CN105879117A - 一种可吸收的植骨材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种可吸收的植骨材料及其制备方法，属于人体工程学用材料的制备领域。本发明通过优化及调整制备过程中试剂的用量及处理时间，制备得到BCB和BMP复合形成可吸收植骨材料。本发明制得的BCB中无脂肪细胞、骨细胞、中央管内的血管神经、骨基质的蛋白成分及哈佛氏管，复合得到的植骨材料无过敏反应且易被生物降解，克服了现有技术中植入材料易产生过敏反应及不易降解等问题，适合临床大规模使用。

Description

一种可吸收的植骨材料及其制备方法
【技术领域】
本发明涉及一种人体工程学用材料的制备方法，具体讲涉及一种可吸收的植骨材料及其制备方法。
【背景技术】
1965年Urist成功地利用脱钙骨基质在肌肉内诱发异位成骨，从而发现并确定了骨形态发生蛋白(BMP)是转化生长因子β超家族的成员之一，其具有诱导未分化的间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖的能力，可促进成骨细胞分化成熟，参与骨和软骨的生长发育及其重建过程，加速骨缺损的修复。BMP最初被认为是软骨和骨形成的蛋白质调节剂，但其随后表现出与各种组织和器官的胚胎发育和形态发生有关的性质，同时BMP也表现出调节各种细胞因子的生长、分化和趋药性的特性。关于BMP的研究和其临床应用已成为骨科领域的一大研究热点，已证实BMP的主要生物学作用包括使组织上未分化的间充质细胞发生趋化、聚集、增殖、分化形成新骨等。目前已从多种动物和人组织中提取出BMP，并发现不同种属天然BMP具有高度同源性且具有跨种间诱导成骨细胞的能力，即从动物骨中提取的BMP可在人体上诱导成骨细胞且其免疫原性弱，这就为动物的BMP应用于临床治疗骨折、骨不连、骨缺损提供了保障。然而对于长骨节段性骨缺损，仅靠单纯地植入BMP时效果并不佳，一是因为其不能提供必要的支架，起不到骨传导作用；二则因为BMP易被血液冲洗掉或被较快吸收，从而不能在局部长时间、有效地发挥骨诱导作用。
为解决上述问题，国内外学者进行了大量研究，发现将一些植骨材料作为BMP的载体与BMP复合，制成复合型植骨材料，既能提供良好支架发挥骨传导作用，又能增强BMP的诱导成骨能力。以往对于BMP的载体研究多侧重于羟磷灰石(HA)和磷酸三钙(TCP)为代表的生物活性陶瓷材料，或以聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA)为代表的多聚体材料。胡蕴玉首次将去抗原的牛松质骨载体(BCB)与从牛皮质骨粗提的BMP复合，制成重组合异种骨(RBX)-一种含骨形态发生蛋白的新型活性植骨材料，将其用于上肢、下肢骨缺损病人，通过骨诱导和骨传导双重作用机理来达到加速骨愈合、促进骨生长、预防骨不连的效果。经实验及临床研究证明RBX既具有高效诱导成骨活性和骨传导作用又不引起明显免疫排斥反应，但其仍处于实验室规模阶段。目前，大多骨松质组织植骨修复材料既可以促进骨细胞生长，又可被降解吸收且降解速度与骨生长速度协调，不需二次手术取出。用于临床试验时植入植骨修复材料的患者每例使用一份(2g)形状为4.5-5mm立方体块状植骨修复材料，而骨 缺损严重的患者偶尔需要两份(4g)。
在扩大的临床试验中，多家医院骨科提出了临床更需要形状为长29±1mm、宽和厚各4.5-5mm)的植骨修复材料，体积是原4.5-5mm立方体载体的6倍。载体的体积增加了5倍的同时，完全去除该条形载体抗原性的难度也增加了5倍，临床使用时发生过敏反应的几率成倍增加，甚至会引发临床事故。
【发明内容】
为解决现有技术中的增大载体而引发的一系列过敏反应及植入材料不易降解的问题，本发明提供了一种可被吸收的植骨材料，该植骨材料无过敏反应且易被生物降解，满足了临床对较大规格载体的需求。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明提供了一种可吸收的植骨材料的制备方法，包括下述步骤：
1)制备BCB：
将净化处理的牛肱骨依次经1：1氯仿/甲醇处理10-14h，10％H2O2处理45-50h后，再于41-43℃下，用0.6mol/L HCl处理2-10min，冷冻干燥和钴60γ射线照射12-15h得BCB；也可以根据需要将该步骤中41-43℃下用0.6mol/L HCl处理2-10min脱骨细胞过程重复进行4次。
2)提取BMP：
将粉碎后的牛腿皮质骨依次经1：1氯仿/甲醇处理10-14h，10％H2O2处理10-12h后，再于室温下，用0.6mol/L HCl处理2-10min，将离心得到的分离液调节至pH 7.0-7.5，按其质量百分比加入0.0004-0.0008％的胶原酶后于37℃无菌条件下浸提20-24h，浸提液于室温下减压浓缩后于终浓度为6mol/L脲/0.5mol/L CaC12中提取20-24h，透析、离心后得到粗制的BMP复溶于4mol/L盐酸胍/0.5mol/L CaC12的纯化液中离心，分离液经截流分子量为70KD的微孔滤膜得到的滤液再经透析、离心后即得BMP；
最终制得的BMP中BMP蛋白含量≥5％；
3)复合：
取步骤2)获得的BMP 6.0g加入终浓度为1.2-1.5％的海藻酸钠溶液中匀浆，与步骤1)制得的BCB 200g混合，于700mmHg压力下保持10min，进气搅拌5次、冷冻干燥得到可吸收的植骨材料。
本发明提供的制备方法步骤3)包括下述步骤：
于步骤2)最终获得的BMP 6.0g中加入1-2L浓度为25％的冰醋酸，匀浆，再加入步骤 1)制得的BCB 200g混匀后浸入Ca(OH)2中1-3min，取出置于真空器皿中，于700mmHg下恒压10min，进气搅拌5次后冷冻干燥，即得可吸收的植骨材料。
本发明提供的制备方法步骤1)中的牛肱骨为牛肱骨上端松质骨。
本发明提供的制备方法步骤1)中的净化处理的条件为：50℃和0.1-0.2MPa压力下用水冲洗3-6h。
本发明提供的制备方法步骤1)中制得的BCB中不含有脂肪细胞、骨细胞、中央管内的血管神经、骨基质的蛋白成分及哈佛氏管。
本发明提供的制备方法步骤1)中钴60γ射线照射强度为14.8KGY。
本发明提供的制备方法3)复合步骤中冷冻干燥过程为：将复合的可吸收的植骨材料于降温至-25℃以下的冷冻干燥机中，再逐渐升至室温冻干。
本发明还提供了一种可吸收的植骨材料，由本发明提供的制备方法制得。
本发明提供的制备方法步骤1)制得的BCB中含有按质量百分比计的蛋白质：25％-30％，无机质：55％-65％。
本发明提供的技术方案中采用了γ射线照射，使得致密板层骨结构松散，有利于载体的生物降解。使松质骨载体微孔扩大1-1.1倍，平均为0.6倍，增加了BMP的复合量，同时也加强了载体的生物降解能力。脱蛋白载体经γ射线照射还起到消毒作用，灭活病菌和病毒。
本发明提供的制备方法步骤2)中提取BMP蛋白为用紫外吸光度OD值与部分纯化BMP浓度的线性关系为Y＝0.7701X+0.1180的BMP蛋白。线性关系的建立是利用紫外吸光度OD值与BMP浓度的线性关系，建立产品生产过程中BMP含量的检验方法，BMP中用酶联免疫方法测定BMP的含量；利用紫外吸光度OD值与BMP浓度的线性关系Y＝0.7701X+0.1180建立量化关系图。
与最接近的现有技术比，本发明提供的技术方案制得的植骨材料具有以下有益效果：
1.不含有脂肪细胞、骨细胞、中央管的血管神经、骨基质的蛋白成分及哈佛氏管的BCB减少了植入体内后的过敏反应；
2.经钴60γ射线照射，松质骨载体微孔扩大1-1.1倍，平均为0.6倍，使致密板层骨结构松散，在提高载体的生物降解能力的同时，增加了BMP的复合量；
3.能够提供临床所需的更大规格及尺寸要求的植骨材料；
4.经钴60γ射线照射，脱蛋白载体γ射线照射起到了消毒作用，灭活病菌和病毒；
5.BMP纯化率高：部分纯化BMP中用酶联免疫方法测定BMP的含量为100mg中含有纯BMP 5mg；利用紫外吸光度OD值与部分纯化BMP浓度的线性关系Y＝0.7701X+0.1180 建立量化关系图；
6.使用本发明提供的植骨材料能够显著降低伤口渗液率。
本发明中将水洗后的牛肱骨上端松质骨切割为条形载体，30mm×5mm×5mm(长29±1mm，宽、厚各4.5-5mm)，(30mm×5mm×5mm)体积是原载体4.5-5mm立方体的6倍，从载体制备上进行了改进：载体不含无脂肪细胞、骨细胞、中央管的血管神经、骨基质的蛋白成分及哈佛氏管，降低了过敏反应，经过γ射线照射，结构松散利于生物降解并增加的BMP的复合量。
本发明人通过实验证实：
(1)确定30mm×5mm×5mm载体在临床试验更易产生过敏反应的原因：
对异种骨抗原性做实验研究，将山羊新鲜皮质骨制成5μm不脱钙冰冻切片。植入家兔桡骨后，不同时间内从家兔采血分离血清进行免疫荧光染色。荧光抗体为异硫氰酸酯标记的羊抗兔IgG染色，在荧光显微镜下观察。观察结果，显示荧光的骨细胞围绕哈佛氏管腔呈同心圆分布，表明植骨中的骨细胞和哈佛氏管内皮成分刺激受体产生了特异性抗体，且这些特异性抗体在植骨后第2周开始产生，第3周达到最高，其中管道内皮抗体尤为突出，之后随观察时间延长，血清抗体滴度降至起始水平。又将山羊新鲜骨切片置盐酸脱钙液10min。完全脱钙后充分水洗，用免疫荧光染色已证实为阳性的家兔血清作双PAP染色(免疫酶染色)。其观察结果与免疫荧光染色所见基本一致，即骨细胞和哈佛氏管内皮呈棕色阳性，周围骨基质透明无色。高倍镜下可见酶阳性物质多集中在骨细胞周边及哈佛氏管周周的少量基质上。
再将山羊皮质骨按根据Urist所述方法进行脱脂、脱钙、脱去非胶原蛋白，置75％乙醇中浸润4-8h处理后再植入家免体内，同样采血作免疫荧光染色，发现多数家兔产生了低浓度的抗植骨抗体，也表现为骨细胞和哈佛氏管道内皮黄绿色荧光。但该组家兔血清中抗体滴度比新鲜植骨组显著降低。组织学检查发现：处理后的植骨其周围炎性反应轻微，并出现新骨诱导。
以上实验结果表明，异种骨抗原性主要集中在骨细胞以及哈佛氏管内皮上。
(2)免疫原性相关控制指标
从免疫组织化学检验切片可以看出，当载体中残留有骨细胞及哈佛氏管内皮时，不利于骨愈合，会出现渗液、发炎等免疫排斥症状，因此本发明在牛松质骨载体的制备过程中，着重考虑牛松质骨载体里是否残留骨细胞及哈佛氏管内皮。
以下图示是免疫组织化学切片中观察的残留骨细胞及细胞器的载体图片，见图1、2及图3，本发明提供的牛松质骨载体切片见图4、5。
图1为山羊皮质骨载体内残留骨细胞；图2为山羊皮质骨载体内残留的细胞器图片，载体中含有中央管的板层骨区域，骨内骨陷窝及骨细胞，中央管内为神经及血管残留物；图3为山羊皮质骨载体(X200)内有残留骨细胞，板层骨间数个骨细胞及中央管内残留物(红色物)。
可以确定脱除骨细胞及哈佛氏管内皮不彻底是引起临床副反应的主要原因。从免疫学角度看，所用骨松质经过一系列化学处理已基本清除了抗原成分，在骨移植情况下，它虽含有异种胶原，但并不引起免疫排斥，全身免疫荧光测定均为阳性，局部组织学检验也证实其具备良好的组织相容性。
图4为本发明提供的BCB载体，经组织免疫学实验观察无骨细胞及细胞器(哈佛氏管内皮)。条形载体的规格为：长29±1mm，宽、厚各4.5-5mm，进行4次脱骨细胞及哈佛氏管内皮过程，能达到符合要求的脱除异种骨细胞(脂肪细胞、骨细胞、中央管的血管神经、骨基质的蛋白成分)及哈佛氏管，此时载体中含有按质量百分比计蛋白质：25％-30％、无机质：55％-65％结合组织学检验及图像分析来控制产品的免疫原性。图5为本发明提供的条形载体经HE染色显示：载体基质染色较均匀；骨陷窝扩大骨细胞完全消失呈透明的空泡；中央管内无血管、神经的任何残留物。在该工序操作中经过试验，BCB载体经过本发明提供的方法进行处理能够达到脱除异种骨蛋白(脂肪细胞、骨细胞、中央管的血管神经、骨基质的蛋白成分)的要求。
(3)测定载体无机质含量
(4)凯氏定氮仪测定载体中蛋白质含量
(5)γ射线对载体吸收的影响
经γ射线照射：
a、使致密板层骨结构松散，有利于载体的生物降解；
b、可使松质骨载体微孔扩大1-1.1倍，平均为0.6倍，加强了BMP复合量；
c、脱除骨细胞及哈佛氏管内皮的载体经γ射线照射起到消毒作用，灭活病菌和病毒。
图6(a)为本发明提供的经4次脱骨细胞及哈佛氏管内皮后在未经γ射线照射时图片，显示其结构完好，中央管及骨陷窝都形成标准空泡；图6(b)本发明提供的载体图中呈环形板层，浅色层是胶原蛋白层，深色层是钙磷层，深、浅层交替排列形成类似多层板加强了骨强度的“环形板层骨结构”(胶原蛋白层较宽，钙磷层较窄)。
本发明经载体经γ射线照射14h(14.8KGY)的图7(a)显示载体出现裂隙或小空腔或小的断裂，说明载体强度有所减弱。图7(b)组织切片清楚看到板层骨结构的层间增宽，排 列紊乱，钙磷层与胶原层有断裂和间隙不规则增宽。
如图8所示，本发明的经γ射线照射脱骨细胞及哈佛氏管内皮后载体扫描电镜图，载体经γ射线照射后扫描电镜图(放大500μm)显示大小不等的11个微孔。经射线照射，见图9，扫描电镜图的孔隙面积比左图100μm，无照射扫描电镜图的孔隙面积扩大1-1.2倍；根据照射或无照射每一平面均有大小不等的孔隙，平均扩大的约数为扩大0.6倍。图10为(200μm，γ射线照射，扫描电镜图)，部分提纯BMP蛋白呈均匀、纤细丝网状100％充满所有孔隙和交通支的细管道。可以认为松质骨三维结构中所有孔隙均被丝网状的部分提纯BMP蛋白100％充满，达到整体松质骨任何部分都具有诱导新生骨的活性。
上述免疫组织化学实验表明，载体中残留有骨细胞及哈佛氏管内皮时，将不利于骨愈合，会出现渗液、发炎等免疫排斥症状，所以在处理牛松质骨载体时，应当限定载体中无机质的含量以及含氮量。处理牛松质骨时将骨松质表面脱钙，使胶原裸露而易与部分提纯BMP结合，相较于未脱钙的骨松质载体，能够更好的诱导新骨生成，同时可以破坏载体中的部分骨细胞。进行4次脱骨细胞及哈佛氏管内皮，达到符合要求的脱除异种骨细胞(不含脂肪细胞、骨细胞、中央管的血管神经、骨基质的蛋白成分)及哈佛氏管内皮，使得载体中含有按质量百分比计的蛋白质：25％-30％，无机质：55％-65％，可以通过制定牛松质骨载体灰分量、含氮量(蛋白质含量)结合组织学检验及图像分析来控制产品的免疫原性。
载体脱除骨细胞及哈佛氏管内皮不彻底是引起临床副反应的主要原因。从免疫学角度看，所用骨松质经过一系列化学处理已基本去除了抗原成分，在骨移植情况下，虽含有异种胶原，但并不引起免疫排斥，全身免疫荧光测定均为阳性，局部组织学检验也证实其具备良好的组织相容性。本发明通过采取以上方法来降低临床应用中出现伤口渗液的比例，使得临床伤口渗液率降至2.5％以下，对比结果见表1。
表1非感染病例后伤口情况对比
(6)寻找脱除骨细胞及哈佛氏管内皮后的牛骨载体免疫原性的量化：
采用“牛主要组织相容性复合体(MHC)酶联免疫分析试剂盒”测定本产品中主要组织相容性复合体(MHC)含量。测定结果是：
成品(骨诱导活性材料)：MHC含量0.9345ng/100mg
蛋白(牛骨提取物)：MHC含量0.8527ng/100mg
材料(牛骨载体材料)：MHC含量0.9072ng/100mg
折合到每份2.0g装的成品，MHC含量18.690ng/份。
(7)制备BMP
选取新鲜小牛四肢皮质骨制成骨粉，冲洗、沥干后依次用1：1氯仿/甲醇脱脂10h，10％H2O2脱骨细胞10h，用0.6mol/L盐酸表面脱钙脱骨细胞及糖蛋白5min，将离心得到的分离液调节pH 7.2，加入其质量百分比0.0006％的胶原酶后于37℃无菌条件下浸提24h得到的液体，于室温下减压浓缩后于终浓度为6mol/L脲/0.5mol/L CaC12提取24h，经透析、离心后得到粗制的BMP复溶于4mol/L盐酸胍/0.5mol/L CaC12的纯化液中离心，分离液经截流分子量为70KD的微孔滤膜过滤得滤液，再经透析、离心后得到BMP。
BMP不溶于水，但溶于4mol/L盐酸胍溶液，经过紫外扫描，发现该溶液在276nm有特征吸收，建立紫外吸光度OD值与活性物质浓度的线性关系，从而建立产品中部分提纯BMP含量的检验方法。
检测步骤：
a.取100mg BMP，加4mol/L盐酸胍溶液5ml匀浆；
b.再加盐酸胍溶液至40ml，倍比稀释，浓度分别为2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml；
c.用紫外分光光度计下分别测出OD值，其波长为276nm，并做出标准曲线。(盐酸胍CH5N3·HCl 95.53)
检测结果，见表2及图11：
表2不同浓度下的紫外吸收光密度值
浓度mg/ml 0.625 1.25 2.5
紫外吸光度值 0.5615 1.1389 2.0247
取2g成品，在37℃室温下，先将成品用4mol/L的盐酸胍溶液完全浸润，再加入10ml的盐酸胍溶液，浸提24h。用紫外分光光度计测出波长276nm下浸提液的光密度值为1.4672，
计算结果：y＝1.25mg
10ml样品中部分提纯BMP含量为(0.7701×1.4672+0.1186)×10＝12.5mg
建立紫外吸光度OD值与BMP蛋白含量的关系:Y＝0.7701X+0.1180
(8)制备可吸收的植骨材料海藻酸钠是海藻细胞壁和细胞间质的主要成分，海藻酸分子是由β-D-1,4-甘露糖醛酸和α-L-1,4-古罗糖醛酸两种单体组成的嵌段线性聚合物。在1个分子 中，可能只含有其中一种段落，也可能由两种糖醛酸链节构成嵌段共聚物。BMP是一酸性蛋白，在水中不溶解，经过吸附工序提取物只能附着在载体表面，很容易脱落，通过添加海藻酸钠溶液，使海藻酸钠的终浓度为1.2-1.5％，此时提取的BMP具有一定的黏附性，经过吸附工序将含BMP蛋白提取物黏附在BCB载体表面通过减压、冷冻干燥使含BMP蛋白均匀的黏附在载体外表面。利用该工艺生产的可吸收植骨材料含BMP蛋白分布均匀、表面光洁，更有利于临床骨科医生的使用。
工艺流程为：精确称取BMP 6.0g，加入海藻酸钠溶液使海藻酸钠终浓度为1.5％，用匀浆器将含BMP蛋白6.0g均匀的分散在海藻酸钠溶液中，精确称取牛松质骨载体200g与含有BMP蛋白6.0g的海藻酸钠溶液混合，置于真空器皿中，减压10min，器皿中的气压为700mmHg，进气搅拌，如此反复进行5次。将复合好的可吸收植骨材料进行冷冻干燥，其流程为：将冷冻干燥机预冷至-25℃以下，放入复合好的可吸收植骨材料，按升温程序逐渐升温，升至室温，结束冻干，利用该工艺生产的可吸收植骨材料含BMP蛋白分布均匀、表面光洁，更有利于临床骨科医生的使用，对比结果见表3。
表3非感染病例后伤口情况对比
分组 病例总数 伤口渗液>7d 渗液阳性率(％)
5mm×5mm×5mmRBX 143 5 3.5
5mm×5mm×30mmRBX 127 3 2.5
【附图说明】
图1为本发明实施例提供的山羊皮质骨载体内残留骨细胞扫描电镜图；
图2为本发明实施例提供的山羊皮质骨载体内残留的细胞器扫描电镜图；
图3为本发明实施例提供的山羊皮质骨载体(X200)内有残留骨细胞扫描电镜图；
图4为本发明实施例提供的BCB载体经组织免疫学实验观察无骨细胞及细胞器扫描电镜图；
图5为本发明实施例提供的条形载体经HE染色显示扫描电镜图；
图6为本发明实施例提供的经4次脱骨细胞及哈佛氏管内皮后在未经γ射线照射时扫描电镜图(a)和载体扫描电镜图(b)；
图7为本发明实施例提供的载体经γ射线照射14h(14.8KGY)扫描电镜图(a)和其组织切片扫描电镜图(b)；
图8为本发明实施例提供的经γ射线照射脱骨细胞及哈佛氏管内皮后载体扫描电镜图；
图9为本发明实施例提供的经γ射线照射脱骨细胞及哈佛氏管内皮后载体扫描电镜图；
图10为本发明实施例提供的载体经200μmγ射线照射的扫描电镜图；
图11为本发明实施例提供的不同浓度下的紫外吸收光密度值标准曲线示意图；
图12为本发明实施例提供的标准品标准曲线制定及样品浓度测定结果示意图；
【具体实施方式】
实施例1
首先制备去抗原牛松质骨载体(BCB)：
选取新鲜牛肱骨上端松质骨，截取公称尺寸5mm×5mm×30mm形状规则的长方形骨条，条形载体长的公差要求为29±1mm，宽、厚各4.5-5mm。该长方形骨条1kg用50℃，0.1MPa压力水反复冲洗4h，沥干后依次用1：1氯仿/甲醇20L脱脂12h，用10％过氧化氢10L，脱骨细胞及哈佛氏管内皮48h，42℃下用0.6mol/L盐酸10L，表面脱钙，脱骨细胞及哈佛氏管内皮5min，也可以根据需要将(42℃下用0.6mol/L盐酸10L处理5min)过程该进行4次脱骨细胞及哈佛氏管内皮，制定BCB载体灰分量、含氮量(蛋白质含量)结合组织学检验及图像分析来控制载体的免疫原性。
取经过四次盐酸脱骨细胞及哈佛氏管内皮处理的样品对其进行化学组成及组织化学检验，测定载体无机质含量：
经检测无机物含量分别为60％
测定载体的蛋白质含量：28.1％
凯氏定氮仪测得含氮量结果：4.5％
达到复合要求的脱除异种骨细胞(不含脂肪细胞、骨细胞、中央管的血管神经、骨基质的蛋白成分)及哈佛氏管内皮，载体中的含氮量在3.8-4.8％，蛋白质含量在25-30％，其无机质含量在55-65％，冷冻干燥，密封包装，经钴60γ射线照射后，制成条形去抗原牛松质骨载体(BCB)。
提取BMP
选取新鲜小牛四肢皮质骨粉碎，1kg用20℃压力水反复冲洗4h，沥干后依次用1：1氯仿/甲醇20L脱脂10h，用300ml/L(10％)过氧化氢脱骨细胞1h，用0.6mol/L盐酸10L表面脱钙脱骨细胞及糖蛋白5min，经脱脂、脱钙及去除低分子量蛋白多糖等成份后，离心得骨粒，上层液调节pH 7.2.加入其质量百分比0.0006％的胶原酶于37℃无菌条件下浸提24h得到的液体，于室温减压浓缩将其连同骨粒形成的骨基质明胶溶于提取液使其终浓度6mol/L脲/0.5mol/L CaC12保持24h，提取上清，经透析、离心后得到粗制BMP，将其复溶于纯化液(4mol/L盐酸胍/0.5mol/L CaC12)，上清液经截流分子量70KD的微孔滤膜过滤得滤液，再经透析、 离心后得到了部分纯化的BMP。
建立紫外吸光度OD值与BMP蛋白含量的关系:Y＝0.7701X+0.1180
检测部分纯化的BMP含量
检测方法：紫外吸收法
部分纯化的BMP不溶于水，但溶于4mol/L盐酸胍溶液，经过紫外扫描，发现该溶液在276nm有特征吸收，建立紫外吸光度OD值与活性物质浓度的线性关系，从而建立产品中活性物质含量的检验方法。
检测步骤：
a.取100mg提取的部分纯化的BMP，加4mol/L盐酸胍溶液5ml匀浆；
b.再加盐酸胍溶液至40ml，倍比稀释，浓度分别为2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml；
c.用紫外分光光度计下分别测出OD值，其波长为276nm，并做出标准曲线。(盐酸胍CH5N3·HCl 95.53)
检测结果见表4：
表4不同浓度下的紫外吸收光密度值
浓度mg/ml 0.625 1.25 2.5
紫外吸光度值 0.5615 1.1389 2.0247
取2g成品，在37℃室温下，先将成品用4mol/L的盐酸胍溶液完全浸润，再加入10ml的盐酸胍溶液，浸提24h。用紫外分光光度计测出波长276nm下浸提液的光密度值为1.4672，计算结果：y＝1.25mg，10ml样品中部分纯化的BMP含量为(0.7701×1.4672+0.1186)×10＝12.5mg，部分纯化的BMP中骨形成蛋白(BMPs)含量测定。
试验方法：
采用武汉中美科技有限公司产牛骨形成蛋白(BMPs)酶联免疫吸附测定试剂盒测定。
样品处理：
40mg牛骨提取物干品中加入4ml含1％Triton-100的样品稀释液(提取液)，4℃浸泡过夜，经研磨后，转入Eppendorf管中，10000rpm离心2min，留取上清液，用含1％Triton-100的样品稀释液稀释400倍后，用于检测BMPs含量。
标准品配制：
BMPs标准品(80ng)溶解于1ml样品稀释液，其浓度为80ng/ml，然后再用样品稀释液分别稀释成2.5ng/ml，1.25ng/ml，0.625ng/ml，0.3125ng/ml。
操作步骤：
1.如下表所示，在酶标板每孔加入100μl稀释成不同浓度的BMPs标准品，稀释10倍的待测样品，以及样品稀释液为空白对照。37℃温育2h，结果见表5。
表5
标准品浓度(ng/ml) 0 0.3125 0.625 1.25 2.5
样品 + +
2.弃去孔内液体，每孔加入100μl检测溶液A(用前1：400稀释)，37℃温育1h。
3.弃去孔内液体，用洗涤液(稀释25倍)洗板3次。然后每孔加入100μl检测溶液B(用前1：400稀释)，37℃温育1h。
4.弃去孔内液体，用洗涤液(稀释25倍)洗板5次。
5.每孔加入90μl底物溶液，37℃温育15min。
6.每孔加入50μl终止液，立即用酶标仪测在450nm波长的光密度(OD450)
实验结果：
1.标准品标准曲线制定及样品浓度测定，见表6及图12。
表6标准品标准曲线制定及样品浓度测定
样品平均OD450值＝(0.171+0.163)＝0.167
样品浓度为1.25ng/ml。
部分纯化的BMP蛋白中(BMPs)含量测定结果：
部分纯化的BMP蛋白40mg中牛骨形成蛋白(BMPs)含量＝样品浓度×稀释倍数×总提取物液量＝1.25ng/ml×400×4ml＝2000ng＝2.0mg
复合
A.经过吸附工序将BMP(部分纯化的BMP)提取物黏附到载体上。精确称取含BMP蛋白6.0g，加入1.6L海藻酸钠溶液使海藻酸钠终浓度为1.5％，用匀浆器将含BMP蛋白6.0g均匀的分散在海藻酸钠溶液中，精确称取牛松质骨载体200g与含有BMP蛋白6.0g的海藻酸钠溶液混合，置于真空器皿中，减压排空气10min，器皿中的气压为700mmHg，进空气使之达到760mmHg，进气搅拌5次。将复合好的可吸收植骨材料进行冷冻干燥，其流程为：将冷冻干燥机预冷至-25℃以下，放入复合好的可吸收植骨材料，按升温程序逐渐升温，冻干 程序结束后，升至室温，结束冻干，包装于铝箔袋中，得产品。
B.精确称取含BMP蛋白6.0g，加入1.6L重量浓度为25％的冰醋酸调节pH至3。用匀浆器将含BMP蛋白6.0g均匀的分散在1.6L重量浓度为25％的冰醋酸溶中，精确称取BCB载体200g与含有BMP的蛋白6.0g的1.6L重量浓度为25％的冰醋酸溶液混合，将经复合有BMP的牛松质骨载体浸入0.1mol/L氢氧化钙水溶液中2min，捞出置于真空器皿中，700mmHg下恒压保持10min。将复合好的可吸收植骨材料进行冷冻干燥，其流程为：将冷冻干燥机预冷至-25℃以下，放入复合好的可吸收植骨材料，按升温程序逐渐升温，冻干程序结束后，升至室温，结束冻干，包装于铝箔袋中，得产品。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种可吸收的植骨材料的制备方法，所述制备方法包括下述步骤：
1)制备BCB：
将净化处理的牛肱骨依次经1：1氯仿/甲醇处理10-14h，10％H2O2处理45-50h后，再于41-43℃下，用0.6mol/L HCl处理2-10min，冷冻干燥和钴60γ射线照射12-15h得所述BCB；
2)提取BMP：
将粉碎后的牛腿皮质骨依次经1：1氯仿/甲醇处理10-14h，10％H2O2处理10-12h后，再于室温下，用0.6mol/L HCl处理2-10min，将离心得到的分离液调节至pH 7.0-7.5，按其质量百分比加入0.0004-0.0008％的胶原酶后于37℃无菌条件下浸提20-24h，浸提液于室温下减压浓缩后于终浓度为6mol/L脲/0.5mol/L CaC12中提取20-24h，透析、离心后得到粗制的BMP复溶于4mol/L盐酸胍/0.5mol/L CaC12的纯化液中离心，分离液经截流分子量为70KD的微孔滤膜得到的滤液再经透析、离心后即得所述BMP；
所述最终制得的BMP中BMP蛋白含量≥5％；
3)复合：
取步骤2)获得的BMP 6.0g加入终浓度为1.2-1.5％的海藻酸钠溶液中匀浆，与步骤1)制得的BCB 200g混合，于700mmHg压力下保持10min，进气搅拌5次、冷冻干燥得到所述可吸收的植骨材料。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)包括下述步骤：
于步骤2)最终获得的BMP 6.0g中加入1-2L浓度为25％的冰醋酸，匀浆，再加入步骤1)制得的BCB 200g混匀后浸入Ca(OH)2中1-3min，取出置于真空器皿中，于700mmHg下恒压10min，进气搅拌5次后冷冻干燥，即得所述可吸收的植骨材料。
3.如权利要求1或2任一项所述的制备方法，其特征在于所述步骤1)中的牛肱骨为牛肱骨上端松质骨。
4.如权利要求1或2任一项所述的制备方法，其特征在于步骤1)所述的净化处理的条件为：50℃和0.1-0.2MPa压力下用水冲洗3-6h。
5.如权利要求1或2任一项所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中制得的BCB中不含有脂肪细胞、骨细胞、中央管内的血管神经、骨基质的蛋白成分及哈佛氏管。
6.如权利要求1或2任一项所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)钴60γ射线照射强度为14.8KGY。
7.如权利要求1或2任一项所述的制备方法，其特征在于：所述3)复合步骤中冷冻干燥过程为：将复合的可吸收的植骨材料于降温至-25℃以下的冷冻干燥机中，再逐渐升至室温冻干。
8.一种可吸收植骨材料，其特征在于：所述植骨材料为利用权利要求1或2任一所述方法制得的植骨材料。
9.如权利要求1或2任一项所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)制得的BCB中含有按质量百分比计的蛋白质：25％-30％，无机质：55％-65％。
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