삽입할 수 있다. 바늘의 적절한 배치는 French 카테터를 요관에 배치하여 용이하게 할 수 있다. 이후, 바늘은 가장 가까운 위치까지 진전시킬 수 있다. 자가 섬유아세포 및 선택적으로 생분해성 무세포 충진제 또는 매트릭스를 함유하고 근육 세포(예, 자가 근육 세포)를 함유하거나 함유하지 않는 조성물은 팽창으로 요관구가 폐쇄될 때까지 천천히 주사할 수 있다. 혈관외 유출(extravasation)을 예방하기 위하여 정확한 단일 주사를 실시하고, 바늘은 회수이전에 2 내지 3분동안 유지시킬 수 있다.
식도는 대략 8 인치 길이의 근육 도관으로, 인두에서부터 위로 연장된다. 식도의 상부와 하부 말단은 삼키기(swallowing)동안 닫힌 상태를 유지하는 괄약근 구조를 보유한다. 하부 식도 괄약근(LES)에서 결손은 위 내용물의 식도로의 역류를 유발하고 GERD를 초래한다.
LES의 기능을 개선하고 GERD의 증상을 완화시키기 위하여, 본 발명의 조성물은 식도 또는 LES 주위에 위치(예, 주사 또는 이식)시킬 수 있다. 내시경을 이용하여 LES를 관찰할 수 있는데, 임의의 적절한 크기와 길이의 바늘(예, 카테터에 부착된 23 게이지 x 25 cm 바늘, 또는 23 게이지 x 1.5 cm 바늘)이 내시경의 작업 채널을 통하여 삽입된다. 식도 내강 쪽으로 비스듬하게 내부를 지향하는 이들 바늘은 LES에 약간 인접한 식도 점막으로 삽입할 수 있다. 본 발명의 조성물은 점막에서원하는 팽창이 달성될 때까지 여러 위치(예, 3시, 6시, 9시, 12시 위치)에서 식도 벽에 주사할 수 있다.
또한, 본 발명은 진피, 피하, 근막 조직의 보강 및/또는 회복을 위하여 본 발명의 조성물을 투여하는 방법을 제시한다. 계대배양된 자가 섬유아세포를 함유하고 계대배양된 근육 세포, 매트릭스 성분 및/또는 충진제를 함유하거나 함유하지 않는 조성물은 흉터, 세포염(cellulite), 피부 이완이나 피부 얇아짐, 주름, 상처(예, 급성, 만성, 부분적 또는 전층 상처, 화상, 욕창, 궤양), 유방 결손, 치주 질환, 경구 점막의 결함, 경구 점막 손상, 당뇨병, 정맥내 저류, 탈장, 관절의 인대, 힘줄, 근육 손상, 탈모증을 치료하기 위하여 개체에 주사 또는 이식될 수 있다. 이들 질환을 치료하는 방법은 계대배양된 자가 섬유아세포 및 계대배양된 근육 세포(예, 계대배양된 자가 근육 세포)를 함유하는 조성물을 결손이나 결함 부위에 주사하는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 세포는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다.
본 발명은 아래의 실시예에서 더욱 구체적으로 기술하지만, 이들 실시예는 특허청구범위에서 기술된 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.
실시예 1: 주사가능 섬유아세포 부유물을 수득하는 방법
피부 섬유아세포 배양은 피부의 1-5 ㎜ 전층 생검 견본, 또는 조직이 가용한 경우 좀더 두터운 견본으로부터 시작하였다. 동종이식편 거부반응으로 인하여, 배양된 섬유아세포는 숙주와 조직이 접합하도록 해야 한다. 조직적합성은 치료되는개체로부터 생검을 수득하고 상기 견본으로부터 섬유아세포를 배양하여 담보하였다.
배양의 시작에 앞서, 생검은 항생제와 항진균제로 반복적으로 세척하였다. 표피와 피하 지방세포-포함 조직을 제거하여, 생성된 배양액에 비-섬유아세포 세포가 실질적으로 존재하지 않도록 하였다. 진피의 나머지 견본은 외과용 메스 또는 가위로 미세하게 절단하였다. 개별 조직 조각은 겸자로 T-25 조직 배양 플라스크의 건조 표면에 위치시키고 2 내지 5분동안, 또는 조직 및 실험실과 배양 후드 온도에 따라 요구되는 기간동안 부착시켰다. 부착된 조직 단편이 이탈되지 않도록 소량의 배지(일반적으로, 1.5 내지 2 ㎖)를 천천히 조심스럽게 첨가하였다. 48-72시간 배양이후, 플라스크는 표준 항생제를 함유하는 배지를 추가로 공급하였다. 세포는 항생제를 함유하는 배지에 14일동안 유지시키고, 이 시점에서부터 세포는 젠타마이신을 함유하는 항생제-없는 배지에서 배양하였다.
초기 배양 단계동안, 조직 단편은 배양 플라스크의 바닥에 부착된 상태로 유지시키는 것이 바람직하다; 이탈된 단편은 새로운 용기로 재이식하였다. 이들 섬유아세포는 EDTA/트립신에 짧은 노출로 성장을 자극할 수 있다. 이런 노출은 부착된 세포가 방출되지 않도록 짧게 실시한다. 이런 과정은 플라스크 표면에서 세포의 좀더 균등한 분포를 가능하게 하고, 합류 수준으로 좀더 신속한 증식을 촉진하였다. 배양액이 확립되고 합류 수준에 근접한 직후에, 섬유아세포 시료는 동결 보관을 위하여 이전하였다. 전형적으로, 사람 섬유아세포의 계대배양 횟수가 제한되기 때문에 초기 계대배양 섬유아세포의 보관이 바람직하다. 전형적으로, 동결 배지는 7-10% DMSO 및 20% 자가 혈청 또는 FBS를 함유하지만, 세포는 글리세롤 또는 90% 혈청에서 동결할 수도 있다.
세포가 합류되면, 이들 세포는 트립신처리(trypsinization)로 새로운 플라스크에 계대배양하였다. 증폭을 위하여, 개별 플라스크는 450 ㎠의 총 배양 면적을 보유하는 삼중 바닥 T-150 플라스크에 1:3 분할하였다. 이들 플라스크는 6x106세포로 접종하고 대략 1.8x107세포를 산출하였다. 플라스크의 수용 능력에 도달하면(전형적으로, 배양 7-10일후), 성장 배지는 혈청-없는 배지로 교체하였다. 이후, 이들 세포는 단백질-없는 배지에서 적어도 2시간(전형적으로, 12시간 초과)동안 37℃에서 배양하였다. 혈청-없는 배지에서 배양은 소 태아 혈청으로부터 유래된 단백질을 세포로부터 실질적으로 제거하였는데, 이들 단백질은 개체에서 면역원성을 보이고 알레르기 반응을 초래할 수 있다.
혈청-없는 배지에서 배양의 종결 시점에서, 이들 세포는 트립신/EDTA로 조직 배양 플라스크로부터 제거하고 원심분리와 재부유로 세척하며 동등 부피의 주사가능 등장성 용액에서 주사용으로 부유시켰다. 수용 능력까지 성장된 5 내지 10개의 삼중 바닥 T-150 플라스크는 1-3 ㎖ 부유물을 구성할 만큼 충분한 대략 3x107내지 1x108세포를 산출하였다.
대안으로, 이들 세포는 부유물이 제조되고 18시간 이내에 주사된다면 4℃에서 수송할 수도 있다. 세포는 동등 부피의 완전 배지에 부유시키는데, 페놀 레드pH 지시약이 부재하고 FBS가 개체의 혈청으로 대체된 점은 예외로 하였다. 이들 세포는 흡기하고 수송 배지에 주입하였다. 세포가 부유되는 식염수 또는 수송 배지의 부피는 중요하지 않았다.
실시예 2: 점성 부유물에서 주사가능 세포 개체군을 수득하는 방법
대량의 물성 개량제가 요구되는 경우에, 세포의 주사가능 부유물을 준비하는 대체 방법을 이용하였다. 상기 방법은 대략 106세포 개체군이 수득될 때까지 실시예 1에 기술된 방법과 동일하였다. 이후, 1 ㎖ 개체 혈장 및 50-100 ㎕의 300 mM CaCl2를 첨가하여 60 ㎜ 또는 100 ㎜ 조직 배양 접시의 바닥에 혈장 덩어리를 형성시켰다. 배양된 진피 섬유아세포(2-10 ㎖에서 106세포)는 혈장 덩어리의 표면에 접종하고 완전 배지에서 추가로 7일동안 배양하였다. 7일후, 완전 배지는 혈청-없는 배지로 교체하였다. 배지의 최초 교체이후 1시간 시점에, 배지는 다시 제거하고 새로운 혈청-없는 배지로 교체하였다. 세포는 추가로 14-18시간동안 배양하였다. 이후, 상기 덩어리는 주사기로 흡기하고 필요에 따라 주사하였다.
실시예 3: 근육 세포의 주사가능 부유물을 수득하는 방법
근육 생검을 실시하여 대략 0.5-1.0 ㎤ 크기 및 대략 0.5-1 g 중량을 보유하는 조직 시료를 수거한다. 이들 조직은 Ham's F10 배지에서 부드러운 교반으로 분리하고, 눈에 잘 띄는 연결 조직이나 지방 조직은 겸자로 떼어낸다. 남아있는 조직 시료는 100 ㎜ 접시에 담긴 5 ㎖ 트립신에 이전하고, 무균 레이저 블레이드를 이용하여 1 ㎜3보다 크지 않은 조각으로 잘게 절단한다. 이후, 잘게 절단된 부유물은 교반 막대가 달린 무균 플라스크에 이전하고 트립신/EDTA를 20-25 ㎖ 최종 부피로 첨가한다. 부유물은 37℃에서 20분동안 부드럽게 교반한다. 조직 조각이 플라스크의 바닥에 가라앉으면, 상층액은 얼음 위에서 50 ㎖ 플라스틱 원심분리 튜브로 이동시킨다. FBS를 10%의 최종 농도로 첨가하여 트립신을 중화시킨다. 트립신처리 단계는 최대 3회, 또는 핑크색 조직 조각이 남지 않을 때까지 반복한다. 상층액은 800-900 g에서 5분동안 원심분리한다.
세포 펠렛은 10 ㎖의 1:1 사람 근육 성장 배지/조건 배지(HuGM/CM)에 모은다. HuGM/CM은 Ham's F10, 10% FBS, 5% 소 태아 혈청(규정되고 철로 보충됨; Hyclone, Logan, UT), 0.5% 병아리 배 추출물(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유한다. CM은 MRC-5 섬유아세포(American Type Culture Collection, Manassas, VA)와 함께 하룻밤동안 배양으로 조절되고 0.45 ㎛ 필터로 여과된 HuGM이다. 각 0.1 g 조직은 전형적으로 5x103세포를 산출한다.
세포는 임의의 적절한 크기(예, 35 ㎜, 60 ㎜ 또는 100 ㎜)의 조직 배양 평판에 도말하고, 이들 세포가 30-40% 합류되면 1일이나 2일에 1:1 HuGM/CM을 제공한다. 그렇지 않으면, 세포는 4일이나 5일에, 또는 세포가 40% 합류에 도달할 때(둘중에 선행되는 시점) 1:1 HuGM/CM을 제공한다. 이후, 40% 이상으로 융합된 세포는 매 2 내지 3일 마다 HuGM을 제공하는데, 여기서 이들 세포는 1:1 HuGM/CM이 제공된다. 세포가 대략 70-80% 합류 수준에 도달하면, 이들 세포는 트립신처리하고 HuGM에 분산시키며 새로운 100 ㎜ 접시에 5-10x105세포/접시로 접종한다. 접시는 전형적으로 계대배양이후 대략 20% 합류된다. 세포는 적절한 수가 달성될 때까지 증폭하고 계대배양한다.
근육 세포는 추후 사용을 위하여 동결한다. 세포는 트립신처리하고 15 ㎖ 튜브에 수거한다. 세포 수는 혈구계산기로 측정하고, 세포는 800-900 g에서 2분동안 원심분리한다. 배지는 흡기하고, 세포는 동결 배지(90% 소 혈청, 10% 디메틸설폭사이드)에 재부유시켜 대략 2x106세포/㎖를 수득한다. 세포 부유물은 2 ㎖ 극저온 동결 바이알당 0.5 ㎖로 분량하고, 바이알은 액체 질소로 이전하기에 앞서 -70℃에서 거품-채워진 상자에서 동결한다.
다른 구체예
본 발명은 상세한 설명과 연계하여 기술하였지만, 상기한 명세서는 본 발명을 설명하며 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 이의 범위를 한정하지 않는다. 다른 특징, 이점, 개변은 아래의 특허청구범위의 범주에 포섭된다.

Claims (125)

  1. 개체에서 질환, 장애 또는 결함의 결과로 퇴화된 조직을 회복시키는 조성물에 있어서, 계대배양된 자가 섬유아세포와 계대배양된 자가 근육 세포를 함유하고 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 질환, 장애 또는 결함은 요실금, 방광 요관(vesicoureteral) 역류 또는 위식도 역류와 연관되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 자가 섬유아세포는 잇몸, 구개, 피부, 점막 고유판(lamina propria), 연결 조직, 골수 또는 지방 조직으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 자가 근육 세포는 횡문근 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 횡문근 세포는 혀, 구개설근, 측두근, 가자미근, 비복근 또는 흉쇄유돌근으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 자가 근육 세포는 평활근 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 조성물은 생분해성 무세포 매트릭스를 추가로 함유하고, 섬유아세포와 근육 세포는 상기 매트릭스 내에서 통합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 섬유아세포 및 근육 세포와 병합이전에 매트릭스는 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 젤라틴, 폴리글리콜산, 장선(cat gut), 탈염된 골, 수산화인회석, 무기질 골에서 선택되는 한가지이상의 물질을 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 글루타르알데하이드와 교차-결합된 콜라겐과 글리코사미노글리칸을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 콜라겐인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 콜라겐은 소 콜라겐인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 10 항에 있어서, 콜라겐은 I형 돼지 콜라겐 또는 Ⅲ형 돼지 콜라겐인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 8 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 젤라틴, 폴리글리콜산, 장선, 탈염된 골, 수산화인회석에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 젤라틴, 폴리글리콜산, 장선에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 7 항에 있어서, 매트릭스 내에서 충분한 섬유아세포와 근육 세포가 통합되어 세포에 이용가능한 매트릭스내 공간을 실질적으로 보충하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 개체에서 질환, 장애 또는 결함의 결과로 퇴화된 조직을 회복시키는 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 개체로부터 섬유아세포-포함 조직의 생검을 제공하고;
    (b) 생검으로부터 자가 섬유아세포를 분리하고;
    (c) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 자가 섬유아세포를 생산하는 조건하에 자가 섬유아세포를 배양하고;
    (d) 상기 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 배양된 자가 섬유아세포를 노출시키고;
    (e) 개체로부터 근육 조직의 생검을 제공하고;
    (f) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 근육 세포를 생산하는 조건하에 근육 조직으로부터 자가 근육 세포를 배양하고;
    (g) 상기 근육 세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 배양된 자가 근육 세포를 노출시키고;
    (h) 상기 섬유아세포와 상기 근육 세포를 병합시킨다.
  17. 제 16 항에 있어서, 질환, 장애 또는 결함은 요실금, 방광 요관 역류 또는 위식도 역류와 연관되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 섬유아세포-포함 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막 고유판, 연결 조직, 골수, 지방 조직에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 근육 조직은 혀, 구개설근, 측두근, 가자미근, 비복근, 흉선유돌근에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 16 항에 있어서, 섬유아세포 또는 근육 세포의 배양은 (1) 0.1% 내지 20% 사람이나 비-사람 혈청을 함유하는 배양 배지에서 배양, 이후 (2) 혈청없는 배양 배지에서 배양을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 16 항에 있어서, 섬유아세포 또는 근육 세포의 배양은 혈청없는 배지에서 배양을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 16 항에 있어서, 섬유아세포 또는 근육 세포의 배양은 마이코플라스마(mycoplasma)의 성장을 예방하는 한가지이상의 시제(reagent)를 함유하는 배지에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 한가지이상의 시제는 타일로신을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 한가지이상의 시제는 젠타마이신, 시프로플록사신, 알라트로플록사신, 아지트로마이신, 테트라사이클린에서 선택되는 한가지이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 16 항에 있어서, 섬유아세포 또는 근육 세포의 부유를 유도하는 조건은 단백분해 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 개체에서 질환, 장애 또는 결함의 결과로 퇴화된 조직을 회복시키는 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 계대배양된 자가 섬유아세포와 계대배양된 자가 근육 세포를 제공하고;
    (b) 생분해성 무세포 매트릭스를 제공하고;
    (c) 상기 섬유아세포와 근육 세포를 상기 생분해성 무세포 매트릭스와 함께 배양하여 상기 섬유아세포와 근육 세포를 생분해성 무세포 매트릭스 내에서 통합시키고, 이런 배양은 조직을 회복하는 조성물을 유도하고, 이런 배양의 조건에서 조성물은 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다.
  27. 제 26 항에 있어서, 질환, 장애 또는 결함은 요실금, 방광 요관 역류 또는 위식도 역류와 연관되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 26 항에 있어서, 계대배양된 자가 섬유아세포 및 계대배양된 자가 근육 세포를 제공하는 단계는 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 개체로부터 섬유아세포-포함 조직의 생검을 제공하고;
    (b) 생검으로부터 자가 섬유아세포를 분리하고;
    (c) 상기 섬유아세포를 배양하고;
    (d) 상기 섬유아세포를 부유시키고;
    (e) 개체로부터 근육 조직의 생검을 제공하고;
    (f) 상기 근육 조직으로부터 근육 세포를 분리하고;
    (g) 상기 근육 세포를 배양하고;
    (h) 상기 근육 세포를 부유시킨다.
  29. 제 28 항에 있어서, 섬유아세포-포함 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막 고유판, 연결 조직, 골수, 지방 조직에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 28 항에 있어서, 근육 조직은 혀, 구개설근, 측두근, 가자미근, 비복근, 흉부유돌근에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 28 항에 있어서, 섬유아세포와 근육 세포의 배양은 마이크로플라스마의 성장을 예방하는 시제를 함유하는 배지에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 시제는 타일로신을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 시제는 젠타마이신, 시프로플록사신, 알라트로플록사신, 아지트로마이신, 테트라사이클린에서 선택되는 한가지이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 26 항에 있어서, 섬유아세포와 근육 세포의 부유물과 병합이전에 생분해성 무세포 매트릭스는 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 젤라틴, 폴리글리콜산, 장선(cat gut), 탈염된 골, 수산화인회석, 무기질 골에서 선택되는 한가지이상의 물질을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 글루타르알데하이드와 교차-결합된 콜라겐과 글리코사미노글리칸을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 34 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 젤라틴, 폴리글리콜산, 장선(cat gut), 탈염된 골, 수산화인회석에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 젤라틴, 폴리글리콜산, 장선(cat gut)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 34 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 콜라겐인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 콜라겐은 소 콜라겐인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 38 항에 있어서, 콜라겐은 I형 돼지 콜라겐 또는 Ⅲ형 돼지 콜라겐인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 26 항에 있어서, 섬유아세포와 근육 세포는 배양에 앞서 병합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 26 항에 있어서, 섬유아세포와 근육 세포는 배양과 별도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 26 항에 있어서, 배양은 (1) 0.1% 내지 20% 사람이나 비-사람 혈청을 함유하는 배양 배지에서 배양, 이후 (2) 혈청없는 배양 배지에서 배양을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 26 항에 있어서, 배양은 혈청없는 배지에서 배양을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 26 항에 있어서, 생분해성 무세포 매트릭스 내에서 충분한 섬유아세포와 근육 세포가 통합되어 세포에 이용가능한 상기 생분해성 무세포 매트릭스내 공간을 실질적으로 보충하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 개체에서 조직을 회복시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 제 7 항의 조성물을 제공하고;
    (b) 개체에서 조직 결함이나 조직 퇴행의 부위를 확인하고;
    (c) 상기 부위에 상기 조성물을 위치시켜 조직 결함이나 조직 퇴행을 회복시킨다.
  47. 제 46 항에 있어서, 조직 결함이나 조직 퇴행은 요실금, 방광 요관 역류 또는 위식도 역류를 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 46 항에 있어서, 자가 섬유아세포는 잇몸, 구개, 피부, 점막 고유판, 연결 조직, 골수 또는 지방 조직으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 46 항에 있어서, 자가 근육 세포는 혀, 구개설근, 측두근, 가자미근, 비복근 또는 흉쇄유돌근으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 개체에서 조직 결함을 회복시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) (1) 계대배양된 자가 섬유아세포, (2) 계대배양된 자가 근육 세포, (3) 제약학적으로 수용가능한 담체를 함유하는 제약학적 조성물을 제공하고, 상기 제약학적 조성물은 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
    (b) 개체에서 요실금, 방관 요관 역류, 위식도 역류에서 선택되는 질환과 연관된 조직 결함이나 조직 퇴행의 부위를 확인하고;
    (c) 조직 결함이나 퇴행의 부위에 인접하여 상기 제약학적 조성물의 치료요법적 효과량을 주사하고, 상기 주사는 조직 결함이나 퇴행의 회복을 유도한다.
  51. 제 50 항에 있어서, 제약학적 조성물을 제공하는 단계는 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 개체로부터 섬유아세포-포함 조직의 생검을 제공하고;
    (b) 생검으로부터 섬유아세포를 분리하여 세포외 매트릭스 및 비-섬유아세포 세포가 실질적으로 존재하지 않는 섬유아세포를 제공하고;
    (c) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 섬유아세포를 생산하는 조건하에 상기 섬유아세포를 배양하고;
    (d) 상기 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 계대배양된 섬유아세포를 노출시키고;
    (e) 개체로부터 근육 조직 생검을 제공하고;
    (f) 상기 근육 조직으로부터 근육 세포를 분리하고;
    (g) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 근육 세포를 생산하는 조건하에 상기 근육 세포를 배양하고;
    (h) 상기 근육 세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 근육 세포를 노출시키고;
    (i) 섬유아세포 부유물과 근육 세포 부유물 및 제약학적으로 수용가능한 담체와 병합하여 제약학적 조성물을 형성한다.
  52. 제 51 항에 있어서, 섬유아세포-포함 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막 고유판, 연결 조직, 골수, 지방 조직에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 51 항에 있어서, 근육 조직은 혀, 구개설근, 측두근, 가자미근, 비복근, 흉쇄유돌근에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 51 항에 있어서, 섬유아세포 또는 근육 세포의 배양은 (1) 0.1% 내지 20% 사람이나 비-사람 혈청을 함유하는 배지에서 배양, 이후 (2) 혈청없는 배지에서 배양을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 51 항에 있어서, 섬유아세포 또는 근육 세포의 배양은 혈청없는 배지에서 배양을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 51 항에 있어서, 섬유아세포 또는 근육 세포의 부유를 유도하는 조건은 단백분해 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 50 항에 있어서, 주사 단계는 요도강(urethral lumen)이 압축되도록 일정 부피의 제약학적 조성물을 요도 또는 요도에 인접한 조직에 주사하여 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 50 항에 있어서, 주사 단계는 요관구(ureteral orifice)가 압축되도록 일정 부피의 제약학적 조성물을 요관구에 인접한 조직에 주사하여 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 50 항에 있어서, 주사 단계는 식도가 압축되도록 일정 부피의 제약학적 조성물을 하부 식도 괄약근(lower esophageal sphincter)에 인접한 조직에 주사하여 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 개체에서 질환, 장애 또는 결함의 결과로 퇴화된 조직을 회복시키는 주사가능 조성물에 있어서,
    (a) 계대배양된 자가 섬유아세포와 계대배양된 자가 근육 세포, 상기 섬유아세포와 근육 세포는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
    (b) 생분해가능한 무세포 주사가능 충진제를 함유하는 것을 특징으로 하는 주사가능 조성물.
  61. 제 60 항에 있어서, 자가 섬유아세포는 잇몸, 구개, 피부, 점막 고유판, 연결 조직, 골수 또는 지방 조직으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 주사가능 조성물.
  62. 제 60 항에 있어서, 자가 근육 세포는 혀, 구개설근, 측두근, 가자미근, 비복근 또는 흉쇄유돌근으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 주사가능 조성물.
  63. 제 60 항에 있어서, 섬유아세포 및 근육 세포와 병합이전에 생분해성 무세포 주사가능 충진제는 (a) 자가 콜라겐 섬유의 주사가능 분산액; (b) 콜라겐; (c) 용해된 젤라틴; (d) 용해된 폴리글리콜산; (e) 용해된 장선; (f) 돼지 젤라틴 분말에서 선택되는 한가지이상의 물질 및 염화나트륨 용액과 혈장 분량에 분산된 아미노 카프로산을 포함하는 것을 특징으로 하는 주사가능한 조성물.
  64. 제 63 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 자가 콜라겐 섬유의 주사가능 분산액을 포함하는 것을 특징으로 하는 주사가능 조성물.
  65. 제 64 항에 있어서, 주사가능 분산액에서 자가 콜라겐 섬유의 농도는 적어도 24 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 주사가능 조성물.
  66. 제 63 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 콜라겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 주사가능 조성물.
  67. 제 66 항에 있어서, 콜라겐은 소 콜라겐인 것을 특징으로 하는 주사가능 조성물.
  68. 제 66 항에 있어서, 콜라겐은 글루타르알데하이드와 교차-결합된 재구성된소 콜라겐 섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 주사가능 조성물.
  69. 제 63 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 용해된 젤라틴, 용해된 폴리글리콜산, 용해된 장선에서 선택되는 것을 특징으로 하는 주사가능 조성물.
  70. 제 63 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 돼지 젤라틴 분말 및 염화나트륨 용액과 혈장 분량에 분산된 아미노 카프로산을 포함하는 것을 특징으로 하는 주사가능 조성물.
  71. 제 70 항에 있어서, 염화나트륨 용액과 혈청 분량의 비율은 용적당 1:1인 것을 특징으로 하는 주사가능 조성물.
  72. 제 71 항에 있어서, 염화나트륨 용액은 용적당 0.9% 염화나트륨을 함유하는 것을 특징으로 하는 주사가능 조성물.
  73. 개체에서 질환, 장애 또는 결함의 결과로 퇴화된 조직을 회복시키는 주사가능 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 계대배양된 자가 섬유아세포와 계대배양된 자가 근육 세포를 제공하고, 상기 섬유아세포와 근육 세포는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
    (b) 생분해성 무세포 충진제를 제공하고;
    (c) 상기 계대배양된 자가 섬유아세포, 상기 계대배양된 자가 근육 세포, 상기 생분해성 무세포 충진제를 병합한다.
  74. 제 73 항에 있어서, 질환, 장애 또는 결함은 요실금, 방광 요관 역류 또는 위식도 역류와 연관되는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 73 항에 있어서, 질환, 장애 또는 결함은 구강 점막의 결함, 구강 점막에 외상, 치주 질환, 당뇨병, 피부 궤양, 혈관내 울혈, 피부의 상처 또는 피부의 주름을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 73 항에 있어서, 계대배양된 자가 섬유아세포와 계대배양된 자가 근육 세포를 제공하는 단계는 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 개체로부터 섬유아세포-포함 조직의 생검을 제공하고;
    (b) 생검으로부터 자가 섬유아세포를 분리하고;
    (c) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 섬유아세포를 유도하는 조건하에 상기 자가 섬유아세포를 배양하고;
    (d) 상기 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 배양된 자가 섬유아세포를 노출시키고;
    (e) 개체로부터 근육 조직 생검을 제공하고;
    (f) 상기 근육 조직 생검으로부터 근육 세포를 분리하고;
    (g) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 근육 세포를 유도하는 조건하에 상기 근육 세포를 배양하고;
    (h) 상기 근육 세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 근육 세포를 노출시킨다.
  77. 제 76 항에 있어서, 섬유아세포-포함 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막 고유판, 연결 조직, 골수, 지방 조직에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제 76 항에 있어서, 근육 조직은 혀, 구개설근, 측두근, 가자미근, 비복근, 흉쇄유돌근에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제 76 항에 있어서, 섬유아세포 또는 근육 세포의 배양은 (1) 0.1% 내지 20% 사람이나 비-사람 혈청을 함유하는 배지에서 배양, 이후 (2) 혈청없는 배지에서 배양을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제 76 항에 있어서, 섬유아세포 또는 근육 세포의 배양은 혈청없는 배지에서 배양을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제 76 항에 있어서, 섬유아세포 또는 근육 세포의 배양은 마이코플라스마(mycoplasma)의 성장을 예방하는 시제를 함유하는 배지에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제 81 항에 있어서, 시제는 타일로신을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제 82 항에 있어서, 시제는 젠타마이신, 시프로플록사신, 알라트로플록사신, 아지트로마이신, 테트라사이클린에서 선택되는 한가지이상의 화합물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제 76 항에 있어서, 섬유아세포 또는 근육 세포의 부유를 유도하는 조건은 단백분해 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제 73 항에 있어서, 섬유아세포 및 근육 세포와 병합이전에 생분해성 무세포 주사가능 충진제는 (a) 자가 콜라겐 섬유의 주사가능 분산액; (b) 콜라겐; (c) 용해된 젤라틴; (d) 용해된 폴리글리콜산; (e) 용해된 장선; (f) 돼지 젤라틴 분말에서 선택되는 한가지이상의 물질 및 염화나트륨 용액과 혈장 분량에 분산된 아미노 카프로산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제 85 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 자가 콜라겐 섬유의 주사가능 분산액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 제 86 항에 있어서, 주사가능 분산액에서 자가 콜라겐 섬유의 농도는 적어도 24 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 제 85 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 콜라겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 제 88 항에 있어서, 콜라겐은 소 콜라겐인 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 제 88 항에 있어서, 콜라겐은 글루타르알데하이드와 교차-결합된 재구성된 소 콜라겐 섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  91. 제 85 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 용해된 젤라틴, 용해된 폴리글리콜산, 용해된 장선에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 제 85 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 돼지 젤라틴 분말 및 염화나트륨 용액과 혈장 분량에 분산된 아미노 카프로산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 제 92 항에 있어서, 염화나트륨 용액과 혈청 분량의 비율은 용적당 1:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 제 93 항에 있어서, 염화나트륨 용액은 용적당 0.9% 염화나트륨을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 개체에서 질환, 장애 또는 결함의 결과로 퇴화된 조직을 회복시키는 방법에 있어서, 제 60 항에 따른 주사가능 조성물의 효과량을 개체의 퇴화 부위에 주사하여 조직을 회복시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 제 95 항에 있어서, 주사 단계는 요도강이 압축되도록 일정 부피의 제약학적 조성물을 요도 또는 요도에 인접한 조직에 주사하여 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 제 95 항에 있어서, 주사 단계는 요관구가 압축되도록 일정 부피의 제약학적 조성물을 요관구에 인접한 조직에 주사하여 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  98. 제 95 항에 있어서, 주사 단계는 식도가 압축되도록 일정 부피의 제약학적 조성물을 하부 식도 괄약근에 인접한 조직에 주사하여 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  99. 제 95 항에 있어서, 섬유아세포 및 근육 세포와 병합이전에 생분해성 무세포 주사가능 충진제는 (a) 자가 콜라겐 섬유의 주사가능 분산액; (b) 콜라겐; (c) 용해된 젤라틴; (d) 용해된 폴리글리콜산; (e) 용해된 장선; (f) 돼지 젤라틴 분말에서 선택되는 한가지이상의 물질 및 염화나트륨 용액과 혈장 분량에 분산된 아미노 카프로산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  100. 제 99 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 콜라겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  101. 제 100 항에 있어서, 콜라겐은 소 콜라겐인 것을 특징으로 하는 방법.
  102. 개체에서 질환, 장애 또는 결함의 결과로 퇴화된 조직을 회복시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 계대배양된 자가 섬유아세포를 개체의 조직 퇴행 부위에 주사하고, 상기 섬유아세포는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
    (b) 계대배양된 자가 근육 세포를 개체의 조직 결함 부위 또는 원하는 조직 증폭 부위에 주사하고, 상기 근육 세포는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
    (c) 생분해가능한 무세포 충진제를 상기 부위에 주사하고, 상기 충진제는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다.
  103. 제 102 항에 있어서, 각 주사 단계 (a)-(c)는 개체의 요도 또는 요도에 인접한 조직에 주사를 포함하고, 요도강의 압축을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  104. 제 102 항에 있어서, 각 주사 단계 (a)-(c)는 개체의 요관구에 인접한 조직에 주사를 포함하고, 요관구의 압축을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  105. 제 102 항에 있어서, 각 주사 단계 (a)-(c)는 개체의 하부 식도 괄약근에 인접한 조직에 주사를 포함하고, 식도의 압축을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  106. 제 102 항에 있어서, 질환, 장애 또는 결함은 구강 점막의 결함, 구강 점막에 외상, 치주 질환, 당뇨병, 피부 궤양, 혈관내 울혈, 피부의 상처 또는 피부의 주름을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  107. 제 102 항에 있어서, 자가 섬유아세포는 잇몸, 구개, 피부, 점막 고유판, 연결 조직, 골수 또는 지방 조직으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 주사가능 조성물.
  108. 제 102 항에 있어서, 자가 근육 세포는 혀, 구개설근, 측두근, 가자미근, 비복근 또는 흉쇄유돌근으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  109. 제 102 항에 있어서, 섬유아세포와 근육 세포는 동시에 주사되는 것을 특징으로 하는 방법.
  110. 제 102 항에 있어서, 섬유아세포, 근육 세포, 생분해성 무세포 충진제는 동시에 주사되는 것을 특징으로 하는 방법.
  111. 제 102 항에 있어서, 섬유아세포와 근육 세포는 개별적으로 주사되는 것을 특징으로 하는 방법.
  112. 제 102 항에 있어서, 섬유아세포와 근육 세포는 생분해성 무세포 충진제와 개별적으로 주사되는 것을 특징으로 하는 방법.
  113. 제 112 항에 있어서, 섬유아세포와 근육 세포를 개체에 투여하는 주사 단계 및 생분해성 무세포 충진제를 개체에 주사하는 단계 사이의 기간은 2주인 것을 특징으로 하는 방법.
  114. 제 102 항에 있어서, 섬유아세포 및 근육 세포와 병합이전에 생분해성 무세포 주사가능 충진제는 (a) 자가 콜라겐 섬유의 주사가능 분산액; (b) 콜라겐; (c) 용해된 젤라틴; (d) 용해된 폴리글리콜산; (e) 용해된 장선; (f) 돼지 젤라틴 분말에서 선택되는 한가지이상의 물질 및 염화나트륨 용액과 혈장 분량에 분산된 아미노 카프로산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  115. 제 114 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 자가 콜라겐 섬유의 주사가능 분산액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  116. 제 115 항에 있어서, 주사가능 분산액에서 자가 콜라겐 섬유의 농도는 적어도 24 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 방법.
  117. 제 114 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 콜라겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  118. 제 117 항에 있어서, 콜라겐은 소 콜라겐인 것을 특징으로 하는 방법.
  119. 제 117 항에 있어서, 콜라겐은 글루타르알데하이드와 교차-결합된 재구성된 소 콜라겐 섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  120. 제 114 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 용해된 젤라틴, 용해된 폴리글리콜산, 용해된 장선에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  121. 제 114 항에 있어서, 한가지이상의 물질은 돼지 젤라틴 분말 및 염화나트륨 용액과 혈장 분량에 분산된 아미노 카프로산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  122. 제 121 항에 있어서, 염화나트륨 용액과 혈청 분량의 비율은 용적당 1:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  123. 제 122 항에 있어서, 염화나트륨 용액은 용적당 0.9% 염화나트륨을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  124. 제 102 항에 있어서, 계대배양된 자가 섬유아세포 및 계대배양된 자가 근육 세포 대 생분해가능 무세포 충진제의 비율은 용적당 1:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  125. 개체에서 질환, 장애 또는 결함의 결과로 퇴화된 조직을 회복시키는 장치에 있어서,
    상기 장치는 (a) 주사기 챔버, 여기에 배치된 피스톤, 상기 챔버와 소통하는 구멍을 보유하는 피하 주사기; (b) 계대배양된 자가 섬유아세포, 계대배양된 근육 세포, 제약학적으로 수용가능한 담체를 함유하는 부유물을 포함하고,
    상기 부유물은 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고 상기 챔버 내에 배치되는 것을 특징으로 하는 장치.
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