TRATAMIENTOS CON FIBROBLASTO AUTÓLOGO CAMPO TÉCNICO Esta invención se relaciona con el tratamiento de incontinencia urinaria, reflujo vesicoureteral, y reflujo gastroesofágico . ANTECEDENTES La incontinencia urinaria es una condición extremadamente prevalente en todos los Estados Unidos . El Departamento de Salud y Servicios Humanos de E.U.A. Reportó en 1996 que 13 millones de personas en este pais sufren de incontinencia urinaria. La condición es mucho más prevalente en mujeres que en hombres. En la población general de edad de 15 a 64 años, 10-30% de las mujeres contra 1.5-5% de los hombres están afectados. Cuando menos 50% de residentes en casas de asistencia están afectados y de ese número, 70% son mu eres La incontinencia urinaria puede resultar de factores anatómicos, fisiológicos o patológicos. La incontinencia aguda y temporal son ocasionadas comúnmente por nacimiento de bebé, movilidad limitada, efectos laterales de medicamento e infecciones de tracto urinario. La incontinencia crónica es comúnmente ocasionada por defectos de nacimiento, debilidad de músculo de la vejiga, una uretra bloqueada (debido, por ejemplo, a hiperplasia de próstata benigna o un tumor), daños de cerebro o médula espinal, desórdenes nerviosos (v.gr., desórdenes congénitos y adquiridos de inervación de músculo tales como esclerosis lateral amiotrófica, espina bifida, o esclerosis múltiple) , y debilidad del músculo del suelo pélvico. Existen varios- tipos de incontinencia urinaria. La incontinencia de tensión se refiere a pérdida de orina durante actividad física que aumenta la presión abdominal (v.gr., toser, estornudar, o reír). La incontinencia de urgencia resulta en pérdida de orina con una necesidad urgente de vaciar y contracción involuntaria de la vejiga. La incontinencia mixta incluye ambas, incontinencia de tensión y de urgencia. La incontinencia de sobreflujo involucra un goteo constante de orina, aún cuando la vejiga nunca se vacía completamente. De estos tipos de incontinencia urinaria, la incontinencia de tensión, urgencia y mixta cuentan más del 90% de los casos. La incontinencia de sobreflujo es más común en personas con desórdenes que afectan el suministro de nervio que se origina en la porción superior de la espina dorsal y en hombres mayores con hiperplasia de próstata benigna. Los problemas con incontinencia urinaria se originan de manera típica en la uretra, y frecuentemente se deben a incompetencia del mecanismo esfintérico uretral en el cuello de la vejiga. Con dicha incompetencia, la resistencia al flujo saliente urinario se reduce al punto de que ocurre la pérdida de orina involuntaria. El reflujo vesicoureteral es una condición relacionada que también involucra resistencia insuficiente al flujo saliente urinario. Este desorden involucra contraflujo inapropiado de orina de la vejiga al uréter, que puede ser acompañado por reflujo intrarrenal y de esta manera puede ser complicado por nefropatia de reflujo. La enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD) es una condición que involucra un mecanismo similar, en el que los contenidos del estómago se apoyan hacia el esófago. Los contenidos gástricos normalmente son retenidos en el estómago a través de la acción del esfínter esofágico inferior, que permanece tónicamente contraído excepto durante el tragado. GERD ocurre cuando este esfínter es funcionalmente incompetente, se relaja intermitentemente o se interrumpe.
Los métodos efectivos para controlar flujo saliente de orina inapropiado de la vejiga y respaldo de alimento inapropiado hacia el esófago serían útiles para tratar pacientes con incontinencia urinaria, reflujo vesicoureteral, y GERD. Las Patentes de E.Ü.A. Nos. 5,858,390, 5,665,372,
5,660,850 y 5,591,444 y solicitud de E.Ü.A. copendiente No. de Serie 09/678,047 se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. COMPENDIO La invención proporciona métodos para tratar condiciones tales como incontinencia urinaria, reflujo vesicoureteral, y reflujo esofágico inyectando una suspensión de fibroblastos pasajeros, autólogos, histológicamente compatibles y células de músculo. La invención proporciona métodos para hacer a los fibroblastos y células de músculo substancialmente libres de proteínas inmunogénicas presentes en el medio de cultivo. La invención también proporciona composiciones que contienen fibroblastos autólogos y células de músculo. Las composiciones de la invención también pueden contener agentes de volumen y/o componentes de matriz acelular biodegradables . Las composiciones se pueden inyectar hacia un sujeto para tratar condiciones tales como incontinencia urinaria, reflujo vesicoureteral, o reflujo esofágico. La invención proporciona además dispositivos para inyectar dichas composiciones . Una suspensión de fibroblastos autólogos, histológicamente compatibles y células de músculo que se administra mediante inyección periuretral o transuretral puede aumentar la presión en la uretra y comprimir el lumen uretral, aliviando de esta manera la incontinencia urinaria mejorando la resistencia uretral al flujo de orina. De manera similar, una suspensión de dichas células que se administra mediante inyección hacia tejidos adyacentes al orificio uretral puede aumentar el soporte detrás de un uréter intravesical de reflujo, aliviando de esta manera el reflujo vesicoureteral y proporcionando resistencia al reflujo urinario. GERD se puede tratar inyectando una suspensión de células y tejidos adyacentes al esfínter esofágico inferior. Los fibroblastos inyectados típicamente son fibroblastos (v. gr . , fibroblastos dérmicos) derivados del cultivo de una muestra de biopsia tomada del sujeto. Las células de músculo (v.gr., células de músculo estriado) también se pueden obtener del sujeto. El lavado extenso de las células resulta en la remoción de esencialmente todas las proteínas derivadas de suero que serían inmunogénicas después de la administración de la suspensión de célula al sujeto. La invención está basada en los descubrimientos de que las células autólogas son ideales para usarse como un agente mejorador de volumen para tratar condiciones tales como incontinencia urinaria y reflujo vesicoureteral, y que un suministro abundante de dichas células se puede obtener cultivando una muestra de biopsia tomada del sujeto varias semanas antes del tratamiento. La invención se basa además en el descubrimiento que respuestas inmunes adversas (v.gr., respuestas inmunes inflamatorias) en un sujeto se pueden evitar removiendo proteínas antigénicas de las células cultivadas autólogas antes de su administración al sujeto. En un aspecto, la invención presenta una composición para reparar tejido que se ha degenerado en un sujeto como resultado de una enfermedad, desorden, o defecto en el sujeto. La composición puede contener fibroblastos pasados, autólogos y células de músculo pasadas, autólogas, y puede estar substancialmente libre de proteinas derivadas de suero de medio de cultivo. La enfermedad, desorden, o defecto se puede asociar con incontinencia urinaria, reflujo vesicoureteral, o reflujo gastroesofágico. Los fibroblastos autólogos se pueden ser de encías, paladar, piel, lamina propia, tejido conector, médula de hueso o tejido adiposo del sujeto. Las células de músculo autólogos pueden ser células de músculo estriadas (v.gr., células de músculo estriado tales como lengua, palatogloso, músculo temporal, soleo, gastronemio o músculo esternocleidomastoide del sujeto) . Las células de músculo autológo también pueden ser células de músculo tersas. La composición puede contener además una matriz acelular biodegradable, en donde los fibroblastos y células de músculo están integradas dentro y en la matriz. La matriz, antes de la combinación con los fibroblastos y células de músculo, pueden contener una o más substancias seleccionadas del grupo que consiste en colágeno, glicosaminoglicanos, gelatina, ácido poliglicólico, tripa de gato, hueso desmineralizado, hidroxiapatita y hueso anorgánico. El colágeno puede ser, por ejemplo, colágeno bovino, colágeno porcino tipo I, o colágeno porcino tipo III.
Los fibroblastos y células de músculo se integran sobre y dentro de la matriz de manera de llenar substancialmente el espacio en o dentro de la matriz disponible para células. En otro aspecto, la invención presenta un método para hacer una composición para reparar tejido que se ha degenerado en un sujeto como resultado de una enfermedad, desorden, o defecto en el sujeto. El método puede involucrar: (a) proporcionar una biopsia de tejido que contiene fibroblasto del sujeto; (b) separa fibroblastos autólogos de la biopsia; (c) cultivar los fibroblastos autólogos bajo condiciones que producen fibroblastos autólogos que están substancialmente libres de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo, (d) exponer los fibroblastos autólogos cultivados a condiciones que resultan en suspensión de los fibroblastos; (e) proporcionar una biopsia de tejido de músculo del sujeto; (f) cultivar células de músculo autólogas aisladas del tejido de músculo bajo condiciones que resultan en células de músculo que están substancialmente libres de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo; (g) exponer las células de músculo autólogas cultivadas a condiciones que resultan en suspensión de las células de músculo; y (h) combinar los fibroblastos con las células de músculo. La enfermedad, desorden, o defecto se puede asociar con incontinencia urinaria, reflujo vesicoureteral, o reflujo gastroesfágico.
El paso de proporcionar una biopsia de fibroblasto que contiene tejido puede involucrar proporcionar una biopsia de las encías, paladar, piel, lámina propia, tejido conector, médula de hueso, soleo, gastronemio o músculo esternocleidomastoide del sujeto. El cultivo de las fibroblastos o las células de músculo puede involucrar: (1) incubación en un medio de cultivo que contiene entre 0.1% y aproximadamente 20% de suero humano o no humano, seguido por (2) incubación en un medio de cultivo libre de suero. El cultivo de los fibroblastos o las células de músculo puede involucrar incubación en medio libre de suero. El cultivo de los fibroblastos o las células de músculo puede ser en un medio que contiene uno o más reactivos que impide el crecimiento de micoplasma . (v.gr., tilosina, plasmocina, agente de remoción de micoplasma, gentamicina, ciprofloxacina, alatrofloxacina, azitromicina, o tetraciclina) . Las condiciones que resultan en suspensión de los fibroblastos o las células de músculo pueden incluir una enzima proteolítica. En otro aspecto, la invención proporciona un método para hacer una composición para reparar tejido que se ha degenerado en un sujeto como resultado de una enfermedad, desorden, o defecto en el sujeto. El método puede involucrar: (a) proporcionar fibroblastos pasados, autólogos y células de músculo pasadas, autólogas (b) proporcionar una matriz acelular biodegradable; y (c) incubar los fibroblastos y células de músculo con la matriz acelular biodegradable de modo que los fibroblastos y células de músculo se integren sobre y dentro de la matriz acelular biodegradable, en donde la incubación resulta en una composición para reparar tejido, y en donde las condiciones de la incubación son tales que la composición está substancialmente libre de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo. La enfermedad, desorden, o defecto puede estar asociado con incontinencia urinaria, reflujo vesicoureteral, o reflujo gastroesofágico. La matriz acelular biodegradable, antes de la combinación con las suspensiones de fibroblastos y células de músculo, puede contener una o más substancias seleccionadas del grupo que consiste en colágeno, glicosaminoglicanos, gelatina, ácido poliglicólico, tripa de gato, hueso desmineralizado, hidroxiapatita y hueso anorgánico. El colágeno puede ser colágeno bovino, colágeno porcino tipo I, o colágeno porcino tipo III. Los fibroblastos y las células de músculo se pueden combinar antes de la incubación. Los fibroblastos y células de músculo se pueden añadir separadamente a la incubación. Alternativamente, la incubación puede involucrar: (1) cultivar en medio de cultivo que contiene entre 0.1% y aproximadamente 20% de suero humano o no humano, seguido por (2) cultivar en medio de cultivo libre de suero. la incubación puede involucrar cultivar en medio libre de suero. Los fibroblastos y células de músculo pueden integrarse dentro de la matriz acelular biodegradable para llenar substancialmente el espacio en o dentro de la matriz acelular biodegradable disponible para células . El paso de proporcionar fibroblastos pasados, autólogos, y células de músculo pasadas, autólogas puede involucrar: (a) proporcionar una biopsia de tejido que contiene fibroblasto del sujeto; (b) separar fibroblastos autólogos de la biopsia; (c) cultivar los fibroblastos; (d) suspender los fibroblastos; (e) proporcionar una biopsia de tejido muscular del sujeto; (f) aislar células de músculo de tejido de músculo; (g) cultivar las células de músculo; y (h) suspender las células de músculo. El paso de proporcionar una biopsia de tejido que contiene fibroblasto puede involucrar proporcionar una biopsia de las encías, paladar o piel del sujeto. El paso de proporcionar una biopsia de tejido de músculo puede involucrar proporcionar una biopsia de la lengua, palatogloso, músculo temporal, soleo, gastronemio o músculo esternocleidomastoide del sujeto. El cultivo de los fibroblastos y las células de músculo puede ser en un medio que contiene un reactivo que previene el crecimiento de micoplasma (v.gr., tilosina, agente de remoción de micoplasma, plasmocina, gentamicina, ciprofloxacina, alatroflaxacina, azitromicina, o tetraciclina) . En todavía otro aspecto, la invención proporciona un método para reparar tejido en un sujeto. El método puede involucrar: (a) proporcionar una composición de la invención; (b) identificar un sitio de defecto de tejido o degeneración de tejido en el sujeto; y (c) colocar la composición en el sitio de manera que el defecto o degeneración de tejido se repare. El defecto de tejido o degeneración de tejido puede resultar en incontinencia urinaria, reflujo vesicoureteral, o reflujo gastroesofágico. Los fibroblastos autólogos pueden ser de eneras, paladar, piel, lámina propia, tejido conector, médula de hueso, o tejido adiposo del sujeto. Las células de músculo autólogas puede ser de la lengua, palatogloso, músculo temporal, soleo, gastrocemio, o músculo esternocleidomastoide del sujeto. En otro aspecto, la invención proporciona un método para reparar un defecto de tejido en un sujeto. El método puede involucrar: (a) proporcionar una composición farmacéutica que contiene (1) fibroblastos pasados, autólogos, (2) células de músculo pasadas, autólogas, y {3} un portador farmacéuticamente aceptable de los mismos; en donde la composición farmacéutica está substancialmente libre de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo; (b) identificar en el sujeto un sitio de defecto de tejido o degeneración de tejido asociado con un desorden seleccionado del gr*upo que consiste en incontinencia urinaria, reflujo vesicoureteral, y reflujo gastroesofágico; (c) inyectar una cantidad de la composición farmacéutica adyacente al sitio de defecto o degeneración de tejido, en donde la inyección resulta en reparación del defecto o degeneración de tejido. La inyección puede involucrar inyectar un volumen de la composición farmacéutica hacia la uretra, o tejido adyacente a la uretra, del sujeto de modo que el lumen uretral se comprima. La inyección puede involucrar inyectar un volumen de la composición farmacéutica hacia tejido adyacente a un orificio ureteral del sujeto de modo que el orificio se comprima. La inyección puede involucrar inyectar un volumen de la composición farmacéutica hacia el tejido adyacente al esfínter esofágico inferior del sujeto de modo que el esófago se comprima. El paso de proporcionar una composición farmacéutica puede involucrar: (a) proporcionar una biopsia de fibroblasto que contiene tejido del sujeto; (b) separar fibroblastos de la biopsia de manera de proporcionar fibroblastos substancialmente libres de matriz extracelular y células de no fibroblasto; (c) cultivar los fibroblastos bajo condiciones que producen fibroblastos que están substancialmente libres de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo; (d) exponer los fibroblastos pasados a condiciones que resultan en suspensión de los fibroblastos;
(e) proporcionar una biopsia de tejido de músculo del sujeto;
(f) aislar las células de músculo del tejido de músculo; (g) cultivar las células de músculo bajo condiciones que producen células de músculo que están substancialmente libres de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo; (g) exponer las células de músculo a condiciones que resultan en suspensión de células de músculo; y (h) combinar la suspensión de fibroblasto con la suspensión de célula de músculo y un portador farmacéuticamente aceptable para formar la composición farmacéutica. La biopsia de fibroblasto que contiene tejido se puede tomar de las encías, paladar, o piel del sujeto. La biopsia de tejido de músculo se puede tomar de la lengua, palatogloso, músculo temporal, soleo, gastronemio o músculo esternocleidomastoide del sujeto. El cultivo de los fibroblastos o las células de músculo puede involucrar: (1) cultivar un medio que contiene entre 0.1% y aproximadamente 20% de suero humano o no humano, seguido por (2) cultivar en un medio libre de suero. El cultivo de los fibroblastos o las células de músculo puede involucrar cultivar en medio libre de suero. Las condiciones que resultan en suspensión de los fibroblastos o células de músculo pueden incluir una enzima proteolítica . La invención también presenta una composición inyectable para reparar tejido que se ha degenerado en un sujeto como resultado de una enfermedad, desorden o defecto en el sujeto. La composición inyectable puede contener: (a) fibroblastos pasados, autólogos y células de músculo pasadas , autólogas, en donde los fibroblastos y las células de músculo están substancialmente libres de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo; y (b) un relleno inyectable acelular biodegradable . Los fibroblastos autólogos pueden ser de encías, paladar, piel, lámina propia, tejido conector, médula de hueso, o tejido adiposo del sujeto. Las células de músculo autólogos pueden ser de la lengua, palatogloso, músculo temporal, gastrocemio o músculo esternocleídomastoíde del sujeto. El relleno inyectable acelular biodegradable, antes de la combinación con los fibroblastos y células de músculo, puede contener una o más substancias seleccionadas del grupo que consiste en: (a) una dispersión inyectable de fibras de colágeno autólogas; (b) colágeno; (c) gelatina solubilizada; (d) ácido poliglicólico solubilizado; (3) tripa de gato solubilizada; y (f) polvo de gelatina porcina y 'ácido amino capróico disperso en solución de cloruro de sodio y una alícuota de plasma del sujeto. La concentración de fibras de colágeno autólogo en la dispersión inyectable puede ser cuando menos 24 mg/ml. El colágeno puede ser colágeno bovino (v.gr., fibras de colágeno bovino reconstituidas reticuladas con glutaraldehído) . La relación de solución de cloruro de sodio y la alícuota de suero puede ser 1:1 en volumen. La solución de cloruro de sodio puede contener 0.9% de cloruro de sodio en volumen. En todavía otro aspecto, la invención presenta in método para hacer una composición inyectable para reparar tejido que se ha degenerado en un sujeto como resultado de una enfermedad, desorden, o defecto en el sujeto. El método puede involucrar: (a) proporcionar fibroblastos pasados, autologos, y células de músculo pasadas, autólogas, en donde los fibroblastos y las células de músculo están substancialmente libres de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo; (b) proporcionar un relleno acelular biodegradable; y (c) combinar los fibroblastos pasados, autologos, las células de músculo pasadas, autólogas, y el relleno acelular biodegradable. La enfermedad, desorden, o defecto se puede asociar con incontinencia urinaria, reflujo vesicoureteral, reflujo gastroesofágico, defectos de una mucosa oral, trauma a una mucosa oral, enfermedad periodontal, diabetes, úlceras cutáneas, estasis venosa, cicatrices de piel, o arrugas de piel. El paso de proporcionar fibroblastos pasados, autologos y células de músculo pasadas, autólogas puede involucrar: (a) proporcionar una biopsia de tejido que contiene fibroblasto del sujeto; (b) separar los fibroblastos autologos de la biopsia; (c) cultivar los fibroblastos au-ólogos bajo condiciones que resultan en fibroblastos que están substancialmente libres de proteina derivada de suero de medio de cultivo; (d) exponer los fibroblastos autólogos incubados a condiciones que resultan en suspensión de los fibroblastos; (e) proporcionar una biopsia de tejido de músculo del sujeto; (f) aislar células de músculo de la biopsia de tejido de músculo; (g) cultivar las células de músculo bajo condiciones que resultan en células de músculo que están substancialmente libres de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo; y (h) exponer las células de músculo a condiciones que resultan en suspensión de las células de músculo. El paso de proporcionar una biopsia de tejido que contiene fibroblasto puede involucran proporcionar una biopsia de las encías, paladar, piel lámina propia, tejido conector, médula de hueso, o tejido adiposo del sujeto. El paso de proporcionar una biopsia de tejido de músculo puede involucrar proporcionar una biopsia de la lengua, palatogloso, músculo temporal, sóleo, gastronemio, o músculo esternocleidomastoide del sujeto. El cultivo de los fibroblastos o las células de músculo comprende: 81) cultivar en un medio que contiene entre 0.1% y aproximadamente 20% de suero humano o no humano, seguido por (2) cultivar en un medio libre de suero. El cultivo de los fibroblastos o las células de músculo puede ser en un medio que contiene un reactivo que previene el crecimiento de micoplasma (-v.gr., tilosina, plasmocina, agente de remoción de micoplasma, gentamicina, ciprofloxacina, alatrofloxacina, azitromicina, y tetraciclina) . Las condiciones que resultan en suspensión de los fibroblastos o células de músculo pueden incluir una enzima proteolitica. El relleno acelular biodegradable, antes de la combinación con los fibroblastos y las células de músculo, puede contener una o más substancias seleccionadas del grupo que consiste en: (a) una dispersión inyectable de fibras de colágeno autólogas; (b) colágeno; (c) gelatina solubilizada; (d) ácido poliglicólico solubilizado; (e) tripa de gato solubilizada; y (f) polvo de gelatina porcina y ácido amino capróico disperso en solución de cloruro de sodio y una alícuota de plasma del sujeto. La concentración de fibras de colágeno autólogas en la dispersión inyectable puede ser cuando menos 24 mg/ml. El colágeno puede ser colágeno bovino (v.gr., fibras de colágeno bovino reticuladas con glutaraldehído) . La relación de solución de cloruro de sodio y la alícuota de suero puede ser 1:1 en volumen. La solución de cloruro de sodio puede contener 0.9% de cloruro de sodio en volumen. En otro aspecto, la invención presenta un método para reparar tejido que se ha degenerado en un sujeto como resultado de una enfermedad, desorden, o defecto en el sujeto. El método puede involucrar inyectar una cantidad efectiva de la composición de la invención al sujeto en el sitio de la degeneración de manera que se repare el tejido. La inyección puede involucrar inyectar un volumen de la composición hacia la uretra o tejido adyacente a la uretra del sujeto de modo que se comprima el lumen uretral. La inyección puede involucrar inyectar un volumen de la composición hacia el tejido adyacente al orificio ureteral del sujeto de modo que el orificio se comprima. La inyección puede involucrar inyectar un volumen de la composición hacia el tejido adyacente al esfínter esofágico inferior del sujeto de modo que el esófago se comprima. El relleno inyectable acelular biodegradable, antes de la combinación con los fibroblastos y células de músculo, puede contener una o más substancias seleccionadas del grupo que consiste en: (a) una dispersión inyectable de fibras de colágeno autólogas; (b) colágeno; (c) gelatina solubilizada; (d) ácido poliglicólico solubilizado; (e) tripa de gato solubilizada; y (f) polvo de gelatina porcina y ácido amino capróico disperso en solución de cloruro de sodio y una alícuota de plasma del sujeto. El colágeno puede ser colágeno bovino. En todavía otro aspecto, la invención presenta un método para reparar tejido que se ha degenerado en un sujeto como resultado de una enfermedad, desorden, o defecto en el sujeto. El método puede involucrar los pasos de: (a) inyectar fibroblastos pasados autólogos hacia el sujeto en un sitio de degeneración de tejido, en donde los fibroblastos están substancialmente libres de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo; (b) inyectar células de músculo pasadas, autólogas al sujeto en un sitio de un defecto de tejido o aumento de tejido deseado, en donde las células de músculo están substancialmente libres de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo; y (c) inyectar un relleno acelular, biodegradable hacia el sitio, en donde el relleno está substancialmente libre de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo. Cada uno de los pasos (a) -(c) de inyección puede involucrar inyectar hacia la uretra o tejido adyacente a la uretra del sujeto, en donde el método resulta en compresión del lumen uretral. Cada uno de los pasos (a) -(c) de inyección puede involucrar inyectar al tejido adyacente a un orificio ureteral del sujeto, en donde el método resulta en compresión del orificio. Cada uno de los pasos (a)-(c) de inyección puede involucrar inyectar hacia el tejido adyacente al esfínter esofágico inferior del sujeto, en donde el método resulta en compresión del esófago. La enfermedad/ desorden, o defecto puede involucrar defectos de una mucosa oral, trauma a una mucosa oral/ enfermedad periodontal, diabetes, úlceras cutáneas, estasis venoso, cicatrices de piel, o arrugas de piel.
Los fibroblastos autólogos pueden ser de encías, paladar, piel, lámina propia, tejido conector, médula de hueso, o tejido adiposo del sujeto. Las células de músculo autólogas pueden ser de la lengua, palatogloso, músculo temporal, soleo, gastronemio o músculo esternocleidomastoide del sujeto. Los fibroblastos y células de músculo se pueden inyectar simultáneamente. Los fibroblastos, células de músculo y relleno acelular biodegradable se pueden inyectar simultáneamente. Los fibroblastos y células de músculo se pueden inyectar separadamente. Los fibroblastos y células de músculo se pueden inyectar separadamente del relleno acelular biodegradable. La duración entre inyectar los fibroblastos y células de músculo hacia el sujeto e inyectar el relleno acelular biodegradable hacia el sujeto puede ser de aproximadamente dos semanas . El relleno acelular biodegradable, antes de la combinación con los fibroblastos y las células de músculo, pueden contener una o más substancias seleccionadas del grupo que consiste en: (a) una dispersión inyectable de fibras de colágeno autólogas; (b) colágeno; (c) gelatina solubilizada; (d) ácido poliglicólico solubilizado; (e) tripa de gato solubilizada; y (f) polvo de gelatina porcina o ácido amino capróico dispuesto en solución de cloruro de sodio y una alícuota de plasma del sujeto. La concentración de fibras de colágeno autólogas en la dispersión inyectable puede ser cuando menos 24 mg/ml. El colágeno puede ser colágeno bovino (v.gr., fibras de colágeno bovino reconstituidas reticuladas con glutaralde ido) . La relación de solución de cloruro de sodio a la alícuota de suero puede ser 1:1 por volumen. La solución de cloruro de sodio puede contener 0.9% de cloruro de sodio en volumen. La relación de fibroblastos pasados, autólogos, y células de músculo pasadas, autólogas a relleno acelular biodegradable, puede ser aproximadamente 1:1 en volumen . En otro aspecto, la invención presenta un dispositivo para reparar tejido que se ha degenerado en un sujeto como resultado de una enfermedad, desorden, o defecto en el sujeto. El dispositivo puede contener: (a) una jeringa hipodérmica que tiene una cámara de jeringa, un pistón dispuesto en la misma, y un orificio que comunica con la cámara; y (b) una suspensión que contiene fibroblastos pasados, autólogos, células de músculo pasadas, autólogas, y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde la suspensión está substancialmente libre de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo, y en donde la suspensión está dispuesta dentro de la cámara. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por uno de experiencia ordinaria en el ramo al que pertenece esta invención. Aún cuando los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente se pueden utilizar para practicar la invención, los métodos y materiales apropiados se describen abajo. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, serán el control. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solamente y no se pretende que sean limitativos . Los detalles de una o más modalidades de la invención se exponen en los dibujos que se acompañan y la descripción abajo. Otras particularidades, objetos y ventajas de la invención serán evidentes de la descripción y de las reivindicaciones. DESCRIPCIÓN DETALLADA La invención proporciona métodos para tratar condiciones tales como incontinencia urinaria, reflujo vesicoureteral, y reflujo esofágico. Estos métodos involucran administrar a un sujeto una composición que contiene fibroblastos pasados, autólogos, histológicamente compatibles. La composición también puede contener células de músculo (v.gr., células de músculo histocompatibles o autólogas), y puede contener además componentes de matriz acelulares biodegradables y/o un agente de volumen (v.gr., un relleno acelular biodegradable) . La invención proporciona métodos para hacer a las células inyectadas substancialmente libres de proteínas inmunogénicas que pueden estar presentes en el medio de cultivo. La invención también proporciona composiciones que contienen fibroblastos autólogos con y sin células de músculo, componentes de matriz acelulares biodegradables, y/o agentes de volumen para administración a un sujeto con una condición tal como incontinencia urinaria, reflujo vesicoureteral, o reflujo esofágico. La invención proporciona además métodos para hacer y dispositivos para inyectar dichas composiciones . 1. Composiciones que contienen fibroblastos autólogos La invención proporciona composiciones que son útiles para tratar condiciones tales como incontinencia urinaria, reflujo vesicoureteral, y reflujo esofágico. Las composiciones de la invención contienen fibroblastos pasados, autólogos que están substancialmente libres de proteínas inmunogénicas (v.gr., proteínas derivadas de suero de medio de cultivo) . Como se utiliza en la presente, el término "autólogo" se refiere a células removidas de un donador y administradas a un recipiente, en donde el donador y recipiente son el mismo individuo. Como se utiliza en la presente, células (v.gr., fibroblastos pasados autólogos) que están "substancialmente libres de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo" son células en las que el fluido que rodea las células en el que las células se incorporan contiene menos de 0.1% {v.gr., menos de 0.05%, menos de 0.01%, menos de 0.00%, o menos de 0.001%) de suero xenogenéico o alogenéico contenido en el medio de cultivo de tejido en el que se cultivaron las células. De manera similar, una composición que está "substancialmente libre de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo" es una composición en la que el fluido que rodea las células en la composición contiene menos de 0.1% (v.gr., menos de 0.05%, menos de 0.01%, menos de 0.00%, o menos de 0.001%) de suero xenogenéico o alogenéico contenido en el medio de cultivo de tejido en el que se cultivan las células. Los fibroblastos pueden ser de cualquier especie mamífera (v.gr., humanos, primates no humanos, perros, vacas, caballos, cerdos, ovejas, gatos, conejos, ratones, ratas, cobayos, hamsters) siempre y cuando las células sean autólogas. Los fibroblastos humanos autólogos son particularmente útiles. Se observa que cuando se crían y de esta manera son isogénicos (v.gr., como en las mismas cepas de laboratorio de animales tales como ratas y ratones) , "autólogo" puede significar de otro individuo derivado de la misma especie. Las composiciones que contienen cualquier célula mesenquimatosa no diferenciada que se pueda expandir en cultivo. Los fibroblastos aislados de tejido dérmico son particularmente útiles debido a que se pueden obtener y expandir fácilmente, y debido a que son un tipo de célula normalmente presente en tejidos adyacentes al esfínter uretral, el orificio ureteral, el esfínter esofágico inferior. Los fibroblastos dérmicos autólogos se pueden obtener, por ejemplo, de una biopsia de las encías, paladar, o piel del sujeto. La dermis está colocada justamente debajo de la epidermis, y típicamente tiene un espesor que varía de 0.5 a 3 mm. Los constituyentes celulares predominantes de la dermis son fibroblastos y macrofagos, aún cuando también pueden estar presentes células adiposas y fibras de músculo. Además de la dermis, los fibroblastos se pueden obtener, sin límite, de fascia, lámina propia, el área bulbar de folículos de cabello, médula de hueso, o cualquier fuente de tejido conector. Además, los fibroblastos se pueden derivar de células mesenquimatosas no diferencias . Cualquier método apropiado para cultivar y diferenciar células mesenquimatosas no diferenciadas se puede utilizar, incluyendo aquellos métodos conocidos en el ramo. Debido al fenómeno de rechazo de aloinjerto, que es bien conocido a los cirujanos de trasplante e inmonólogos, es esencial que los fibroblastos cultivos sean istocompatibles con el recipiente. La histocompatibilidad se puede asegurar obteniendo una biopsia del sujeto que se va a tratar. Se entiende, sin embargo, que dichas células también se pueden obtener de un gemelo idéntico al sujeto, o de un individuo que es idéntico en el mayor complejo de histocompatibilidad (MHC) con el sujeto. Los fibroblastos de una muestra de biopsia se pueden cultivar de modo que las células resultantes estén substancialmente libres de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo, que también reduce la capacidad de las células a activar la respuesta inmune dañada en el sujeto. Para generar una composición de la presente invención, un cultivo de fibroblasto se puede iniciar, por ejemplo, de una muestra de biopsia dérmica de espesor completo (v.gr., 1-5 mm, o más de 5 mm si hay disponible suficiente tejido) de las encías, paladar, o piel de un sujeto que sufre de degeneración de tejido (v.gr., incontinencia urinaria, reflujo vesicoureteral, o GERD) . Esta muestra de biopsia se puede obtener utilizando, por ejemplo, un procedimiento de biopsia de perforación. Las biopsias de la dermis o lámina propia también son particularmente útiles para obtener fibroblastos autólogos. Las biopsias de piel se pueden tomar de la piel, por ejemplo, detrás de la oreja. Antes del inicio del cultivo, la biopsia se puede lavar repetidamente con agentes antibióticos y antifungales . Un "medio de lavado" apropiado puede contener, por ejemplo, medio de cultivo de tejido tal como Dulbeccors Modified Eagle's Médium (DMEM) y algunos o todos de los siguientes agentes: gentamicina, anfotericina B (Fungizone(R) ) , agente de remoción de micoplasma (MRA; Dianippon Pharmaceutical Company, Japón), plasmocina y tolosina (disponible de, por ejemplo, Serva, Heidelberg, Alemania) . La gentamicina se puede utilizar a una concentración de 10 a 100 ug/ml (v.gr., 25 a 75 ug/ml, o aproximadamente 50 ug/ml) . La Anfotericina B se puede utilizar a una concentración de 0.5 a 12.5 ug/ml
(v.gr., l.o a 10.0 ug/ml, o aproximadamente 2.5 ug/ml). MRA se puede utilizar a una concentración de 0.1 a 1.5 ug/ml
(v.gr., 0.25 a 1.0 ug/ml, o aproximadamente 0.5 ug/ml). La plasmocina se puede utilizar a una concentración de 1 a 50 ug/ml (v.gr., 10 a 40 ug/ml, o aproximadamente 25 ug/ml. La tilosina se puede utilizar a una concentración de 0.012 a 1.2 mg/ml (v.gr., 0.06 a 0.6 mg/ml, o aproximadamente 0.12 mg/ml) . Si se desea, se puede utilizar disección microscópica estéril para separar tejido dérmico en una biopsia de epidermis que contiene tejido queratinizado y tejido subcutáneo que contiene adipocito subcutáneo. La muestra de biopsia luego se puede separar en piezas pequeñas usando, por ejemplo, un escalpelo o tijeras para desmenuzar finamente el tejido. En algunas modalidades, las piezas pequeñas de tejido se digieren con una proteasa (v.gr., colagenasa, tripsina, quimiotripsina, papaina, o ciquimiopapaina) . La digestión con 200-1000 U/ml de colagenasa tipo II durante 30 minutos a 24 horas es particularmente útil. Si se usa digestión enzimática, las células se pueden recoger mediante centrifugación y chapar en frascos de cultivo de tejido. Si el tejido no se somete a digestión enzimática, las piezas de tejido desmenuzadas se pueden colocar individualmente sobre la superficie seca de un frasco de cultivo de tejido y dejarse fijar durante entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10 minutos. Una cantidad pequeña de medio se puede añadir lentamente de manera de no desplazar los fragmentos de tejido fijados. En el caso de células digeridas, las células se pueden suspender en medio de cultivo y colocarse en uno o más f ascos. Después de aproximadamente 48-72 horas de incubación, los frascos se pueden alimentar con medio adicional. Cuando se utiliza un frasco T-25 para iniciar el cultivo, la cantidad inicial de medio es típicamente alrededor de 1.5-2.0 mi. El establecimiento de una línea de célula de la muestra de biopsia puede tomar entre aproximadamente 2 y 3 semanas, en cuyo tiempo las células se pueden remover del recipiente de cultivo inicial para expansión. Durante las etapas tempranas del cultivo, es deseable que los fragmentos de tejido permanezcan ligados al fondo del recipiente de cultivo. Los fragmentos que se separan se pueden reimplantar en nuevos recipientes . Los fibroblastos se pueden estimular para crecer por una exposición breve a EDTA-tripsina, de conformidad con técnicas convencionales . Esta exposición a tripsina es demasiado breve para liberar los fibroblastos de su fijación a la pared de recipiente de cultivo. Inmediatamente después de que los cultivos quedan establecidos y se están acercando a confluencia, muestras de los fibroblastos se pueden procesar para almacenamiento congelado, por ejemplo, en nitrógeno liquido. Cualquier método apropiado para congelar células se puede utilizar, incluyendo cualquiera de los numerosos métodos que son conocidos en el ramo para congelar satisfactoriamente células para uso posterior. La congelación y almacenamiento de fibroblastos pasados temprano más bien que tarde se prefiere debido a que el número de pasajes en cultivo de célula de fibroblastos humanos normales es limitado. Los fibroblastos se pueden congelar en cualquier medio de congelación apropiado para conservar los fibroblastos (v.gr., cualquier medio de congelación comercialimente disponible) . Un medio que consiste de aproximadamente 70% (v/v) de medio de crecimiento, aproximadamente 20% (v/v) de suero bovino fetal (FBS) y aproximadamente 10% (v/v) de sulfóxido de dimetilo (DMSO) es particularmente útil. El DMSO también se puede reemplazar, por ejemplo, con glicerol. Las células descongeladas se pueden usar para iniciar cultivos secundarios para la preparación de suspensiones adicionales para uso posterior en el mismo sujeto, evitando de esta manera la inconveniencia de obtener una segunda muestra. Cualquier técnica de cultivo de tejido que es apropiada para la propagación de fibroblastos dérmicos de muestras de biopsia se puede utilizar para expandir las células. Las técnicas útiles se pueden encontrar, por ejemplo, en R. ( . Freshney, Ed., Animal Cell Culture; A Practical Approach, (IRL Press, Oxford, Inglaterra, 1986) y R.I. Freshney, Ed. , Culture of Animal Cells : A Manual of Basic Techniques, (Alan R. liss & col., New York, 1987). El medio de cultivo de célula puede ser cualquier medio apropiado para el crecimiento de cultivos de fibroblasto primarios. El medio se puede suplementar con suero humano o no humano (v.gr., suero humano autólogo, suero A/B humano no autólogo, suero de cabello, o suero bovino fetal (FBS)J para promover el crecimiento de los fibroblastos. Cuando se incluyen en el medio, el suero típicamente está en una cantidad entre alrededor de 0.1% y alrededor de 20% v/v (v.gr., entre 0.5% y 19%, entre 1% y 15%, o entre 5% y 12%). Las concentraciones superiores de suero también se pueden usar para promover crecimiento más rápido de los fibroblastos. Un medio particularmente útil contiene glucosa DMEM que se suplementa con aproximadamente 2 mM de glutamina, aproximadamente 10 mg/L de piruvato de sodio, aproximadamente 10% (v/v) de FBS, y antibióticos (llamados frecuentemente "medio completo") , en donde la concentración de glucosa varia de alrededor de 1,000 mg/L a alrededor de 4,500 mg/L. Los fibroblastos también se pueden expandir en medio libre de suero. De esta manera, los fibroblastos nunca se exponen a proteínas de suero xenogenéicas o alogenéicas y no requieren el cultivo extra en medio libre de suero que se lleva a cabo cuando los fibroblastos se expanden en medio que contiene suero no autólogo . El medio de crecimiento usado para cultivar fibroblastos se puede suplementar con antibióticos para prevenir la contaminación de los cultivos, por ejemplo, de bacteria, hongos, levadura, y microplasma. La contaminación con micopl srtia es un problema frecuente y particularmente molesto en cultivo de tejido. A fin de prevenir o reducir al mínimo la contaminación con micoplasma, un agente tal como tilosina se puede añadir el medio de crecimiento de cultivo. El medio se puede suplementar adicionalmente con uno o más antibióticos/antimicóticos (v.gr., gentamicina, ciprofloxacina, alatrofloxacina, azitromicina, MRAf plasmocina, y tetraciclina) . La tilosina se puede utilizar a una concentración de 0.006 a 0.6 mg/ml (v.gr., 0.01 a 0.1 mg/ml, o aproximadamente 0.06 mg/ml) . La gentamicina se puede utilizar a una concentración de 0.01 a 0.1 mg/ml (v.gr., 0.03 a 0.08 mg/ml, o aproximadamente 0.05 mg/ml). La ciproíloxacina se puede utilizar a una concentración de 0.002 a 0.05 mg/ml (v.gr., 0.005 a 0.03 mg/ml, o aproximadamente 0.01 mg/ml) . Al alatrofloxacina se puede utilizar a una concentración de 0.2 a 5.0 ug/ml (v.gr., 0.5 a 3.0 ug/ml, o aproximadamente 1.0 ug/ml) . La azitromicina se puede utilizar a una concentración de 0.002 a 0.05 mg/ml (v.gr., 0.005 a 0.03 mg/ml, o aproximadamente 0.01 mg/ml). MRA se puede utilizar a una concentración de 0.1 a 1.5 ug/ml (v.gr.,
0.2 a 1.0 ug/ml, o aproximadamente 0.75 ug/ml). La plasmocina se puede utilizar a una concentración de 1 a 50 ug/ml (v.gr., 10 a 40 ug/ml, o aproximadamente 25 ug/ml) . La tetraciclina se puede utilizar a una concentración de 0.04 a 0.01 mg/ml (v.gr., 0.008 a 0.05 mg/ml, o aproximadamente 0.02 mg/ml) . Los antibióticos pueden estar presentes durante el periodo completo del cultivo o durante una porción del periodo de cultivo. La contaminación con micoplasma se pueden ensayar mediante un método de cultivo de agar utilizando un sistema, tal como por ejemplo, placas de agar de microplasma que están disponibles de bioMérieux (Marcy l'Etoile, Francia) o se pueden preparar en casa, y mediante PCR. La American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) también vende un PCR (Juego de Detección de Microplasma". El medio de cultivo que contiene tilosina (0.06 mg/ml), gentamicina (0.1 mg/ml) , ciprofloxacina (0.01 mg/ml), alatrofloxacina (1.0 ug/ml) , azítromicína (0.01 mg/ml), y tetraciclína (0.102 mg/ml es particularmente útil para prevenir la contaminación con micoplasma . Otro agente que puede ser útil al prevenir contaminación con micoplasma es un derivado de ácido 4-oxo-quinolin-3-carboxílico (OQCA) que está comercialmente disponible como "Mycoplasma Removal Agent" de, por ejemplo, ICN P armaceuticals, Inc. (Costa Mesa, CA) . Este agente típicamente se usa a una concentración de 0.1 a 2.5 mg/ml (v.gr., 0.2 a 2.0 mg/ml, o 0.5 mg/ml). La mezcla antibiótica u otros agentes pueden estar presentes en los cultivos de fibroblasto durante las primeras dos semanas después del inicio. Después de dos semanas de cultivo, el medio que contiene antibiótico típicamente se reemplaza con medio libre de antibiótico. Una vez que está presente un número suficiente de células en el cultivo (v.gr., cuando las células son 70%-90% confluentes), se pueden probar para contaminación micoplasmal, bacteriana y fungal. Solamente las células sin contaminación detectable son útiles en métodos de la Los fibroblastos autólogos se pueden pasar hacia nuevos frascos mediante tripsinización. Para expansión, frascos individuales se pueden dividir en una relación, por ejemplo, de 1:3 a 1:5. Frascos T-150 de fondo triple, que tienen un total de área de cultivo de 450 cm2 son apropiados para expandir fibroblastos. Un frasco T-150 de fondo triple se puede sembrar, por ejemplo, con aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 3 x 106 células, dependiendo del tamaño de las células . Dicho frasco tiene típicamente una capacidad para rendir alrededor de 8 x 106 a alrededor de 1.0 x 107 células. Cuando la capacidad del frasco se alcanza, lo que puede requerir aproximadamente 5-7 días de cultivo, el medio de crecimiento se puede reemplazar por medio libre de suero. Las células típicamente se incuban entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 37.5°C durante cuando menos 4 horas (v.gr., durante la noche o aproximadamente 18 horas) . La incubación de las células en medio libre de suero puede remover substancialmente las proteínas derivadas del suero no autólogo (v.gr., FBS) añadido al medio de cultivo, que si está presente en una composición inyectada a un sujeto, elucidaría una respuesta inmune no deseable. El medio libre de suero puede contener, por ejemplo, glucosa DMEM suplementada con aproximadamente 2 mM de glutamina, con o sin aproximadamente 110 mg/L de piruvato de sodio, en donde la concentración de glucosa puede variar de aproximadamente 1,000 mg/L a aproximadamente 4,500 mg/L. Una concentración de glucosa de aproximadamente 4,500 mg/L es particularmente útil. El medio libre de suero también puede contener uno o más de los antibióticos arriba descritos.
Al final de la incubación en medio libre de suero, las células se pueden remover de los frascos de cultivo de tejido usando, por ejemplo, tripsina-EDTA. Antes de administración a un sujeto, los fibroblastos típicamente se lavan 2 a 4 veces en medio que está libre de suero y fenol libre de rojo, o en salina. Las células se pueden lavar mediante centrifugación y resuspensión, y luego suspenderse para inyección en un volumen igual de solución isotónica inyectable que tiene una osmolaridad fisiológica apropiada y está substancialmente libre de pirógeno y proteina extraña. La salina isotónica es una solución isotónica particularmente útil. Cinco frascos T-150 de fondo triple, desarrollados a capacidad, pueden rendir aproximadamente 3.5 x 107 a aproximadamente 7 x 107 células, que son suficientes para formar aproximadamente 1.2 mi a aproximadamente 1.4 mi de suspensión. Un portador farmacéuticamente aceptable luego puede añadirse a los fibroblastos autólógos pasados para formar una composición farmacéutica. La frase
"farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no son per udiciales a células, son fisiológicamente tolerables, y no producen típicamente una reacción dañina alérgica o similar, tal como desajuste gástrico, mareo, y lo semejante, cuando se administran a un humano. Estas composiciones incluyen diluyentes fisiológicamente aceptables de diversos contenidos de tampón (v.gr., Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y resistencia iónica. Antes de la administración, los fibroblastos se pueden incubar con un compuesto de activación tal como por ejemplo, ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, ácido linoléico, C-Med 100(R! (Optigene-X LLC, Shrewsbury, NJ) , CoEnzyme Q10, ácido glicólico, ácido L-hidroxi, ácido L-lipóico, monofosfato de calcio u otros aditivos estimulantes tales como factores de crecimiento. La incubación con dichos compuestos puede estimular los fibroblastos y mejorar su producción de colágeno. Uno o más compuestos de activación también" se pueden administrar a un sujeto junto con una composición que contiene fibroblastos pasados, autólogos . Alternativamente, la administración de un compuesto de activación en ausencia de fibroblastos pasados se puede utilizar para estimular fibroblastos en vivo . Si los fibroblastos no se van a administrar inmediatamente, se pueden incubar en hielo a aproximadamente 4°C durante hasta 24-48 horas. Las células se pueden suspender en una solución fisiológica que tiene una osmolaridad apropiada y se ha probado para niveles de pirógeno y endotoxina. Dicha solución típicamente no contiene indicador de pH rojo fenol, y cualquier suero de preferencia es suero del sujeto más bien que FBS u otro suero xenogenéico. Los fibroblastos se pueden suspender, por ejemplo, en solución de Krebs-Ringer que comprende 5% de dextrosa, o en cualquier otra solución fisiológica (v.gr., salina fisiológica) . Las células se pueden aspirar y administrar a un sujeto en el medio de incubación. El volumen de salina o medio de incubación en el que las células se suspenden típicamente está relacionado con factores tales como el número de fibroblastos que se van a inyectar y el grado del daño debido a la degeneración de tejido o defecto. Cualquier otro método apropiado también se puede usar para preparar composiciones que contienen fibroblastos pasados, autólogos. Ver, v.gr., Patentes de E.U.A. Nos. 5,858,390; 5,665,372; 5,660,850; y 5,591,444; así como WO 99/60951, todas las cuales se incorpora por referencia en su totalidad. 2. Composiciones que contienen fibroblastos y células de músculo Las composiciones de la invención pueden contener fibroblastos pasados, autólogos, junto con células de músculo pasadas . Las células de músculo pueden ser autólogas o no autólogas (v.gr., de otro sujeto o de una línea de célula), aún cuando las células de músculo autólogas son particularmente útiles . Las células de músculo pueden ser células de músculo estriado o células de músculo liso. Las células de músculo estriado autólogas se pueden aislar de, por ejemplo, una biopsia de tejido de músculo de la cabeza ("v.gr., la lengua, palatogloso o músculo temporal), cuelo, tronco (v.gr., el músculo esternocleidomastoide) , o miembros (v.gr., el soleo o músculo gastonemio) . Las biopsias de músculo autólogo típicamente se obtienen de sitios que son fácilmente accesibles, sino embargo no altamente visibles desde un punto de vista cosmético. Las células de músculo tersas típicamente son no autólogas, y se pueden aislar, por ejemplo, de biopsia aórtica de un donador de trasplante de órgano (v.gr., corazón). Las células de músculo no autólogas también pueden ser de líneas de célula de músculo. Estas células están comercialmente disponibles, por ejemplo, de ATCC y de Clonetics Corp. (San Diego, CA) . Alternativamente, las células de músculo se pueden derivar de células de tallo aisladas, por ejemplo de una biopsia dérmica. Cualquier medio apropiado para cultivar y diferenciar células de tallo se puede utilizar, incluyendo aquellos métodos conocidos en el ramo . Para preparar una suspensión de células de músculo pasadas, tejido de músculo autólogo o no autólogo se puede obtener de una biopsia de músculo. Las muestras típicamente son de alrededor de 0.5-1.0 cm3 en tamaño, con una masa de aproximadamente 0.5-1 g. El tejido puede ser disociado mediante agitación suave en medio de cultivo que contiene, por ejemplo, los mismos antibióticos descritos para procesamiento de biopsias para generar cultivos de fibroblasto autólogo. Cualquier tejido conector o graso obvio se puede remover con un fórceps. La muestra de tejido restante se puede adelgazar en piezas más pequeñas (v.gr. , piezas que no son mayores de 1 m3) . El desmenuzado con hojas de rasurar en tripsina es particularmente útil. La suspensión desmenuzada se puede agitar suavemente con tripsina/EDTA para disociar las células, que luego se pueden decantar hacia un frasco fresco de modo que las piezas de tejido restantes se dejan atrás. Se puede añadir FBS para neutralizar la tripsina. Los pasos de tripsinización se pueden repetir hasta un máximo de tres veces, o hasta que no permanecen piezas de tejido rosadas, y las células de músculo se pueden recoger mediante centrifugación. Las células de músculo y) tejido de músculo (v.gr., loa muestra de biopsia) se puede lavar extensamente en medios que contienen antibióticos y agentes antifungales, como se describe arriba para fibroblastos cultivados. Las células de músculo se pueden cultivar en cualquier medio apropiado. Una mezcla de 1:1 de medio de crecimiento de músculo humano rmedio acondicionado (HuGM/CM) es particularmente útil. HuGM típicamente contiene Ham' s FIO, 10% de FBS, 5% de FBS (definido y suplementado con hierro; Hyclone, Logan, UT} , 0.5% de extracto de embrión de poyo (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U/ml de penicilina, y 100 ug/ml de estreptomicina. CM es HuGM que se ha acondicionado mediante incubación con fibroblastos MRC-5 (disponibles, por ejemplo, de ATCC) . Otros medios útiles que no contienen proteínas de suero xenogenéico (v.gr., medios libres de suero) son aquellos arriba descritos para fibroblastos autólogos . El medio de cultivo también puede contener los mismos antibióticos descritos arriba para fibroblastos autólogos. Las células de músculo se pueden chapar en placas de cultivo de tejido o frascos de cualquier tamaño apropiado
(v.gr., placas de 96 pozos, placas de 24 pozos, placas de 12 pozos, o platos de 35 mm, 60 mm o 10 mm, o frascos T25-, T-75, T-150 o T-500) y alimentarse con medio fresco (v.gr., 1:1 HuGM/CM) cuando alcanzan aproximadamente 40% de confluencia. Las células luego pueden alimentarse con medio de crecimiento (v.gr., HuGM) cada 2 a 3 días. Cuando las células de músculo alcanzan aproximadamente 70 a80% de confluencia, se pueden tripsinizar y sembrar en platos de cultivo frescos (v.gr., platos de 100 mm) a aproximadamente 5 x 10s-10 x 105 células por plato. Los platos típicamente son aproximadamente 20% confluentes después del subcultivo. Las células se pueden expandir y subcultivar hasta que se obtiene un número apropiado. Las células se pueden supervisar para contaminación por bacterias, hongos, levadura, o micoplasma como se describe arriba. Una ve< que se alcanza un número apropiado de células de músculo, se pueden incubar en medio libre de suero durante 2-18 horas para remover proteínas inmunogénicas (es decir, hacer a las células substancialmente libres de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo) . Antes de administración a un sujeto, las células de músculo típicamente se lavan 2 a 4 veces en medio libre de suero o en PBS . El PBS que no contiene Ca+2 o Mg+2 es particularmente útil. Las células típicamente se lavan mediante centrifugación y resuspensión, y luego se suspenden para inyección en un volumen igual de solución isotónica que tiene una osmolaridad fisiológica apropiada y está substancialmente libre de pirógenos y proteínas extrañas. La salina isotónica es una solución isotónica particularmente útil. Un portador farmacéuticamente aceptable se puede añadir a las células de músculo antes de que se administren a un sujeto. Alternativamente, si las células no se van a administrar inmediatamente, se pueden incubar en hielo a aproximadamente 4°C durante hasta 24-48 horas. Para dicha incubación, las células se pueden suspender en una solución fisiológica que tiene una osmolaridad apropiada y se ha probado para niveles de pirógeno y endotoxina. Dicha solución típicamente no contiene indicador de pH rojo fenol, y cualquier FBS suero, de preferencia es el usuario del sujeto más bien que u otro suero xenogenéico. Las células de músculo se pueden suspender, por ejemplo, en solución de Krebs-Ringer que comprende 5% de dextrosa, o en cualquier otra solución fisiológica. Las células se pueden aspirar y administrar a un sujeto en el medio de incubación. El volumen de salina o medio de incubación en el que se suspenden las células de músculo está típicamente relacionado con factores tales como el número de células que se va a inyectar y la extensión del daño debido a degeneración de tejido o defecto. Las células de músculo se pueden congelar para uso futuro. Las células se pueden tripsinizar y resuspender en cualquier medio de congelación apropiado (ver arriba; v.gr., medio que contiene 90% de suero de oveja y 10% de DMSO) . Las suspensiones de célula de músculo luego se pueden poner en alícuotas en viales de congelación criogénicos y congelarse a de alrededor de -70°C a alrededor de -86°C antes de transferencia a nitrógeno liquido, o se pueden congelar en una Unidad de Criopreservación de Nitrógeno liquido. Las células se pueden descongelar y usar para iniciar cultivos secundarios para preparación de suspensiones adicionales para uso posterior en el mismo sujeto, evitando de esta manera la inconveniencia de obtener una segunda muestra. La invención proporciona métodos para hacer una composición para reparar o aumentar un defecto de tejido en un sujeto. Estos métodos típicamente involucran obtener una biopsia dérmica y preparar una suspensión de fibroblastos pasados, autólogos que están substancialmente libres de proteínas inmunogénicas (v.gr., proteínas derivadas de suero de medio de cultivo) , obteniendo una biopsia de músculo y preparando una suspensión de células de músculo pasadas, autólogas, que también están libres de estas proteínas inmunogénicas, y combinar los fibroblastos con las células de músculo para generar una composición que se puede utilizar para tratar una condición tal como por ejemplo, incontinencia urinaria, reflujo vesicoureteral, o reflujo esofágico. Alternativamente, una suspensión de células de músculo no autólogas se puede preparar y combinar con los fibroblastos. 3. Composiciones que contienen componentes de matriz acelular biodegradable . Las composiciones de la invención pueden contener fibroblastos pasados, autólogos, con o sin células de músculo pasadas también pueden incluir componentes de matriz acelular biodegradable. Estas composiciones son apropiadas para inyección o implantación hacia un sujeto para reparar tejido que se ha degenerado. El término "biodegradable" como se utiliza en la presente denota una composición que no es biológicamente dañina y se puede degradar químicamente o '•descomponer por efectos naturales (v.gr., intemperie, bacterias de tierra, plantas, animales). Los ejemplos de matrices que se pueden utilizar en la presente invención incluyen, sin limitación, matrices acelulares que comprenden proteínas autólogas y no autólogas, y matrices acelulares que comprenden polímeros biodegradables . Cualquiera de un número de matrices acelulares biodegradables que contienen proteínas no autólogas se puede utilizar en las composiciones proporcionadas en la presente. Los ejemplos de matrices acelulares biodegradables incluyen matrices que contienen cualquier tipo de colágeno, o cualquier tipo de colágeno con glicosaminoglicanos (GAG) reticulados, por ejemplo, con glutaraldehído . Otras substancias de las que se pueden hacer matrices acelulares biodegradables útiles incluyen híalurón, ácido híaluróníco, restalina, y parleano. Las matrices que contiene colágeno incluyen, sin limitación, esponjas de colágeno absorbibles, membranas de colágeno y esponjosa de hueso. Los tipos útiles de colágeno incluyen, por ejemplo, colágeno bovino (v.gr., Z derm(R> y Zyplast (R) , comerciaimente disponibles de McGhan Medical Corporation, Santa Barbara, CA) , colágeno porcino, colágeno de cadáver humano (v.gr., Fascian1® (Fascia Biosystems, LLC, Beverly Hills, CA) , Cymetra (LifeCell Copr. ,
Branchburg, NJ) , o Dermalogenm, anteriormente producido por la Collagenesis Corp.), y colágeno humano autólogo (Autologen(R> , ver abajo). Fascian1* es particularmente útil. Este producto está disponible en cinco tamaños de partícula diferentes, cualquiera de los cuales se puede utilizar en composiciones y métodos descritos en la presente. Las partículas que son de 0.25 de tamaño son particularmente útiles . Las- esponjas de colágeno absorbibles se pueden comprar, por ejemplo, de Sulzer Calcitek, Inc. (Carlsbad, CA) . Estos vendajes de esponja de colágeno, vendidos bajo los nombres CollaTape(R), CollaCote(R), y CollaPlug(R) , están hechos de colágeno reticulado extraído de tendón de flexor (Aquiles) profundo bovino, y GAG. Estos productos son suaves, plegables, no frágiles y no pirogénicos. Más de 905 de una esponja de colágeno consiste típicamente de poros abiertos . Las matrices acelulares biodegradables pueden contener colágeno (v.gr., colágeno bovino o porcino tipo I) formado en, por ejemplo, una membrana delgada. Una de estas membranas se fabrica por Sulzer Calcitek y se vende como BioMendm. Otra de estas matrices membranosas se vende como Bio-Gide(R1 por Geistlich Sohne AG (Wolhusen, Suiza) , y está hecha de colágeno porcino tipo I y tipo III. El Bio-Gide(B) tiene una estructura dé bicapa, con una superficie que es porosa y permite el crecimiento interno de células, y una segunda superficie que es densa e impide el crecimiento interno de tejido fibroso. Las matrices acelulares biodegradables también se pueden hacer de esponjosa de hueso formada en gránulos o bloques. Este material consiste de hueso animal (v.gr., humano, primate no humano, bovina, ovejas, cerco o cabra) del que substancialmente todo el material orgánico (v.gr., proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, carbohidratos y pequeñas moléculas orgánicas tales como vitaminas y hormonas de no proteina) se han eliminado. Este tipo de matriz se llama en la presente como una "matriz anorgánica". Una de estas matrices, que se vende como gránulos de esponjosa Bio-Oss(R) y bloques de Bio-Oss<R! se fabrica por Geistlich Sóhne AG. Esta compañía también fabrica una matriz tipo bloque (colágeno Bio-OssÍR) ) que contiene hueso anorgánico y adicionalmente contiene aproximadamente 10% de fibras de colágeno en peso. Otras matrices acelulares biodegradables útiles pueden contener gelatina, ácido poliglicólico, tripa de gato, hueso desmineralizado, hueso anorgánico o hidroxiapatita, o mezclas de estas substancias. Una matriz hecha de hueso humano desmineralizado, por ejemplo, se forma en bloques pequeños y se vende como DynaGraft(n:' por GenSci Regeneration Laboratories, Inc. (toronto, Ontario). El hueso desmineralizado se puede combinar, por ejemplo, con colágeno para producir una matriz en la forma de una esponja, bloque o membrana. Polímeros sintéticos hechos de uno o más monómeros también se pueden utilizar para hacer matrices acelulares biodegradables que son útiles en la presente. Las matrices se pueden hacer de uno o más de estos polímeros sintéticos. Los polímeros sintéticos también se pueden combinar con cualquiera de las substancias arriba mencionadas para formar matrices. Diferentes polímeros que forman una sola matriz pueden estar en compartimentos o capas separadas. Por ejemplo, W. L. Gore & Associates, Inc. (Flagstaff, AZ) fabrica una matriz acelular biodegradable porosa (Material Regenerativo GORE RESOLUT XT) . Esta matriz está compuesta de un glicólido bioabsorbible sintético y fibra de copolímero de carbonato de trimetileno hacia la que pueden migrar las células, fijadas a una membrana oclusiva que está compuesta de un glicólido bioabsorbible sintético y copolímero de lacturo que no permite el desarrollo interno de células. Después de que se ha seleccionado una matriz acelular biodegradable, una suspensión concentrada de fibroblastos pasados autólogos con o sin células de músculo pasadas se puede distribuir uniformemente sobre la superficie de la matriz. Una suspensión concentrada típicamente se usa a fin de evitar exceder la capacidad de la matriz de absorber la suspensión líquida. Por ejemplo, una suspensión de célula aplicada a una matriz GORE RESOLUT XT generalmente puede tener un volumen entre alrededor de 94 ul y alrededor de 125 ul y contener entre aproximadamente 2.0 x 106 células y aproximadamente 4.0 x 10s células por centímetro cuadrado de matriz. Las células se pueden dejar fijarse a la matriz sin adición extra de medios. La incubación de las células con la matriz puede ocurrir, por ejemplo, a aproximadamente 37°C durante alrededor de 1-2 horas. Las células típicamente se fijan a y se distribuyen uniformemente a través del material de matriz después de aproximadamente sesenta minutos de incubación. En este tiempo, los recipientes de cultivo que contienen matrices cargadas de célula se pueden suplementar con medio de crecimiento adicional, y las células se pueden cultivar en la matriz durante aproximadamente 3 a 4 días. Debido a que las células se añaden a la matriz a densidad elevada de manera de llenar substancialmente el espacio dentro de la matriz, poca o ninguna proliferación ocurre durante el período de cultivo de 3-4 días. En realidad, la proliferación de célula significativa es típicamente indeseable durante este período debido a que dividir los fibroblastos puede secretar enzimas (v.gr., colagenasa) que pueden degradar o degradar parcialmente las matrices . La matriz con células típicamente se lava (v.gr., cuando menos 3 lavadas de 10 minutos cada una) con, por ejemplo, salina o medio que está libre de suero y rojo de fenol, a fin de remover substancialmente las proteínas inmunogénicas (v.gr., proteínas derivadas de suero de medio de cultivo si se usó suero que contiene medio no autólogo para el paso de sembrado de matriz) que podría producir una respuesta inmune cuando se administra a un sujeto. PBS fresco se puede utilizar para cada lavada. La matriz luego se puede incubar (v.gr., incubaciones de 2 horas de duración) en PBS fresco antes del uso. Después de la incubación, la matriz que contiene fibroblastos pasados, autólogos, con o sin células de músculo pasadas se puede colocar en el área de degeneración de tejido o defecto. Para matrices de esponja de colágeno (v.gr., CollaCote(R) ) , aproximadamente 1.5 x 107 a 2.0 x 107 células en aproximadamente 1,.5 mi de medio de crecimiento se pueden sembrar a una esponja de 2 cm por 4 cm de grueso (aproximadamente 2.5 a 3.0 mm de espesor). La esponja luego se puede incubar a 37 °C durante 1-2 horas sin adición extra de medio para permitir que substancialmente todos los fibroblastos se adhieran al material de matriz. Después de la adherencia de célula, se puede agregar medio de crecimiento adicional a la composición de matriz y célula, que luego se puede incubar a 37 °C durante 3-4 dias con un cambio de medio diario. Si el medio que contiene suero no autólogo se usó para el paso de sembrado de célula, la composición se puede remover del medio de crecimiento que contiene dicho suero y lavar repetidamente (v.gr., 3 veces o más) con PBS. Después de cada adición de PBS, la matriz se puede incubar durante 10-20 minutos antes de descartar el PBS. Después del lavado final, la composición se puede administrar inmediatamente a un sujeto, o se puede transferir a un vial de embarque que contiene una solución fisiológica (v.gr., solución de reb' s Ringer) y se incuba a aproximadamente 4°C durante hasta aproximadamente 24-48 horas . Para una matriz membranosa (v.gr., BioMend'®) , aproximadamente 3 x 106 a 8 x 105 fibroblastos en alrededor de 100 ul de medio de crecimiento se pueden sembrar hacia una membrana de 15 mm x 20 m de delgado (aproximadamente 0.5 a 1.0 mm de espesor) . la membrana se puede incubar a 37 °C durante aproximadamente 30-60 minutos sin adición extra de medio para permitir que substancialmente todas las células se adhieren al material de matriz. Después de la adherencia de célula, medio de crecimiento adicional se puede agregar a la composición de matriz y célula, que luego se puede incubar a 37°C durante 2-3 días con un cambio diario de medio. Las células típicamente se añaden a la matriz a densidad elevada (ver arriba) de manera de llenar substancialmente el espacio dentro de la matriz disponible para células. El lavado de la composición y ya sea uso inmediato o incubación se puede describir como arriba para las matrices de esponja. En el caso de una matriz de bloque tal como la matriz anorgánica arriba recibida (v.gr., el bloque Bio-OssiR>) o una matriz de hueso desmineralizado (v.gr., matriz Dynagraftm) , aproximadamente 1.2 x 107 a 2.0 x 107 células en aproximadamente 100 a 150 ul de medio de crecimiento se pueden sembrar hacia un bloque de material de matriz de 1 cm x 1 cm x 2 cm cúbicos . Las células típicamente se siembran lentamente hacia una cara de la cara de bloque. Una vez que el medio y células se han absorbido hacia el bloquer otra cara del bloque se puede sembrar de una manera similar. El procedimiento se puede repetir hasta que todas las caras del bloque se han sembrado y el bloque se satura completamente con medio. Se debe tener cuidado de evitar añadir exceso de medio y de esta manera ocasionar fuga de medio y células del bloque. La composición luego se puede incubar a 37 °C durante aproximadamente 60-120 minutos sin adición extra de medio para permitir que substancialmente todas las células se adhieran al material de matriz. Después de la adherencia de célula, se puede agregar medio de crecimiento adicional a la composición de matriz y célula, que luego se puede incubar a
37 °C durante 2-3 días con un cambio de medio diario. Las células se añaden típicamente a la matriz a densidad elevada (ver arriba) de manera de llenar substancialmente el espacio dentro de la matriz disponible para células con el mismo resultado arriba descrito. El lavado de la composición y ya sea uso inmediato o incubación son como se describe arriba para las matrices de esponja. Las composiciones que contienen fibroblastos pasados, autólogos y una matriz biodegradable de partícula pequeña (v.gr., Fascian1®, Cymetram, o DermalogenMR) se pueden preparar mezclando los componentes, por ejemplo, pasándolos de un lado a otro entre dos jeringas que están conectadas a través de una sujeción de luer. Fascian", por ejemplo, está típicamente disponible en jeringas (v.gr., jeringas de 3 ce) a 80 mg/jeringa. Las partículas de Fascianm se pueden lavar directamente en la jeringa antes del uso tomando un volumen pequeño (v.gr., 1.5 mi) de un tapón de lavado (v.gr., salina isotónica o solución de Kreb' s Ringers que contiene dextrosa) hacia la jeringa, conectando la primera jeringa a una segunda jeringa a través de una sujeción de luer, y haciendo pasar las partículas y solución de lavado de un lado al otro entre las dos jeringas varias veces. Para separar las partículas de la solución de lavado, la mezcla se puede transferir a un tubo estéril y las partículas de Fascianm se dejan sedimentar. La solución se puede remover (v.gr., decantar o aspirar) , y el proceso de lavado se puede repetir como se desee tomando las partículas hacia una jeringa fresca (v.gr., a través de una aguja calibre 18 o calibre 20) . Cuando las partículas de relleno se lavan apropiadamente, se pueden mezclar con fibroblastos y, opcionalmente, células de músculo utilizando el mismo procedimiento que para lavado. Las células (v.gr., 1 x 107 a 3 x 107 células) se pueden suspender en solución (v.gr., 1.5 mi de solución de Kreb' s Ringers con 5% de dextrosa) y tomarse hacia una jeringa. La jeringa que contiene las células se puede conectar a una jeringa que contiene partículas de relleno a través de una sujeción de luer, y los dos componentes se pueden mezclar haciéndolos pasar de un lado al otro entre las jeringas. La mezcla luego se puede transferir a un frasco de cultivo T-25 o a un plato de cultivo de tejido o un tubo de manera que las células se puedan fijar a las partículas de relleno. Alternativamente, la mezcla puede permanecer en las jeringas mientras que ocurre la fijación, aún cuando esto puede ser más perjudicial a las células. La mezcla se puede incubar durante la noche y luego transferirse a un recipiente (v.gr. , un vial o un tubo) para entrega a un clínico, o transferirse a una jeringa para administración a un sujeto. Un recipiente se puede entregar a un clínico y mantenerse en hielo durante la entrega. Cuando dichas matrices biodegradables acelulares de partícula pequeña se usan, una suspensión de las partículas que contienen célula se puede inyectar opcionalmente en lugar de implantarse hacia una área de degeneración o defecto de tejido. Cuando las células de músculo cultivadas se incluyen en una composición que contiene fibroblastos y una matriz acelular biodegradable, se pueden mezclar con los fibroblastos antes de sembrarse hacia las matrices. Alternativamente, se pueden sembrar hacia las matrices antes de o después de sembrar los fibroblastos . Cuando las células de músculo se siembran antes o después de los fibroblastos, la segunda siembra se puede realizar inmediatamente después de la primera siembra o después de que las células de la primera siembra se han adherido substancialmente al material de matriz. La invención también proporciona métodos para hacer composiciones que contienen fibroblastos pasados, autólogos junto con componentes de matriz. Estos métodos involucran de manera típica proporcionar una suspensión de fibroblastos pasados, autólogos que están substancialmente libres de proteínas inmunogénicas (v.gr., proteínas derivadas de suero de medio de cultivo) , proporcionando una matriz acelular biodegradable, incubando la matriz acelular biodegradable con la suspensión de fibroblasto de manera que los fibroblastos se integren sobre y dentro de la matriz, formando de esta manera una composición para reparar o aumentar tejido. Estos métodos también pueden incluir añadir una suspensión de células de músculo pasadas (v.gr., células de músculo pasadas, autólogas) a la matriz, ya sea junto o separadamente de los fibroblastos . 4. Composiciones que contienen agentes de agrupación Las composiciones de la invención pueden contener fibroblastos pasados, autólogos, junto con uno o más materiales de relleno inyectables biodegradables (es decir, agentes de agrupación) . Las composiciones son apropiadas para inyección hacia un sujeto a fin de reparar tejido que se ha degenerado. Además de fibroblastos y rellenos, las composiciones también pueden contener células de músculo pasadas (tipicamente células de músculo autólogas; ver arriba) . En una composición inyectable que contiene fibroblastos pasados, autólogos con o sin células de músculo, junto con un relleno acelular, biodegradable, las células tipicamente se mezclan con el relleno en una relación de aproximadamente 1:1 en volumen. Numerosos tipos de rellenos inyectables acelulares, biodegradables se pueden añadir a composiciones de la invención. Un relleno puede consistir de proteínas autólogas, incluyendo cualquier tipo de colágeno obtenido de un sujeto. Un ejemplo de dicho relleno es AutologenÍR) , anteriomente producido por Collagenesis Corp. (Beverly, MA) . AutologenÍR) es una dispersión de fibras de colágeno dérmico autólogo de un sujeto, y por lo tanto, no debe producir una respuesta inmune cuando se readministra al sujeto con células de músculo y) fibroblastos. A fin de obtener AutologentR), una muestra de tejido (v.gr., dermis, placenta, o cordón umbilical) se obtiene de un sujeto y se envía a Collagenesis Corp., en donde se procesa en una dispersión rica en colágeno. Aproximadamente 9.68 cm2 (1-1/2 pulgadas cuadradas) de tejido dérmico pueden proporcionar un centímetro cúbico (ce) de Autologen(R) . La concentración de Autologen(R1 se puede ajustar dependiendo de la cantidad requerida para corregir defectos o aumentar tejido dentro del sujeto. La concentración de Autologen(R! en la dispersión puede ser, por ejemplo, cuando menos aproximadamente 25 mg/L (v.gr., cuando menos 30 mg/L, por lo menos 40 mg/L, al menos 50 mg/L, o cuando menos 100 mg/L) . Un material de relleno inyectable acelular también puede contener proteínas no autólogas, incluyendo cualquier tipo de colágeno. Numerosos productos de colágeno están comercialmente disponibles y se pueden utilizar en composiciones de la invención. Los productos de colágeno humano también se encuentran comercialmente disponibles. Los ejemplos de colágeno comercialmente disponibles incluyen, sin limitación, productos de colágeno bovino reconstituido tal como Zyderm(R) y Zyplast<R), que contienen fibras de colágeno bovino reconstituidas y están reticuladas con glutaraldehido y suspendidas en salina fisiológica tamponada con fosfato con 0.3% de lidocaína. Estos productos son producidos por McGhan Medical Corporation de Santa Barbara, CA. Los productos de colágeno porcino también se encuentran comercialmente disponibles . Otros ejemplos de materiales de relleno útiles incluyen, pero no están limitados a, gelatina solubilizada, ácido poliglicólico, o suturas de tripa de gato. Un implante de matriz de gelatina particular, por ejemplo, se vende bajo la marca Fibril (R) . Este relleno contiene volúmenes iguales de (1) una mezcla de polvo de gelatina porcina y ácido o-aminocapróico disperso en una solución de cloruro de sodio al 0.9% (en volumen), y (2) una alícuota de plasma del sujeto. Otras substancias útiles como rellenos incluyen hialurón, ácido hialurónico, restalina, y parleano. La invención también proporciona métodos para hacer composiciones que contienen fibroblastos pasados, autólogos y rellenos acelulares biodegradables, con o sin células de músculo pasadas . Estos métodos involucran de manera típica proporcionar una suspensión de fibroblastos pasados, autólogos y, opcíonalmen e, células de músculo que están substancialmente libres de proteínas inmunogénicas (v.gr., proteínas derivadas de suero de medio de cultivo) , proporcionando uno o más materiales de relleno acelular biodegradable, y combinando el relleno con la suspensión de fibroblasto y célula de músculo. Alternativamente, suspensiones separadas de los dos tipos de célula se pueden combinar con el relleno. 5. Dispositivo para administrar composiciones de la invención La invención también proporciona un dispositivo para entregar composiciones que contienen células pasadas, autólogas hasta un punto próximo al sitio de degeneración o defecto de tejido (v.gr., la uretra, el orificio ureteral, o el esfínter esofágico inferior) . Dicho dispositivo puede consistir de una jeringa hipodérmica estéril que tiene una cámara de jeringa, un pistón dispuesto en la misma, un orificio que comunica con la cámara, y una composición farmacéutica que contiene fibroblastos pasados, autólogos, de modo que la composición farmacéutica se dispone dentro de la cámara. La composición farmacéutica puede contener fibroblastos pasados autólogos y uno o más de los siguientes : células de músculo pasadas (v.gr., células de músculo pasadas, autólogas), un portador farmacéuticamente aceptable, un relleno acelular biodegradable, y componentes de matriz acelular biodegradables . La jeringa hipodérmica puede tener una capacidad de cualquier tamaño apropiado (v.gr., 1 ce, 3 ce, 10 ce, o más de 10 ce) . La jeringa también se puede conectar a una aguja de un tamaño apropiado (v.gr., calibre 14, calibre 16, calibre 18, calibre 20, calibre 23, calibre 25, calibre 27 o calibre 30) y longitud (v.gr., menos de 20 cm, 20 cm, 25 cm, 30 cm, 35 cm, o 40 cm, o más de 40 cm) . 6. Métodos para reparar o aumentar tejido. Los métodos de la invención se pueden utilizar para administrar una cantidad efectiva de una composición de la invención a un sujeto de manera de reparar o aumentar tejido dentro del sujeto. Como se utiliza en la presente, el término "cantidad efectiva'"'' . se refiere a una cantidad de una composición farmacéutica que puede proporcionar volumen apropiado para corregir un defecto de te ido en el sujeto, o que puede promover regeneración de tejido en tejido que se ha degenerado en un sujeto. ios métodos de la invención son particularmente útiles para administrar composiciones farmacéuticas para tratar degeneración de tejido o defectos que están asociados con desórdenes tales como por ejemplo, incontinencia urinaria, reflujo vesicoureteral o GERD. Los métodos de la invención involucran típicamente administrar una o más composiciones de la invención a un sujeto, por ejemplo, mediante inyección o implante. Cuando una combinación de fibroblastos pasados, autólogos, células de músculo pasadas (v.gr., células de músculo . pasadas, autólogas) , y relleno se va a administrar a un sujeto, los componentes se pueden administrar simultánea o separadamente. Por ejemplo, fibroblastos pasados, autólogos se pueden administrar a un sujeto como una inyección, células de músculo pasadas, autólogas, se pueden administrar como una inyección separada, y un material de relleno se puede administrar como todavía otra inyección. Las inyecciones pueden estar separadas por cualquier duración de tiempo apropiada (v.gr., 5 minutos, 30 minutos, 1 día, 3 días, 1 semana, 2 semanas, o más de 2 semanas) . Alternativamente, los componentes se pueden combinar antes de la inyección. Por ejemplo, una composición que contiene fibroblastos pasados, autólogos, células de músculo pasadas, y un relleno se pueden administrar en una sola inyección. Alternativamente, una mezcla de fibroblastos pasados autólogos y células de músculo pasadas se puede administrar como una inyección, y un relleno se puede administrar en una inyección separada. Los métodos de la invención se pueden utilizar para tratar cualquier especie de mamífero (v.gr., humanos, primates no humanos, perros, vacas, cerdos, caballos, ovejas, gatos, conejos, ratones, ratas, cobayos, hámsters). Los métodos de la invención son particularmente útiles para tratar humanos. Los métodos de la invención se pueden utilizar para tratar incontinencia urinaria y/o reflujo vesicoureteral reformando o reparando tejido (v.gr., estructuras de esfínter) que rodean la uretra, uréteres, y esófago, ocasionando de esta manera una reducción en tamaño de lúmenes anormalmente amplios y sueltos. Estos métodos involucran colocación (v.gr., inyección o implante) de composiciones de la invención hacia las regiones que rodean la uretra, uréteres, o esófago, o directamente hacia una cavidad creada en la región que se va a reparar o aumentar. La uretra masculina está dividida en las regiones prostética, membranosa y de pene. La región membranosa es la porción más gruesa de la uretra, y pasa a través del diafragma genitourinario. La capa de músculo esquelético de la uretra membranosa contiene el esfínter urinario externo (o voluntario) , que forma casi un anillo completo alrededor de la uretra. Los métodos de la invención se pueden utilizar para administrar (v.gr., mediante inyección o implante hacia la pared uretral) composiciones que contienen fibroblastos autólogos a un sujeto con incontinencia urinaria para mejorar la función de una uretra membranosa dañada o defectuosa. La uretra femenina es una estructura tubular muy corta y dilatable que mide aproximadamente 4 cm de longitud. La uretra empieza en la salida de vejiga y se extiende a través de la membrana perineal, corriendo detrás de la sinfísís púbica y terminando en el orificio uretral externo en el perineo. La uretra femenina representa el mecanismo de esfínter completo para la vejiga. Internamente está cubierta por una capa mucosa y su núcleo es una pared muscular fuerte compuesta de tres capas musculares principales . La capa media contiene fibras de músculo estriado condensadas que forman un anillo; la incontinencia puede resultar si estas fibras de músculo son parcialmente deficientes. La función uretral se puede alterar o dañar por problemas anatómicos dentro de la uretra o dentro de órganos adyacentes tales como la vagina y la vejiga. La función de una uretra membranosa dañada o defectuosa se puede mejorar usando métodos de la invención para administrar (v.gr., mediante inyección o implante hacia la pared uretral) composiciones que contienen fibroblastos autólogos y, opcionalmente, células de músculo (v.gr., células de músculo autólogas) . Estas composiciones pueden contener las células en un diluyente (v.gr., salina), en una suspensión que contiene un material de relleno biodegradable, o sembrarse hacia una matriz acelular biodegradable . El uréter es un conducto muscular que se contrae en respuesta al reflejo de estirado durante el transporte de orina del riñon a la vejiga. El orificio del uréter distante hacia la vejiga se conoce como meato ureteral, y está colocado en el aspecto posterolateral de la pared de vejiga en los lados de un músculo subyacente y una estructura triangular llamada la trígona vesical. La musculatura del uréter y la trígona vesical está en continuidad debido a que el revestimiento muscular ureteral pasa a través del meato y se abre fuera del suelo de la vejiga. La longitud del uréter intravesical y el revestimiento muscular longitudinal intrínseco del uréter submucosal que se inserta hacía la trígona superficial son críticos para la función normal del uréter distante. Estos factores son importantes para la forma del orificio ureteral, y cuando el orificio tiene una forma alterada, hay una tendencia aumentada a mala posición del orificio, porciones más cortas de uréter intravesical, y reflujo como consecuencia. Los procedimientos para mejorar la función del esfínter uretral o musculatura ureteral, opcionalmente, se pueden conducir bajo anestesia local o general. Para inyección hacia estructuras ureterales, se puede realizar una cistoscopía, típicamente en una base de paciente externo o aún durante una visita de oficina. Un cistoscopio se puede introducir hacia la uretra de modo que su punta esté colocada a una distancia visual apropiada del lumen de uretra/uréter distendido anormal. Las inyecciones se pueden hacer periuretral o transuretralmente. Para tratar a un hombre con incontinencia urinaria, una aguja de cualquier calibre y longitud apropiados (v.gr., una aguja calibre 20 x 35) se puede introducir a través del canal de trabajo del cistoscopio, orientado hacia el tejido circundante uretral desde el lumen distendido al exterior, y se hace avanzar hacia el tejido. Una composición de la invención que contiene fibroblastos autólogos, con o sin células de músculo (v.gr., células de músculo autólogas) y, opcionalmente, un relleno o matriz acelular biodegradable, se puede inyectar hacia el tejido circundante uretral hasta que se logra el estrechamiento deseado del lumen. Para tratar a una mujer con incontinencia urinaria, una aguja de cualquier calibre y longitud apropiados (v.gr., una aguja calibre 20 x 30 cm) se puede insertar pe iuretraimente, de modo que la aguja se dirija con el bisel hacia abajo y se haga avanzar hacia el cuello de vejiga con la dirección de la colocación de aguja guiada por el eje del cistoscopio. La observación de la colocación de aguja ideal hacia el tejido mucosal circundante se pueden obtener mediante movimiento suave de la aguja observada desde el campo visual cistoscopico antes de inyectar la preparación de célula empacada hacia una jeringa conectada a la aguja. Las inyecciones se pueden hacer en las posiciones de las "3 horas y/o 9 horas". _ El estrechamiento del lumen se puede supervisar continuamente por el cistoscopio hasta que se completa la inyección. Para tratar reflujo vesicoureteral, un sujeto se puede colocar en una posición de litotorrtía dorsal o modificada y un cistoscopio se puede insertar y hacer avanzar hasta que se visualizan los uréteres. Una aguja (v.gr., una aguja calibre 18, k una aguja calibre 20, una aguja calibre 23, una aguja calibre 25, o una aguja calibre 27) que es de aproximadamente 25 a 40 cm de longitud (v.gr., 25 cm, 30 cm, 35 cm o 40 cm de longitud) se puede hacer avanzar ha través del canal de trabajo. La punta de aguja se puede insertar hacia la mucosa de vejiga bajo división directa en la "posición de las 6 horas"" hacia el espacio subureteral, aproximadamente 4 a 6 mm distante al orificio ureteral. La colocación apropiada de la aguja se puede facilitar colocando un catéter Frenen hacia el uréter. La aguja luego se puede hacer avanzar de manera próxima. Una composición que contiene fibroblastos autólogos con o sin células de músculo (v.gr., células de músculo autógenas) y opcionalmente un relleno o matriz acelular biodegradable, se puede inyectar lentamente hasta que un bulto casi oblitera el orifico ureteral. Para impedir la extravasión, se realiza de manera tipica una sola inyección precisa, y la aguja se puede mantener en posición durante 2 o 3 minutos antes de retirarse. El esófago es un canal muscular que es de aproximadamente 20.32 cm (8 pulgadas) de longitud y se extiende desde la faringe al estómago. Los extremos superior e inferior del esófago ambos tienen estructuras de esfínter que permanecen cerradas excepto durante el tragado. Una deficiencia en el esfínter isofágico inferior (LES) puede permitir que los contenidos del estómago regresen hacia el esófago, ocasionando de esta manera GERD. Para mejorar la función del LES y aliviar síntomas de GERD, las composiciones de la invención se pueden colocar (v.gr., inyectar o implantar) hacia el esófago en o cerca del LES. Un endoscopio se puede utilizar para visualizar el LES, y una aguja de cualquier tamaño y longitud apropiados (v.gr., una aguja calibre 23 x 25 cm, o una aguja calibre 23 x 1.5 cm fijada a un catéter) se inserta a través del canal de trabajo del endoscopio. Con el bisel orientado hacia adentro hacia el lumen esofágico, la aguja luego se puede insertar hacia la mucosa esofágica ligeramente próxima al LES. Una composición de la invención se puede inyectar hacia la pared del esófago en diversas ubicaciones (v.gr., en las posiciones de 3 horas, 6 horas, 9 horas y 123 horas) , hasta que se logra el volumen deseado de la mucosa. La invención también proporciona métodos para administrar composiciones de la invención para aumento y/o reparación de tejidos dérmicos, subcutáneos y fasciales. Las composiciones que contienen fibroblastos pasados, autólogos, con o sin células de músculo pasadas, componentes de matriz, y/o rellenos se pueden inyectar o implantar hacia un sujeto para tratar, por ejemplo, cicatrización, celulítis, flojedad de el o adelgazamiento de piel, arrugas, heridas (v.gr., heridas agudas, crónicas, parciales o de espesor completo, quemaduras, raspaduras de presión, y úlceras), deficiencias de pecho, desórdenes periodontales, defectos de una mucosa oral, trauma a una mucosa oral, diabetes, estasis venosa, hernias, daño a ligamentos, tendones y músculos de las articulaciones, y alopecia. los métodos para tratar estas condiciones pueden involucrar, por ejemplo, inyectar hacia el sitio de la deficiencia o defecto una composición que contiene fibroblastos pasados, autólogos, y células de músculo pasadas (v.gr., células de músculo pasadas, autólogas), en donde las células están substancialmente libres de proteínas derivadas de suero de medio de cultivo.
La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrito en las reivindicaciones. EJEMPLOS Ejemplo 1 - Método para obtener una suspensión de fibroblasto inyectable. Se iniciaron cultivos de fibroblasto dérmico de una muestra de biopsia de espesor total de 1-5 mm de la piel, o una muestra más gruesa si el tejido estaba disponible. Debido al fenómeno de rechazo de aloinjerto, fue esencial que los fibroblastos cultivados sean histocompatibles con el huésped. La hístocompatibilidad se aseguró obteniendo una biopsia del sujeto a tratar, y cultivando los fibroblastos de esta muestra. Antes del inicio del cultivo, la biopsia se lavó repetidamente con agentes antibióticos y antifungales (ver arriba) . La epidermis y el tejido que contiene adipocito subcutáneo se removieron de manera que el cultivo resultante estuviera substancialmente libre de células de no fibroblasto. La muestra restante de dermis se dividió finamente con un escalpelo o tejidas. Las piezas individuales de tejido se colocaron con un fórceps sobre la superficie seca de un frasco de cultivo 'de tejido T-25 y se dejaron fijar durante entre 2 y 5 minutos, o como se necesitó dependiendo del tejido y la temperatura en el laboratorio y capucha de cultivo. Una cantidad pequeña de medio
(generalmente 1.5 a 2 mi) se añadió lenta y cuidadosamente de manera de no desplazar los fragmentos de tejido ligados. Después de 48-72 horas de incubación, el frasco se alimentó con medio adicional que contiene antibióticos convencionales. Las células se mantuvieron en medio con antibióticos durante 14 días, desde cuyo punto las células se incubaron en medio libre de antibiótico que contiene Gentamicina. Durante las primeras etapas de cultivo se deseó que los fragmentos de tejido permanecieran fijados al fondo de los frascos de cultivo; fragmentos que se separaron se reimplantaron hacia nuevos frascos. Los fibroblastos se estimularon a crecer por una breve exposición a tripsina/EDTA. Esta exposición fue demasiado breve para liberar las células de su fijación. Este proceso permitió una distribución más uniforme de las células sobre la superficie de frasco, y promovió proliferación más rápida hacia confluencia. Inmediatamente después de que los cultivos quedaron establecidos y se estaban acercando a confluencia, muestras de los fibroblastos se removieron para almacenamiento congelado. Debido a que el número de pasajes de fibroblastos humanos es típicamente limitado, el almacenamiento de fibroblastos de pasaje temprano se prefirió. El medio de congelación contenía típicamente 7-10% de DMSO, y 20% de suero autólogo o FBS, aún cuando las células también se pudieron congelar en glicerol o 90% de suero. Una vez que las células fueron confluentes, se pasaron hacia nuevos frascos mediante tripsinización . Para expansión, frascos individuales se dividieron 1:3 en frascos T-150 de triple fondo que tuvieron una área de cultivo total fue 450 cm2. Estos frascos se sembraron con aproximadamente 6 x 106 células y rindieron alrededor de 1.8 x 101 células. Cuando la capacidad de los frascos se alcanzó (típicamente después de 7-10 días de cultivo) el medio de crecimiento se reemplazó con medio completo libre de suero. A continuación, las células se incubaron a 37 °C durante cuando menos 2 horas (típicamente más de 12 horas) en medio libre de proteína. La incubación en medio libre de suero removió substancialmente de las células las proteínas que se derivaron del suero bovino fetal que, si están presentes, habrían sido inmunogénicas en el sujeto y ocasionarían una reacción alérgica . Al final de la incubación en medio libre de suero, las células se removieron del los frascos de cultivo de tejido mediante tripsína/EDTA, se lavaron extensamente mediante centrifugación y resuspensión, y se suspendieron para inyección en un volumen igual de salina isotónica inyectable. Cinco a diez frascos T-150 de triple fondo, crecidos a capacidad, proporcionaron aproximadamente 3 x 107 a 1 x 108 células, que fue suficiente para formar aproximadamente 1-3 mi de suspensión; Alternativamente, las células se pudieron transportar a 4°C en tanto se inyectaran dentro de 18 horas del tiempo en que la suspensión se hizo. Las células se suspendieron en un volumen igual de medio completo, excepto por la ausencia de indicador de pH de rojo de fenol y la reposición de FBS con suero del sujeto. Las células se aspiraron e inyectaron en el medio de transporte. El volumen de salina o medio de transporte en el que las células se suspendieron no fue critico. Ejemplo 2 - Método para obtener una población de célula inyectable en una suspensión viscosa Cuando se requirió un volumen grande de material de mejora de volumen, se usó un método alternativo para preparar una suspensión inyectable de células. Este método fue idéntico a los métodos descritos en el Ejemplo 1 hasta que se obtuvo una población de aproximadamente 106 células . Se formó luego un gránulo de plasma en el fondo de un plato de cultivo de tejido de 60 mm o 100 mm añadiendo 1 mi del plasma del sujeto y 50-100 ul de 300 mM de CaCl2. Se sembraron fibroblastos dérmicos cultivados (106 células en 2-10 mi) sobre la superficie del gránulo y se cultivaron durante 7 días adicionales en medio completo. Después de 7 dias, el medio completo se cambió por medio libre de suero . Una hora después de la reposición inicial de medio, el medio se removió nuevamente y se coloró con medio libre de suero fresco. Las células se incubaron durante otras 14-18 horas. El gránulo luego se espiró hacia una jeringa y se inyectó como se necesitó. Ejemplo 3 - Método para obtener una suspensión inyectable de células de músculo. Se realizó una biopsia de músculo para recoger una muestra que es de tamaño de aproximadamente 0.5-1.0 cm3, de modo que se obtuvo alrededor de 0.5-1 g de tejido. El tejido se disoció mediante agitación suave en medio Ham' s FIO, y cualquier tejido conector o graso obvio se remueve con un fórceps. La muestra de tejido restante se transfirió a 5 mi de tripsina en un plato de 100 mm, y horas de rasurar estériles se usaron para desmenuzar el tejido en piezas no mayores de 1 mm3. La suspensión desmenuzada se transfirió luego a un frasco estéril que contiene una barra de agitación, y se añade tripsina/EDTA a un volumen final de 20-25 mi. La suspensión se agita muy suavemente durante 20 minutos a 37 °C. Una vez que las piezas de tejido se sedimentan al fondo del frasco, el sobrenadante se decanta a un tubo centrifugo de plástico de 50 mi en hielo. Se añade FBS a una concentración final de 10% a fin de neutralizar la tripsina. Los pasos de tripsinizacion se repiten a un máximo de tres veces, o hasta que no permanecen piezas de tejido rosadas. Los sobrenadantes se centrifugan a 800-900 g durante 5 minutos . los granulos de célula finales se agrupan en 10 mi de medio de crecimiento de músculo Humano/medios acondicionados de 1:1 (HuGM/CM) . El HuGM contiene Ham' s FIO,
10% de FBS, 5% de suero de becerro bovino (definido y suplementado con hierro; Hyclone, Logan, ÜT) , 0.5% de extracto de embrión de polo (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 ü/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina. CM es HuGM que se acondiciona mediante incubación con fibroblastos
MRC-5 (.American Type Culture Collection, Manassas, VA) durante la noche y luego se filtra a través de filtros de 0.45 um. Cada O.lg de tejido típicamente rinde 5 x 103 células . Las células se colocan en placas de cultivo de tejido de cualquier tamaño apropiado (v.gr., 35 mm, 60 mm, o 100 mm) y se alimentan con 1:1 de HuGM/CM a 1 o 2 días si las células con 30-40% confluentes. De otra manera, las células se alimentan con 1:1 de HuGM/CM a 4 o 5 días o cuando las células alcanzan 40% de confluencia (cualquiera que sea más pronto) . Las células luego se alimentan con HuGM cada 2-3 días, menos que sean menos de 40% confluentes, en cuyo caso se alimentan con 1:1 de HuGM/CM. Cuando las células alcanzan 70-80% de confluencia, se someten a trípsinización, se dispersan en HuGM, y se siembran en platos de 100 mm frescos a 5-10 x 10s células por plato en 10 mi de HuGM. Los platos de manera típica son aproximadamente 20% confluentes después de subcultivo. Las células se expanden y subcultivan hasta que se obtiene un número apropiado. Las células de músculo se congelan para uso futuro. Las células se tripsinizan y recogen hacia un tubo de 15 mi. El número de células se determina usando un hemocitómetro, y las células se centrifugan a 800-900 g durante 2 minutos. El medio se aspira y las células se resuspenden en medio de congelación (90% de suero de becerro, 10% de sulfóxido de dimetilo) para proporcionar aproximadamente 2 x 106 células/mi. La suspensión de célula se coloca en alícuotas a 0.5 mi por vial de congelación criogénico de 2 mi y, los viales se congelan en una caja llenada con espuma a -70°C antes de transferir a nitrógeno líquido. OTRAS MODALIDADES Se debe entender que aún cuando la invención se ha descrito en conjunción con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior se pretende para ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones anexas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.