CN102872479B - 异种骨移植替代材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种异种骨材料的脱脂处理方法，取新鲜的异种骨条放入索氏提取器的抽提筒内，利用石油醚在一定条件下不断回流抽提，直到更换后的石油醚经脱脂后其颜色仍然保持澄清；得到脱脂后的异种骨材料。本发明还公开了一种脱蛋白处理方法，将前述脱脂处理后的异种骨材料放入含胃蛋白酶的脱蛋白处理液中进行浸泡，浸泡时pH值控制在1.5～3，然后用碱液灭活胃蛋白酶，反复冲洗、沥干后即可。本发明还公开了一种异种骨移植替代材料的制备方法，将前述脱脂、脱蛋白处理后的异种骨材料进行冷冻干燥、灭菌处理，即得到异种骨移植替代材料。本发明的方法加工制作简单、成本低，产品具有低抗原性、较好的骨传导性及生物力学性能。
Description
技术领域
本发明涉及一种骨材料的处理方法及骨移植替代材料的制备方法，尤其涉及一种异种骨材料的处理方法及异种骨移植替代材料的制备方法。
背景技术
在骨外科的临床工作中，由于创伤、肿瘤、炎症以及发育异常等其他原因常会导致骨缺损，引起肢体的功能丧失，影响人们的生活质量。骨移植是治疗骨缺损最常用的方法，其中传统自体骨移植是临床上治疗骨缺损的最有效手段，但自体骨移植是以牺牲健康组织为代价，会导致供骨区出现附加的手术损伤以及疼痛、血肿、骨折等并发症；且自体骨来源和能获取的骨量均非常有限，极大地限制了其在临床上的应用。同种异体骨移植是修复骨缺损的另一常见的方法，其愈合过程与自体骨移植基本上相同，其来源也同样有限，且潜在的疾病传播和并发感染的现象是其在临床使用最大的风险之一。近年来，临床上使用较多的人工材料骨，具有加工容易、腐蚀性小、价格便宜等优点，但人工骨没有骨诱导作用、耐磨性差，其孔隙结构、降解能力及生物性能远不及天然骨。因此，寻找理想的骨移植替代材料，是骨科学、材料学及相关学科长期面临的艰巨挑战和重大课题。
异种骨具有天然的多孔结构以及与人骨的力学性能相近等优点，其天然的骨小梁结构更符合生物力学性能，且其来源广泛，价格低廉，易于大量获取，具有其他人工合成材料难以比拟的优势，符合骨移植替代材料的要求。但是，异种骨的抗原成分来源广泛且复杂，异种骨种属差异性大，如不经过处理直接植入人体内，必然会产生强烈的免疫排斥反应，因此我们必须降低甚至完全消除异种骨的抗原性，这是异种骨移植替代材料制备过程中的核心问题。
为制备令人满意的异种骨移植替代材料，很多科研工作者曾尝试了多种不同的方法来去除异种骨中的抗原，譬如，深低温冷冻、高温煅烧、γ射线辐照、强氧化剂等方法来减弱或消除异种骨的抗原。上述各种方法虽然都能在一定程度上减弱异种骨的免疫原性，但在去除异种骨抗原的过程中，同时也去除了Ⅰ型胶原等重要的有机成分，破坏了骨中的I型胶原支架结构，严重影响了异种骨的生物力学性能、骨传导及骨诱导性能，而且杂蛋白的去除也并不彻底。因此，找到一种既能脱除异种骨中引起免疫反应的抗原，同时又保留其良好成骨能力和力学性能的制备方法，是异种骨移植替代材料研究中需要解决的关键问题。
此外，目前最常用的对异种骨的脱脂方法是采用体积比为1∶1的甲醇和氯仿混合液进行脱脂，但这种脱脂方法脱除脂肪的效率并不高，残存的脂肪会具有抗原性，并且甲醇、氯仿均有神经毒性、肾毒性、肝毒性、致癌性和致畸性等，属于中毒性溶剂，因此，现有对异种 骨的脱脂技术也需要进一步改进。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种原料来源广泛、加工制作简单、成本低、脱脂效果好的异种骨材料的脱脂处理方法和脱蛋白处理方法，还提供一种原料来源广泛、加工制作简单、成本低、产品具有低抗原性、较好的骨传导性及生物力学性能的异种骨材料的异种骨移植替代材料的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种异种骨材料的脱脂处理方法，所述脱脂处理方法是采用石油醚索氏抽提法，所述脱脂处理方法具体包括以下步骤：取新鲜的异种骨条并用滤纸包好，将包含异种骨条的滤纸筒放入索氏提取器的抽提筒内，连接接收瓶，由索氏提取器的冷凝管上端加入石油醚，石油醚的添加量按每50g异种骨条添加280ml～320ml计；然后于60℃～70℃水浴上加热，使石油醚不断回流抽提，回流抽提过程中至少更换一次接收瓶，并在更换接收瓶时再次注入前述体积量的新的石油醚，直到更换后的石油醚经反复回流抽提脱脂后其颜色仍然保持澄清；停止抽提脱脂，取出异种骨条进行反复冲洗，透析，沥干后得到脱脂后的异种骨材料。
上述的异种骨材料的脱脂处理方法，所述新鲜的异种骨条优选是指宰杀6h内、且去除掉周围软组织、骨膜及骨髓的牛胫骨上端松质骨。
上述的异种骨材料的脱脂处理方法，更换接收瓶的间隔时间优选控制在12h～14h，整个抽提脱脂的处理时间优选控制在48h以上。
上述的异种骨材料的脱脂处理方法，优选的，所述反复冲洗和透析均采用蒸馏水进行，所述反复冲洗和透析的时间控制在24h以上。
上述的异种骨材料的脱脂处理方法是选用石油醚索氏提取法进行异种骨（尤其是牛骨）的脱脂，其特点在于利用石油醚溶剂回流和虹吸原理，使得溶剂循环利用；另一方面，石油醚蒸汽的温度虽与水浴温度相近（约为65℃），但由于冷凝管的冷凝作用，萃取腔内液体的温度维持在38℃左右，即异种骨（尤其是牛松质骨）可始终浸泡于新鲜的38℃的石油醚中，这不仅有利于脂肪成分的快速溶解，且这种略高于生理温度的脱脂处理过程不会对异种骨中Ⅰ型胶原造成损害。另外，石油醚是低毒性溶剂，毒性较小，安全性更有保障。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种异种骨材料的脱蛋白处理方法，包括以下步骤：将脱脂处理后的异种骨材料放入含胃蛋白酶的脱蛋白处理液中进行浸泡，浸泡过程中所述脱蛋白处理液的pH值控制在1.5～3，浸泡处理完成后用碱液（例如NaOH溶液）将脱蛋白处理液的pH值上调到以上（优选8～9），以灭活其中的胃蛋白酶，然后反复冲洗浸泡后的异种骨材料，沥干后得到脱蛋白后的异种骨材料。
上述的异种骨材料的脱蛋白处理方法中，所述脱蛋白处理液主要由胃蛋白酶和磷酸盐缓冲液配制而成，所述胃蛋白酶的用量优选为2500U/g～4000U/g。
上述的异种骨材料的脱蛋白处理方法中，所述磷酸盐缓冲液主要由磷酸溶液和磷酸氢二钠溶液按照（2.6～2.7）∶1的体积比混合而成。所述磷酸溶液的体积百分比浓度优选为1.66%，所述磷酸氢二钠溶液的浓度为7.16g/ml。
上述的异种骨材料的脱蛋白处理方法中，所述异种骨材料优选是指宰杀6h内、且去除掉周围软组织、骨膜及骨髓的牛胫骨上端松质骨。
上述的异种骨材料的脱蛋白处理方法中，所述浸泡处理时脱蛋白处理液的用量按每克异种骨材料添加18ml～22ml计，浸泡处理的时间不少于8h，浸泡处理在室温下进行。
上述本发明的脱蛋白处理方法是采用较温和的胃蛋白酶脱蛋白，其克服了传统的深低温冷冻、高温煅烧、γ射线辐照、强氧化剂等去除杂蛋白方法的局限性，不仅能较为彻底地去除杂蛋白，减轻异种骨免疫反应，同时，胃蛋白酶无法降解骨中的I型胶原，所以处理过程中对其没有伤害，这种脱蛋白方法在减轻异种骨免疫反应的同时能保护异种骨内的I型胶原，从而提高该异种骨材料自身的骨传导性能、生物力学性能和成骨能力。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种异种骨移植替代材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用上述的脱脂处理方法对异种骨材料先进行脱脂处理；
（2）采用上述的脱蛋白处理方法对经过上述步骤（1）脱脂处理后的异种骨材料进行脱蛋白处理；
（3）将经过步骤（2）脱蛋白处理后的异种骨材料进行冷冻干燥、灭菌处理，得到异种骨移植替代材料。
上述的异种骨移植替代材料的制备方法，所述冷冻干燥优选是指将步骤（2）后的骨材料放入-72℃～-80℃的冻干机内冻结干燥24h～48h。
上述的异种骨移植替代材料的制备方法，所述灭菌处理优选是指将冷冻干燥后的骨材料用塑料袋包装封口后放入环氧乙烷灭菌器内灭菌，环氧乙烷的质量浓度控制在480mg/L～520mg/L，灭菌温度控制在38℃～42℃，灭菌湿度为45%～55%，灭菌作用时间为3h～4h，消毒强度在1500mg/h·L～2000mg/h·L。
在改进对异种骨材料处理方法的基础上，本发明进一步提出了上述的异种骨移植替代材料的制备方法，即：首先用石油醚索氏抽提法较彻底地脱去异种骨（如牛松质骨）中的脂肪，再选择胃蛋白酶脱去异种骨中的杂蛋白，最后进行冷冻干燥和灭菌处理，通过该方法制备的异种骨（特别是牛松质骨）移植替代材料，具有低抗原性、较好的骨传导性能、生物力学性 能和成骨能力，同时该异种骨移植替代材料也可以与各种成骨因子、种子细胞构建成复合植骨材料。
与现有技术相比，本发明的优点在于：通过本发明方法处理后骨材料及通过本发明方法制备得到的异种骨（特别是牛松质骨）移植替代材料保留了骨组织的天然网状结构，且产品具有低抗原性、较好的骨传导性及生物力学性能，生物相容性好。经动物实验证实，本发明处理、加工后的骨移植替代材料在植入受体后无明显免疫反应，并具有较好的成骨能力。同时，本发明方法制得的骨移植替代材料还具有来源广泛、加工制作简单、成本低等优点。因此，本发明方法制得的骨移植替代材料既可作为临床上骨缺损的充填材料，又可以与各种成骨因子，种子细胞构建成具有骨诱导能力的复合植骨材料，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例的脱脂对比实验中三种脱脂方法脱除脂肪占牛松质骨湿重百分比的箱式图。
图2为本发明实施例的脱蛋白对比实验中羟脯氨酸含量的均值比较图。
图3为本发明实施例的脱蛋白对比实验中色氨酸含量的均值比较图。
图4为本发明实施例的新鲜牛松质骨HE染色显微照片（1×40X）。
图5为本发明实施例的新鲜牛松质骨HE染色显微照片（1×200X）。
图6为本发明实施例的脱脂脱蛋白后牛松质骨HE染色显微照片（1×40X）。
图7为本发明实施例的脱脂脱蛋白后牛松质骨HE染色显微照片（1×200X）。
图8为本发明实施例的成骨能力测试中空白组术后4周组织切片显微照片（HE×40）。
图9为本发明实施例的成骨能力测试中空白组术后4周组织切片显微照片（HE×100）。
图10为本发明实施例的成骨能力测试中空白组术后8周组织切片显微照片（HE×40）。
图11为本发明实施例的成骨能力测试中空白组术后8周组织切片显微照片（HE×100）。
图12为本发明实施例的成骨能力测试中空白组术后12周组织切片显微照片（HE×40）。
图13为本发明实施例的成骨能力测试中空白组术后12周组织切片显微照片（HE×100）。
图14为本发明实施例的成骨能力测试中过氧化氢处理组术后4周组织切片显微照片（HE×40）。
图15为本发明实施例的成骨能力测试中过氧化氢处理组术后4周组织切片显微照片（HE×100）。
图16为本发明实施例的成骨能力测试中过氧化氢处理组术后8周组织切片显微照片（HE×40）。
图17为本发明实施例的成骨能力测试中过氧化氢处理组术后8周组织切片显微照片 （HE×100）。
图18为本发明实施例的成骨能力测试中过氧化氢处理组术后12周组织切片显微照片（HE×40）。
图19为本发明实施例的成骨能力测试中过氧化氢处理组术后12周组织切片显微照片（HE×100）。
图20为本发明实施例的成骨能力测试中本发明处理组术后4周组织切片显微照片（HE×40）。
图21为本发明实施例的成骨能力测试中本发明处理组术后4周组织切片显微照片（HE×100）。
图22为本发明实施例的成骨能力测试中本发明处理组术后8周组织切片显微照片（HE×40）。
图23为本发明实施例的成骨能力测试中本发明处理组术后8周组织切片显微照片（HE×100）。
图24为本发明实施例的成骨能力测试中本发明处理组术后12周组织切片显微照片（HE×40）。
图25为本发明实施例的成骨能力测试中本发明处理组术后12周组织切片显微照片（HE×100）。
图26为本发明实施例的成骨能力测试中空白组术后当天及术后4周、8周、12周后的X线片（从左至右依次排列）。
图27为本发明实施例的成骨能力测试中过氧化氢处理组术后当天及术后4周、8周、12周后的X线片（从左至右依次排列）。
图28为本发明实施例的成骨能力测试中本发明处理组术后当天及术后4周、8周、12周后的X线片（从左至右依次排列）。
图29为本发明实施例的成骨能力测试中过氧化氢处理组术后4周的Micro-CT检测结果。
图30为本发明实施例的成骨能力测试中本发明处理组术后4周的Micro-CT检测结果。
图31为本发明实施例的成骨能力测试中过氧化氢处理组术后8周的Micro-CT检测结果。
图32为本发明实施例的成骨能力测试中本发明处理组术后8周的Micro-CT检测结果。
图33为本发明实施例的成骨能力测试中过氧化氢处理组术后12周的Micro-CT检测结果。
图34为本发明实施例的成骨能力测试中本发明处理组术后12周的Micro-CT检测结果。
图35为本发明实施例的免疫学实验中空白组术后3d流式细胞仪检测外周血CD4、CD8T 细胞结果原图。
图36为本发明实施例的免疫学实验中本发明处理组术后3d流式细胞仪检测外周血CD4、CD8T细胞结果原图。
图37为本发明实施例的免疫学实验中自体骨组术后3d流式细胞仪检测外周血CD4、CD8T细胞结果原图。
图38为本发明实施例的免疫学实验中各实验组术后3d、7d、14d、28d、56d不同时间点ELISA法检测兔白细胞分化抗原CD4的结果图（横坐标表示时间点，下同）。
图39为本发明实施例的免疫学实验中各实验组术后3d、7d、14d、28d、56d不同时间点ELISA法检测兔白细胞分化抗原CD8的结果图。
图40为本发明实施例的免疫学实验中各实验组术后3d、7d、14d、28d、56d不同时间点ELISA法检测兔白细胞分化抗原CD4/CD8的结果图。
图41为本发明实施例的免疫学实验中各实验组术后3d、7d、14d、28d、56d不同时间点RT-PCR检测移植组织及周围组织中细胞因子IL-2的mRNA表达结果。
图42为本发明实施例的免疫学实验中各实验组术后3d、7d、14d、28d、56d不同时间点RT-PCR检测移植组织及周围组织中细胞因子IL-10的mRNA表达结果。
图43为本发明实施例的免疫学实验中各实验组术后3d、7d、14d、28d、56d不同时间点RT-PCR检测移植组织及周围组织中细胞因子IgG的mRNA表达结果。
图44为本发明实施例的免疫学实验中各实验组术后3d、7d、14d、28d、56d不同时间点ELISA法检测外周血细胞因子IL-2的结果。
图45为本发明实施例的免疫学实验中各实验组术后3d、7d、14d、28d、56d不同时间点ELISA法检测外周血细胞因子IL-10的结果。
图46为本发明实施例的免疫学实验中各实验组术后3d、7d、14d、28d、56d不同时间点ELISA法检测外周血细胞因子IgG的结果。
图47为本发明实施例的免疫学实验中各实验组术后3d、7d、14d、28d、56d不同时间点MTT比色法检测兔脾淋巴细胞增殖反应结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例：
一种本发明的牛松质骨移植替代材料的制备方法，具体包括以下几个步骤。
1.取材：
清洁条件下取检验合格（疯牛病毒原检测）且宰杀6h内的新鲜牛胫骨上端松质骨，骨刀去净周围软组织、骨膜及骨髓，低速锯片铣刀将其加工成5mm×5mm×30mm骨条或5mm×5mm×5mm骨粒，40℃～50℃温水反复冲洗干净表面的血迹，沥干。从中人工挑选出无血渍、无皮质骨成分，清洁包装，冷藏于－20℃冰箱中。
2.脱脂处理：
取上述预处理后的新鲜牛松质骨条，用滤纸包好。将包含牛松质骨条的滤纸筒放入索氏提取器的抽提筒内，连接接收瓶，由索氏提取器的冷凝管上端加入石油醚进行抽提脱脂，石油醚的添加量按每50g牛松质骨条添加300ml计；然后于65℃水浴上加热，使石油醚不断回流抽提；回流抽提过程中每12h后更换一次接收瓶，并在更换接收瓶时再次注入前述体积量的新的石油醚，直到更换后的石油醚经一段时间的抽提脱脂后，颜色仍然保持清澈为止，一般抽提脱脂的时间控制在48h。脱脂完毕以蒸馏水反复冲洗牛松质骨条至无石油醚气味后，再用蒸馏水透析24h，以去除残留的有机溶剂，沥干，得到脱脂后的牛松质骨材料。
3.脱蛋白处理：
将步骤2得到的牛松质骨材料放入含胃蛋白酶的脱蛋白处理液中进行浸泡，浸泡时的骨液比为1∶20（g∶mL），浸泡过程中脱蛋白处理液的pH值控制在2，浸泡处理约8h后用NaOH溶液将脱蛋白处理液的pH值上调到8～9，以灭活其中的胃蛋白酶，然后将容量瓶中的脱蛋白处理液倒出，用蒸馏水反复冲洗浸泡后的牛松质骨材料约30分钟后，沥干，得到脱蛋白后的牛松质骨材料。本实施例的脱蛋白处理液主要由胃蛋白酶和磷酸盐缓冲液（pH值=2）配制而成，胃蛋白酶的用量为3000U/g，磷酸盐缓冲液主要由72.5mL的磷酸溶液和27.5mL的磷酸氢二钠溶液混合而成，磷酸溶液的体积百分比浓度为1.66%（取磷酸16.6mL，加水至1000mL，摇匀），磷酸氢二钠溶液的质量浓度为7.163%（取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶解成1000mL）。整个脱蛋白处理过程可在室温25°C环境下进行。
4.冷冻干燥：
将经过步骤3脱蛋白处理后的牛松质骨材料进行冷冻干燥，冷冻时放入-72℃～-80℃的冻干机内冻结干燥24h。
5.灭菌密封保存：
将经过步骤4冷冻干燥后的牛松质骨材料用双层塑料袋包装好封口，放入环氧乙烷灭菌器内进行灭菌处理，环氧乙烷的质量浓度控制在500mg/L，温度是40℃，湿度为50%，作用时间为3～4小时，消毒强度在1500mg/h·L～2000mg/h·L，消毒后随机进行抽样细菌培养，无菌生长后置于4℃冰箱中保存备用，得到牛松质骨移植替代材料。
脱脂效果对比实验：
取五组新鲜牛松质骨，每一组牛松质骨样品分别采用以下三种方法进行脱脂处理：（1）采用现有常规的甲醇/氯仿混合液间歇振动浸提法对牛松质骨样品进行脱脂；（2）采用现有常规的超临界CO2流体复合正己烷对牛松质骨样品进行萃取脱脂处理；（3）采用上述本实施例中步骤2的处理方法对牛松质骨样品进行脱脂处理。三种方法处理后的脱脂效果实验数据如下表1～表3所示。
超临界CO2流体复合正己烷脱脂法的操作步骤包括：称取一定量的牛松质骨条，置于高压反应釜内，加入促溶剂正己烷，水浴45℃，预热10min。泵入CO2，压力维持在20.0MPa，使超临界CO2、促溶剂和脂肪形成“溶胀体系“，静态溶胀一段时间；达到预计时间后，一端泵入CO2，另一端收集萃取物，流动萃取一定时间；收集萃取物于105℃干燥2h，放干燥器内冷却0.5h后称重，重复本步骤直至恒重。最佳实验条件：骨∶促溶剂=1∶2，静态溶胀时间0.5h，动态萃取时间0.5h。
表1：甲醇/氯仿间歇振动浸提法脱脂结果
表2：牛松质骨添加正己烷作为促溶剂超临界CO2脱脂结果
表3：石油醚索氏抽提法脱脂结果
由上表1～表3可见，三种脱脂方法脱除脂肪占牛松质骨湿重百分比统计图及三种脱脂方法提取脂肪含量单因素方差分析结果如图1所示。由图1可见，将三种脱脂方法的脱脂效 果进行统计学分析，采用完全随机方差分析方法，F=320.908，P<0.01，说明三种脱脂方法对牛松质骨的脱脂效果不全相等，进一步进行多个样本间的两两比较，选用LSD-t检验，统计分析结果显示，三种脱脂方法中，本发明的石油醚索式抽提法的脱脂效果明显优于其他两种脱脂方法（P<0.01），石油醚索氏抽提法对牛松质骨脱脂效果最确切。
脱蛋白效果对比实验：
采用现有常规的过氧化氢法（将异种骨5g加入100ml的30%H2O2溶液，放置8小时；后将H2O2溶液倒出，用双蒸水反复充分冲洗牛松质骨条或骨粒约30分钟，将湿骨烘干）和本发明实施例步骤3中的胃蛋白酶法对上述脱脂后的牛松质骨进行脱蛋白处理。通过高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）测定不同方法脱蛋白处理后的牛骨中羟脯氨酸含量和色氨酸含量，随后采用成组t检验将这两种脱蛋白方法的处理效果进行比较。本实验通过测定经脱蛋白处理后牛松质骨中色氨酸含量的多少，对脱蛋白方法去除杂蛋白的效果进行评价；通过测定脱蛋白处理后牛松质骨中羟脯氨酸含量的多少，来表明脱蛋白方法对I型胶原的破坏情况。因为在胶原的一级结构氨基酸组成中没有色氨酸；I型胶原中存在其他蛋白质中不存在的羟赖氨酸和很少存在的羟脯氨酸。
高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）实验步骤包括：
①高效液相色谱分析条件：色谱柱：Luna 5u C18(2)100A,150mm×2.0mm,5micron；内标为烟酰胺；流动相为0.2%甲酸水溶液；固定相为乙腈。流动相︰固定相=60︰40，分流速率：20ul/min；
②质谱条件：离子化方式：ES+；毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：30.00V；离子源温度：100℃；去溶剂气体温度：350°C；锥孔气体流速：50L/Hr；去溶剂气体流速：400L/Hr；LM1和LM2分辨率均为：11.0；离子能1电压：0.5；离子能2电压：3.0；碰撞气压：3.82e-3；
③定内标为烟酰胺，称取一定量的烟酰胺、色氨酸和羟脯氨酸于容量瓶中，加入溶解定容；按1/10稀释三次后，进行离子扫描；
④完成色氨酸和羟脯氨酸溶液标准曲线的制作；
⑤异种骨制成骨粉后，称取一定量于容量瓶中，加入6mol/L的浓盐酸1ml，置于40℃恒温水浴中溶解，至骨粉完全溶解后取出；
⑥将完全溶解后的骨液移入小烧杯中，置于120℃烤箱中烘干，待骨液完全烘干后，各瓶中均加入2ml纯水溶解剩余物后，再度置于120℃烤箱中烘干；再次加入2ml纯水溶解；
⑦将烧杯中的骨液用移液枪移入离心管内，离心10分钟（3500r/min）后机振20分钟；将200μl骨液、50μl烟酰胺加入进样瓶中，以10μl自动进样。
采用过氧化氢和胃蛋白酶经过不同时间脱蛋白处理后的牛松质骨，用高效液相色谱-质谱 联用的方法，参照已经建立的标准曲线得到其内羟脯氨酸浓度，并计算出牛松质骨中的羟脯氨酸和色氨酸含量，详见下表4。上述两种方法进行脱蛋白处理后，牛松质骨中羟脯氨酸和色氨酸含量的均值比较如图2和图3所示。
表4：不同方法脱蛋白后牛松质骨中羟脯氨酸和色氨酸含量
将上述两种脱蛋白方法的脱蛋白效果进行统计学分析，对牛松质骨中羟脯氨酸值采用成组t检验分析方法，t=-7.324，P<0.01。统计分析结果显示，两种脱蛋白方法中，本发明的胃蛋白处理组I型胶原的保护效果明显优于过氧化氢法处理组（P<0.01）。由于方差不齐，对牛松质骨中色氨酸值选择非参数检验—Wilcoxon秩和检验进行分析，u=-0.836，P=0.403。统计结果分析显示，两种脱蛋白方法处理后牛松质骨中色氨酸含量没有显著性差异，故两种脱蛋白方法能等效去除异种骨中的杂蛋白。
此外，我们还对未经脱蛋白处理的新鲜牛松质骨与上述本发明的脱脂、脱蛋白处理后的牛松质骨进行常规组织学切片、HE染色及光学显微镜观察。其中，新鲜牛松质骨的HE染色光学显微镜观察照片如图4和图5所示，脱脂、脱蛋白后牛松质骨的HE染色光学显微镜观察照片如图6和图7所示。通过组织切片，可观察到在光学显微镜下新鲜牛松质骨小梁内有细胞成分或细胞碎片，骨组织内有脂肪细胞及少量的血细胞，图4和图5中虚线椭圆圈及箭头所指即为脂肪组织及骨陷窝内细胞成分；而经本发明的脱脂、脱蛋白后的牛松质骨，胶原纤维排列整齐，但高倍镜下可观察到一些脱落的纤维组织。
由上可见，与H2O2脱蛋白法相比，本发明的胃蛋白酶脱蛋白法去除异种骨中的杂蛋白能力与之相当，但是能更好的保护牛松质骨中的I型胶原。而且，采用本发明的石油醚索氏抽提法脱脂、胃蛋白酶脱蛋白后的牛松质骨，光学显微镜下观察发现骨内胶原纤维排列整齐，骨陷窝内基本没有细胞成分。
异种牛松质骨移植替代材料抗压缩力学性能对比实验：
对参照本实施例方法制得的某一特定直径、高度的牛松质骨移植替代材料的最大抗压载荷、最大抗压强度和压缩弹性模量的均值进行测试，以新鲜的牛松质骨作为对照，性能测试结果如下见表5所示。
表5：异种骨材料抗压缩性能实验数据
（注：表5中的a为新鲜的牛松质骨，b为牛松质骨移植替代材料）
根据表5对两种牛松质骨材料的抗压强度进行统计学分析，采用成组t检验分析方法，t=0.086，P=0.932。统计分析结果显示两种材料的抗压强度无明显差别，即经各组脱蛋白处理后，牛松质骨移植替代材料的抗压强度与新鲜牛松质骨相比并没有明显下降。
异种牛松质骨移植替代材料抗弯曲力学性能对比实验：
对参照本实施例方法制得的某一特定直径、跨度的牛松质骨移植替代材料的最大抗弯载荷、最大抗弯强度和弯曲弹性模量的均值进行测试，以新鲜的牛松质骨作为对照，性能测试结果如下见表6所示。
表6：异种骨材料抗弯曲性能实验数据
（注：表6中的a为新鲜的牛松质骨，b为牛松质骨移植替代材料）
根据表6对两种牛松质骨材料的抗弯强度进行统计学分析，采用成组t检验分析方法，t=0.134，P=0.895。统计分析结果显示两种材料的抗弯强度无明显差别，即经各组脱蛋白处理后，牛松质骨移植替代材料的抗弯强度与新鲜牛松质骨相比并没有明显下降。
由上可见，与新鲜的牛松质骨相比，按照本发明方法制备得到的牛松质骨移植替代材料，其生物力学性能并没有明显的下降。
本发明异种牛松质骨移植替代材料的成骨能力测试：
准备新西兰大耳白兔45只，随机分为空白组、过氧化氢处理组、本发明处理组3组，每组15只，手术造成兔左前肢桡骨中上段10mm骨缺损，空白组骨缺损处不植入任何材料，其余两组分别在骨缺损处植入过氧化氢脱蛋白处理后的异种骨移植材料和本发明制得的异种牛松质骨移植替代材料，术后的4周、8周、12周时，分别对每组部分动物取样本送检，对手术部位照X线片，取标本进行Micro-CT检测及组织学观察。
空白组术后4周、8周、12周的标本在完全脱钙后，经组织切片及HE染色，光镜下所见的组织学观察结果显微照片如图8～图13所示。其中，图8、图10、图12是空白组标本放大40倍后光镜下所见，图9、图11、13则是放大100倍后光镜下所见。由图8和图9可见，术后4周缺损区未见骨小梁生成，炎性细胞多，纤维结缔组织生成少。由图10和图11 可见，术后8周缺损区未见骨小梁生成，炎性细胞较多，纤维结缔组织生成较多。由图12和图13可见，术后12周缺损区仍未见骨小梁生成，炎性细胞较少，纤维结缔组织生成多。
过氧化氢处理组术后4周、8周、12周的标本在完全脱钙后，经组织切片及HE染色，光镜下所见的组织学观察结果显微照片如图14～图19所示。其中，图14、图16、图18是过氧化氢处理组标本放大40倍后光镜下所见，图15、图17、图19则是放大100倍后光镜下所见。由图14和图15可见，术后4周有散在的骨小梁生成，成骨细胞增生较活跃，可见少量骨细胞生成，并有大量的成纤维细胞及炎性细胞。由图16和图17可见，术后8周骨小梁生成较多，基本为编织骨，可见较多骨细胞，成骨细胞增生较活跃，炎性细胞较少。由图18和图19可见，术后12周骨小梁生成较多，基本为编织骨，未见明显的板层骨，成骨细胞增生活跃，炎性细胞较少。
本发明处理组术后4周、8周、12周的标本在完全脱钙后，经组织切片及HE染色，光镜下所见的组织学观察结果显微照片如图20～图25所示。其中，图20、图22、图24是本发明处理组标本放大40倍后光镜下所见，图21、图23、图25则是放大100倍后光镜下所见。由图20和图21可见，术后4周有散在的骨小梁生成，可见较多骨细胞，成骨细胞增生较活跃，可见较多的成纤维细胞及炎性细胞。由图22和图23可见，术后8周骨小梁生成较多，基本为编织骨，可见少量板层骨，骨细胞多，成骨细胞增生活跃，炎性细胞较少。由图24和图25可见，术后12周有成熟的骨小梁形成，编织骨大部分改建为板层骨，成骨细胞增生活跃，骨细胞趋于成熟，炎性细胞少。
图26为空白组术后当天及术后4周、8周、12周后的X线片。由图26可见，术后4周时缺损区未见骨痂形成，骨断端出现骨硬化，骨髓腔未见闭合；术后8周时缺损区未见骨痂形成，断端骨硬化较4周时明显，骨髓腔部分闭合；术后12周时缺损区未见骨痂形成，断端骨硬化明显，骨髓腔完全闭合。
图27为过氧化氢处理组术后当天及术后4周、8周、12周后的X线片。由图27可见，术后当天材料显影较明显；术后4周时材料周围有少量骨痂生长，骨折线清晰；术后8周时缺损区有不均匀的低密度骨痂显影，骨折线稍模糊；术后12周时缺损区仍见不均匀的低密度骨痂显影，骨痂量较8周时增多，骨痂外层未见明显皮质骨轮廓，骨折线稍模糊。
图28为本发明处理组术后当天及术后4周、8周、12周X线片。由图28可见，术后当天材料显影不明显；术后4周时缺损区有不均匀的低密度骨痂显影，骨折线清晰；术后8周时缺损区骨痂密度增高，骨痂外层形成皮质骨轮廓，与缺损断端连接，骨折线模糊；术后12周时骨痂密度进一步增高，周围皮质骨轮廓较清晰，与断端连接较好，骨折线模糊。
对术后4周、8周及12周X线片评分结果进行统计学分析，采用成组t检验分析方法， 4周时t=-0.250，P=0.809；8周时t=-2.058，P=0.074；12周时t=-2.546，P=0.034。统计结果分析表明，本发明处理组术后12周X线片评分高于过氧化氢组，即在12周时，本发明处理组标本在骨断端与宿主骨整合情况已明显优于过氧化氢处理组标本。
另外，再对过氧化氢处理组及本发明处理组术后4周、8周、12周进行Micro-CT检测，检测结果如图29～图34所示。由此可以看出，术后12周本发明处理组标本在骨断端与宿主骨整合情况明显优于过氧化氢处理组标本。另外通过对Micro-CT检测项目评分统计分析，本发明处理组在骨体积分数、组织骨密度、骨小梁数量、骨小梁间隙、骨小梁厚度、结构模型指数等方面均优于过氧化氢处理组，本发明处理组的组织矿含量在4周、8周时相对过氧化氢处理组较差，但是在12周时，两者并无差异。综合所有Micro-CT检测指标的实验结果，本发明处理组制备的牛松质骨移植替代材料的成骨能力要优于过氧化氢处理组。
本发明异种牛松质骨移植替代材料的免疫学实验研究：
取新西兰兔75只，随机分为空白组（假手术组）、牛松质骨组（本发明处理组）、自体骨组，每组25只，手术造成兔左前肢桡骨中上段10mm骨缺损，空白组骨缺损处不植入任何材料，其余2组分别在骨缺损处植入本发明的异种牛牛松质骨移植替代材料和对侧锯下的自体骨，术后3天、7天、14天、28天、56天时分别对每组部分动物取标本送检。
结果显示，各实验组新西兰兔术后第2天恢复正常进食，术后1周内患肢不能负重，跛行，术后1周逐渐开始正常活动。术后2周时伤口均I期愈合，无感染化脓出现，手术部位毛发重新长出，患肢足趾部均有一定程度的肿胀，约术后4周肿胀消退。
CD4+细胞或T辅助细胞被认为是启动移植物排斥最重要的细胞，通过对MHC II类分子的特异性识别，受者CD4+T细胞被激活。CD8+T识别MHC-I分子的抗原而被激活为细胞毒性细胞（CTL），通过穿孔素/颗粒酶途径直接溶解供者细胞以及Fas/FasL途径诱导移植细胞凋亡。T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+与排斥的发生密切关系。移植后外周血T淋巴细胞亚群会随机体的免疫状态的变化而改变，监测外周血T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+是检测和判断器官移植排斥反应的常用指标和方法之一。尤其是CD4+/CD8+比值的变化更能够直接反映机体的免疫状态，是判断发生排斥反应较有价值的间接指标。
各实验组术后3d、7d、14d、28d、56d用流式细胞仪检测外周血CD4、CD8 T细胞，检测结果分别如图35～图37所示。根据流式细胞仪检测结果及统计分析可知，CD4+、CD8+T淋巴细胞两个检测指标在各组实验新西兰兔外周血中各个时间时，空白组和自体骨组的表达含量均最低，且两者间均无统计学差异，而本发明的牛松质骨组有不同程度增加。但与同一时间点自体骨组及空白组比较，牛松质骨组CD4+T淋巴细胞比率在所有时间点均无统计学差异；与同一时间点自体骨组比较，牛松质骨组CD8+T淋巴细胞比率和CD4/CD8 T细胞比值 仅在术后第28天这一时间点有统计学差异，最终术后第56天这一时间点无统计学差异；这表明本发明处理组与自体骨组在CD4+、CD8+T淋巴细胞两个检测指标上均无明显差异。
各实验组术后3d、7d、14d、28d、56d不同时间点ELISA法检测兔白细胞分化抗原CD4、CD8及CD4/CD8的结果分别如图38～图40所示。根据ELISA结果可知，兔白细胞分化抗原CD4、CD8及CD4/CD8比值在各组实验新西兰兔外周血中各个时间时，空白组和自体骨组的表达含量均最低，且两者间均无统计学差异，而本发明的牛松质骨组均有不同程度增加。与自体骨组及空白组比较，牛松质骨组兔白细胞分化抗原CD4、CD8及CD4/CD8比值在前四个时间点部分结果有统计学差异，但最终到第56天各项实验数据均没有统计学差异。与流式细胞仪检测外周血CD4T淋巴细胞、CD8T淋巴细胞对比可以发现，ELISA法检测兔外周血白细胞分化抗原CD4、CD8及CD4/CD8比值结果的趋势与流式细胞仪基本符合，与自体骨组比较，本发明处理的牛松质骨组CD4、CD8T细胞在前几个时间点有不同程度的增加，但到第56天各项实验数据均没有统计学差异。
根据RT-PCR结果灰度扫描（参见图41和图42），IL-2、IL-10m-RNA表达这两个检测指标在移植组织及其周围组织中各个时间时空白组和自体骨组的表达含量均最低，且两者间均无统计学差异，而本发明的牛松质骨处理组IL-2、IL-10m-RNA的表达均有不同程度增加。与同一时间点自体骨组比较，牛松质骨组植骨局部组织IL-2m-RNA表达在第14、28天时间点有统计学差异，IL-10m-RNA表达在第7、14天有统计学差异，到第56天各项实验数据均没有统计学差异。ELISA法检测兔外周血细胞因子IL-2、IL-10结果的趋势与RT-PCR实验结果基本符合（参见图44和图45）。
根据RT-PCR结果灰度扫描可知，IgG m-RNA表达结果在三组的各个时间点之间均无统计学差异（参见图43）。ELISA法检测兔外周血细胞因子IgG的结果在各个时间时空白组和自体骨组的表达含量均最低，而牛松质骨组IgG的表达均有不同程度增加（参见图46）。与同一时间点自体骨组比较，牛松质骨组IgGm-RNA表达在第7、14天时间点有统计学差异，在其他时间点无统计学差异。
根据MTT比色法检测兔脾淋巴细胞增殖反应结果可知（参见图47），以空白组为参照，各个时间点自体骨组的结果均较本发明处理的牛松质骨组低，两者间在术后第7、14、28天这三个时间点有统计学差异，而在术后第3天和56天这两个起止时间点无统计学差异。
综上可以发现，本发明制备的牛松质骨移植替代材料组在以上多个免疫学检测中，与自体骨组主要在中间的少数几个时间点上有统计学差异，但是在最初及最后时间点统计学分析结果均无差异。综合所有实验结果表明，本发明制备的牛松质骨移植替代材料在植入动物体内7天～14天左右，动物体内免疫学反应要高于自体骨组，但在植入体内2个月左右后，牛 松质骨组植骨材料致动物体内免疫反应的强度与自体骨及空白对照组基本相当。
综上所述，将本发明制备的牛松质骨移植替代材料植入实验新西兰兔体内后，与自体骨植骨材料以及空白对照组（假手术组）相比，炎症反应在早期较为明显，但无明显的免疫排斥反应发生，2个月后炎症反应则在三组中没有区别。以上所有的免疫实验结果显示，本发明制备的牛松质骨移植替代材料的免疫原性较低。
Claims (1)
1.一种异种骨移植替代材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用脱脂处理方法对异种骨材料先进行脱脂处理；所述脱脂处理方法是采用石油醚索氏抽提法，所述脱脂处理方法具体包括以下步骤：取新鲜的异种骨条并用滤纸包好，将包含异种骨条的滤纸筒放入索氏提取器的抽提筒内，连接接收瓶，由索氏提取器的冷凝管上端加入石油醚，石油醚的添加量按每50g异种骨条添加280ml～320ml；然后于60℃～70℃水浴上加热，使石油醚不断回流抽提，回流抽提过程中至少更换一次接收瓶，并在更换接收瓶时再次注入前述体积量的新的石油醚，直到更换后的石油醚经反复回流抽提脱脂后其颜色仍然保持澄清；停止抽提脱脂，取出异种骨条进行反复冲洗，透析，沥干后得到脱脂后的异种骨材料；所述新鲜的异种骨条是指宰杀6h内、且去除掉周围软组织、骨膜及骨髓的牛胫骨上端松质骨；更换接收瓶的间隔时间控制在12h～14h，整个抽提脱脂的处理时间控制在48h以上；
（2）采用脱蛋白处理方法对经过上述步骤（1）脱脂处理后的异种骨材料进行脱蛋白处理；脱蛋白处理方法包括以下步骤：将脱脂处理后的异种骨材料放入含胃蛋白酶的脱蛋白处理液中进行浸泡，浸泡过程中所述脱蛋白处理液的pH值控制在1.5～3，浸泡处理完成后用碱液将脱蛋白处理液的pH值上调到8以上，以灭活其中的胃蛋白酶，然后反复冲洗浸泡后的异种骨材料，沥干后得到脱蛋白后的异种骨材料；所述脱蛋白处理液主要由胃蛋白酶和磷酸盐缓冲液配制而成，所述胃蛋白酶的用量为2500U/g～4000U/g；所述磷酸盐缓冲液主要由磷酸溶液和磷酸氢二钠溶液按照（2.6～2.7）∶1的体积比混合而成；所述浸泡处理时脱蛋白处理液的用量按每克异种骨材料添加18ml～22ml计，浸泡处理的时间不少于8h，浸泡处理在室温下进行；
（3）将经过步骤（2）脱蛋白处理后的异种骨材料进行冷冻干燥、灭菌处理，得到异种骨移植替代材料；所述冷冻干燥是指将步骤（2）后的骨材料放入-72℃～-80℃的冻干机内冻结干燥24h～48h；所述灭菌处理是指将冷冻干燥后的骨材料用塑料袋包装封口后放入环氧乙烷灭菌器内灭菌，环氧乙烷的质量浓度控制在480mg/L～520mg/L，灭菌温度控制在38℃～42℃，灭菌湿度为45%～55%，灭菌作用时间为3h～4h，消毒强度在1500 mg/h·L～2000 mg/h·L；
所述反复冲洗和透析均采用蒸馏水进行，所述反复冲洗和透析的时间控制在24h以上。
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