BRPI0717388A2 - Materiais ecm processados com melhores perfis de componentes - Google Patents

Description

"MATERIAIS ECM PROCESSADOS COM MELHORES PERFIS DE COMPONENTES"

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

O presente pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisório dos Esta- dos Unidos número de série 60/853.584, depositado em 23 de outubro de 2006, intitulado "PROCESSED ECM MATERIALS WITH ENHANCED COMPONENT PROFILES" que está por meio deste incorporado pela referência na sua íntegra.

Antecedentes da Invenção

A presente invenção diz respeito de um modo geral a materiais de enxerto médico e, em particular, a materiais de enxerto médico derivados de materiais do tecido.

Uma variedade de materiais de matriz extracelular (ECM) processados foi proposta para o uso em enxerto médico, cultura celular e outras aplicações relacionadas. Por exem- plo, foram propostos materiais de enxertos médicos e cultura celular contendo submucosa derivada de tecidos de intestino delgado, estômago ou bexiga urinária. Ver, por exemplo, patentes US 4.902.508, 4.956.178, 5.281.422, 5.554.389, 6.099.567 e 6.206.931. Além dis- so, Cook Biotech lncorporated, West Lafayette, Indiana, fabrica atualmente uma variedade de produtos médicos baseados na submucosa do intestino delgado com o nome comercial SURGISIS®, STRATASIS® e OÁSIS®.

Foram também propostos materiais médicos derivados de membrana do embasa- mento do fígado, por exemplo, na patente US 6.379.710. Igualmente, materiais ECM deriva- dos de âmnio (ver, por exemplo, patente US 4.361.552 e 6.576.618) e de membrana da cápsula renal (ver pedido de patente Internacional PCT WO 03/002165 publicado em 9 de janeiro de 2003) foram propostos para aplicações médicas e/ou cultura celular.

Têm sido feitas tentativas de fornecer um material ECM processado que retém substâncias medicinalmente significativas sem ser colágeno. Entretanto, a fim de preparar um ECM processado do qual componentes indesejados foram removidos, o material é tipi- camente submetido a uma bateria de manipulações, que pode ter conseqüências indesejá- veis para os componentes desejáveis contidos no material. Por exemplo, submucosa e ou- tros materiais ECM têm mostrado incluir uma variedade de componentes desejáveis sem ser colágeno que pode contribuir para a bioatividade dos materiais e para seu valor em enxerto médico e outros usos. Como exemplos, materiais ECM podem incluir fatores de crescimen- to, proteínas de adesão celular e proteoglicanos que podem ser benéficos quando retidos no ECM processado. Entretanto, é difícil reter seletivamente estes componentes ao mesmo tempo removendo altos níveis de componentes indesejados na preparação de um enxerto medicinalmente aceitável.

Continua haver uma necessidade de biomateriais que não possuam apenas as pro- priedades físicas necessárias e altos níveis de biocompatibilidade e esterilidade, mas tam- bém os níveis desejados de componentes benéficos. Métodos para preparar e usar estes materiais, bem como dispositivos médicos formados a partir desses materiais, são também necessários. A presente invenção aborda esta necessidade.

Sumário da Invenção

Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um material de enxerto médico

incluindo um material de matriz extracelular (ECM) processado. O material ECM retém com- ponentes de colágeno e não colágeno e apresenta desejavelmente um caráter angiogênico. Ao mesmo tempo, o material ECM tem baixos níveis de componentes indesejados tais como lipídios nativos, ácidos nucléicos (por exemplo, DNA), e/ou componentes de imunoglobulina A (IgA). Em modalidades preferidas, o material ECM inclui submucosa.

Em uma modalidade, a presente invenção diz respeito a um material de enxerto médico incluindo um material de matriz extracelular (ECM) descelularizado estéril. O materi- al ECM inclui fator de crescimento-2 (FGF-2) de fibroblasto nativo e imunoglobulina A (IgA) nativa a um nível de não mais que 20 //g/g. Em algumas formas, o material pode ter um teor lipídio de não mais que cerca de 4 %. Em modalidades preferidas, o material ECM isolado inclui submucosa e tem um IgA nativo ao nível de não mais que 5 //g/g e um teor de lipídio nativo de não mais que cerca de 3 %.

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um material de en- xerto médico incluindo um material de matriz extracelular (ECM) descelularizado estéril. O material ECM tem um teor de FGF-2 nativo de pelo menos cerca de 10 ng/g e pelo menos um de e de certa forma cada um de (i) IgA nativo ao nível de não mais que cerca de 20 /vg/g; (ii) lipídios nativos ao nível de não mais que cerca de 4 % em peso; (iii) ácido hialurônico nativo ao nível de pelo menos cerca de 50 pg/g; e (iv) glicosaminoglicano sulfatado nativo ao nível de pelo menos cerca de 500 //g/g. Em certas modalidades preferidas, o material ECM inclui submucosa. Em formas adicionais, o material ECM tem um IgA nativo ao nível de não mais que cerca de 5 //g/g e um teor de lipídio nativo de não mais que cerca de 3 % em peso.

É adicionalmente fornecido pela invenção, um método para tratar um paciente. O método inclui enxertar o paciente com um material de enxerto médico da invenção.

A presente invenção adicionalmente diz respeito a um método para preparar um material de enxerto médico. O método compreende fornecer um material de matriz extrace- lular (ECM) de partida. O material ECM de partida é tratado para diminuir o teor de lipídio, ácido nucléico e/ou IgA e/ou outra imunoglobulina do material enquanto o material retém um nível significativo de fator(s) de crescimento, proteoglicanos e/ou glicosaminoglicanos. Em certas modalidades, o método inclui tratar o material ECM de partida com uma solução de detergente iônico diluído para romper as membranas celulares e nucleares e com uma solu- ção básica para solubilizar e remover o DNA e outros materiais de ácido nucléico. O método pode adicionalmente incluir tratar o material ECM com um solvente orgânico para remover lipídios do material e/ou com uma solução desinfetante oxidante, por exemplo, contendo um composto de peróxi, para desinfetar o material. O material ECM é preferivelmente rinsado para remover resíduos deixados pelas soluções.

Materiais de enxerto médico da invenção podem ser fornecidos em uma ampla va- riedade de formas. Por exemplo, um material de enxerto médico pode ser fornecido como uma ou mais folhas, uma pasta, uma esponja, uma solução aquosa não gelificada, um pó, ou um gel. Combinações dessas formas são também contempladas.

As várias formas de um material de enxerto médico podem ser usadas em uma ampla variedade de aplicações médicas (incluindo veterinária). Exemplos incluem o reparo ou reconstrução de tecido, tais como tecido nervoso, tecido dérmico (por exemplo, em cui- dado de ferida), tecido cardiovascular (incluindo tecido vascular e tecido cardíaco), tecido pericardial, tecido muscular, tecido da bexiga, tecido ocular, tecido periodontal, osso, tecido conectivo tais como tendões ou Iigamentos e outros.

Modalidades adicionais bem como aspectos e vantagens da invenção ficarão aqui aparentes a partir das descrições.

Descrição Resumida dos Desenhos

A figura 1 descreve um material de enxerto médico da invenção formada a partir de uma camada única de um material de matriz extracelular (ECM) isolado do tecido de um vertebrado de sangue quente. A figura 2 descreve um material de enxerto médico da invenção formada a partir de

duas camadas de um material ECM isolado do tecido de um vertebrado de sangue quente.

A figura 3 fornece uma vista lateral de um dispositivo da válvula protética da inven- ção que inclui um material ECM anexado a uma armação.

A figura 4 fornece uma vista lateral esquerda do dispositivo da válvula protética descrita na figura 3.

A figura 5 fornece uma vista lateral direita do dispositivo da válvula protética descri- ta na figura 3.

Descrição Detalhada da Invenção

Com o propósito de promover um entendimento dos princípios da invenção, será agora feita referência a certas modalidades desta e linguagem específica será usada para descrever a mesma. No entanto, deve-se entender que não será feita nenhuma limitação do escopo da invenção, tais alterações e modificações adicionais nas modalidades descritas e tais aplicações adicionais dos princípios da invenção da maneira aqui ilustrada sendo con- templadas como ocorrerão normalmente aos versados na tecnologia a qual a invenção diz respeito.

Da maneira revelada anteriormente, em um aspecto, a invenção diz respeito a ma- teriais de enxerto da matriz extracelular tendo perfis de componentes exclusivos que são baixos em componentes indesejados ao mesmo tempo em que retêm níveis significativos de componentes desejados. Estes materiais exclusivos podem ser preparados processando métodos que compreendem tratar um material de partida de ECM relativamente impuro para diminuir o teor dos componentes indesejados, tais como ácido nucléico, lipídios e/ou imuno- globulinas tal como IgA1 ao mesmo tempo retendo níveis substanciais de componentes de- sejados tais como fator de crescimento(s), proteoglicanos e/ou glicosaminoglicanos (GAGs). Tipicamente, o material de partida de ECM será tratado com uma solução detergente bran- da, tal como uma solução detergente iônica ou não iônica. A baixa concentração de deter- gente permite uma retenção de um nível substancial de componentes desejados, tais como aqueles notados anteriormente. Em certos modos de operação, o material ECM será tratado com uma solução aquosa de dodecil sulfato de sódio (SDS) ou um outro detergente iônico ou não iônico a uma concentração detergente de cerca de 0,05 % a cerca de 1 %, mais pre- ferivelmente cerca de 0,05 % a cerca de 0,3 %. Este tratamento pode ser por um período de tempo efetivo para romper as membranas celulares e nucleares e para reduzir o teor de i- munoglobulina (por exemplo, IgA) do material ECM1 tipicamente na faixa de cerca de 0,1 hora a cerca de 10 horas, mais tipicamente na faixa de cerca de 0,5 horas a cerca de 2 ho- ras. Processar o material ECM isolado desta maneira rompe preferivelmente as membranas celulares e nucleares e resulta em um material com um teor de IgA substancialmente redu- zido, reduzindo assim a imunogenicidade do material. Por exemplo, um material ECM pro- cessado da invenção pode ter um teor de IgA nativo de não mais que cerca de 20 //g/g. Em modalidades preferidas, um material ECM da invenção pode ter um teor de IgA nativo de não mais que 15 //g/g, não mais que 10 gg/g, ou ainda não mais que 5 //g/g. Em certas mo- dalidades, o material ECM processado não inclui essencialmente nenhum IgA nativo. Por "essencialmente nenhum IgA" significa que o material ECM isolado inclui IgA de baixos ní- veis detectáveis. Meios para detectar IgA são bem conhecidos na tecnologia e incluem, por exemplo, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). Deve-se entender em relação a isto, que materiais ECM obtidos de fontes diferentes podem ter imunoglobulinas diferencia- das que predominam no tecido. Espera-se que as técnicas de processamento aqui revela- das sejam efetivas para reduzir o teor de materiais ECM em outras imunoglobulinas, incluin- do aquelas que predominam no tecido da fonte. Consequentemente, outros aspectos da invenção dizem respeito ao isolamento de um material ECM que tem níveis substancialmen- te reduzidos (por exemplo, menos que cerca de 20 //g/g) de (i) a imunoglobulina predomi- nante no tecido da fonte, ou (ii) o teor total de imunoglobulina (a soma de todas imunoglobu- linas no tecido).

Além de tratar um material ECM com um meio detergente, o material ECM pode ser colocado em contato com outros agentes que participam na obtenção do perfil do compo- nente ECM desejado. Por exemplo, o material ECM pode ser tratado com um meio aquoso, preferivelmente básico, no qual o DNA é solúvel. Um meio como esse pode em certas for- mas ter um pH na faixa acima de 7 a cerca de 9, com pH's na faixa de cerca de 8 a cerca de 8,5 fornecendo particularmente benefícios em algumas modalidades. O meio aquoso básico pode incluir um tampão, desejavelmente um tampão biocompatível tal como tris(hidroximetil)aminometano (IRIS), e/ou um agente quelante tal como ácido etileno diami- na tetracético (EDTA). Em uma forma preferida, o meio de solubilização do ácido nucléico é uma solução de tampão MS-borato-EDTA (TBE). Em uma outra forma preferida, o meio de solubilização do ácido nucléico é uma solução de hidróxido de amônio. Este tratamento com um meio de solubilização do DNA pode ser por um período de tempo efetivo para reduzir o teor do DNA do material ECM, tipicamente na faixa de cerca de 0,1 hora a cerca de 10 ho- ras, mais tipicamente na faixa de cerca de 0,5 hora a cerca de 2 horas.

Além de tratamento com detergente e meios de solubilização do DNA, métodos de preparar materiais de enxerto médico da invenção podem envolver tratamento com um meio líquido que resulta em uma redução substancial do nível de componentes do lipídio do mate- rial ECM. Por exemplo, o teor de lipídio nativo resultante do material ECM pode ser reduzido a não mais que cerca de 4 % em certas modalidades. Isto pode ser realizado, por exemplo, por um processo preparatório que envolve uma etapa de tratar o material ECM com um sol- vente orgânico líquido no qual os lipídios são solúveis. Tais solventes orgânicos adequados incluem, por exemplo, solventes miscíveis em água, incluindo solventes orgânicos polares. Estes incluem álcoois de baixo peso molecular (por exemplo, Ci a C4), por exemplo, meta- nol, etanol, isopropanol e butanóis, acetona, clorofórmio e outros. Solventes orgânicos adi- cionais incluem solventes não polares tais como hexano, benzeno, tolueno e similares. Em modalidades mais preferidas, o material ECM processado será processado para ter um teor de lipídio nativo não mais que cerca de 3 %, ou não mais que cerca de 2.5 %. Este trata- mento com um meio de remoção de lipídio pode ser por um período de tempo efetivo para reduzir o teor lipídio do material ECM, tipicamente na faixa de cerca de 0,1 hora a cerca de horas, mais tipicamente na faixa de cerca de 0,1 horas a cerca de 1 hora. Em certas mo- dalidades, serão conduzidos tratamentos múltiplos (dois ou mais) como esse. Adicionalmen- te, tratamento com o meio de redução de lipídio da maneira discutida anteriormente pode ser realizado antes ou após o tratamento com um meio detergente e/ou meio de redução de DNA aquoso (preferivelmente básico) da maneira discutida anteriormente. Em certas moda- lidades preferidas, tratamento com o meio de redução de lipídio ocorrerá antes do tratamen- to com o meio detergente e/ou o meio aquoso (preferivelmente básico).

O material ECM pode também ser tratado com uma solução desinfetante. A solução desinfetante pode incluir um agente desinfetante tais como um álcool, um composto peróxi, ou outro desinfetante oxidante ou não oxidante. Em certas formas, a solução desinfetante será uma solução de ácido peracético tendo uma concentração de ácido peracético de cerca de 0,1 % a cerca de 0,3 %. Por exemplo, ácido peracético e outras soluções de tratamento de desinfetante oxidante tais como aquelas descritas na patente US 6.206,.931 pode ser usado.

O material ECM também pode ser rinsado em vários estágios por toda a sua prepa- ração (por exemplo, com água de torneira, água ou tampão de alta pureza) de maneira a remover resíduos químicos introduzidos que permanecem em ou no material. Em modalida- des preferidas, pelo menos cerca de 90 % de resíduos de detergente são removidos do ma- terial. Mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 97 % de resíduos de detergente são removidos do material. Tratamentos com detergente, solubilizante de DNA1 solubilizante de lipídio, enxa-

guante e potencialmente outros meios líquidos podem ser realizados de qualquer modo a- dequado e em qualquer ordem adequada em que o material ECM é colocado em contato com o meio. Por exemplo, o material ECM pode ser encharcado no meio, potencialmente com agitação, durante o tratamento. Outros métodos de contato tais como aspersão ou pul- verização do material ECM com o meio podem também ser usados. Igualmente, o(s) trata- mento^) pode ser realizado em qualquer temperatura adequada. Temperaturas de 0 0C a cerca de 50 0C são preferidas uma vez que elas permitem minimizar ou evitar desnaturação substancial do colágeno e outros componentes desejáveis do material ECM. Mais preferi- velmente, a temperatura do tratamento será na faixa de cerca de 0 0C a cerca de 37 °C e mais tipicamente na faixa de cerca de 20 0C a cerca de 37 °C. Deve-se entender, entretanto, que outras temperaturas podem ser usadas nos aspectos mais amplos da invenção. Em modalidades onde um elemento tubular ou outra estrutura fechável é formada, o material ECM incluindo um lúmen pode ser preso em uma extremidade para permitir que o lúmen seja cheio com o meio e pode ser preso à outra extremidade para fechar essencialmente uma extremidade proximal e distai do material ECM tubular. O material ECM tubular tendo um lúmen cheio pode submergir em um meio, que pode ser o mesmo meio ou diferente. Desta maneira, cada um do lúmen e da superfície externa de um material ECM tubular pode ser tratado sem exigir necessariamente que o meio de tratamento se difunda ou de outra forma passe através do material ECM. Este processo pode ser repetido com qualquer meio aqui usado, incluindo qualquer etapa de enxague.

Tratamentos tais como os anteriores, e/ou outros tratamentos químicos e/ou mecâ- nicos, descelularizarão o tecido ECM, resultando desejavelmente em um tecido ECM pro- cessado que é livre de células viáveis derivadas do tecido da fonte. Material ECM acelular assim obtido pode, entretanto, ser usado para cultivar ou ser semeado com células em cer- tas modalidades, por exemplo, algumas das descritas a seguir.

Materiais ECM processados da invenção podem ser derivados de qualquer órgão adequado ou outra fonte de tecido, desejavelmente um contendo significativo tecido conecti- vo colagenoso. Humano ou outras fontes de tecido animal podem ser usados. Fontes de animal não humano podem ser vertebrados de sangue quente, incluindo mamíferos, com fontes bovina, ovina, caprina e suína sendo adequadas. Materiais ECM adequados obtidos desta fonte de tecidos podem incluir submucosa, membrana de cápsula renal, colágeno dérmico, dura mater, pericárdio, fáscia lata, serosa, peritônio ou com base nas camadas da membrana, incluindo membrana de base de fígado. Materiais de submucosa adequados com este propósito incluem, por exemplo, submucosa intestinal, incluindo submucosa do intestino delgado, submucosa do estômago, submucosa da bexiga urinária e submucosa uterina. Deve-se entender que no isolamento ECMs que inclui submucosa, parte ou toda submucosa original do tecido da fonte pode ser retida, potencialmente junto com materiais derivados de uma ou mais camadas de tecido adjacente. Princípios similares se aplicam a outras camadas ricas em colágeno ou outros tecidos aqui nomeados - o material ECM recu- perado pode incluir parte ou todo tecido especificado originalmente presente no tecido da fonte, e/ou pode permanecer conectado ao(s) tecido(s) adjacente(s) no material ECM pro- cessado final.

Materiais ECM derivados naturalmente processados da invenção incluirão tipica- mente colágeno abundante, mais comumente sendo constituídos pelo menos cerca de 80 % em peso de colágeno em uma base de peso seco. Tais materiais ECM derivados natural- mente incluirão na maior parte fibras colágeno que são orientadas não aleatoriamente, por exemplo, que ocorrem como fibras de um modo geral uniaxial ou multiaxial mas orientadas regularmente. Quando processados para reter componentes bioativos nativos, o material ECM pode reter estes componentes entremeados como sólidos entre, mediante e/ou nas fibras de colágeno. Materiais ECM derivados naturalmente desejáveis particularmente para o uso na invenção incluirão quantidades significativas de sólidos não colagenosos entreme- ados que são facilmente examináveis sob exame de luz microscópica. Tais sólidos não co- lagenosos pode constituir uma porcentagem significativa do peso seco do material ECM em certas modalidades inventivas, por exemplo, pelo menos cerca de 1 %, pelo menos cerca de 3 % e pelo menos cerca de 5 % em peso em várias modalidades da invenção.

O material ECM processado da presente invenção pode também apresentar um ca- ráter angiogênico e assim ser efetivo para induzir angiogênese em um hospedeiro enxertado com o material. Com relação a isso, angiogênese é o processo através do qual o corpo fa- brica novos vasos sangüíneos para gerar aumento no sangue para suprir os tecidos. Assim, materiais angiogênicos, quando colocados em contato com tecidos do hospedeiro, promo- vem ou encorajam a formação de novos vasos sangüíneos. Foram desenvolvidos métodos para medir angiogênese in vivo em resposta ao implante biomaterial. Por exemplo, um de tal método usa um modelo de implante subcutâneo para determinar o caráter angiogênico de um material. Ver, C. Heeschen et al., Nature Medicine 7 (2001), No. 7, 833-839. Quando combinado com uma técnica microangiografia de fluorescência, este modelo pode fornecer tanto medida quantitativa quanto e qualitativa de angiogênese nos biomateriais. C. Johnson et al., Circulation Research 94 (2004), No. 2, 262-268.

É vantajoso preparar materiais ECM bioremodeláveis para os materiais de enxerto médico e métodos da presente invenção. Tais materiais que são bioremodeláveis e promo- vem invasão e crescimento celular fornecem vantagem particular. Materiais bioremodeláveis podem ser usados neste contexto para promover crescimento celular no sítio em que um material de enxerto médico da invenção é implantado.

Da maneira notada anteriormente, o material ECM submucosal processado (con- tendo submucosa) e qualquer outro material ECM pode reter qualquer de uma variedade de fatores de crescimento ou outro nativo de componentes bioativos benéficos para o tecido da fonte. Por exemplo, a submucosa ou outros ECM podem incluir um ou mais fatores de cres- cimento nativos tais como fator de crescimento fibroblasto básico (FGF-2), fator de cresci- mento beta transformante (TGF-beta), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de cres- cimento do tecido conectivo (CTGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e/ou fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF). Igualmente, submucosa ou outros ECM usados na invenção podem incluir outros materiais biológicos tais como proteoglicanos e/ou glicosaminoglicanos, tais como heparina, sulfato de heparina, ácido hialurônico, fibronectina e similares. Assim, de um modo geral, o material ECM processado incluirá pelo menos um componente bioativo que induz, direta ou indiretamente, uma resposta celular tal como uma mudança na morfologia, proliferação, crescimento celular, expressão de proteína ou gene. Em modalidades preferidas, o material ECM processado apresentará um perfil do componente em que os componentes não colágeno seguintes estão presentes nas quanti- dades estabelecidas:

Componente_Faixa preferida_Faixa mais preferida

Lipídio: : menos que 5 % menos que 3 % FGF-2: mais que 2 ng/g mais que 5 ng/g IgA menos que 5 jug/g menos que 1 ;ug/g HA: mais que 50 jug/gmais que 100 pg/g sGAG: mais que 1000 /yg/gmais que 2000 //g/g

Núcleos visíveis menos que 200 per 0,263 mm2 menos que 100 por 0,263 mm2 Adicionalmente, além da retenção de componentes bioativos nativos, componentes bioativos não nativos, tais como os produzidos sinteticamente por tecnologia recombinante ou outros métodos, podem ser incorporados no material submucosal ou outro material ECM. Estes componentes bioativos não nativos podem ser proteínas naturalmente derivadas ou recombinantemente produzidas que correspondem àquelas nativamente de ocorrência no tecido ECM, mas talvez de uma espécie diferente (por exemplo, proteínas humanas aplica- das a ECMs colagenosos dos outros animais, tais como porcos). Os componentes bioativos não nativos podem também ser substâncias de medicamento. Substâncias de medicamento ilustrativas que podem ser incorporadas em e/ou nos materiais ECM usados na invenção incluem, por exemplo, antibióticos, substâncias que promovem trombos tal como fatores de coagulação do sangue, por exemplo, trombina, fibrinogênio e similares. Estas substâncias podem ser aplicadas ao material ECM como uma etapa pré-fabricada, imediatamente antes do procedimento (por exemplo, encharcando o material em uma solução contendo um anti- biótico adequado tal como cefazolina), ou durante ou após enxerto do material no paciente.

Um componente bioativo não nativo pode ser aplicado a uma submucosa ou outro tecido ECM por qualquer meio adequado. Meios adequados incluem, por exemplo, asper- são, impregnação, imersão, etc. O componente bioativo não nativo pode ser aplicado ao tecido ECM tanto antes quanto após o material ser afixado a um membro alongado. Simi- larmente, se outros componentes químicos ou biológicos forem incluídos no tecido ECM, o componente bioativo não nativo poderá ser aplicado tanto antes, junto com, ou após estes outros componentes.

Tecido submucoso processado ou outro tecido ECM da invenção preferivelmente apresenta um nível de endotoxina de menos que cerca de 12 unidades de endotoxina (EU) por grama, mais preferivelmente menos que cerca de 5 EU por grama e acima de tudo pre- ferivelmente menos que cerca de 1 EU por grama. As preferências adicionais, a submucosa ou outros materiais ECM podem ter uma biocarga de menos que cerca de 1 unidade de for- mação de colônia (CFU) por grama, mais preferivelmente menos que cerca de 0,5 CPU por grama. Níveis de fungo são desejavelmente similarmente baixos, por exemplo, menos que cerca de 1 CFU por grama, mais preferivelmente menos que cerca de 0,5 CPU por grama. Níveis de ácido nucléico são preferivelmente menos que cerca de 2 /vg/mg, mais preferi- velmente menos que cerca de 1 ^/g/mg e níveis de vírus são preferivelmente menos que cerca de 50 unidades de formação de placa (PPU) por grama, mais preferivelmente menos que cerca de 5 PFU por grama.

Em certas modalidades, níveis de endotoxina podem ser considerados com relação à área superficial de uma ou mais folhas únicas isoladas, de um material ECM. Em tais e- xemplos, uma folha de material ECM pode apresentar um nível de endotoxina de menos que cerca de 0,25 EU/cm2. Em modalidades preferidas, uma folha de material ECM apresenta um nível de endotoxina de menos que cerca de 0,2 EU/cm2, menos que cerca de 0,1 EU/cm2 e ainda menos que cerca de 0,05/cm2. Em uma modalidade mais preferida, uma folha de material ECM apresenta um nível de endotoxina de menos que cerca de 0,025 EU/cm2. As estruturas ECM multicamada incluindo uma pluralidade de folhas ligadas ou de outra forma acopladas de material ECM pode apresentar níveis de endotoxina similares com base na área superficial da estrutura multicamadas total. O material ECM processado da invenção pode ser empacotado ou de outra forma armazenado em um estado hidratado ou desidratado. A desidratação de um material de en- xerto médico da invenção pode ser obtida por qualquer meio conhecido na tecnologia. Pre- ferivelmente, a desidratação é realizada tanto por liofilização quanto por pressão a vácuo, embora outras técnicas, por exemplo, secagem ao ar, possam também ser usadas. Quando armazenado em um estado seco, será desejável freqüentemente ré-hidratar o material ECM processado antes do uso. Com relação a isso, qualquer adequado meio umectante pode ser usado para ré-hidratar o material médico, incluindo como exemplos água ou soluções de salina tamponada.

Em certas modalidades, o material ECM processado pode ser reticulado. Aumen-

tando a quantidade (ou número) de reticulações no material de enxerto médico ou entre du- as ou mais camadas do material de enxerto médico pode ser usados para melhorar sua re- sistência. Entretanto, reticulações no material de enxerto médico pode também afetar sua bioremodelabilidade ou outras características bioativas. Consequentemente, em certas mo- dalidades, um material ECM bioremodeláveis será fornecido que substancialmente retém seu nível nativo de reticulação, ou a quantidade e/ou tipo de reticulações adicionadas no material ECM pode ser judiciosamente selecionadas para reter o nível desejado de biore- modelabilidade ou outra característica bioativa.

Para o uso na presente invenção, qualquer reticulação introduzida do material ECM processado pode ser obtida por técnicas de reticulação de foto, ou pela aplicação de um agente de reticulação, tal como por reticuladores químicos, ou por reticulação de proteína induzida por desidratação ou outros meios. Reticuladores químicos que podem ser usados incluem por exemplo, aldeídos tal como glutaraldeídos, diimidas tal como carbodiimidas, por exemplo, cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, ribose ou outros açúcares, azido de acila, sulfo-N-hidroxisuccinamida, ou compostos de poliepóxido, incluindo por e- xemplo, éteres de poliglicidila tal como éter de etilenoglicol diglicidila, disponível com o nome comercial DENACOL EX810 pela Nagese Chemical Co., Osaka, Japão e éter de glicerol poliglicerol disponível com o nome comercial DENACOL EX 313 também pela Nagese Chemical Co.. Tipicamente, quando usados, éteres de poliglicerol ou outros compostos de poliepóxido terão de 2 a cerca de 10 grupos epóxidos por molécula. Preferivelmente, um material de enxerto médico é reticulado com um agente de reticulação compreendendo transglutaminase.

Materiais ECM processados da invenção podem ser fabricados em uma variedade de formas físicas para adaptar uma variedade de aplicações médicas. Por exemplo, um ma- terial ECM isolado pode ser fornecido como uma ou mais folhas, uma pasta, uma espuma, uma solução aquosa não gelificada, um pó, ou um gel. Combinações dessas formas são também contempladas. Com relação a isso, a configuração do material ECM pode ser obti- da antes ou após o material ECM ter sido processado da maneira aqui descrita. Adicional- mente, um material compósito ECM pode ser fabricado em maiores dimensões volumétricas e então dividido em produtos menores. Entretanto, o material ECM pode ser provido em uma forma de camada derivada naturalmente, ou pode por si mesmo ser um artigo fabrica- do, tais como uma esponja ou folha fundida, preparado de um material ECM derivado natu- ralmente.

Materiais de enxerto médico da invenção podem ser usados em uma ampla varie- dade de aplicações médicas (incluindo veterinária). Exemplos incluem o reparo ou recons- trução de tecido, tais como tecido nervoso e tecido dérmico, tal como na cura de ferida, por exemplo, aplicação em feridas dérmicas externas, incluindo, mas sem limitações, úlceras (por exemplo, úlceras diabéticas ou outras crônicas), tecido cardiovascular (incluindo tecido vascular e tecido cardíaco), tecido pericardial, tecido muscular, tecido ocular, tecido perio- dontal, osso, tecido conectivo tais como tendões ou ligamentos, no tratamento de fístulas gastrintestinais (por exemplo, processado na forma de um plugue para ocultar pelo menos a abertura primária de uma fístula tal como uma fístula anoretal, retovaginal, ou enterocutâ- nea) e outros.

Em uma modalidade, o material ECM processado é feito em uma composição flui- dizada, por exemplo, usando técnicas da maneira descrita nas patentes US 5.275.826 e 5.516.533. Com relação a isso, soluções ou suspensões do material ECM podem ser prepa- radas diminuindo e/ou digerindo o material com uma protease (por exemplo, tripsina ou pep- sina), por um período de tempo suficiente para solubilizar o material e formar solução subs- tancialmente homogênea. O material ECM é desejavelmente diminuído rasgando, cortando, moendo, aparando ou similares. Moer o material em um estado congelado ou congelado seco é vantajoso, embora bons resultados possam ser obtidos igualmente submetendo uma suspensão de pedaços do material a tratamento em um misturador de alta velocidade e de- sidratando, se necessário, centrifugando e decantando o excesso de resíduo. O material diminuído pode ser seco, por exemplo, seco congelado, para formar um pó. Em seguida, se desejado, o pó pode ser hidratado, isto é, combinado com água ou salina tamponada e op- cionalmente outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis, para formar uma composição de enxerto de tecido fluido, por exemplo, com uma viscosidade de cerca de 2 a cerca de 300.000 cps a 25 °C. As composições de enxerto de viscosidade maior podem ter uma con- sistência de gel ou pasta.

Um material ECM fluidizado desta invenção encontra uso como um heteroenxerto injetável para tecidos, por exemplo, osso ou tecidos macios, que precisam de reparo ou au- mento mais tipicamente para corrigir trauma ou defeitos do tecido induzidos por doença. As composições fluidizadas presentes são também usadas vantajosamente como uma carga para construções de implante compreendendo, por exemplo, uma ou mais folhas de um ma- terial ECM colagenoso formado em bolsas seladas (suturadas) para o uso em cosmético ou tratamento de trauma de procedimentos cirúrgicos.

Em uma preparação ilustrativa, um material ECM preparado da maneira aqui des- crita é reduzido em pedaços pequenos (por exemplo, cortando) que são carregados para um recipiente de aço inoxidável de base chata. Nitrogênio líquido é introduzido no recipiente para congelar os corpos de prova, que são então diminuídos enquanto no estado congelado para formar um pó grosseiro. Tal processamento pode ser realizado, por exemplo, com um prensa de eixo manual com um lingote de bronze cilíndrico colocado em cima dos corpos de prova congelados.

O lingote serve como uma interface entre os corpos de prova e o eixo da prensa.

Nitrogênio líquido pode ser adicionado periodicamente aos corpos de prova para mantê-los congelados.

Outros métodos para diminuir corpos de prova de material ECM podem ser utiliza- dos para produzir um pó usável de acordo com a presente invenção. Por exemplo, corpos de prova do material ECM podem ser congelados secos e então moídos usando uma prensa de eixo manual ou outros meios de moagem. Alternativamente, o material ECM pode ser processado em um misturador de alto cisalhamento para produzir um pó, mediante desidra- tação e secagem.

Moagem adicional do pó do material ECM usando um pilão e almofariz pré-resfriado pode ser usada para produzir produto consistente mais finamente dividido. Novamente, o nitrogênio líquido é usado da maneira necessária para manter partículas congeladas sólidas durante a moagem final. O pó pode ser facilmente hidratado usando, por exemplo, salina tamponada para produzir um material de enxerto de tecido fluidizado desta invenção na vis- cosidade desejada.

Para preparar um outro material fluidizado preferido, um pó do material ECM pode

ser peneirado através de uma malha de arame, coletado e submetido a digestão proteolítica para formar uma solução substancialmente homogênea. Por exemplo, o pó pode ser digeri- do com 1 mg/ml de pepsina (Sigma Chemical Co., St. Louis Mo.) e ácido acético 0,1 M, ajus- tado ao pH 2,5 com HCI, durante um período de 48 horas a temperatura ambiente. Após este tratamento, o meio de reação pode ser neutralizado com hidróxido de sódio (NaOH) para inativar a atividade péptica. A submucosa solubilizada pode então ser concentrada por precipitação de sal da solução e separada por purificação adicional e/ou secagem a frio para formar um material ECM colagenoso solubilizado de protease em forma de pó.

Composições fluidizadas desta invenção encontram ampla aplicação em substitui- ção, aumento, e/ou reparo do tecido. As composições fluidizadas podem ser usadas para induzir ré-crescimento de tecido conectivo natural ou osso em uma área de um defeito exis- tente. Injetando uma quantidade efetiva de uma composição fluidizada no local de um defei- to do tecido ou uma ferida que necessita de cura, pode-se facilmente tirar vantagem das propriedades biotrópicas do material ECM colagenoso.

Em aplicações ortopédicas, um material de enxerto médico da invenção pode ser usado para reparar tecido ósseo, por exemplo, usando as técnicas gerais descritas na pa- tente US 5.641.518. Assim, uma forma em pó do material pode ser implantada em uma re- gião óssea danificada ou doente para reparo. O pó pode ser usado sozinho, ou em combi- nação com um ou mais agentes bioativos adicionais tais como minerais fisiologicamente compatíveis, fatores de crescimento, antibióticos, agentes quimioterapêuticos, antígeno, anticorpos, enzimas e hormônios. Preferivelmente, o implante em forma em pó será com- primido em uma forma tridimensional pré-determinado, que será implantado na região óssea e reterá substancialmente suas forma durante a substituição do enxerto com tecidos endó- genos.

Um material ECM processado da invenção pode também ser usado como um subs- trato do crescimento celular, ilustrativamente em forma de folha, pasta ou gel em combina- ção com nutrientes que suportam o crescimento das células em questão, por exemplo, célu- las eucarióticas tais como células endoteliais, fibroblásticas, pele fetal, osteosarcomas e adenocarcinomas (ver, por exemplo, publicação do pedido de patente internacional PCT No. WO 96/24661). Em forma preferida, a composição do substrato suportará a proliferação e/ou diferenciação de células de mamíferos, incluindo células humanas. Um material ECM processado da invenção pode também ser usado em reparo de

parede corpórea, incluindo, por exemplo, no reparo de defeitos da parede abdominal tal co- mo hérnias , usando técnicas análogas às descritas em Ann. Plast. Surg., 1995, 35:3740380; e J. Surg. Res., 1996, 60:107-114. Em tais aplicações, materiais de enxerto médico preferidos da invenção promovem organização favorável, vascularidade e consis- tência no tecido remodelado.Em aplicações dermatológicas, um material de enxerto médico da invenção pode ser usado no reparo de feridas de espessura parcial ou total e em aumen- tos dérmicos usando técnicas de enxerto gerais que são conhecidas na tecnologia e literatu- ra (ver, por exemplo, Annals of Plastic Surgery 1995, 35:381-388). Além disso, na área de tratamento de queimadura, é de um modo geral conhecido fornecer um substituto dérmico nos quais enxertos epidérmicos cultivados (preferivelmente autoenxertos epidérmicos culti- vados, ou CEA's) são transplantados. Tais enxertos cultivados têm tipicamente envolvido transplantar queratinócitos e/ou fibroblastos no substituto dérmico. De acordo com a presen- te invenção, o material de enxerto médico pode ser usado como o substituto dérmico, por exemplo, em forma de folha e o CEA desta maneira transplantado no material. Em um modo de praticar este aspecto da invenção, queratinócitos podem ser transplantados, por exem- plo, semeando ou transferindo uma folha de queratinócito, no lado mucosal da submucosa. Fibroblastos podem ser transplantados também na mucosal e/ou no lado oposto (abluminal) da submucosa. O material ECM processado da invenção pode também ser usado em enxerto de tecido em aplicações urogenitais. Por exemplo, o material de enxerto médico pode ser usa- do em reparo de bexiga urinária para fornecer um andaime para regeneração da bexiga, usando técnicas correspondentes àquelas descritas de um modo geral na patente US 5.645.860; Urology, 1995, 46:396-400; e J. Urology, 1996, 155:2098. Em forma fluidizada, o material de enxerto médico inventivo pode também encontrar uso em um procedimento de injeção endoscópica para corrigir refluxo vesicureteral. Em tais aplicações, uma injeção po- de ser feita, por exemplo, na área sob o orifício ureteral de um paciente, para induzir o cres- cimento do músculo macio e formação de colágeno no sítio da injeção.

De um modo geral, quando configurado para o uso como um enxerto de tecido, o material ECM processado da invenção pode incluir uma ou mais folhas de material ECM que podem ser cortadas ou de outra forma configuradas para um tamanho desejado para seu uso final. O material de enxerto é em muitos casos dimensionado maior que o defeito do tecido ao qual ele é aplicado. O dimensionando o material de enxerto médico desta maneira permite fácil anexação do tecido a sua volta.

Uma vez que o ECM material de enxerto dimensionado tenha sido colocado no, em, ou ao redor do defeito, o material pode ser anexado ao tecido a sua volta usando qualquer dos diversos meios de anexação adequados conhecidos. Meios de anexação adequados incluem, por exemplo, adesivos biocompatível (por exemplo, cola de fibrina), colocação de grampo, sutura e similares. Preferivelmente, o material de enxerto médico é anexado ao tecido a sua volta por suturas. Existe uma variedade de materiais sintéticos atualmente dis- ponível na tecnologia para o uso como suturas. Por exemplo, suturas compreendendo Pro- lene™, Vicryl™, Mersilene™, Panacryl™ e Monocryl™, são contempladas para o uso na invenção. Outros materiais de sutura serão bem conhecidos aos versados na tecnologia. Os materiais supramencionados servem portanto meramente como exemplos e, consequente- mente, não são de maneira nenhuma limitantes.

Em outras áreas, os materiais de enxerto médico formados com um material ECM da presente invenção podem ser usados em aplicações neurológicas, por exemplo, em téc- nicas que exigem um substituto durai para reparar defeitos por causa de trauma, tumor re- secção, ou procedimentos descompressivo.

Em forma de folha, um material de enxerto médico ECM processado da invenção pode ser compreendido de uma camada única ou múltiplas camadas de material. Assim, em certas modalidades, uma camada de material ECM isolada única ou uma construção de ECM multilaminada pode ser usada. Construções ECM multilaminadas ilustrativas para o uso na invenção pode, por exemplo, ter de duas a cerca de dez camadas ECM laminadas isolada juntas. Construções ECM multilaminadas para o uso na invenção pode ser preparadas de qualquer modo adequado. Com relação a isso, uma variedade de técnicas para laminar ca- madas ECM juntas podem ser usadas. Estas incluem, por exemplo, ligação deidrotérmica em condições aquecidas, não aquecidas ou de liofilização, usando adesivos, colas ou outros agentes de ligação, reticulação com agentes ou radiação química (incluindo radiação UV), ou qualquer combinação desses um com o outro ou outros métodos adequados. Para infor- mação adicional para construções ECM multilaminadas que pode ser usada na invenção e métodos para sua preparação, pode ser feita referência, por exemplo, as patentes US 5.711.969, 5.755.791. 5.855.619. 5.955.110. 5.968.096 e a publicação de pedido de patente U.S.20050049638.

ECM de camada única ou construções ECM multilaminadas ou outros materiais bi- ocompatíveis usados na presente invenção podem ter ou pode não ter perfurações ou cor- tes em sua estrutura e em certas modalidades podem ter uma estrutura de malha, por e- xemplo, da maneira descrita em publicação de pedido de patente Us 20050021141. Tais estruturas padronizadas de malha podem ser usadas para fornecer um ECM ou outro seg- mento de implante que é altamente deformável para o uso na presente invenção.

Em modalidades adicionais, ECM's processados da invenção podem ser submeti- dos a processos que expandem os materiais. Em certas formas, tais materiais expandidos podem ser formados pelo contato controlado de um material ECM com uma ou mais subs- tâncias alcalinas até que o material se expanda e o isolamento do material expandido. Ilus- trativamente, o contato pode ser suficiente para expandir o material ECM até pelo menos 120 % de (isto é, 1,2 vezes) seu volume massivo original, ou em algumas formas a pelo me- nos cerca de duas vezes seu volume original. Em seguida, o material expandido pode op- cionalmente ser isolado do meio alcalino, por exemplo, por neutralização e/ou enxague. O material expandido coletado pode ser usado de qualquer maneira adequada na preparação de um dispositivo médico. Ilustrativamente, o material expandido pode ser enriquecido com componentes bioativos, secos, e/ou moldados, etc., na formação de uma construção de en- xerto de uma forma ou configuração desejada. Em certas modalidades, um material de en- xerto médico e/ou dispositivo formado com o material expandido ECM pode ser altamente compressível (ou expansível) de maneira tal que o material possa ser comprimido para dis- tribuição, tal como do lúmen de um dispositivo de distribuição canulado e em seguida ex- pandir mediante desdobramento do dispositivo de maneira a ficar ancorado dentro de um paciente e/ou causar fechamento de um trato no paciente.

Materiais ECM expandidos podem ser formados pelo contato controlado de um ma- terial ECM processado da maneira descrita anteriormente com uma solução aquosa ou ou- tro meio contendo hidróxido de sódio. Tratamento do material alcalino pode causar mudan- ças na estrutura física do material que por sua vez faz com que ele se expanda. Tais mu- danças podem incluir desnaturação do colágeno no material. Em certas modalidades, prefe- re-se expandir o material a pelo menos cerca de três, pelo menos cerca de quatro, pelo me- nos cerca de 5, ou pelo menos cerca de 6 ou ainda mais vezes seu volume massivo original. A magnitude da expansão está relacionada a diversos fatores, incluindo por exemplo, a con- centração ou pH do meio alcalino, tempo de exposição e temperatura usados no tratamento do material to ser expandido.

Materiais ECM que podem ser processados para fazer materiais expandidos podem incluir qualquer dos aqui revelados ou outros ECM's adequados. Tais materiais ECM típicos incluirão uma rede de fibrilas de colágeno com reticulações intrarmoleculares de ocorrência natural e reticulações intermoleculares de ocorrência natural. Mediante o processo de ex- pansão da maneira aqui descrita, as reticulações intramolecular de ocorrência natural e de reticulações intermoleculares de ocorrência natural podem ser retidas no material matriz colagenoso processado suficientemente para manter o material de matriz colagenoso como um material folha colagenoso intacto; entretanto, fibrilas de colágeno no material de folha colagenoso pode ser desnaturado e o material de folha colagenoso pode ter uma espessura processada alcalina isto é, mais que o espessura do material de partida, por exemplo, pelo menos 120 % da espessura original, ou pelo menos o dobro da espessura original.

Ilustrativamente, a concentração da substância alcalina para tratamento do material remodelável pode ser na faixa de cerca de 0,5 a cerca de 2 M, com uma concentração de cerca de 1 M sendo mais preferível. Adicionalmente, o pH da substância alcalina pode em certas modalidades variar de cerca de 8 a cerca de 14. Em aspectos preferidos, a substân- cia alcalina terá um pH de cerca de 10 a cerca de 14 e acima de tudo preferivelmente de cerca de 12 a cerca de 14.

Além de concentração e pH, outros fatores tais como temperatura e tempo de ex- posição contribuirão para a extensão da expansão, da maneira discutida anteriormente. Com relação a isto, em certas variantes, a exposição do material colagenoso para a subs- tância alcalina é realizada a uma temperatura de cerca de 4 a cerca de 45 °C. Em modali- dades preferidas, a exposição é realizada a uma temperatura de cerca de 25 a cerca de 40 °C, com 37 0C sendo mais preferida. Entretanto, o tempo de exposição pode variar de pelo menos cerca de um minuto até cerca de 5 horas ou mais. Em algumas modalidades, o tem- po de exposição é cerca de 1 a cerca de 2 horas. Em uma modalidade particularmente pre- ferida, o material colagenoso é exposto a uma solução 1 M de NaOH tendo um pH de 14 a uma temperatura de cerca de 37 0C por cerca de 1,5 a 2 horas. Tal tratamento resulta na desnaturação do colágeno e uma expansão substancial do material remodelável. A desnatu- ração da matriz de colágeno do material pode ser observada como uma mudança nas ca- racterísticas do empacotamento do colágeno do material, por exemplo, uma ruptura subs- tancial de uma rede colagenosa firmemente ligada ao material de partida. Um ECM não ex- pandido ou outro material colagenoso pode ter uma rede colagenosa firmemente ligada a- presentando uma superfície contínua substancialmente uniforme, quando vista a olho nu ou em ampliação moderada, por exemplo, ampliação de 100 x. Ao contrário, um material cola- genoso expandido pode ter uma superfície isto é, bastante diferente, em que a superfície não é contínua, mas em vez disso apresenta fios ou feixes de colágeno em muitas regiões que são separadas por aberturas substanciais em material entre o fios ou feixes quando vistas na mesma ampliação, por exemplo, cerca de 100 x. Consequentemente, um material colagenoso expandido tipicamente parece mais poroso do que um material colagenoso não expandido correspondente. Entretanto, em muitos casos, o material colagenoso expandido pode ser demonstrado tendo maior porosidade, por exemplo, medindo uma maior permeabi- lidade para água ou outra passagem de fluido comparado ao material de partida não tratado. A estrutura mais espumosa e porosa de um ECM expandida ou outro material colagenoso pode permitir que o material seja fundido ou de outra forma preparado em uma variedade de formas de esponja ou espuma para o uso na preparação de materiais médicos e dispositi- vos. Pode-se adicionalmente permitir que a preparação de construções que são altamente compressíveis e que expandem após a compressão. Tais propriedades podem ser usadas, por exemplo, quando o material de enxerto médico preparado deve ser comprimido e carre- gado em um dispositivo de desdobramento (por exemplo, um lúmen deste) para distribuição em um paciente e em seguida desdobrado para expandir no sítio do implante.

Após tais tratamentos alcalinos, o material pode ser isolado do meio alcalino e pro- cessado após uso adicional. Ilustrativamente, o material coletado pode ser neutralizado e/ou rinsado com água para remover a alcalinidade do material, antes do processamento adicio- nal do material para formar um material de enxerto médico da invenção.

Materiais de enxerto médico da invenção também podem ser usados junto com um ou mais componentes secundários para construir uma variedade de dispositivos médicos. Em certas modalidades, o material ECM processado é afixado em um membro expansível, tais como um stent auto expansível ou forçosamente expansível (por exemplo, balão expan- sível) ou uma armação. Tais dispositivos da invenção podem ser adaptados para desdo- bramento dento do sistema cardiovascular, incluindo dentro de uma artéria ou veia. Certos dispositivos são adaptados como válvulas vasculares, por exemplo, para implante percutâ- neo dentro das artérias, ou dentro das veias das pernas ou pés para tratar insuficiência ve- nosa.

Dispositivos da válvula protética feitos com materiais ECM processado da invenção podem ser implantados em uma passagem corpórea como dispositivos sem armação de válvula ou, da maneira notada anteriormente, o material ECM pode ser anexado a uma ar- mação expansível. O material ECM pode ser usado para formar coberturas biocompatível tais como camisas e/ou para formar folículos ou outras estruturas de válvula (ver, por exem- pio, WO 99/62431 e WO 01/19285). Em um modo de formar uma estrutura de válvula, o material ECM processado pode ser anexado a um stent de um modo por meio do qual ele forma um, dois, ou mais folículos, cúspide, bolsas ou estruturas similares que resistam ao fluxo em uma direção com relação a outra. Em uma aplicação específica de tais dispositivos, tais dispositivos construídos como válvulas vasculares são implantados para tratar insufici- ências venosas em humanos, por exemplo, que ocorrem nas pernas.

Agora com referência a Figurai, é descrito um enxerto médico em forma de folha formada de uma camada única do material ECM inventivo processado 11 derivado de tecido de um vertebrado de sangue quente. A Figura 2 ilustra um dispositivo de enxerto mé- dico 20 formado de duas camadas do material ECM inventivo processado 11. Dispositivos de enxerto médico em forma de folha da maneira descrita nas Figuras 1 e 2 podem ser usa- dos em uma variedade de aplicações de enxerto da maneira aqui descrita, incluindo, sem limitação, em cuidado de ferida e aplicações de suporte de tecido macio.

Agora com referência a Figuras 3 e 5, são descritas várias vistas laterais de um dispositivo da válvula protética 31 da invenção. Um material ECM processado da invenção é anexado a um elemento da armação 33 e fornece dois folículos 34 e 35 em uma configura- ção para implante em um paciente. Em particular, a Figura 3 fornece uma vista lateral de dispositivo da válvula protética 31 feita em uma direção paralela às bordas superiores de adaptação 34a e 35a dos folículos 34 e 35. A figura 4 fornece uma vista do dispositivo 31 descrito na figura 3 feita do lado esquerdo. A figura 5 fornece uma vista do dispositivo 31 descrito na figura 3 feita do lado direito. O dispositivo 31 é particularmente bem adequado para aplicações vasculares, tal como implante em uma passagem vascular de um paciente.

Como pode ser visto nas figuras 3 a 5, folículos 34 e 35 incluem bordas respectivas livres 34a e 35a para coaptação umas com as outras e bordas fixas respectivas 36 e 40 que serão cada uma forçada contra a parede de um vaso vascular mediante implante de disposi- tivo 31 em um caminho que parcialmente circunscreve a parede do vaso de maneira a for- mar cada qual um elemento de captura de sangue. No dispositivo 31 ilustrado, o contato do caminho de borda do folículo com a parede do vaso inclui porções substanciais que esten- dem-se essencialmente longitudinal ao longo da parede do vaso que conecta a uma porção de formação de taça que estende-se tanto longitudinalmente ao longo da parede do vaso quanto circunferencialmente ao redor da parede do vaso. Em particular, a borda fixa 36 de folículo 34 inclui porções que se estendem longitudinalmente opostas 37 e 38 cada qual se estendendo para um lado oposto de uma porção de formação de taça 39. Correspondente- mente, a borda fixa 40 de folículo 35 inclui porções que se estendem longitudinalmente o- postas 41 e 42 cada qual estendendo para um lado oposto de porção de formação de taça 43.

A quantidade de área de folículo de contato ou adaptação pode ser expressa em um número de maneiras diferentes. O comprimento de coaptação (por exemplo, LOC) na configuração original para implante é desejavelmente pelo menos cerca de 2 mm e pode ser até cerca de 50 mm ou mais dependendo da configuração da prótese da válvula. Em certas modalidades da invenção, o comprimento de coaptação pode ser na faixa de cerca de 5 a cerca de 30 mm, mais tipicamente cerca de 5 a cerca de 15 mm, na configuração original para implante. O comprimento de coaptação pode representar uma porcentagem substanci- al de comprimento total da prótese da válvula, por exemplo, pelo menos cerca de 5 %, ou pelo menos cerca de 10 %, do comprimento total da prótese. Em certas modalidades, o comprimento de coaptação dos folículos representa 10 % a 80 % do comprimento total do dispositivo, tipicamente cerca de 30 % a cerca de 60 % e mais tipicamente cerca de 35 % a cerca de 55 %.

Em aspectos adicionais, um comprimento longo de coaptação pode ser fornecido orientando as bordas do folículo externas de forma substancialmente longitudinal ao longo da armação em proximidade imediata umas com as outras em uma distância significativa. Assim, com referência às figuras 3-5 com propósitos de ilustração, a porção da borda do folículo externa 37 do folículo 34 é configurada para fazer contato ao longo da parede do vaso em proximidade imediata com a porção da borda do folículo externa 41 do folículo 35 em uma distância significativa, por exemplo, 2 a 50 mm, tipicamente cerca de 5 a cerca de mm e mais tipicamente cerca de 5 a cerca de 15 mm. O mesmo seria válido para as por- ções da borda do folículo localizada ao longo do lado oposto da parede do vaso (por exem- plo, porções da borda 38 e 42, figuras 3-5). Prefere-se que as bordas do folículo permane- çam em proximidade imediata nessas distâncias, por exemplo, a cerca de 5 mm, mais prefe- rivelmente a cerca de 3 mm e acima de tudo preferivelmente a cerca de 1 mm. Deve-se en- tender que esta proximidade imediata pode envolver deixar as bordas do folículo localizadas bem próximas umas das outras ao longo da parede do vaso, ou pode deixá-las anexadas essencialmente ao longo do mesmo caminho (por exemplo, ambas ao longo de uma estrutu- ra única de uma armação) e não exibindo assim essencialmente nenhuma separação uma da outra uma vez que ela passa junto a parede do vaso.

Com o propósito de promover um entendimento adicional de aspectos da presente invenção, são fornecidos os exemplos específicos seguintes. Deve-se entender que estes exemplos são ilustrativos e não Iimitantes da presente invenção.

EXEMPLO 1

Este exemplo descreve a preparação de um material ECM processado da invenção.

Intestinos delgados suínos foram recebidos de uma usina de embalagem e foram seccionados e divididos para revelar suas porções internas. Após limpeza inicial para remo- ver os conteúdos presentes nos intestinos, cada intestino foi mecanicamente friccionado em cada lado para remover as camadas mucosa e serosa e para isolar uma camada de tecido principalmente conectivo incluindo a submucosa para processamento adicional. A camada submucosa foi tratada em uma solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,1 % 1:10 (pe- so: volume) por uma hora a 37 °C, seguida por tratamento em uma solução de tris borato ácido etileno diamino tetra acético (TBE) 1:10 (peso: volume) 89 mM por uma hora a 37 °C.

Após estes tratamentos iniciais, a submucosa foi rinsada com água de alta pureza 1:10 (pe- so: volume) por 5 minutos a temperatura ambiente. Esta etapa de rinsagem foi repetida uma segunda vez antes de tratar a submucosa em uma solução de álcool isopropílico (IPA) a 100 % 1:5 (peso: volume) por 30 minutos a temperatura ambiente. Esta etapa de tratamento com IPA foi repetida uma segunda vez, seguida pela rinsagem da submucosa duas vezes da maneira descrita anteriormente. A submucosa foi a seguir tratada em uma solução alcoólica especialmente desnaturada a 0,2% PAA/5% 1:10 (peso: volume) por duas horas a tempera- tura ambiente. Finalmente, a submucosa foi rinsada em água de alta pureza 1:10 (peso: volume) por 5 minutos a temperatura ambiente. Esta etapa de rinsagem foi repetida em um total de 4 rinsagens antes de testar a submucosa com relação a resíduos SDS. O teor de SDS foi medido usando um estojo de detecção de detergente (Chemetrics)1 que indicou que mais de 97% do detergente inicial foram removidos. O tecido submucoso resultante foi usa- do nos exemplos que seguem.

EXEMPLO 2

Este exemplo demonstra uma melhor redução em teor lipídico usando o processo descrito no exemplo 1 comparado a um outro processo para preparar um material ECM submucoso.

Dez lotes de intestino delgado dividido suíno foram obtidos e divididos em dois gru- pos aproximadamente iguais. Um grupo foi processado da maneira descrita no exemplo 1 da patente U.S. 6.206.931 (em seguida referido como o "grupo controle"). Resumidamente, o intestino bruto foi primeiro tratado com ácido peracético, em seguida friccionando mecani- camente cada lado para isolar a camada de tecido submucoso e rinsando para remover re- síduos químicos. O segundo grupo foi preparado da maneira descrita anteriormente no e- xemplo 1 (em seguida referido como o "grupo teste").

Cada lote de material foi usado para fazer três folhas Iiofilizadas de 4 camadas so- brepondo quatro das camadas submucosas (úmidas) e Iiofilizando a pilha resultante. As fo- lhas de 4 camadas foram esterilizadas usando um ciclo de óxido de etileno de baixa tempe- ratura. A partir de cada folha, uma amostra de 1 cm χ 1 cm foi cortada para análise do teor lipídico. Três amostras foram analisadas por grupo por lote (3 amostras χ 10 lotes) para um total de 30 amostras para cada grupo. Cada amostra foi pesada (peso inicial) e a seguir tra- tada com uma solução de etanol a 100% por 24 horas, seguida por uma solução de acetona por 24 horas para extrair lipídios. As amostras foram subseqüentemente secas por aproxi- madamente 48 horas e pesadas (peso final). O teor lipídico foi calculado pelo peso inicial menos o peso final dividido pelo peso inicial.

A análise de distribuição foi realizada para determinar qual distribuição (normal, Iog- normal, Weibull ou gama) ajusta melhor a cada conjunto de dados. A análise de distribuição indicou que o teor lipídico do grupo controle ajusta melhor a distribuição log-normal, que corresponde a um teor lipídico médio de 8,06 +/- 5,59%. A análise de distribuição indicou que o teor lipídico do grupo teste ajusta melhor a distribuição Weibull, que corresponde a um teor lipídico médio de 2,51 +/- 2,51%.

Um valor ρ de 1,08 χ 10"5 foi atingido usando um teste t não pareado em todas as amostras. Um valor ρ de 6,2 χ 10"5 foi atingido usando um teste t pareado para comparar os resultados do grupo controle de lote casado com os resultados do grupo teste correspon- dente. Ambos os valores ρ são menores que 0,05, indicando que existe uma diminuição es- tatisticamente significante no teor lipídico do material teste comparado ao material controle.

EXEMPLO 3

Este exemplo demonstra uma melhor redução no teor de IgA usando o processo descrito no exemplo 1.

Dez lotes de intestino delgado suíno dividido foram obtidos e divididos em dois gru- pos aproximadamente iguais. Um grupo foi processado da maneira descrita no exemplo 1 da patente U.S. 6.206.931 (em seguida referido como o "grupo controle"). Resumidamente, intestino bruto foi primeiro tratado com ácido paracético, em seguida friccionando em cada lado para isolar uma camada de tecido submucoso e rinsando para remover resíduos quími- cos. O segundo grupo foi preparado da maneira descrita anteriormente no exemplo 1 (em seguida referido como o "grupo teste").

Cada lote de material foi feito em três folhas Iiofilizadas de 4 camadas sobrepondo quatro das camadas submucosas (úmidas) e Iiofilizando a pilha resultante. As folhas de 4 camadas foram esterilizadas usando um ciclo de oxido de etileno de baixa temperatura. A partir de cada folha, uma amostra de 1 cm χ 1 cm foi cortada para análise do teor de imuno- globuiina A (IgA). Três amostras foram analisadas por grupo por lote (3 amostras χ 10 lotes) para um total de 30 amostras para cada grupo. Cada amostra foi pesada (peso inicial), cole- tada em um tubo centrifugador de 1,5 mL, e moída por 90 segundos em 400 //L de salina tamponada com fosfato (PBS). As amostras foram subseqüentemente centrifugadas, e o sobrenadante foi isolado e diluído com PBS estéril 1:5. Estas amostras diluídas foram en- saiadas para testar o teor de IgA por ELISA usando um estojo do Bethyl Laboratories, Beth- yl, Texas. O teor em peso de IgA foi calculado dividindo o teor de IgA do grupo teste pelo peso inicial do grupo controle. A análise de distribuição foi realizada para determinar qual distribuição (normal, log-

normal, Weibull, ou gama) ajusta melhor a cada conjunto de dados. A análise de distribuição indicou que o teor de IgA do grupo controle ajusta melhor distribuição normal, que corres- ponde a um teor de IgA médio de 50,4 +/- 27,7 //g/g. Uma das amostras do grupo teste foi testada a 1,54 >c/g/g enquanto todas as outras amostras de grupos teste foram testadas a 0 pg/g. Portanto, a análise de distribuição não foi realizada para o grupo teste, já que a distri- buição foi essencialmente um ponto único.

Um valor ρ de 1,7 χ 10"13foi atingido usando um teste t não pareado em todas as

amostras. Um valor ρ de 1,88 χ 104 foi atingido usando um teste t pareado para comparar os resultados do grupo controle de lote casado com os resultados do grupo teste correspon- dente. Ambos os valores ρ são menores que 0,05, indicando que existe uma diminuição es- tatisticamente significante no teor de IgA do material do grupo teste comparado ao grupo controle.

EXEMPLO 4

Este exemplo demonstra uma melhor redução no número de núcleos usando o pro- cesso descrito no exemplo 1.

Dez lotes de intestino delgado suíno dividido foram obtidos e divididos em dois gru- pos aproximadamente iguais. Um grupo foi processado da maneira descrita no exemplo 1 da patente U.S. 6.206.931 (em seguida referido como o "grupo controle"). Resumidamente, intestino bruto foi primeiro tratado com ácido peracético, em seguida friccionando cada lado para isolar uma camada de tecido submucoso e rinsando para remover resíduos químicos. O segundo grupo foi preparado da maneira descrita anteriormente no exemplo 1 (em segui- da referido como o "grupo teste").

Uma amostra de cada lote em cada grupo foi cortada e corada com Hoechst 33258 para identificar núcleos. Três imagens dos núcleos em cada amostra foram obtidas de locais aleatórios usando um microscópio de fluorescência Olympus com um filtro ultravioleta. As imagens foram feitas em uma amplificação total de 200x pela câmara digital Spot Insight e adquiridas por meio de software de computador Spot RT. Estas imagens representam uma área total de 0,263 mm2. Três analisadores independentes contaram núcleos para cada i- magem adquirida. O número de núcleos por imagem foi obtido como a média destas 3 con- tagens.

A análise de distribuição foi realizada para determinar qual distribuição (normal, Iog- normal, Weibull, ou gama) ajusta melhor a cada conjunto de dados. A análise de distribuição indicou que as contagens de núcleos do grupo controle ajusta melhor a distribuição Weibull, que corresponde aos núcleos médios por campo para o grupo controle de 473 +/- 193 nú- cleos. A análise de distribuição indicou que as contagens de núcleos do grupo teste ajustam melhor a distribuição gama, que corresponde a núcleos médios por campo para o grupo teste que foi 26,7 +/- 36,1 núcleos.

Um valor ρ de 1,66 χ 10"6 foi atingido usando um teste t pareado para comparar os resultados do grupo controle de lote casado com os resultados do grupo teste correspon- dente. O valor ρ é menor que 0,05, indicando que existe uma diminuição estatisticamente significante no teor de núcleos do material teste comparado ao material controle.

EXEMPLO 5

Este exemplo demonstra que um material ECM processado da maneira descrita no exemplo 1 retém FGF-2 nativo.

Dez lotes de intestino bruto delgado suíno foram obtidos e processados de acordo com o exemplo 1. Cada lote de material foi feito em três folhas Iiofilizadas de 4 camadas da maneira descrita anteriormente no exemplo 2 e esterilizado usando um ciclo de óxido de etileno de baixa temperatura. A partir de cada folha, uma amostra de 1 cm χ 1 cm foi cortada para análise do teor de FGF-2. Três amostras foram analisadas por lote (3 amostras χ 10 lotes) para um total de 30 amostras. Cada amostra foi pesada (peso inicial), colocada em um tubo centrifugador de 1,5 mL, e moída 3 χ 30 segundos em 400 μΙ de salina tamponada com fosfato (PBS). As amostras foram subseqüentemente centrifugadas, e o sobrenadante foi isolado e diluído com PBS estéril 1:5. Estas amostras diluídas foram ensaiadas em dupli- cata com relação ao teor de FGF-2 usando estojos R&D Systems FGF-2 ELISA. O teor em peso de FGF-2 foi calculado dividindo o teor de FGF-2 determinado por ELISA pelo peso inicial da amostra.

A análise de distribuição foi realizada para determinar qual distribuição (normal, Iog- normal, Weibull, ou gama) ajusta melhor a cada conjunto de dados. A análise de distribuição indicou que o teor de FGF-2 ajusta melhor a distribuição normal, que corresponde a um va- lor de teor de FGF médio de 25,0 ng/g +/- 12,9 ng/g.

EXEMPLO 6

Este exemplo demonstra que um material ECM processado da maneira descrita no exemplo 1 retém ácido hialurônico nativo (HA). Dez lotes de intestino bruto delgado suíno foram obtidos e processados de acordo

com o exemplo 1. Cada lote de material foi feito em três folhas Iiofilizadas de 4 camadas da maneira descrita anteriormente no exemplo 2 e esterilizado usando um ciclo de óxido de etileno de baixa temperatura. A partir de cada folha, uma amostra de 1 cm χ 1 cm foi cortada para análise do teor do ácido hialurônico (HA). Três amostras foram analisadas por lote (3 amostras χ 10 lotes) para um total de 30 amostras. Cada amostra foi pesada (peso inicial), colocada em um tubo centrifugador de 1,5 mL, e digerida com 50 μί de proteinase K em 450 μί de salina tamponada com fosfato (PBS) a 56 0C por 45 minutos. As amostras foram sub- seqüentemente centrifugadas e o sobrenadante foi isolado e diluído 1:40 com PBS estéril. Estas amostras diluídas foram ensaiadas em duplicata para teor de HA por ELISA usando um estojo da Corgenics1 Westminster, Colorado. O teor em peso de HA foi calculado divi- dindo o teor de HA determinado por ELISA pelo peso inicial da amostra.

A análise de distribuição foi realizada para determinar qual distribuição (normal, Iog- normal, Weibull, ou gama) ajusta melhor a cada conjunto de dados. A análise de distribuição indicou que o teor de HA da amostra teste ajusta melhor a distribuição log-normal, que cor- responde a um teor de HA médio para a amostra teste de 303 +/- 209 jt/g/g.

EXEMPLO 7

Este exemplo demonstra que um material ECM processado da maneira descrita no exemplo 1 retém glicosaminoglicanas sulfatadas nativas (sGAGs).

Dez lotes de intestino bruto delgado suíno foram obtidos e processados de acordo com o exemplo 1. Cada lote de material foi feito em três folhas Iiofilizadas de 4 camadas como no exemplo 2 anterior e esterilizado usando um ciclo de oxido de etileno de baixa temperatura. A partir de cada folha, uma amostra de 1 cm χ 1 cm foi cortada para análise de s(GAG). Três amostras foram analisadas por lote (3 amostras χ 10 lotes) para um total de 30 amostras. Cada amostra foi pesada (peso inicial), colocada em um tubo centrifugador de 1,5 mL, e digerida com 50 μΐ de proteinase K em 450 //L de salina tamponada com fosfato (PBS) a 56 0C por 45 minutos. Todas as amostras foram vortexadas por 5 segundos seguido pela adição de 1,0 mL do reagente corante Blyscan. As leituras de absorbância foram feitas com um espectrofotômetro em triplicata de cada amostra a 685 nm, e a concentração de sGAG foi calculada a partir de uma curva padrão de heparina. O teor em peso de sGAG foi calculado dividindo o teor de s(GAG) determinado pelas leituras de absorbância pelo peso total da amostra.

A análise de distribuição foi realizada para determinar qual distribuição (normal, log- normal, Weibull, ou gama) ajusta melhor a cada conjunto de dados. A análise de distribuição indicou que o teor de sGAG ajusta melhor a distribuição normal, que corresponde a um valor médio do teor de s(GAG) de 7.588 μg/g +/- 6.505 //g/g.

EXEMPLO 8

Este exemplo demonstra a força de estouro diafragmática do material ECM que foi processado de acordo com o exemplo 1 comparado a um outro processo.

Dez lotes de intestino delgado suíno dividido foram obtidos e divididos em dois gru- pos aproximadamente iguais. Um grupo foi processado da maneira descrita na patente U.S. 6.206.931 (em seguida referido como o "grupo controle"). Resumidamente, intestino bruto foi primeiro tratado com ácido peracético, em seguida friccionando em ambos os lados para isolar uma camada de tecido submucoso e rinsando para remover resíduos químicos. O segundo grupo foi preparado da maneira descrita anteriormente no exemplo 1 (em seguida referido como o "grupo teste").

Cada lote foi feito em três folhas Iiofilizadas de 4 camadas da maneira descrita an- teriormente no exemplo 2 ou três folhas prensadas a vácuo de 8 camadas sobrepondo oito camadas submucosas úmidas e prensando a vácuo a construção. Estas folhas foram esteri- lizadas usando um ciclo de oxido de etileno de baixa temperatura. A partir de cada folha, uma amostra de 63,5 milímetros χ 63,5 milímetros (2,5 polegadas χ 2,5 polegadas) foi corta- da para testar a força de estouro diafragmática. Três amostras foram analisadas por lote para os grupos Iiofilizados de 4 camadas (3 amostras χ 9 lotes) para um total de 27 amos- tras. Três amostras foram analisadas por lote para os grupos prensados a vácuo de 8 ca- madas (3 amostras χ 10 lotes) para um total de 30 amostras. Cada amostra foi reidratada em salina tamponada com fosfato (PBS) por pelo menos 15 minutos antes do teste. A força de estouro diafragmática foi medida antes da ruptura usando o dispositivo de teste de força de estouro de Mullen.

A análise de distribuição foi realizada para determinar qual distribuição (normal, Iog- normal, Weibull, ou gama) ajusta melhor a cada conjunto de dados. A análise de distribuição indicou que a força de estouro do controle Iiofilizado de 4 camadas ajusta melhor a distribui- ção Weibull, que corresponde a uma força de estouro média de 359 +/- 98 kPa. A análise de distribuição indicou que a força de estouro diafragmática do teste Iiofilizado de 4 camadas ajusta melhor a distribuição log-normal, que corresponde a uma força de estouro média de 378 +/- 79 kPa. A diferença média em força de estouro diafragmática entre os dois grupos foi 5,3%. Um valor ρ de 0,458 foi atingido usando um teste t não pareado em todas as amos- tras. Um valor ρ de 0,060 foi atingido usando um teste t pareado para comparar os resulta- dos do grupo controle de lote casado com os resultados do grupo teste correspondente. Ambos estes valores ρ são maiores que 0,05, indicando que não existia uma diminuição estatisticamente significante na força de estouro diafragmática de um material Iiofilizado de 4 camadas da presente invenção comparado a um material Iiofilizado de 4 camadas prepara- do por um processo usado atualmente.

Com relação aos materiais prensados a vácuo de 8 camadas, a análise de distribui- ção indicou que a força de estouro do controle prensado a vácuo de 8 camadas ajusta me- Ihor a distribuição log-normal, que corresponde a uma força de estouro média de 915 +/- 234 kPa. A análise de distribuição indicou que a força de estouro do teste prensado a vácuo de 8 camadas ajusta melhor a distribuição log-normal, que corresponde a uma força de estouro média de 872 +/- 269 kPa. A diferença média na força de estouro entre os dois grupos foi 4,8%. Um valor ρ de 0,516 foi atingido usando um teste t não pareado em todas as amos- tras. Um valor ρ de 0,217 foi atingido usando um teste t pareado para comparar os resulta- dos do grupo controle de lote casado com os resultados do grupo teste correspondente. Ambos estes valores ρ são maiores que 0,05, indicando que não existia uma diminuição estatisticamente significante na o força de estouro do material prensado a vácuo de 8 cama- das teste comparado ao material prensado a vácuo de 8 camadas controle. EXEMPLO 9

Este exemplo demonstra a resistência de retenção de sutura do material ECM que foi processado de acordo com o exemplo 1 comparado a um outro processo para preparar um tecido submucoso isolado esterilizado.

Dez lotes de intestino delgado suíno dividido foram obtidos e divididos em dois gru- pos aproximadamente iguais. Um grupo foi processado da maneira descrita na patente U.S. 6.206.931 (em seguida referido como o "grupo controle"). Resumidamente, intestino bruto foi primeiro tratado com ácido peracético, em seguida friccionando ambos os lados para isolar uma camada de tecido submucoso e rinsando para remover resíduos químicos. O segundo grupo foi preparado da maneira descrita anteriormente no exemplo 1 (em seguida referido como o "grupo teste").

Cada lote foi feito em três folhas Iiofilizadas de 4 camadas ou três folhas prensadas a vácuo de 8 camadas da maneira descrita no exemplo 8. Estas folhas foram esterilizadas usando um ciclo de óxido de etileno de baixa temperatura. A partir de cada folha, uma a- mostra de 1 cm χ 3 cm foi cortada para testar a resistência de retenção de sutura. Três a- mostras foram analisadas por grupo por lote (3 amostras χ 10 lotes) para um total de 30 a- mostras para cada grupo. O material Iiofilizado de 4 camadas foi cortado nas duas direções primárias, longitudinal e transversal, enquanto o material de 8 camadas foi cortado apenas em uma direção, já que este material não tem nenhuma direção primária em virtude da so- breposição ortogonal das camadas. Cada amostra foi reidratada em salina tamponada com fosfato (PBS) por pelo menos 15 minutos antes do teste. Um arame de aço inoxidável 302/304, de mesmo tamanho das suturas 5-0 usadas clinicamente, passou através de uma extremidade de cada artigo teste, com uma profundidade de mordida de 2 mm, e foi anexa- do a garra móvel da máquina de teste de tração. As outras extremidades de cada artigo tes- te foram presas na garra estacionária da máquina de teste de tração e o arame foi puxado para cima a uma velocidade constante de 150 mm/min. A força máxima, alongamento na ruptura e modo de falha foram registrados para cada amostra. Todas as amostras de teste (180/180, 100%) foram recusadas em decorrência de o arame de aço ser puxado para fora do material SIS. Em todos os exemplos, o arame de aço permaneceu intacto e o material SIS foi recusado.

Os resultados dos testes são como a seguir (média +/- desvio padrão): grupo con- trole prensado a vácuo de 8 camadas = 12,22 +/- 2,68 N, grupo teste prensado a vácuo de 8 camadas = 12,77 +/- 1,81 N (p=0,3714); grupo controle transversal Iiofilizado de 4 camadas = 7,58 +/- 1,68 N, grupo teste transversal Iiofilizado de 4 camadas = 7,99 +/- 1,90 N (p = 0,3801); grupo controle longitudinal Iiofilizado de 4 camadas = 6,19 +/- 1,46 N, grupo teste longitudinal Iiofilizado de 4 camadas = 6,14 +/- 1,41 N (p = 0,8929). A boa qualidade dos testes de ajuste de normalidade nos conjuntos de dados mostrou que nenhum dos conjuntos de dados não teve nenhum desvio significativo de uma distribuição normal. Portanto, duas amostras de testes t (grupos teste versus controle) foram corridas em cada grupo de dados (prensado a vácuo de 8 camadas, transversal Iiofilizado de 4 camadas e longitudinal Iiofili- zado de 4 camadas). Todos os valores ρ foram maiores que 0,3714, indicando que não hou- ve nenhuma diminuição estatisticamente significante na resistência de retenção de sutura nos materiais teste comparada aos materiais controle.

EXEMPLO 10

Este exemplo demonstra o limite de resistência do material ECM que foi processa-

do de acordo com o exemplo 1 comparado a um outro processo para preparar um tecido submucoso isolado esterilizado.

Dez lotes de intestino delgado suíno dividido foram obtidos e divididos em dois gru- pos aproximadamente iguais. Um grupo foi processado da maneira descrita na patente U.S. 6.206.931 (em seguida referido como o "grupo controle"). Resumidamente, o intestino bruto foi primeiro tratado com ácido peracético, em seguida friccionando em ambos os lados para isolar uma camada de tecido submucoso e rinsando para remover resíduos químicos. O segundo grupo foi preparado da maneira descrita anteriormente no exemplo 1(em seguida referido como o "grupo teste"). Cada lote foi feito em três folhas Iiofilizadas de 4 camadas ou três folhas prensadas

a vácuo de 8 camadas como no exemplo 8. Estas folhas foram esterilizadas usando um ci- clo de oxido de etileno de baixa temperatura. A partir de cada folha, uma amostra em forma de "osso de cachorro" foi cortada para testar a tração. Três amostras foram analisadas por grupo por lote (3 amostras χ 10 lotes) para um total de 30 amostras para cada grupo. O ma- terial Iiofilizado de 4 camadas foi cortado nas duas direções primárias, longitudinal e trans- versal, enquanto o material de 8 camadas foi cortado apenas em uma direção. Cada amos- tra foi reidratada em salina tamponada com fosfato (PBS) e testada com relação a força de tração máxima (UTF) antes da ruptura usando o Instron em uma taxa de deformação de 100 mm/minuto.

A análise de distribuição foi realizada para determinar qual distribuição (normal, Iog-

normal, Weibull, ou gama) ajusta melhor a cada conjunto de dados. A análise de distribuição indicou que o controle Iiofilizado de 4 camadas na UTF da direção longitudinal ajusta melhor a distribuição log-normal, que corresponde a uma UTF média de 3,72 +/- 1,05 lbs. A análise de distribuição indicou que o material teste Iiofilizado de 4 camadas na UTF da direção Iongi- tudinal ajusta melhor a distribuição normal, que corresponde a uma UTF média de 2,92 +/- 0,88 lbs. A diferença média em UTF entre estes dois grupos foi 21%. Um valor ρ de 3,6 χ 10" 3 foi atingido usando um teste t não pareado em todas as amostras. Um valor ρ de 3,4 χ 10"3 foi atingido usando um teste t pareado para comparar os resultados do grupo controle de lote casado com os resultados do grupo teste correspondente. Ambos estes valores ρ são menores que 0,05, indicando que existia uma diminuição estatisticamente significante em UTF na direção longitudinal do material teste Iiofilizado de 4 camadas comparada ao materi- al controle Iiofilizado de 4 camadas. Similarmente, a análise de distribuição indicou que o controle Iiofilizado de 4 cama- das na UTF da direção transversal ajusta melhor a distribuição log-normal, que corresponde a uma UTF média de 3,2 +/- 0,96 lbs. A análise de distribuição indicou que o material teste Iiofilizado de 4 camadas na UTF da direção longitudinal ajusta melhor a distribuição Iog- normal, que corresponde a uma UTF média de 2,48 +/- 0,90 lbs. A diferença média em UTF entre estes dois grupos foi 22%. Um valor ρ de 7,1 χ 10"3 foi atingido usando um teste t não pareado em todas as amostras. Um valor ρ de 5,11 χ 10"2 foi atingido usando um teste t pa- reado para comparar os resultados do grupo controle com os resultados do grupo teste cor- respondente. Ambos este valores ρ são menores que 0,05, indicando que existia uma dimi- nuição estatisticamente significante em UTF na direção transversal do material teste Iiofili- zado de 4 camadas comparada ao material controle Iiofilizado de 4 camadas.

Com relação ao material de 8 camadas, a análise de distribuição indicou que a UTF do controle prensado a vácuo de 8 camadas ajusta melhor a distribuição Weibull, que cor- responde a uma UTF média de 10,78 +/- 3,35 lbs. A análise de distribuição indicou que a UTF do material teste prensado a vácuo de 8 camadas ajusta melhor a distribuição normal, que corresponde a uma UTF média de 7,46 +/- 2,45 lbs. A diferença média em UTF entre estes dois grupos foi 31%. Um valor ρ de 6,4 χ 10"5 foi atingido usando um teste t não pare- ado em todas as amostras. Um valor ρ de 9,9 χ 10"7 foi atingido usando um teste t pareado para comparar os resultados do grupo controle de lote casado com os resultados do grupo teste correspondente. Ambos este valores ρ são menores que 0,05, indicando que existia uma diminuição estatisticamente significante em UTF do material prensado a vácuo de 8 camadas teste comparada ao material controle prensado a vácuo de 8 camadas.

EXEMPLO 11

Este exemplo demonstra que o material ECM processado do exemplo 1 exibe cará- ter angiogênico.

Um disco para implantação foi formado de submucosa do intestino delgado suíno (SIS) processada da seguintes maneiras: Controle Iiofilizado (preparado da maneira descrita no exemplo 1 da patente U.S. 6,206.931), controle prensado a vácuo (preparado da maneira descrita no exemplo 1 da patente U.S. 6.206.931), teste Iiofilizado (preparado da maneira descrita no exemplo 1), teste prensado a vácuo (preparado da maneira descrita no exemplo 1), e um produto curativo de ferida Promogran® (PR). Os discos controle e teste foram este- rilizados com um ciclo de óxido de etileno de baixa temperatura antes da implantação. O produto PR foi recebido estéril e processado assepticamente. Cada disco foi implantado no dorso subcutâneo de um camundongo por 3 semanas. Após 3 semanas, cada disco foi son- dado com relação a formação capilar. A angiogênese foi medida qualitativamente usando microangiografia de fluorescência, um método de imageamento da microvasculatura funcio- nal intacto. A capacidade vascular, como uma medida de angiogênese, foi determinada u- sando uma perfusão vascular de microesferas fluorescentes, seguida por extração por fluo- rescência dos implantes usando xilenos e subsequente quantificação com um leitor de placa de fluorescência. Por último, os implantes foram examinados histologicamente por seccio- namento fino e coloração com H&E para ilustrar o crescimento celular.

A microangiografia de fluorescência indicou que todos os discos suportaram angio-

gênese. O disco teste Iiofilizado teve resultados similares ao disco controle liofilizado. O dis- co teste prensado a vácuo teve um desempenho superior ao disco controle prensado a vá- cuo. O disco PR teve crescimento vascular significativamente menor com apenas uma área para as duas amostras investigadas com qualquer crescimento. Os resultados da capacida- de vascular para o disco PR foram significativamente menores que o controle. Não houve diferença estatística para nenhum dos outros discos testados. A histologia confirmou as ob- servações microangiográficas. O disco controle liofilizado e o disco teste liofilizado tiveram crescimento fibrovascular significante. O disco controle prensado a vácuo teve apenas pene- tração menor. O disco teste prensado a vácuo teve maior crescimento celular, espelhando os resultados da microangiografia, mas ainda teve sinais de SIS não incorporados próximos à borda, provavelmente em virtude da natureza densa deste material. O crescimento celular muito pequeno foi evidente no disco PR, sugerindo evidência muito pequena de remodela- mento funcional.

EXEMPLO 12

Este exemplo fornece uma comparação do ECM processado do exemplo 1 com um

outro ECM processado quando usado em um modelo de reparo de parede abdominal de rato.

Dez lotes de intestino delgado suíno dividido foram obtidos e divididos em dois gru- pos aproximadamente iguais. Um grupo foi processado da maneira descrita no exemplo 2 da patente U.S. 6.206.931 (em seguida referido como o "grupo controle"). Resumidamente, intestino bruto foi primeiro tratado com ácido peracético, em seguida friccionando ambos os lados para isolar uma camada de tecido submucoso e rinsando. O segundo grupo foi prepa- rado da maneira descrita anteriormente no exemplo 1 (em seguida referido como o "grupo teste").

Cada lote de material foi feito em um implante teste prensado a vácuo de 4 cama-

das ou um implante controle prensado a vácuo de 4 camadas. Um defeito de 2 cm χ 2 cm foi criado na fáscia abdominal do rato e cada implante foi implantado para fornecer o reparo. Após duas, quatro ou oito semanas, os ratos foram sacrificados e os implantes foram remo- vidos. Um fragmento em forma de osso de cachorro foi cortado de cada implante e testado com relação a resistência mecânica.

Os implantes teste foram comparados com suas contrapartes controle em cada ponto de tempo com relação a resistência mecânica na ruptura. Além disso, em explante, quaisquer complicações foram notadas. Complicações registradas incluíram infecção, for- mação de adesão abdominal e formação de seroma. Em cada ponto de tempo, o implante teste teve UTF similar a falha comparado ao implante controle correspondente. O implante teste induziu menos reação negativa do hospedeiro. Especificamente, apenas um seroma foi notado no material teste em todos os pontos, enquanto 5 seromas foram vistos no im- plante controle. Por último, a histologia indicou que o implante teste remodelou igualmente se não melhor que o implante controle.

EXEMPLO 13

Este exemplo descreve a preparação de um outro material ECM processado da in-

venção.

Intestinos delgados suínos foram recebidos de uma usina de embalagem e foram seccionados e divididos para revelar suas porções internas. Após limpeza inicial para remo- ver os conteúdos presentes nos intestinos, cada intestino foi mecanicamente friccionado em cada lado para remover camadas mucosa e serosa e para isolar uma camada de tecido principalmente conectivo incluindo a submucosa para processamento adicional. A camada submucosa foi tratada em uma solução de álcool isopropílico a 99 % (IPA)1:5 (peso: volu- me) por 30 minutos a temperatura ambiente. Esta etapa de tratamento com IPA foi repetida uma segunda vez, em seguida rinsando a submucosa duas vezes com água de torneira. A submucosa foi a seguir tratada em uma solução aquecida de dodecil sulfato de sódio a 0,1 % (SDS)1:10 (peso: volume) por uma hora a 37 °C, seguida por tratamento em uma solução aquecida de tris borato ácido etileno diamina tetra acético (TBE) e 1:10 (peso: volume) 89 mM tris, por uma hora a 37 °C. A submucosa tratada foi a seguir rinsada duas vezes com água de torneira. Após a rinsagem, a submucosa foi tratada em uma solução alcoólica es- pecialmente desnaturada a 0,2 % PAA/5 % 1:10 (peso: volume) por duas horas a temperatu- ra ambiente. Após estas etapas de tratamento, a submucosa foi rinsada com água de alta pureza 1:10 (peso: volume) por 5 minutos a temperatura ambiente. Esta etapa de rinsagem foi repetida em um total de 4 rinsagens antes do teste e liberação. A água de rinsagem foi testada quanto ao pH, condutividade e teor de PAA. Um amostra de submucosa foi testada com relação à biocarga após desinfecção, bem como com relação aos atributos físicos. Os termos "um", "uma", "o" e "a" e referentes similares no contexto de descrever a

invenção (especialmente no contexto das reivindicações seguintes) devem ser interpretados de forma a cobrir tanto o singular quanto o plural, a menos que de outra forma aqui indicada ou claramente contradito pelo contexto. Pretende-se que a citação de faixas de valores aqui sirvam meramente como um método rápido de referir individualmente a cada valor separado que cai na faixa, a menos que de outra forma aqui indicada, e cada valor separado é incor- porado na especificação como se ele fosse aqui citado individualmente. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que de outra forma aqui indicada ou contradita claramente de outra forma pelo contexto. O uso de todo e qualquer exemplo ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") é meramente para ilus- trar melhor a invenção e não apresenta uma limitação do escopo da invenção, a menos que de outra forma reivindicada. Nenhuma linguagem na especificação deve ser interpretada indicando nenhum elemento não reivindicado como essencial à prática da invenção.

Modalidades preferidas desta invenção são aqui descritas, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para realizar a invenção. Certamente, variações destas modali- dades preferidas se tornarão aparentes aos versados na técnica mediante leitura da descri- ção precedente. Os inventores contam com versados na técnica para empregar tais varia- ções apropriadas, e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de outra forma além da maneira especificamente aqui descrita. Dessa maneira, esta invenção inclui todas as modificações e equivalências da matéria em questão citada nas reivindicações aqui ane- xadas da maneira permitida pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos ele- mentos anteriormente descritos em todas as variações possíveis destes está englobada pela invenção a menos que de outra forma aqui indicada ou contradita claramente de outra forma pelo contexto. Além do mais, todas as publicações aqui citadas são indicativas das capacidades dos versados na técnica e são aqui incorporadas pela referência nas suas ín- tegras como se estivessem incorporadas individualmente pela referência e apresentadas completamente.

Claims (37)

REIVINDICAÇÕES

1. Material de enxerto médico, compreendendo: um material de matriz extracelular (ECM) descelularizado estéril incluindo compo- nentes de colágenos e não colágenos, CARACTERIZADO pelo fato de que os ditos compo- nentes não colágenos incluem: (i) IgA nativo ao nível de não mais que cerca de 20 //g/g; (ii) lipídios nativos ao nível de não mais que cerca de 4 % em peso; (iii) FGF-2 nativo ao nível de pelo menos cerca de 10 ng/g; (iv) ácido hialurônico nativo ao nível de pelo menos cerca de 50 μ g/g; (v) glicosaminoglicanos sulfatado nativo ao nível de pelo menos cerca de 500 //g/g.

2. Material de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito material ECM compreende submucosa.

3. Material de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita submucosa é intestinal, bexiga urinária ou sub- mucosa do estômago.

4. Produto de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita submucosa é submucosa do intestino delgado (SIS).

5. Material de enxerto médico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: um material de matriz extracelular (ECM) descelularizado estéril incluindo compo- nentes de colágeno e não colágeno, em que os ditos componentes não colágenos incluem IgA nativo ao nível de não mais que 20 //g/g e pelo menos um de FGF-2 nativo, ácido hialu- rônico nativo e glicosaminoglicanos nativos.

6. Material de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o material ECM inclui IgA nativo ao nível de não mais que 15 //g/g.

7. Material de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o material ECM inclui IgA nativo ao nível de não mais que 10 ///g.

8. Material de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o material ECM inclui IgA nativo ao nível de não mais que 5 μ/g.

9. Material de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o material ECM é essencialmente livre de IgA nativo.

10. Material de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o material ECM tem um teor de lipídio de não mais que cerca de 4 %.

11. Material de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o material ECM inclui um teor de lipídio de não mais que cerca de 3 %.

12. Material de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o material ECM é formado como um ou mais de uma folha, um gel, uma composição aquosa não gelificada, um pó, ou uma esponja.

13. Material de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito material ECM é formado como uma folha e é liofilizado.

14. Material de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o material ECM é formado de pelo menos duas cama- das de ECM e em que as pelo menos duas camadas de ECM são acopladas umas nas ou- tras.

15. Material de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito material ECM compreende FGF-2 nativo, ácido hialurônico nativo e glicosaminoglicanos nativos.

16. Produto de enxerto médico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5- 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito material ECM compreende submucosa.

17. Produto de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita submucosa é intestinal, bexiga urinária ou sub- mucosa estômago.

18. Produto de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita submucosa é submucosa do intestino delgado (SIS).

19. Material de enxerto médico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: um material de matriz extracelular descelularizado estéril apresentando um caráter angiogênico e incluindo IgA nativo ao nível de não mais que 20 //g/g.

20. Material de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito ECM compreende submucosa.

21. Material de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita submucosa é intestinal, bexiga urinária ou sub- mucosa do estômago.

22. Produto de enxerto médico, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita submucosa é submucosa do intestino delgado (SIS).

23. Método para tratar um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de que compre- ende: fornecer o material de enxerto médico de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-22, e enxertar o paciente com o dito material de enxerto médico.

24. Método para preparar um material de enxerto médico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: fornecer um material de matriz extracelular (ECM) de partida contendo IgA nativo e FGF-2 nativo; e tratar o dito material ECM de partida efetivamente para reter o FGF-2 nativo ao ní- vel de pelo menos cerca de 10 ng/g ao mesmo tempo em que diminui o teor de IgA nativo para um nível menos que 20 //g/g, em que o dito tratamento compreende fazer contato com o material de matriz extracelular de partida com uma solução de detergente aquosa.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende adicionalmente enxaguar o material ECM após a dita etapa de trata- mento de maneira a remover pelo menos 90 % dos resíduos de detergente do material.

26. Material da matriz extracelular, CARACTERIZADO pelo fato de que compreen- de: um material de matriz extracelular substancialmente acelular (ECM) isolada de um vertebrado de sangue quente, o dito material ECM tendo um teor de FGF-2 nativo de pelo menos cerca de 10 ng/g e um teor de lipídio de não mais que cerca de 4 %.

27. Material da matriz extracelular, CARACTERIZADO pelo fato de que compreen- de: um material de matriz extracelular substancialmente acelular (ECM) isolada de um vertebrado de sangue quente, o dito material ECM retendo pelo menos um componente bio- ativo e tendo núcleos visíveis presentes ao nível de menos que 200 por 0,263 mm2.

28. Material ECM, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito pelo menos um componente bioativo é um fator de crescimento.

29. Material da matriz extracelular, CARACTERIZADO pelo fato de que compreen- de: um material de matriz extracelular substancialmente acelular (ECM) isolado de um vertebrado de sangue quente, o dito material ECM retendo pelo menos um componente bio- ativo e tendo um teor de ácido nucléico de menos que cerca de 2 micrograma/grama.

30. Material ECM, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito pelo menos um componente bioativo é um fator de crescimento.

31. Material da matriz extracelular, CARACTERIZADO pelo fato de que compreen- de: um material de matriz extracelular substancialmente acelular (ECM) isolado de um vertebrado de sangue quente, o dito material ECM retendo pelo menos um componente bio- ativo e tendo núcleos visíveis presentes ao nível menos que 200 por 0,263 mm .

32. Material ECM1 de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito pelo menos um componente bioativo é um fator de crescimento.

33. Material da matriz extracelular, CARACTERIZADO pelo fato de que compreen- de: um material de matriz extracelular substancialmente acelular (ECM) isolado de um vertebrado de sangue quente, o dito material ECM retendo pelo menos um componente bio- ativo e tendo um teor de imunoglobulina de menos que micrograma/grama.

34. Material ECM1 de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito pelo menos um componente bioativo é um fator de crescimento.

35. Material da matriz extracelular, CARACTERIZADO pelo fato de que compreen- de: um material de matriz extracelular substancialmente acelular (ECM) isolado de um vertebrado de sangue quente, o dito material ECM tendo um teor de lipídio de não mais que cerca de 4 % e apresentando um nível de endotoxina de menos que cerca de 12 EU/grama.

36. Material da matriz extracelular, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito material apresenta um nível de endotoxina de menos que cerca de 5 EU/grama.

37. Material da matriz extracelular, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito material compreende submucosa.