CN1214821C - 异种骨胶原基质制备的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及骨外科修复材料和骨组织工程细胞外基质材料等生物材料技术领域，具体是一种异种骨胶原基质制备的新方法。本方法选取牛、猪等异种骨，主要经异种骨来源和加工—脱脂处理—部分脱钙—脱非胶原蛋白—蛋白酶消化，最后消毒包装得新型的异种骨胶原基质，该材料保留了原骨的骨矿成分和大部分胶原蛋白，其中的胶原成分经蛋白酶消化后，切除了能够引起免疫原性的端肽，因而免疫原性大大降低。在具有较强力学性能的同时，该材料具有较好的孔隙率和孔道连通，适合用作骨组织工程细胞外基质材料和骨缺损移植材料，为骨移植外科和骨组织工程的发展提供廉价的生物材料。
Description
技术领域
本发明涉及骨外科修复材料和骨组织工程细胞外基质材料等生物材料技术领域。更确切地说，本发明涉及到一种采用生物和化学方法处理异种松质骨和皮质骨的方法，以获得可移植的异种骨修复材料和骨组织工程细胞外基质材料。
背景技术
由于创伤、感染、肿瘤以及发育异常等原因使骨丧失了一些骨质，形成较大的间隙，称之为骨缺损。绝大多数骨缺损由于间隙大，成骨细胞难以爬过间隙而不能发生正常的愈合，最终形成骨不连。在美国，每年因为各种原因进行骨移植的手术多达980000例，而在德国，这一数字也高达100000例(Kessler S，Wohlfart U M，Ingnatius A，et al.Solventdehydrated bone transplants to bridge segmental bone defects：histomorphologicaland biomechanical investigations in an animal model.Arch Orthop TraumaSurg，2001，121：472～475)。
临床证明，自体骨移植一直是治疗骨缺损的最好方法。在病人体内不会发生免疫反应，移植骨中的细胞和生物活性分子能在受体部位继续存活，并发挥相应的功能，促进骨缺损的愈合，但取骨部位容易发病，取骨量有限并且其尺寸和形状常常受到限制。同种异体骨能提供大量不同形状和尺寸的皮质骨或松质骨。但它容易引起免疫反应，在骨缺损边缘与宿主骨的连接速度较慢，并有传染病毒性疾病的危险，而且制样、处理和存贮的成本很高，其应用受到很大限制。人工合成可降解聚合物材料，其组成成分、分子量、力学性能、降解速度等都能预先设计和控制，也容易塑型和构建多孔三维结构，但很多此类材料的降解产物会使体内酸度过高，容易诱发炎症反应。
为了克服这些缺点，人们开始考虑新的骨替代材料，近十多年来发展起来的骨组织工程学，为大范围骨缺损的修复开辟了新的渠道。其中，能够支持细胞粘附、增殖和分化以及释放生物活性因子或种子细胞的基质材料的开发是骨组织工程成功与否的重要条件。天然异种骨具有来源丰富、价格低廉等优点，是骨组织工程细胞外基质材料和骨缺损移植材料的潜在来源之一，但是异种骨含有很多有机成分，其中很多酸溶性蛋白具有免疫原性，植入人体后能够诱发免疫排斥反应，必须彻底脱除。骨基质中的I型胶原，由于有规整的螺旋结构，免疫原性较温和。在胶原分子中95％的氨基酸具有Gly-X-Y的重复序列和三螺旋结构，在两端约5％的氨基酸不具有这种序列而不能形成螺旋结构，这些区域与胶原的免疫原性有关，除掉这些区域可以大大减小免疫原性。因此，如何去除异种骨的抗原性物质并保留其诱导成骨能力是异种骨研究首要解决的问题。
国内外关于异种骨的加工方法很多，早在1937年Orell就首次将脱蛋白骨应用于临床，该方法称为Os Purum法，将异种骨除去软组织后用KOH去结缔组织，随后用丙酮脱脂，在盐溶液中脱蛋白。在此后的几十年里，出现了Kiel骨、Oswestry骨和Anorganic骨等多种脱蛋白骨，在这些处理方法中，通常使用NaClO、H2O2和乙二胺等化学试剂来破坏胶原和其它蛋白质。通过脱钙、深低温冷冻、煮沸、射线辐照等方法也能减小或消除其抗原性。目前在骨移植手术中使用的异种骨多采用煅烧骨和经一些物理和化学方法处理的无机骨，为了避免剧烈的免疫排斥反应，通常去除了胶原等重要的有机成分，这种处理方法使移植骨的力学性能很差，因而限制了它的使用(Salama R.Xenogeneic bone grafting in humans.Clin Orthop，1983，174：113～121)。罗卓荆等人采用离心技术、超声波技术和化学处理技术相结合的方法处理牛松质骨，获得了一种无免疫原性并具有一定机械支撑能力的大块形异种骨移植材料(罗卓荆和胡蕴玉，新型块形脱脂去抗原异种骨移植材料及其制备方法，中国专利号ZL97108538.2)。杨志明等人采用物理化学处理方法，将来源于猪骨或异种骨制成生物衍生骨支架，引入高分子材料或活性成分，构建生物衍生组织工程骨(杨志明和秦廷武，生物衍生组织工程骨及其制备方法，中国专利号ZL00132082.3)。这些加工方法能够脱除异种骨的抗原性物质并保留其天然网状结构，但采用H2O2等强氧化性试剂脱除抗原性物质对有机成分的破坏较大，也必然影响其力学强度，特别是松质骨材料，本身的力学强度就很低，文献报道牛松质骨经H2O2处理后，其力学强度明显降低，处理24小时降低43.7％，其压缩极限强度为5.3564MPa，处理96小时降低92.8％，仅为0.6896MPa(罗卓荆，胡蕴玉，候德门，赵婷.牛松质骨力学强度与去抗原处理时限的相关性实验.第四军医大学学报，1996；17(6)：434～436)。
发明内容
为了克服已有方法的缺点，本发明的目的是研究一种骨胶原基质的制备方法，在去除或减小免疫原性的同时，尽量保持天然骨的骨矿结构和部分有机胶原结构，以增加移植骨的整体力学强度，并保留适当的成骨性能。
本发明主要涉及一种新型异种骨胶原基质的制备方法，其主要的技术特征是：采用一系列生物和化学方法对牛、猪等异种骨进行处理。采用的技术路线如下：
(1)异种骨材料的来源和加工
从屠宰场获得新鲜的牛或猪的腿骨，经充分去除软组织、软骨和骨髓后，洗净，置于-20℃的冰箱中冷冻24小时。用低速锯切割使干骺端分离，骨骺端松质骨加工成块状，其长轴与骨小梁的排列方向保持一致，用于制备组织工程细胞外基质材料或骨缺损填充材料；骨干中部加工成圆柱体或条形，用于制备骨缺损移植材料。
(2)脱脂处理
加工好的骨块用40～60℃压力水反复冲洗，然后用0.01～5mol/L碱液室温浸泡24h，将骨块置于含脱脂剂的脂肪提取器中于50～60℃下脱脂48～72h，每24h将骨块取出在离心机上以4000转/分钟的速度离心30分钟左右，清除骨块内细胞成分和脂肪等物质，脱脂剂可以采用1∶1～1∶3的甲醇/氯仿、甲酸乙酯、乙酸甲酯、异丙醇或丙酮等有机溶剂。
(3)部分脱钙处理
骨块在0.1～5mol/L酸性溶液中室温下部分脱钙5～10分钟，再用双蒸水反复透析至pH值为6，以去除残留的酸液。
(4)脱非胶原蛋白
骨块放入含有pH为7.4的脱非胶原蛋白混合液中，该混合液的组成为含氮碱性有机物、Tris缓冲液和盐类，置于4℃的冰箱中脱除非胶原蛋白，时间为24h，可以采用尿素或盐酸胍作为非胶原蛋白脱除剂。
(5)蛋白酶消化
骨块用0.05～0.5％的蛋白酶消化，加入少量巯基酶抑制剂防腐，用缓冲溶液控制溶液的pH为7.8～8.0，骨液比为1∶1～1∶6，在37℃条件下消化48h。再用4mol/L NaCl浸泡12～24h，以脱除溶解的非胶原蛋白和部分胶原蛋白。
经蛋白酶消化，能进一步脱除骨块中的非胶原蛋白，并使骨块中剩余的胶原脱去端肽，变成无端肽胶原，消除胶原的免疫原性。
(6)消毒和包装
骨块用重蒸水反复冲洗，50℃下真空干燥24h，三层聚乙烯薄膜封装，环氧乙烷消毒2小时，置4℃冰箱中保存备用。
由上述方法获得的异种骨胶原基质，能降低或消除牛、猪等异种松质骨和皮质骨的免疫原性，胶原蛋白和骨矿成分之比约为1∶2，其中的胶原蛋白经过蛋白酶处理已切除了端肽，所得的材料为白色块状、圆柱状或条状，保留了天然骨的网状多孔结构，采用牛皮质骨制备的胶原基质材料的拉伸杨氏模量达6000Mpa左右，最大应力达110Mpa左右。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1.采用生物和化学方法制备的松质骨材料，保留了原骨的骨矿成分和大部分胶原蛋白，其中的胶原成分经蛋白酶消化后，切除了能够引起免疫原性的端肽，因而免疫原性大大降低，胶原的存在使材料的力学强度大大改善，同时，该材料具有较好的孔隙率和孔道连通，为成骨细胞等种子细胞的爬行替代提供了良好的条件，适合用作骨组织工程细胞外基质材料。
2.采用生物和化学方法制备的皮质骨材料，除了具有低免疫原性和一定的孔隙率之外，还具有优异的力学性能，如按照该方法制备的牛皮质骨材料，其拉伸杨氏模量可达6000Mpa左右，最大应力可达110Mpa左右，与人长骨的力学性能较为接近，在植入体内后，消除了其它植骨材料如金属等由于与人骨力学性能的差异而引起的“应力遮挡”效应。适合用作骨缺损移植材料。
3.本发明所制备的材料具有各种不同的外形，可以根据临床上的需要裁切成各种不同的形状，也可以根据需要用抗生素或其它药物进行进一步处理或在其表面引入活性肽、生长因子、可降解聚合物等进行修饰。
本发明的意义在于采用生物和化学方法相结合研制出了新型异种骨胶原基质，为骨移植外科和骨组织工程的发展提供廉价的生物材料，以满足市场的需求。
附图说明
图1是本发明所涉及的异种皮质骨胶原基质材料加工过程示意图，1为从屠宰场获得的新鲜猪或牛腿骨，经去除软组织和其它成分后冷冻；2为截取的骨干部分；3为加工好的材料。
图2是本发明制备的圆柱状和条状材料的外形照片。
具体实施方式
实施例1 一种牛皮质骨胶原基质材料的制备方法
本发明所述的皮质骨材料应取自骨干中部(参见附图1)。加工过程应在冷冻后采用低速锯切割，以免温度较高破坏胶原。加工好的骨块用50℃压力水反复冲洗，然后用0.1mol/LNaOH溶液室温浸泡24h，将骨块置于含有甲酸乙酯的索氏提取器中于60℃下脱脂72h，每24h将骨块取出在离心机上以4000转/min的速度离心30min左右，清除骨块内异物；骨块在0.5mol/L HCl溶液中室温下部分脱钙10min，再用双蒸水反复透析至pH值为6，以去除残留的酸液；骨块放入含有4mol/L HCl胍、50mmol/L Tris-HCl和0.5Mmol/LCaCl2，pH为7.4的溶液中，并置于4℃的冰箱中脱除非胶原蛋白，时间为24h；骨块用0.1％的胰蛋白酶消化，加入少量叠氮化钠溶液防腐，用Na2HPO4和NaH2PO4的缓冲溶液控制溶液的pH为7.8，骨液比为1∶3，在37℃条件下消化48h。再用4mol/L NaCl浸泡12～24h，以脱除溶解的非胶原蛋白和部分胶原蛋白；骨块用重蒸水反复冲洗，50℃下真空干燥24h，三层聚乙烯薄膜封装，环氧乙烷消毒2小时，置4℃冰箱中保存备用，
实施例2一种牛松质骨胶原基质材料的制备方法
本发明所述的松质骨材料应取材于骨骺端，取其长轴与骨小梁排列方向一致。加工过程应在冷冻后采用低速锯切割成块状，以免温度较高破坏胶原。加工好的骨块用50℃压力水反复冲洗，然后用0.05mol/L NaOH溶液室温浸泡24h，将骨块置于含有1∶1的甲醇/氯仿混合溶剂的索氏提取器中于55～60℃下脱脂72h，每24h将骨块取出在离心机上以4000转/min的速度离心30min左右；骨块在0.1mol/L HCl溶液中室温下部分脱钙10min，再用双蒸水反复透析至pH值为6，以去除残留的酸液；骨块放入含有6mol/L尿素的溶液中，并置于4℃的冰箱中脱除非胶原蛋白，时间为24h；骨块用0.1％的胰蛋白酶消化，加入叠氮化钠溶液防腐，用Na2HPO4和NaH2PO4的缓冲溶液控制溶液的pH为7.8，骨液比为1∶4，在37℃条件下消化36h。再用4M NaCl溶液浸泡12h；骨块用重蒸水反复冲洗，50℃下真空干燥24h，三层聚乙烯薄膜封装，环氧乙烷消毒2小时，置4℃冰箱中保存备用。
本发明制备的圆柱状和条状材料的外形见图2所示的照片。
Claims (4)
1.一种异种骨胶原基质制备的新方法，其特征在于：采用一系列生物和化学方法对牛、猪等异种骨进行处理，过程如下：
(1)异种骨材料的来源和加工
选取新鲜的牛或猪的腿骨，经充分去除软组织、软骨和骨髓后，洗净，冷冻，切割分离干骺端，将骨骺端松质骨加工成块状，其长轴与骨小梁的排列方向保持一致，骨干中部加工成圆柱体或条形；
(2)脱脂处理
加工好的骨块用40～60℃压力水反复冲洗，然后用0.01～5mol/L碱液室温浸泡24h，将骨块用脱脂剂于50～60℃下脱脂48～72h，每24h将骨块取出在离心机上以4000转/分钟的速度离心30分钟左右，清除骨块内细胞成分和脂肪等物质；
(3)部分脱钙处理
骨块在0.1～5mol/L酸性溶液中室温下部分脱钙5～10分钟，再用双蒸水反复透析至pH值为6，以去除残留的酸液；
(4)脱非胶原蛋白
骨块放入含有pH值为7.4的非胶原蛋白脱除剂的混合液中，该混合液的组成为含氮碱性有机物、Tris缓冲液和盐类，置于4℃的冰箱中脱除非胶原蛋白，时间为24h；
(5)蛋白酶消化
骨块用0.05～0.5％的蛋白酶消化，加入少量巯基酶抑制剂防腐，用缓冲溶液控制溶液的pH为7.8～8.0，骨液比为1∶1～1∶6，在37℃条件下消化48h，再用4mol/LNaCl浸泡12～24h，以脱除溶解的非胶原蛋白和部分胶原蛋白；
(6)消毒和包装。
2、根据权利要求1所述的异种骨胶原基质制备的新方法，其特征在于：脱脂剂采用1∶1～1∶3的甲醇/氯仿、甲酸乙酯、乙酸甲酯、异丙醇或丙酮。
3、根据权利要求1所述的异种骨胶原基质制备的新方法，其特征在于：采用尿素或盐酸胍作为非胶原蛋白脱除剂。
4.根据权利要求1、2或3所述方法制备的异种骨胶原基质，其特征在于：降低或消除牛、猪等异种松质骨和皮质骨的免疫原性，胶原蛋白和骨矿成分之比约为1∶2，其中的胶原蛋白经过蛋白酶处理已切除了端肽，所得的材料为白色块状、圆柱状或条状，保留了天然骨的网状多孔结构，采用牛皮质骨制备的胶原基质材料的拉伸杨氏模量达6000Mpa左右，最大应力达110Mpa左右。
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