CN113398332B - 一种含干细胞外泌体的3d仿生生物支架及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含干细胞外泌体的3D仿生生物支架及应用，该仿生支架是利用甲基丙烯酸酐明胶、氧化的透明质酸和多巴胺修饰的透明质酸作为主体材料，添加软骨脱细胞基质（DCM）或骨脱细胞基质（DBM）模拟软骨或骨软骨下骨微环境并添加间充质干细胞外泌体（Exos）混合作为生物墨水，使用3D打印生物墨水构建包含Hydrogel‑DCM‑Exos和Hydrogel‑DBM‑Exos的复合支架，该复合支架模仿软骨和软骨下骨的生物活性，同时促进关节软骨和关节下骨的愈合。

Description

一种含干细胞外泌体的3D仿生生物支架及应用

技术领域

本发明属于医疗器械领域，具体涉及一种含干细胞外泌体的3D仿生生物支架及应用。

背景技术

关节软骨是运动系统的重要的组成结构之一，与关节内骨端的表面相连接，质地光滑有弹性。关节软骨具有润滑关节、缓冲运动产生的震动和冲击、改善骨与骨的之间的运动和形态匹配，对维持关节正常运动功能至关重要。软骨缺损可以引起剧烈疼痛、关节肿胀、活动能力下降和周围软骨及软骨下骨的退化，甚至发展为骨关节炎，严重影响患者的生活质量，给个人和社会带来沉重的经济负担。随着我国人民群众体育锻炼的热情日益高涨，参与体育活动的种类也逐步扩大，人们发生运动创伤包括关节软骨损伤的机率大大增加。在运动创伤领域，越来越多的患者遭受关节软骨损伤的困扰。软骨缺损在临床常见，有研究显示在接受膝关节镜手术的患者中，有超过 60% 的患者存在软骨缺损。软骨组织没有血管、神经和淋巴分布，其营养来源主要依靠关节滑液和关节囊滑膜层周围的血管供应。因此，软骨损伤后自我修复困难。

目前，常用的软骨缺损修复的手术策略主要包括微骨折术（microfracture, MF）、自体软骨细胞移植（autologous chondrocyte implantation, ACI）、自体软骨组织移植、同种异体软骨组织移植、干细胞疗法以及组织工程技术等。但是，每种方法都有一定的局限性。许多临床结果表明 MF 和 ACI 方法修复的再生软骨组织主要是纤维软骨组织，并且生物力学性能不如天然的透明软骨。自体软骨组织或者同种异体软骨组织移植修复效果较好，但是由于取材部位容易发生并发症以及来源有限限制了在临床的广泛应用。细胞移植包括 ACI 和干细胞疗法往往需要两个阶段：第一阶段是在体外对自体软骨细胞或者干细胞进行分离、培养和扩增；第二阶段是手术移植到缺损部位。细胞体外扩增过程中的存在去分化、干性降低、衰老，以及高成本、较长的等待时间和二次手术等是细胞疗法临床应用的限制因素。此外，传统的细胞移植在缺损部位不易长期保留也是面临的一个重要问题。目前为止，这些治疗方法均无法完全修复受损的关节软骨，如何实现关节软骨和关节骨的同时修复是需要解决的问题。

骨软骨作为关节结构中的连续性组织，从软骨表面到软骨下骨表现出不同的生理结构和力学特征。对骨软骨缺损患者而言，理想的修复策略应考虑软骨和软骨下骨两种组织各自的结构组成和生理微环境。现有的临床治疗方案主要针对软骨缺损，而缺乏对软骨下骨损伤的重视。其中，使用最广泛的微骨折术，通过在软骨下骨钻孔使骨髓中释放出来的血液在缺损处形成血凝块用于局部软骨修复，是一种主动破坏软骨下骨为代价的治疗方案。虽然近年人工合成聚合物材料、金属和陶瓷类生物材料的研发和应用于软骨或骨组织工程取得了可观的进展，但是对于同时诱导关节软骨和软骨下骨组织的再生显现出明显局限性，包括酸性代谢产物滞留、降解速率过慢、组织替代不完全等，不利于同时建立软骨和软骨下骨微环境，从而难以安全高效地促进原位不同组织缺损的良好修复。

有人证实，直接向待修复组织注射外泌体的实验组相比对照组具有更好的修复效果，但是多次注射带来的感染风险以及外泌体悬液在关节腔的弥散降低了其治疗效率。

传统冻干法难以制备不同空间特异的仿生支架，而3D生物打印技术的出现为精确构建仿生结构以模拟和重塑不同组织的三维空间结构提供了新的方法。但是，单纯的脱细胞基质材料由于力学强度较低，打印多层后容易出现的“坍塌效应”，导致无法维持软骨和软骨下骨的空间排布。

因此，需要一种能够解决以上所有或部分问题的方法和产品。

发明内容

本发明提供了一种复合支架，该复合支架包含使用第一生物墨水和第二生物墨水通过3D打印制造的两个部分，第一生物墨水包含主体材料、软骨脱细胞基质（decellularcartilage matrix, DCM）和外泌体，第二生物墨水包含主体材料、骨脱细胞基质（decellular bone matrix, DBM）和外泌体；其中，主体材料包含括甲基丙烯酸酐明胶（gelatin methacryloyl，GelMA）、氧化的透明质酸（oxidized hyaluronic acid，OHA）和多巴胺修饰的透明质酸（dopamine conjugated hyaluronic acid，HA-DA）。

进一步地，外泌体的终浓度为 10 -1000μg/mL；优选为100±50μg/mL，最优选100μg/mL。

可选地，上文描述的外泌体来自间充质干细胞，优选地外泌体来自脂肪间充质干细胞。

在一些实施例中，第一生物墨水和第二生物墨水中甲基丙烯酸酐明胶的质量比例为6%-12%。

在一些实施例中，第一生物墨水和第二生物墨水中氧化的透明质酸的质量比例为0.5-4%。

在一些实施例中，第一生物墨水和第二生物墨水中多巴胺修饰的透明质酸的质量比例为0.5-4%。

可选地，在一些实施例中，第一生物墨水和第二生物墨水还包含光引发剂，进一步地，光引发剂的质量比例为0.1-0.5%。

在一些实施例中，第一生物墨水包含质量比例9%的甲基丙烯酸酐明胶、质量比例2%的氧化的透明质酸、质量比例2% 的多巴胺修饰的透明质酸、 质量比例2%的软骨脱细胞基质、和质量比例0.4%的光引发剂、以及浓度为100μg/mL的外泌体。

进一步地，第二生物墨水包含质量比例9%的甲基丙烯酸酐明胶、质量比例2%的氧化的透明质酸、质量比例2% 的多巴胺修饰的透明质酸、 质量比例2%的骨脱细胞基质、和质量比例0.4%的光引发剂、以及浓度为100μg/mL的外泌体。

本发明的优点至少在于：

1、本发明的支架模拟关节软骨和关节软骨下骨微环境，并实现关节软骨和关节下骨的一步同时仿生修复；

2、本发明的支架加入的OHA中存在的醛基，可以与GelMA和脱细胞基质中的氨基发生席夫碱反应，实现动态共价交联，与HA-DA中的多巴胺活性基团联合，起到更好的外泌体缓释修效果，缓释时间长；

3、本发明的支架缓释的外泌体保留了生物活力，可以促进间充质干细胞增殖、成软骨和成骨分化；

4、本发明的支架在体内吸收的速率和组织再生速率相匹配，软骨生成和成骨效果好，效率高。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明的一个实施例中凝胶材料的1H NMR分析。图1A为明胶和GelMA的比对分析；图1B为HA、OHA和HA-DA的比对分析。

图2为根据本发明一个实施例的方法制备的软骨和骨组织脱细胞基质的表征。图2A和图2B分别显示软骨和骨组织脱细胞前后的大体观、HE染色和DAPI染色；图2C. DNA含量检测；图2D. GAG含量检测；图2E. 胶原（collagen）含量检测；图2F. 脱细胞基质生物墨水成胶试验；图2G. 流变学检测。n= 3, ** P < 0.01, *** P < 0.001。

图3 为根据本发明一个实施例的方法制备的Hydrogel支架、Hydrogel-DCM支架和Hydrogel-DBM支架在扫描电子显微镜下的微观形貌。

图4为根据本发明一个实施例的方法制备的Hydrogel支架、Hydrogel-DCM支架和Hydrogel-DBM支架的傅里叶变换红外光谱分析，透射比（transmittance），波数（wavenumber）。

图5为根据本发明一个实施例的方法制备的Hydrogel支架、Hydrogel-DCM支架和Hydrogel-DBM支架的溶胀和降解速率，图5A. 支架的溶胀，n=3，时间（time）（小时（h））；图5B. 支架的降解速率，n=5，时间（time）（天（days））。

图6为根据本发明一个实施例的方法制备的Hydrogel支架、Hydrogel-DCM支架和Hydrogel-DBM支架的生物相容性检测。图6A. 骨髓间充质干细胞（BMSCs）种植在支架24h的活/死（Live/Dead）染色；图6B. 支架上BMSCs培养72h的细胞骨架染色。i - iii：3D 图；iv- vi：叠加图；vii–ix：局部放大图。

图7为使用本发明说明书所描述的方法获得的人髌下脂肪间充质干细胞 （ADSCs）三系分化能力检测的结果。

图8示出使用流式细胞术检测本发明说明书所描述的方法获得ADSCs 表面标志物。

图9示出人ADSCs来源的外泌体的鉴定。图9A. 透射电子显微镜观察；图9B. 纳米粒径分析，浓度（concentration），颗粒（particles），尺寸（size）（纳米（nm））；图9C. 外泌体标志物的蛋白质免疫印迹检测。

图10示出本发明一个实施例的复合支架中外泌体的分布与性能，图10A示出使用激光共聚焦显微镜观察外泌体在复合支架中的分布；图10B. 3D分布效果；图10C. 外泌体的缓释曲线；n=3，累积释放（cumulative release）。

图11 示出使用CCK-8检测复合支架上BMSCs细胞活力的结果。n=5, ** P < 0.01,*** P < 0.001，活力（viability），时间（time）（天（days））。

图12 示出根据本发明的方法制作的各组支架体内实验的血液毒性测试结果，即大鼠术后各时间点的血常规检测。中性粒细胞 (granulocytes, GR)、淋巴细胞(lymphocytes, LY)、红细胞 (red blood cells, RBC)、白细胞 (white blood cells,WBC)、血小板 (platelet, PLT) 和血红蛋白 (hemoglobin, HGB) 浓度通过全自动血液分析仪检测用于评估血液毒性；n = 5。

图13示出根据本发明的方法制作的各组支架体内实验的炎症结果，即大鼠术后各时间点血清中炎症因子 IL-1 的检测。n = 5。** P < 0.01, *** P < 0.001。

图14示出根据本发明的方法制作的各组支架体内实验引起的脏器毒性，心（heart），肝脏（liver），脾脏（spleen），肺（lung），肾脏（kidney）。

图15示出根据本发明的方法制作的各组支架体内实验中使用MRI 评估软骨再生情况，箭头指示缺损边界，对照组（CTRL），凝胶支架（Hydrogel），不含外泌体的复合支架（Bi-Hydrogel），含有外泌体的复合支架（Bi-Hydrogel-Exos）, 12周（12w），6周（6w）。

图16示出根据本发明的方法制作的各组支架体内实验中使用CT 评估软骨下骨组织再生。图16A. 3D 重建图；图16B. 骨密度（bone mineral density，BMD）；图16C. 骨体积/总体积（bone volume/total volume，BV/TV）；图16D. 骨小梁数量（trabecularnumber，Tb. N）；图16E. 骨小梁厚度（trabecular thickness, Tb. Th）。n = 5, * P <0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001。

图17示出根据本发明的方法制作的各组支架体内实验中软骨再生的评估；图17A.大体观察；图17B. 表面软骨的ICRS 评分。圆圈代表缺损处的再生组织。n = 5, * P <0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001。

图18示出根据本发明的方法制作的各组支架体内实验中再生软骨的组织学染色。图18A. H&E 染色；图18B. 甲苯胺蓝染色；图18C. II 型胶原免疫组织化学染色。N，正常软骨；R，修复组织；箭头，缺损边界；*代表未降解的支架。

图19示出根据本发明的方法制作的各组支架体内实验中的组织学评分。n = 5, *P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

一、实验方法

1.1 成软骨诱导分化

(1) 当第二代脂肪间充质干细胞（ADSCs）生长至90%密度时，加入0.25%胰蛋白酶消化液2 mL，1‒2分钟（min）通过倒置显微镜下观察细胞形态。当发现细胞回缩、变圆、间隙变大和悬浮后，加入等体积完全培养基终止消化。

(2) 转移细胞悬液至离心管，800转/min, 离心5 min。

(3) 使用细胞自动计数仪对细胞悬液进行计数，并调整细胞密度至1.0 × 10⁷个/mL，取 5 μL细胞悬液轻轻滴加于 24 孔细胞培养板，37℃ 细胞培养箱中静置 4 小时（h）。

(4) 加入成软骨诱导分化完全培养基后放入 37℃ 细胞培养箱。每3天更换新鲜诱导分化培养基。

(5) 当诱导分化 21 天后，弃去培养基，使用 PBS 溶液小心洗涤后，加入 10% 中性甲醛固定 30 min。

(6) PBS 溶液小心洗涤 2 次，室温下阿利辛蓝染液染色 30 min。

(7) 吸走染液，PBS 冲洗 3 次。

(8) 显微镜下观察并拍照。

1.2 成骨诱导分化

(1) 当第二代 ADSCs 生长至 90% 密度时，加入 0.25% 胰蛋白酶消化液 2 mL，1‒2 min 通过倒置显微镜下观察细胞形态。当发现细胞回缩、变圆、间隙变大和悬浮后，加入等体积完全培养基终止消化。

(2) 转移细胞悬液至离心管，800 转/min, 离心 5 min。

(3) 使用细胞自动计数仪对细胞悬液进行计数，并调整细胞密度至 0.5 × 10⁵个/mL，取 2 mL细胞悬滴 6 孔细胞培养板（提前用 0.1% 明胶进行包被处理），在37℃细胞培养箱中孵育 12 h 使细胞充分贴壁。

(4) 吸出培养基后使用 PBS 溶液洗涤 2 次，加入成骨诱导分化完全培养基后放入 37℃ 细胞培养箱。每 3 天换液 1 次。

(5) 当诱导分化 21 天后，弃去培养基，使用PBS溶液小心洗涤后，加入 10% 中性甲醛固定 30 min。

(6) PBS 溶液小心洗涤 2 次，室温下茜素红染液染色 30 min。

(7) 吸去茜素红染液，PBS 冲洗 3 次。

(8) 显微镜下观察并拍照。

1.3 成脂诱导分化

(1) 当第二代 ADSCs 生长至 90% 密度时，加入 0.25% 胰蛋白酶消化液 2 mL，1‒2 min 通过倒置显微镜下观察细胞形态。当发现细胞回缩、变圆、间隙变大和悬浮后，加入等体积完全培养基终止消化。

(2) 转移细胞悬液至离心管，800 转/min, 离心 5 min。

(3) 使用细胞自动计数仪对细胞悬液进行计数，并调整细胞密度至 0.5 × 10⁵个/mL，取 2 mL细胞悬于 6 孔细胞培养板，在 37℃ 细胞培养箱中孵育12 h使细胞充分贴壁。

(4) 吸出培养基后使用 PBS 溶液洗涤 2 次，加入成脂肪诱导分化完全培养基 A液诱导分化 3 天后，更换为 B 液诱导分化1天。

(5) 使用 A 液和 B 液交替诱导 4 次，用 B 液继续培养 5 天，每 3 天更换。

(6) 当诱导分化 21 天后，弃去培养基，使用PBS溶液小心洗涤后，加入 10% 中性甲醛固定 30 min。

(7) PBS溶液小心洗涤 2 次，室温下油红 O 染液染色 30 min。

(8) 吸走油红 O 染液，PBS 冲洗 3 次。

(9) 显微镜下观察并拍照。

1.4 流式细胞术

(1) 当第二代 ADSCs 生长至 90% 密度时，使用 0.25% 胰蛋白酶消化液 2 mL消化细胞 1‒2 min，观察细胞形态，当发现细胞回缩、变圆、间隙变大和悬浮后，加入等体积完全培养基终止消化。

(2) 转移细胞悬液至离心管，按照 300 g/min 的转速, 离心 5 min。

(3) 加入 5 mL PBS 轻轻吹打细胞，重复步骤 (2)。

(4) 使用 400 μL PBS 重悬细胞，均按照 1：100 的比例分别加入CD29、CD34、CD45、CD90 和 CD105 抗体，避光孵育1 h。

(5) 300 g/min 的转速下离心 5 min，使用 400 μL PBS 重悬细胞。

(6) 使用细胞筛过滤细胞悬液为单细胞悬液，上机检测。

(7) 使用 FlowJo 软件对数据进行分析。

1.5 再生软骨的组织学评估

1.5.1 膝关节取材、固定及包埋

(1) 取膝关节股骨远端，剔除周围软组织，10% 中性甲醛室温下固定 48 h。

(2) 使用快速脱钙液对标本进行脱钙处理，待注射器针头可以轻松穿过骨皮质说明脱钙完全，大约需要2 周。

(3) 修剪样品后置于包埋盒中，自来水流水冲洗过夜，充分洗去残留在组织内的脱钙液。

(4) 使用全自动脱水机对标本进行脱水处理，随后石蜡包埋。

(5) 使用石蜡切片机制作 5 μm 连续石蜡切片，然后在 42℃ 水浴中展片，用多聚赖氨酸处理过的载玻片小心捞取石蜡切片。60℃ 烤箱中烘烤 2 h，随后37℃ 烤箱中烘烤过夜。

1.5.2 H&E 染色

(1) 脱蜡和水化：

二甲苯替代物 I	10 min
		二甲苯替代物 II	10 min
二甲苯替代物 III	10 min
		无水乙醇 I	5 min
无水乙醇 II	5 min
		95%乙醇	5 min
85%乙醇	5 min
		75%乙醇	5 min
蒸馏水	3 min

(2) 染色:

1) 苏木精染色 4 min，蒸馏水洗去浮色。

2) 在 1% 盐酸乙醇分化液中分化 10秒（s），蒸馏水冲洗。

3) 在 0.5‒1% 氨水观察返蓝 10 s，蒸馏水冲洗。

4) 伊红染色 40 s，蒸馏水洗去浮色。

(3) 脱水透明：

95%乙醇脱水 I	20 s
		95%乙醇脱水 II	20 s
无水乙醇脱水 I	20 s
		无水乙醇脱水 II	20 s
染色后二甲苯替代物透明I	3 min
		染色后二甲苯替代物透明II	3 min

(4) 中性树胶封片，晾干后显微镜下观察并拍照。

1.5.3 甲苯胺蓝染色

(1) 脱蜡和水化：同 1.5.2 所述。

(2) 染色：室温下，用 0.5% 甲苯胺蓝染色液滴染组织 30 min，蒸馏水洗去浮色。

(3) 脱水透明：

95%乙醇脱水	3 s
		无水乙醇脱水	3 s
染色后二甲苯替代物透明 I	3 min
		染色后二甲苯替代物透明 II	3 min

(4) 中性树胶封片，晾干后显微镜下观察并拍照。

1.5.4 免疫组织化学染色

(1) 脱蜡和水化：同 1.5.2 所述。

(2) 用 3% 内源性过氧化物酶阻断剂避光孵育 15 min，PBS 冲洗 3 min，共3次。

(3) 胃蛋白酶抗原修复液 37℃ 避光孵育 30 min，PBS 冲洗 3 min，共 3 次。

(4) 滴加山羊血清封闭工作液，37℃ 避光孵育 30 min，PBS 冲洗 3 min，共 3次。

(5) 分别滴加 50 μL 的 I 型、II 型和 X 型胶原蛋白一抗，置于湿盒中 4℃ 孵育过夜，PBS 冲洗 3 min，共 3 次。

(6) 滴加 50 μL二抗工作液于组织上，置于湿盒中，室温下避光孵育 60 min，PBS冲洗 3 min，共 3 次。

(7) 配制 DAB 显色工作液：按照每毫升 A 液（DAB 稀释液）中加 50 μL 的 B 液（DAB 原液）的浓度配制所需要的用量，混匀后备用，现用现配。

(8) 滴加 50 μL DAB 显色工作液，显微镜下观察，自来水终止显色。

(9) 脱水透明：参见 3.15.2 所述。

(10) 中性树胶封片，晾干后显微镜下观察并拍照。

1.5.5 统计学分析

采用 SPSS 22.0 软件进行统计学分析，结果以（均数 ± 标准差）表示。两组之间比较采用独立样本 T 检验分析。三组及以上比较时，先进行方差齐性检验，方差齐时采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）；方差不齐时采用非参数检验。当 P < 0.05 时，认为结果具有统计学差异。

1.5.6 BMSCs 的原代分离和培养

取80‒100g 的雄性 SD 大鼠，处死后在 75% 酒精中浸泡 30 min。取膝关节处胫骨和股骨并暴露干骺端，使用注射器吸取 PBS 冲洗骨髓腔并收集骨髓抽吸物。采用 800rpm/min 的转速离心 5 min 后，加入MEM-α 完全培养基重悬底部细胞团，放入含有 5%CO₂ 的37℃ 细胞培养箱中静置培养 5 天，随后每 3 天更换一次培养基，1‒2 周可获得BMSCs。当细胞长至 80‒90% 密度后，按照1:3‒1:4的比例传代扩增细胞或者冻存。

1.5.7 外泌体的提取

提取 MSCs 来源的外泌体需要扩增足够的细胞，为了保证扩增效率和减少 MSCs的去分化，采用康宁公司的 Falcon 多层细胞培养瓶（875 cm²）扩增三种MSCs。当细胞长至约80% 密度时，弃去培养上清，使用 PBS 洗 2 遍后，更换含5% 无外泌体 FBS 的MEM-α培养基继续培养 48 h, 收集细胞上清即条件培养基。随后条件培养基按以下步骤处理：

(1) 条件培养基在300 × g离心10 min，收集上清。

(2) 2,000 × g 离心10 min，收集上清。

(3) 10,000 × g离心 30 min，收集上清。

(4) 应用切向流技术，采用含有 100 kDa 分子量界限的过滤膜系统（CentriconPlus-70，Millipore），上清在3,500 × g条件下离心浓缩。

(5) 使用 0.22 μm 孔径的滤器过滤上清。

(6) 4℃，100,000 × g离心2 h，小心吸出上清，预冷的 PBS 重悬沉淀。

(7) 4℃，100,000 × g离心2 h，小心吸出 PBS，加入100‒200 μL预冷的 PBS 重悬底部沉淀，分装后冻存于 ‒80℃ 保存。

1.5.8 外泌体的鉴定

1.5.8.1透射电子显微镜观察

取 10 μL 新鲜分离的外泌体，PBS 稀释后滴加到铜网上，用 2% 磷钨酸室温负染2 min。采用JEOL -1400透射电子显微镜（JEOL, Tokyo, Japan）进行观察。

1.5.8.2 纳米粒径分析

使用NanoSight NS300系统（Malvern Instruments）通过纳米颗粒跟踪分析来确定外泌体的大小和浓度。取 2 μL 新鲜分离的外泌体，PBS 稀释到 1 mL 置于注射器中，自动机械泵匀速将样品注入仪器，通过颗粒的布朗运动进行追踪分析计算纳米颗粒的大小及浓度。

1.5.8.3 蛋白质免疫印迹实验

（1）细胞和外泌体蛋白质样品的制备

细胞蛋白质提取：细胞在直径 10 cm 的细胞培皿生长至 90% 密度时，弃去上清，预冷的 PBS 洗涤 2 遍后，使用移液器将残留的 PBS 充分吸净，在冰上加入含有蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液，迅速用细胞刮刀收集裂解产物。冰上孵育 30 min 后, 于 4℃、10,000 × g条件下离心15 min，所获上清即细胞的蛋白质提取物。

外泌体蛋白质提取：将外泌体和含有蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液按照 1:1 的体积比混匀，冰上孵育 30 min 后, 于 4℃、10,000 × g条件下离心15 min，所获上清即外泌体的蛋白质提取物。

（2）蛋白质浓度测定

使用 BAC 法测定蛋白质浓度，按照Thermo公司蛋白定量试剂盒（BCA法）说明书进行，具体如下：

1）工作液配制：将试剂 A 和试剂 B 按照 50:1 的体积比混匀制备工作液。工作液需要现用现配。

2）标准品溶液配制：使用 PBS 和蛋白质标准品溶液（2000 μg/mL），通过稀释法获得不同浓度（1500、1000、750、500、250、125和0 μg/mL）的标准品溶液。取各浓度标准品25 μL加入96 孔板中。

3）取各样品 2.5 μL 加入96 孔板中，加入 PBS 补充样品体积至25 μL。

4）将 200 μL 工作液加入 96 孔板中，轻轻混匀，避免气泡。

5）37℃ 恒温箱内避光孵育 30 min。

6）通过多功能酶标仪检测 562 nm 波长处的吸光度值。

7）根据各标准品溶液的浓度和所测得的吸光度值建立标准曲线，通过标准曲线计算各样品的蛋白质浓度。

（3）蛋白质免疫印迹实验

1）制作 10% 分离胶，各成分比例如下：

30% 丙烯酰胺溶液	3.3 mL
		分离胶缓冲液	2.5 mL
ddH<sub>2</sub>O	4.1 mL
		10% APS	0.1 mL
TEMED	4 μL

混合均匀后将分离胶灌入干净的玻璃板之间中，加入的ddH₂O使分离胶水平。室温静置 30 min 后，水和分离胶之间可见明显的分界线。

2）制作 5% 浓缩胶，各成分比例如下：

30% 丙烯酰胺溶液	0.68 mL
		浓缩胶缓冲液	1.0 mL
ddH<sub>2</sub>O	2.28 mL
		10% APS	40 μL
TEMED	4 μL

小心弃去分离胶上层的ddH₂O，加入浓缩胶至玻璃板顶部，插入梳子，室温静置 30min 后拔去梳子。

3）上样：在电泳槽中加入 1 × 电泳缓冲液后，根据所测的蛋白质浓度将等量的蛋白样品加入到浓缩胶各孔中，预染蛋白质 marker上样 6 μL。

4）电泳：使用 80 V 恒压电泳，待样品进入分离胶以后，调整至 120 V 电压继续电泳，溴酚蓝到达分离胶底部时候结束电泳。

5）拆胶：取下并小心去除一侧玻璃板，切除浓缩胶和分离胶无样品部分，切角标记。

6）转膜：测量剩余胶的大小，按照相应尺寸剪裁一张 PVDF 膜，并在甲醇中浸泡 3min 平衡PVDF 膜，按照“黑胶白膜”顺序放置在电转槽中。接通电源，设置电流大小为250mA 恒流，冰浴或者 4℃ 转膜 2 h。

7）封闭和一抗孵育：将膜在 TBST 中漂洗 3 次，用 5% 脱脂奶粉或 5% BSA 室温条件下封闭 1 h后加入一抗，放于摇床4℃ 过夜。

8）二抗孵育：室温下 TBST 漂洗 3 次，每次 10 min，加入二抗，室温孵育 1 h。

9）发光：室温下 TBST 漂洗 3 次，每次 10 min，滴加适量发光液进行化学显色，采集图像。

二、实施例：使用3D打印制备含有外泌体的复合支架及其性能检测方法

2.1 实验动物

本发明遵循美国国立卫生研究院出版的《The Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals》（1996 版）进行，动物实验方案经过北京大学医学部动物伦理委员会批准。选用 4 周龄体重 80‒100g 的雄性 SD 大鼠提取 BMSCs，选用 12 周龄体重 400‒450 g 的雄性 SD 大鼠用于建立软骨和软骨下骨缺损动物模型。实验动物均购买于北京大学医学部动物实验中心并在 SPF 环境饲养，购入后至少适应环境 7 天。采用随机分组方式排除因动物个体差异造成的实验误差。所用实验动物标本取材采用过量麻醉的方式安乐死。

2.2 间充质干细胞（MSCs）的分离和培养

2.2.1 大鼠 BMSCs 的分离和鉴定

使用 1.5.6 描述的方法分离和鉴定的大鼠 BMSCs。

2.2.2 人 ADSCs 分离、培养和鉴定

人脂肪组织标本的取材及实验方案通过北京大学第三医院医学伦理委员会批准。患者签署知情同意书。人脂肪组织标本来自关节镜下行膝关节交叉韧带重建术中废弃的髌下脂肪垫组织。获得组织后立即放入无菌生理盐水中，使用临床标本专用低温冰盒送至实验室进行原代细胞培养。对第 2 代 ADSCs 细胞进行三系分化（参见 1.1-1.3）和流式细胞术（参见1.4）鉴定。

2.3 外泌体的提取和鉴定

参见 1.5.7 和 1.5.8。

2.4 材料制备和表征

2.4.1 明胶-甲基丙烯酸酐制备

（1）称量 6 g 的明胶加入 60 mL 体积的 PBS 中，置于 50℃ 水浴中搅拌溶解。

（2）使用移液器逐滴滴加甲基丙烯酸酐 300 μL。

（3）50℃ 水浴中避光持续搅拌 1 h。

（4）加入200 mL 37℃的 PBS 终止反应，快速搅拌 10 min。

（5）转移到透析袋后封口，放入含有 ddH₂O 的大烧杯 37℃ 烘箱中透析 3 天，每间隔 12 h 更换 ddH₂O。

（6）冷冻干燥后于 ‒20℃ 保存备用。

2.4.2 氧化透明质酸制备

（1）称量 1 g 的透明质酸，加入到 100 mL 体积的 ddH₂O 中，室温磁力搅拌溶解。

（2）称量 550 mg 的高碘酸钠，溶于5 mL体积的 ddH₂O 中。

（3）使用移液器将高碘酸钠溶液逐滴加入透明质酸溶液中，室温搅拌 2 h。

（4）转移到透析袋后封口，放入含有 ddH₂O 的大烧杯透析 3 天，每间隔 12 h 更换ddH₂O。

（5）冷冻干燥后于 ‒20℃ 保存备用。

2.4.3 透明质酸-多巴胺制备

（1）称量 1 g 的透明质酸，加入到 100 mL 体积的 ddH₂O 中，室温磁力搅拌溶解。

（2）加入 575 mg 的EDC，345 mg 的NHS，室温搅拌 20 min。

（3）加入 569 mg 的盐酸多巴胺，避光搅拌 3 h，在此期间需维持 pH在 5‒6 范围内，随后继续反应 21 h。

（4）装入透析袋并封口，使用 pH 为 3‒4的 ddH₂O 透析 2 天后，继续用 ddH₂O 透析 1 天，期间每间隔 12 h 更换ddH₂O。

（5）冷冻干燥后于 ‒20℃ 保存备用。

2.4.4 核磁共振波谱检测

使用重水分别配制 1% 明胶、1% GelMA、0.8% HA、0.8% OHA和 0.8% HA-DA的水凝胶，充分搅拌均匀后，移入圆柱形核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance，NMR）玻璃样品管中，注意避免气泡，上机检测。

2.5 脱细胞基质制备

使用 6 月龄大的猪股骨的新鲜标本，剔除周围的脂肪、肌肉、筋膜等软组织。按照如下方法分别制备软骨脱细胞基质（decellular cartilage matrix, DCM）和骨脱细胞基质（decellular bone matrix, DBM）。

2.5.1 软骨脱细胞基质制备

（1）使用外科手术刀片小心切取股骨远端滑车处的软骨，切成厚度约 1 mm 的软骨片，注意不要切取到软骨下骨。

（2）将软骨片置于 50 mL 离心管，液氮冷冻后 37℃ 水浴，进行 6 个循环。

（3）37℃ 条件下，0.25% 胰蛋白酶溶液（含 EDTA）洗涤 4 次，每次 6 h。

（4）37℃ 条件下，含10 mM Trizma-HCl、DNase（50 U/mL）和 RNase A（1 U/ mL）的DPBS洗涤 4 h。

（5）10 mM Trizma-HCl 洗涤 24 h。

（6）含 0.5% SDS 的 DPBS 洗涤 24 h。

（7）含 1% Triton X-100的DPBS 溶液洗涤 24 h。

（8）DPBS 洗涤，直至泡沫消失。

（9）冷冻干燥，球磨仪磨成粉末，‒20℃ 保存备用。

2.5.2 骨组织脱细胞基质制备

（1）使用骨刀和骨锯收集股骨远端关节软骨下的松质骨标本，切成厚度不超过1cm的方块骨组织。

（2）高压水冲洗骨髓后，采用 0.5 M 的盐酸溶液室温下脱钙 24 h, 每 12 h 更换一次盐酸溶液。

（3）按照 1：1 体积比混合的三氯甲烷和甲醇混合物冲洗 6 h，随后甲醇冲洗 6h，DPBS洗涤 2 h，目的是充分去除骨组织中的脂肪。

（4）37℃ 条件下，0.25% 胰蛋白酶溶液（含 EDTA）洗涤 4 次，每次 6 h。

（5）37℃ 条件下，含 0.1% EDTA 、10 mM Trizma base、DNase（50 U/mL）和RNaseA（1 U/ mL）的 DPBS 洗涤 4 h。

（6）10 mM Trizma base 的 DPBS 洗涤 24 h。

（7）含 0.5% SDS和 10 mM Trizma base 的 DPBS 洗涤 24 h。

（8）DPBS 洗涤，直至泡沫消失。

（9）冷冻干燥，球磨仪磨成粉末，‒20℃ 保存备用。

2.6 脱细胞基质的表征

2.6.1 组织切片 H&E 染色

参见 1.5.2。

2.6.2 组织切片 DAPI 染色

（1）脱蜡和水化：参见 1.5.2。

（2）DAPI 染色：将 DAPI 染色液滴加于标本处，室温下避光孵育 10 min。

（3）PBS 洗涤 3 次，每次 3 min。

（4）封片后使用荧光显微镜拍摄图像。

2.6.3 DNA含量检测

（1）木瓜蛋白酶裂解液配制：木瓜蛋白酶 125 μg/mL，5 mM Na2-EDTA，5 mM L-半胱氨酸盐酸，0.1 M 乙酸钠，调整 pH 到 6.2。

（2）分别取 10 mg 冷冻干燥后的正常软骨、正常骨、DCM 和 DBM粉末添加到 1 mL木瓜蛋白酶裂解液中，置于 60℃ 烘箱中裂解 24 h。

（3）取200 μL Hoechst 33258 工作液（2 μg/ml）加入 96 孔板，随后每孔加入 20uL 样品裂解液或者各浓度的小牛胸腺 DNA 标准品，于 37℃ 孵箱避光孵育 1 h。

（4）取 100 μL 混合液加入 96 孔板，使用多功能酶标仪检测荧光值（激发光为360 nm，发射光为 460 nm）。

（5）绘制 DNA 标准曲线，计算各样本的 DNA 浓度。

2.6.4 GAG 含量检测

（1）将 200 μL 体积的 1,9-二甲基亚甲蓝（DMMB）溶液加入 96 孔板，加入 20 μL体积的上述样品裂解液或者不同浓度的硫酸软骨素标准品，充分混匀。

（2）于室温避光孵育 30 min。

（3）使用多功能酶标仪上检测 525 nm 处的吸光度值。

（4）绘制标准曲线，计算各样本的 GAG 浓度。

2.6.5 羟脯氨酸含量检测

使用南京建成生物工程研究所生产的羟脯氨酸检测试剂盒，通过测定羟脯氨酸含量评估脱细胞前后胶原含量的改变。羟脯氨酸在氧化剂作用下生成的氧化产物可以与二甲氨基苯甲醛反应呈现紫红色，根据其吸光度值推算含量。

（1）按照说明书操作配制试剂一、试剂二和试剂三。

（2）分别取 200 μL 的 ddH₂O、标准品和上述各样品裂解液加入含有 100 μL 试剂一的 EP 管中，混匀后静置 10 min。

（3）加入 100 μL 试剂二，混匀后静置 5 min。

（4）加入 100 μL 试剂三，混匀后 60℃ 水浴加热 15 min。

（5）3500 rpm/min，离心 10 min。

（6）取 100 μL 上清加入 96 孔板，使用多功能酶标仪检测波长 550 nm 处的吸光度值。

（7）根据标准品浓度计算样品中羟脯氨酸含量。

2.6.6 成胶能力检测

（1）DCM 和 DBM 墨水配制：

1）称取 15 mg 的胃蛋白酶加入 5 mL 的 0.1 M盐酸溶液中，室温搅拌 30 min。

2）称取 150 mg 的 DCM 或者 DBM 粉末，加入上述含有胃蛋白酶的盐酸溶液，室温密封搅拌 72 h 获得 DCM 或 DBM 墨水。

3）将 DCM 或 DBM 墨水置于冰上，使用氢氧化钠溶液小心调整 pH 至 7.4，需要注意少量多次添加，避免 pH 至 7.4 以上。

（2）将适量的 DCM 和 DBM 墨水加入到玻璃管中，放入37℃ 孵箱孵育 30 min后，倒置观察是否成胶并拍照。

（3）使用流变仪检测 DCM 和 DBM 墨水随着温度改变弹性模量 G’ 和粘性模量G”的动态变化。

2.7 支架的打印和表征

2.7.1 水凝胶生物墨水制备

（1）Hydrogel 生物墨水的配制：

1）称取 0.9 g GelMA 加入 5 mL的 ddH₂O 中, 37℃ 搅拌溶解后加入 0.2 gOHA，继续搅拌溶解。

2）称取 0.2 g HA-DA 和 0.04 g 光引发剂，加入 5 mL的 ddH₂O 中，室温搅拌溶解。

3）将上述两种溶液混合均匀获得 Hydrogel 生物墨水。

（2）Hydrogel-DCM 和 Hydrogel-DBM 生物墨水的配制：

1）称取 0.9 g GelMA 加入 5 mL 的 ddH₂O 中, 37℃ 搅拌溶解后加入 0.2 gOHA，继续搅拌溶解。

2）按2.6.6所述方法配制 4% 的 DCM 或 DBM 墨水5 mL，调整 pH 至 7.4后，加入0.2 g HA-DA 和 0.04 g 光引发剂，室温搅拌溶解。

3）将上述两种溶液混合均匀获得 Hydrogel-DCM 或 Hydrogel-DBM 墨水生物墨水。

（3）Hydrogel-DCM-Exos 和 Hydrogel-DBM-Exos 生物墨水的配制：Hydrogel-DCM和 Hydrogel-DBM 生物墨水的配制好后加入 ADSCs 外泌体，终浓度为 100 μg/mL。

步骤1）和 2）仅为描述方便，没有先后顺序，同时进行也可。

为了研究不同变量浓度对生物墨水的影响，发明人在这个实例的基础上进行了若干组对照试验，试验变量的具体变化如下表所示：

变量名称	第一组	第二组	第三组	单位
					GelMA	6%	9%	12%	质量百分比
OHA	0.50%	2%	4%	质量百分比
					HA-DA	0.50%	2%	4%	质量百分比
脱细胞基质	0.50%	2%	4%	质量百分比
					光引发剂	0.10%	0.20%	0.40%	质量百分比
外泌体终浓度	10	100	1000	μg/mL

其中脱细胞基质是软骨脱细胞基质或者骨脱细胞基质；

每个变量选择一个具体数值，作为一个实验组，例如：

GelMA（6%）、OHA（0.5%）、HA-DA(0.5%)、 脱细胞基质(0.5%)、光引发剂(0.1%)、以及终浓度为 10 μg/mL的间充质干细胞外泌体作为一个实验组，以此类推，共计1458（729*2）个具体实验方案，实验结果表明，这些实验方案均可以获得用于3D打印的生物墨水，使用这些生物墨水可以得到仿生支架，结果与前述实例类似，实验结果重复，不再赘述。

2.7.2 支架的打印

使用 3D-Bioplotter（EnvisionTEC）生物打印机进行支架打印。设置层高、线宽和线间距均为 320 μm，打印压力为 2.5‒3.5，打印速度为8‒15 mm/s，平台温度10℃，墨水舱温度18‒22℃。体外实验各支架打印 6 层，体内实验共打印 9 层，下面 6 层为 Hydrogel-DBM 或 Hydrogel-DBM-Exos，上面 3 层为 Hydrogel-DCM 或 Hydrogel-DCM-Exos。将打印好的支架置于冰上，UV 照射 20 min 以充分交联。

2.7.3 支架的表征

（1）扫描电子显微镜观察

1）对 Hydeogel支架、Hydeogel-DCM支架和 Hydeogel-DBM 支架进行冷冻干燥。

2）将三种支架置于黑色导电胶上，对表面进行喷金处理。

3）使用扫描电子显微镜（JSM-7900F，JEOL，日本）对支架的微观结构进行观察和拍摄。

（2）傅里叶红外光谱分析

1）将明胶、GelMA、HA、OHA、HA-DA、DCM、DBM 和 Hydeogel、Hydeogel-DCM、Hydeogel-DBM 三种支架冷冻干燥后研碎成粉末。

2）按照 1:100 的质量比与溴化钾固体混合，充分研磨后压制成薄片。

3）采用 4000-400 cm^-1 范围的扫描波数和 4 cm^-1 的扫描精度，通过傅里叶红外光谱分析蛋白质的二级结构。

（3）支架的降解速率检测

1）打印同样尺寸的各种支架，冷冻干燥后，称量各个支架的干重为Wi。

2）将支架分别放入含有 1 mL PBS 的圆底离心管中，置于 37℃ 和 30 rpm/min转速的孵育摇床内。

3）每间隔 3 天更换 PBS，在预定时间取出支架，ddH₂O 洗涤 2 次，冷冻干燥后测量支架称重为 Wt。

4）降解率 = (Wt- Wi)/Wi × 100%。

（4）支架的溶胀率检测

打印同样尺寸的各种支架，滤纸吸去表面水分称重为 Wi。放入含有 1 mL PBS的圆底离心管中，置于 37℃ 培养箱中孵育。在预定时间取出支架，ddH₂O 洗涤 2 次，滤纸吸去表面水分后称重为 Wt。溶胀率 = (Wt- Wi)/Wi × 100%。

（5）外泌体的释放

将同样尺寸称重后的 Hydeogel-DCM、Hydrogel-DBM、Hydrogel-DCM-Exos、Hydrogel-DBM-Exos 支架置于不同的 Transwell 上室（8 μm），在下室加入 150 μL 的PBS，放入 37 ℃的培养箱中孵育。在预定时间从下室取出 15 μL PBS并加入等体积 PBS。使用 micro BCA 试剂盒测量各时间点取出的 PBS 的蛋白质含量，进而计算外泌体的释放百分比。

2.8 支架的生物相容性

2.8.1 细胞种植于支架上

（1）将经过 UV 照射后的支架放入含 10% 无外泌体 FBS 的 MEM-α 完全培养基中于 37℃ 细胞培养箱孵育 24 h。

（2）取第 3 代大鼠 BMSCs, 0.25% 胰蛋白酶溶液消化约 2 min，在800 rpm/min条件下离心 3 min，使用含 10% 无外泌体 FBS 的 MEM-α 完全培养基重悬细胞。

（3）调整细胞悬液密度为 1 × 10⁷/mL，取 100 μL 滴加到支架上，置于 37℃ 细胞培养箱孵育 4 h，更换培养基，继续培养或者诱导分化。

2.8.2 细胞在支架上的活性

（1）按照上述 2.8.1 描述将细胞种植在支架后，继续培养 24 h。

（2）配制 Live/Dead 细胞活性检测工作液：取 1 μL 体积的 Live 试剂混入 499ul 的 PBS 中，取 1 μL 体积的 Dead 试剂混入 499 ul的另一份 PBS 中，混合均匀后即Live/Dead工作液。Live/Dead 工作液现用现配。

（3）用 PBS 洗涤支架 2 次，转移支架到共聚焦培养皿，加入1 mL Live/Dead工作液，置于 37℃ 细胞培养箱孵育 15 min。

（4）弃去工作液，用PBS洗涤支架 2 次，使用激光共聚焦显微镜观察支架上活细胞和死细胞分布。

2.8.3 细胞在支架上的形态

（1）按照上述 2.8.1 描述将细胞种植在支架后，继续培养 72 h。

（2）弃去上清，用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 min，PBS 冲洗 3 次，每次 5 min。

（3）用罗丹明‒鬼笔环肽对细胞骨架染色15 min，PBS 冲洗 3 次，每次 5 min。

（4）使用 Hoechst 33342对细胞核染色15 min，PBS 冲洗 3 次，每次 5 min。

（5）通过激光共聚焦显微镜观察并拍照。

2.8.4 细胞在支架上的增殖能力检测

（1）按照上述 2.8.1 描述将细胞种植在支架后，更换含 10% 无外泌体 FBS的MEM-α 完全培养基继续培养。

（2）于1 d、3 d、5 d 和 7 d后分别取出支架，PBS 冲洗 3 次，置于新的 24 孔细胞培养板中。

（3）每孔加入 1 mL含 10% 的 CCK-8 试剂的 MEM-α 培养基（现用现配），于 37℃细胞培养箱孵育 2 h。

（4）取 100 μL 体积的孵育液置于 96 孔细胞培养板，使用酶标仪测定 450 nm波长处的吸光度值。

2.9 细胞在支架上的成软骨和成骨诱导分化

将 BMSCs 种植于支架后培养 3 d后，PBS 洗涤 2 遍，更换成软骨诱导分化完全培养基或者成骨诱导分化完全培养基（使用无外泌体的 FBS）分别诱导 7 d 和 14 d。随后进行下一步相关检测。

2.9.1 qRT-PCR 检测

采用 qRT-PCR 检测成软骨和成软骨相关基因 mRNA 表达。在成软骨或者成骨诱导 7 d 和 14 d 后，取出支架用 PBS 洗涤 2 次，放入 EP 中并加入 0.5 mL 体积的TRIzol 试剂，充分剪碎后置冰上 30 min，每间隔 10 分钟震荡，进行后续操作，或者保存于 ‒80℃ 备用。详细方法其他参见 3.2.11。

2.9.2 细胞免疫荧光检测

在成软骨或者成骨诱导分化 14 d 后，采用细胞免疫荧光检测成软骨和成软骨相关基因蛋白质表达。详细方法参见第二部分 3.2.12。

2.10 动物实验

本发明采用体重 400‒450 g 的雄性 SD 大鼠（约 12 周龄），建立大鼠膝关节软骨和软骨下骨缺损模型。具体方法和手术步骤如下：

（1）使用小动物专用气体麻醉机，给予异氟烷和氧气混合气体对实验动物进行麻醉。

（2）充分麻醉后脱毛备皮，用碘伏消毒剂消毒对膝关节进行消毒 2 次，75% 酒精脱碘 2 遍。

（3）铺一次性无菌手术单和一次性无菌洞巾，并穿戴无菌手术衣和手套。

（4）采用膝关节内侧入路，切开皮肤和皮下组织，暴露并小心切开关节囊，手动使膝关节髌骨向外侧脱位，暴露出股骨滑车。

（5）使用直径为 2.5 mm 的角膜环钻，在股骨滑车中心区域小心钻取深度为 3 mm的缺损区域，并取出钻下的圆柱形骨软骨栓，制成股骨滑车的全层软骨和软骨下骨复合缺损。

（6）术后随机分为 4 组，每组 10 只。具体分组和处理如下：

1）空白对照组（Control，CTRL 组）：未做任何处理。

2）Hydrogel 组：植入 Hydrogel 水凝胶支架。

3）Bi-Hydrogel 组：植入软骨层和软骨下骨层分别含有 DCM 和 DBM 的 Bi-Hydrogel 复合仿生水凝胶支架（不含外泌体的复合支架）。

4）Bi-Hydrogel-Exos 组：植入含有人 ADSCs 外泌体的复合仿生水凝胶支架（含有外泌体的复合支架）。

（7）植入支架后小心复位关节，并屈伸活动膝关节 10 余次后观察以确保支架仍在处于缺损处，逐层缝合。

（8）手术后各实验动物不做任何外固定处理，术后自由活动和饮食，肌注青霉素，连续 3 天。

（9）在手术后第 1、2、3、6 和 12 周，取各组大鼠的眼球血。在手术第 6 和12 周后过量麻醉安乐死，取心、肝、脾、肺、肾和膝关节组织标本。

2.11 支架在体内毒性评估

2.11.1 血液学检测

（1）手术后第1、2、3、6 和12 周，取各组大鼠的眼球血。

（2）血常规检测：将 20 μL 体积的新鲜全血加入提前配置好的血液稀释液中，轻轻吹打混合均匀后，使用全自动血细胞分析仪（MEK-6410C，Nihon Kohden）检测血常规。

（3）取各时间点的全血于抗凝管中，4℃ 冰箱静置 1 h。在 3500 rpm/min 条件下4℃ 离心 15 min 后获得血清标本。保存于 ‒80℃ 备用。

（4）使用大鼠 IL-1 的 ELISA 检测试剂盒（RLB00，R&D Systems），按照说明书步骤检测各浓度标准品和各组血清样本在 450 nm 处的吸光度值。

（5）绘制标准曲线，根据测得的吸光度值计算各血清样本中 IL-1 的浓度。

2.11.2 脏器的组织学评估

使用 H&E 染色观察心、肝、脾、肺和肾的结构形态。H&E 染色方法参见 1.5.2。

2.12 影像学检测

2.12.1 MRI 检测

(1) 术后 6 和 12 周，使用过量麻醉对实验动物进行安乐死。

(2) 将大鼠膝关节固定在小动物专用核磁共振线圈内，核磁共振探头正对着髌骨。

(3) 根据膝关节冠状位和矢状位磁共振定位图像，调整膝关节位置保持髌骨和探头垂直。

(4) 对膝关节进行软骨序列扫描，每个标本采集时间约 20 min。

2.12.2 计算机断层扫描（computed tomography，CT）

（1）取膝关节股骨远端标本，剔除周围软组织，浸泡于 10% 中性甲醛溶液室温下固定 48 h。

（2）使用小动物专用 Inveon Micro-CT（Siemens，德国）对标本进行扫描。

（3）通过 Inveon Research Workplace 软件对扫描数据进行 3D 重建，并分析骨组织相关指标，包括：骨密度（bone mineral density，BMD）、骨体积/总体积（bone volume/ total volume，BV/TV）、骨小梁数量（trabecular number，Tb. N）和骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb. Th）。

2.13 再生组织的大体观察

(1) 在术后第 6、12 周处死动物后，获得膝关节股骨远端，将周围肌肉等附着的软组织剔除干净。

(2) 生理盐水冲洗后使用纱布擦干标本，然后观察修复区域大体观，并拍照记录。

(3) 由两名独立的参与者在双盲的情况，根据国际软骨修复协会（InterntionalCartilage Repair Society, ICRS）评分体系（表 1）进行评分。

表1软骨缺损修复大体观 ICRS 评分表

2.14 组织学评估

进行 H&E、甲苯胺蓝和免疫组织化学染色。参见 1.5。对组织学结果按照表2进行评分。

表2 软骨组织学评分

分类	分数
		（1）细胞形态
透明软骨	4
		大部分透明软骨	3
大部分纤维软骨	2
		大部分非软骨组织	1
无软骨组织	0
		（2）软骨基质染色
正常	3
		轻度下降	2
严重下降	1
		无染色	0
（3）表面规则度*
		光滑且规则（>3/4）	3
轻度不规则（>1/2–3/4）	2
		中度不规则（1/4–1/2）	1
重度不规则（<1/4）	0
		（4）软骨厚度
>2/3	2
		1/3–2/3	1
<1/3	0
		（5）再生组织与周围组织的融合性
双侧边缘愈合良好	2
		只有一侧边缘愈合良好	1
边缘无融合	0
		（6）总分	14

*代表再生的光滑软骨区域面积占与整个软骨缺损区面积的比例。

2.15 统计学分析

采用 SPSS 22.0 软件进行统计学分析，结果以（均数±标准差）表示。两组之间比较采用独立样本 T 检验分析。三组及以上比较时，先进行方差齐性检验，方差齐时采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）；方差不齐时采用非参数检验。当P < 0.05 时，认为结果具有统计学差异。

三、3D打印制备的含有外泌体的复合支架的实验结果

3.1 1H NMR 波谱分析

在明胶衍生物 GelMA 和透明质酸衍生物 OHA、HA-DA 合成后，通过 1H NMR 波谱分析各中材料的波普变化。由图1A可见，GelMA在5.3和5.5 ppm位置出现新信号，代表丙烯酸成功与明胶结合；在2.9 ppm处峰值降低和1.8 ppm位置出现的新信号代表了甲基的结合，证明本发明中GelMA的成功合成。如图1B所示，OHA中4.9和5.0 ppm处出现的新信号代表醛基结合到HA，说明OHA合成成功；HA-DA在6.7 ppm位置出现的新信号代表苯环的信号，2.76 ppm出现新信号表示临近苯环的-CH2基团，证明了多巴胺与HA成功结合形成HA-DA。

3.2 脱细胞基质的表征

收集关节软骨和软骨下的松质骨，经过脱细胞处理，分别获得软骨脱细胞基质DCM和骨组织脱细胞基质DBM。大体积观察发现，DCM相比脱细胞之前的正常软骨而言，整体较薄、较透亮（图2A）；而骨组织脱细胞之后，原有的残留血液消失，质地柔韧有弹性，可见疏松多孔样结构（图2B）。通过HE染色可见DCM和DBM中均无细胞和细胞碎片残留，而DAPI染色证明了DCM和DBM中的细胞核均消失不见（图2A和图2B），说明脱细胞过程有效去除了软骨和骨组织的细胞成分。DNA含量检测结果显示，DCM和DBM中DNA含量分别为14.2±1.7和22.0±3.6ng/mg（图2C），均低于脱细胞基质生物材料50ng/mg的标准。为了进一步评估脱细胞过程对软骨和骨组织成分的影响，本课题分别检测了GAG和胶原蛋白在两种组织脱细胞前后的含量。结果显示，DCM和DBM中GAG含量分别是正常软骨和骨组织中GAG含量的28.7%和44.5%（图2D），而DCM和DBM中胶原含量分别是正常软骨和骨组织中胶原含量的77.7%和70.6%（图2E）。

脱细胞基质材料生物墨水在37℃可以发生自组装形成胶状物并维持形状。随后，本发明在冰上调节 DCM和DBM两种生物墨水预凝胶的pH至中性，随后放入37℃孵箱30 min后，观察到DCM和DBM两种脱细胞基质均形成胶状物，倒置后基本可以维持形态（图2F）。随后，本发明采用流变仪进一步检测两种脱细胞基质生物墨水预凝胶的弹性模量G’和粘性模量G”随着温度改变的动态变化。结果显示，在15℃以下时，DCM和DBM预凝胶表现得更像液态物质，15℃后弹性模量G’开始明显升高，而37℃孵育一段时间后，流变性能表现为类似交联凝胶，弹性模量G’显著高于粘性模量G”（图2G）。

3.3 支架的表征

3.3.1支架的微观结构

各种生物墨水体系中GelMA占主要比例，因此均具有良好的可打印性能。打印的支架经过冷冻干燥后，通过扫描电子显微镜观察脱细胞基质对生物支架微观形貌的影响（图3）。由GelMA、HA-DA和OHA三种成分生物墨水打印出的Hydrogel支架线条表面比较光滑，可见凹凸起伏状形貌，而加入DCM或DBM两种脱细胞基质后，支架线条内可见明显的孔隙结构。说明DCM或DBM的添加可以显著改善支架线条的内部孔径，实现3D打印支架的“框架大孔”和“线条小孔”相结合。

3.3.2 傅里叶变换红外光谱分析

采用傅里叶变换红外光谱对本发明各种组分及打印的水凝胶支架进行了表征（图4），以确定支架的化学成分及结构变化。其中，1652 cm-1处峰代表酰胺（Amide）I区间的C=O，1534 cm-1处峰代表Amide II区间的N-H，1230 cm-1处峰代表Amide III区间的C-N。在OHA中可见1735 cm-1处出现信号峰，代表-CHO的引入，而在Hydrogel、Hydrogel-DCM和Hydrogel-DBM中该处信号峰均消失，提示-CHO和-NH2发生席夫碱反应，形成动态共价键网络。

3.3.3 支架的降解速率和溶胀检测

如图5A所示，Hydrogel、Hydrogel-DCM和Hydrogel-DBM三种水凝胶支架的72 h达到吸水量的平衡状态，吸水率分别为221.0%、187.8%和193.5%，表明DCM和DBM的添加可以而降低水凝胶的溶胀率。Hydrogel、Hydrogel-DCM和Hydrogel-DBM三种水凝胶支架在28天的降解率分别为77.9%、64.1%和60.0%（图5B），提示脱细胞基质的添加可以延缓支架的降解。

3.4 支架的生物相容性

将BMSCs种植于Hydrogel、Hydrogel-DCM和Hydrogel-DBM支架上，孵育24 h后，对各组支架进行Live/Dead染色（图6A）。通过激光共聚焦显微镜观察发现，三种支架上的BMSCs绝大多数表现为活细胞，仅仅可见个别死细胞。个别死细胞的出现符合细胞的正常生长周期。由此可见，三种支架均未发现明显的细胞毒性。

为了进一步观察BMSCs在支架上的分布情况和形态特征，本发明采用罗丹明‒鬼笔环肽和DAPI分别对细胞骨架和细胞核进行染色。激光共聚焦显微镜下观察发现，BMSCs种植于支架培养3d后，含有脱细胞基质的Hydrogel-DCM和Hydrogel-DBM支架上细胞沿支架线条分布均匀，细胞骨架呈现出方向一致的走形；而在Hydrogel支架，细胞沿支架分布出现聚集情况，细胞骨架形态相对杂乱（图6B）。以上结果提示脱细胞基质成分可以明显改善细胞在支架上的延展性能，促进细胞在立体微环境的均匀分布。

3.5 人ADSCs的鉴定

为了验证本发明中所提取的人髌下脂肪垫来源的ADSCs是否为MSCs，本发明进行了三系诱导分化试验和流式细胞术。如图7所示，油红O、茜素红和阿利新蓝染色阳性分别说明ADSCs具有成脂、成骨和成软骨分化能力，提示具备MSCs的多向分化潜能。流式细胞术检测细胞表面标志物发现CD34、CD45和HLA-DR阳性率分别为2.3%、2.1%和1.8%，均为阴性表达；而CD29、CD73、CD90和CD105阳性率分别为99.9%、100%、99.8%和99.9%，呈强阳性表达（图8）。以上结果说明本发明提取的人髌下脂肪垫来源的ADSCs符合MSCs特征。

3.6 人ADSCs来源的外泌体的鉴定

收集人ADSCs的细胞培养上清，通过差异离心法分离获得其外泌体。透射电子显微镜检测显示具有外泌体典型的“杯口状”或“圆盘状”结构（图9A）。纳米粒径分析检测发现提取的外泌体直径主要分布在160 nm以下，平均直径为140.3 nm（图9B），蛋白质免疫印迹实验结果显示分离的人ADSCs外泌体高表达外泌体特异性蛋白质标志物CD81、TSG101和ALIX，而内质网特异性蛋白质标志物Calnexin表达量很低（图9C）。

3.7 外泌体在脱细胞基质支架中的分布和缓释

随后，本发明将人ADSCs的外泌体添加到含有脱细胞基质的生物墨水中，旨在通过外泌体进一步增强含有脱细胞基质支架的生物学功能。通过激光共聚焦显微镜观察发现，被PKH67荧光染料标记的外泌体沿着支架线条均匀分布，而线条之间的黑色孔隙间接证明了所观察到支架的线条为外泌体发出的荧光（图10A和图10B）。通过缓释曲线可见，Hydrogel-DCM-Exos和Hydrogel-DBM-Exos两种外泌体支架均可以稳定释放外泌体长达24天以上（图10C）。

3.8 外泌体脱细胞基质支架对BMSCs活力的影响

将BMSCs种植于支架上1、3、5、7天后，采用CCK-8检测各组支架对细胞活力的影响，以第1天细胞活力作为参考。结果显示，各组支架均未见细胞毒性。第7天时，加入脱细胞基质的两种支架Hydrogel-DCM和Hydrogel-DBM上BMSCs的细胞活力显著高于Hydrogel组（P <0.01），而含外泌体的Hydrogel-DCM-Exos和Hydrogel-DBM-Exos支架上BMSCs的细胞活力显著高于其他三组（P < 0.001）（图11）。证明了脱细胞基质和外泌体的添加产生了协同效应，显著提高了细胞活力。

3.9 支架在体内的毒性检测

为了检测支架植入动物体内后是否引起毒性反应，本发明采集了术后各组实验动物第1、2、3、6和12周的全血。通过检测血常规，发现各组实验动物在手术后各时间点均未见未异常，各组之间没有统计学差异（图12）。使用ELISA方法检测血清中的炎性因子白介素1（interleukin-1，IL-1），结果发现在术后第1和2周各组实验动物血清中IL-1含量明显较高。在第3周IL-1继续下降并维持在较低的水平（图13）。同时，H&E染色结果显示，三种支架植入组的大鼠的心、肝、脾、肺和肾的组织学结构正常，与正常组和CTRL大鼠的组织学结果相似（图14）。以上结果共同表明，Hydrgel、Bi-Hydrgel和Bi-Hydrgel-Exos三种支架均不会引起动物体内明显的毒性反应，具有良好的生物相容性。

3.10 动物体内再生组织的影像学评估

采用MRI对关节缺损处的新生组织进行评估。由图15可见，术后第6周，CRTL组缺损大部分未被新生组织填充，Hydrogel组和Bi-Hydrogel组的修复效果好于CTRL组，但缺损处关节面仍然可见较大的空隙。在Bi-Hydrogel-Exos组中，新生组织修复厚度基本达到关节面水平，与周围正常软骨组织相连接。在术后第12周后，CRTL组缺损仍然没有完全被修复，Hydrogel组新生组织表面粗糙，较附近正常关节面低。Bi-Hydrogel组和Bi-Hydrogel-Exos组新生组织光滑，并且信号强度与相邻正常软骨的信号强度相似，说明缺损处新生组织主要为透明关节软骨。

为了评估缺损处软骨下骨的再生情况，本发明将术后6周和12周的标本进行CT检测，并对骨组织相关指标包括骨密度（bone mineral density，BMD）、骨体积/总体积（bonevolume / total volume，BV/TV）、骨小梁数量（trabecular number，Tb. N）和骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb. Th）进行定量分析。如图16A所示，术后6周和12周，植入支架的各组中新生骨均明显多于CTRL组。其中，Bi-Hydrogel组和Bi-Hydrogel-Exos组骨组织生成情况相比单纯支架的Hydrogel组更好。将CT数据经过定量分析后，结果显示各组支架植入组的骨组织再生显著优于CTRL组（图16B-图16E）。三组实验组相比较，Bi-Hydrogel组和Bi-Hydrogel-Exos组中Tb.N和Tb.Th显著高于Hydrogel组（图16D-图16E）。虽然术后6周和12周，Bi-Hydrogel-Exos组的各项指标均数高于Bi-Hydrogel组，但是仅观察到第12周两组间的Tb.N差异具有统计学意义（P < 0.05）（图16D）。以上结果说明，含有脱细胞基质的Bi-Hydrogel复合仿生支架和含有外泌体的Bi-Hydrogel-Exos复合仿生支架促进软骨下骨再生能力更强。

3.11 再生组织大体观察

术后第6周和12周结束后，对各组实验动物膝关节股骨滑车处缺损部位进行大体观察（图17A）。CTRL组在两个时间点缺损处均未见明显的透明软骨生成，提示2.5mm的临界尺寸软骨和软骨下骨缺损不能自行愈合。Hydrogel组在第6周仍可见较大缺损存在，而12周时候和周围正常软骨之间仍有明显的界限。在第6周，Bi-Hydrogel和Bi-Hydrogel-Exos两组缺损处均可见较多的透明软骨再生，但是缺损处仍然未达到完全修复；第12周时，两组均可见大量光滑的透明软骨生成，Bi-Hydrogel组缺损边界未完全消失，而Bi-Hydrogel-Exos组再生软骨组织与周围正常软骨融合，提示界面修复良好。大体观ICRS评分结果显示，Bi-Hydrogel和Bi-Hydrogel-Exos两组在第6和12周均显著高于CTRL和Hydrogel组，Bi-Hydrogel-Exos组还显著优于Bi-Hydrogel组（图17B）。

3.12 组织学评估

在术后第6周和第12周，对股骨远端标本进行组织学染评估缺损处组织的修复效果。在术后第6周，CTRL组仍可见较大的缺损存在，Hydrogel组可见较多支架残留在缺损处（图18A，黑色星号标记），Bi-Hydrogel组可见透明软骨软骨和软骨下骨组织再生，Bi-Hydrogel-Exos组再生软骨和周围软骨相连且损伤处软骨下骨修复良好（图18A）。在术后第12周，CTRL组缺损仍未完全被新生组织填充，Hydrogel组缺损处以纤维软骨修复为主，Bi-Hydrogel和Bi-Hydrogel-Exos组缺损处软骨和软骨下骨均修复良好，和周围正常组织结构相似，但是Bi-Hydrogel组再生透明软骨和周围软骨之间仍然伴有明显的界限（图18A），其中，与Bi-Hydrogel相比，Bi-Hydrogel-Exos的修复效果更佳。

甲苯胺蓝染色用来鉴定再生组织中透明软骨相关的GAG。结果显示，CTRL组和Hydrogel组缺损处再生组织在术后第6周和第12周均未被甲苯胺蓝着色，提示主要生成成分为纤维软骨；而Bi-Hydrogel组和Bi-Hydrogel-Exos组缺损处在术后12周染色情况和周围正常软骨基本相似，提示主要生成了透明软骨（图18B）。随后，本发明通过COL II免疫组织化学染色进一步评估再生组织的成软骨情况。同甲苯胺蓝染色结果类似，术后第12周，Bi-Hydrogel组和Bi-Hydrogel-Exos组均可见强表达的COL II蛋白质，而CTRL组和Hydrogel组再生组织的COL II表达均较低（图18C）。对再生组织进行组织学评分（图19），结果显示第6周和12周，Bi-Hydroge组和Bi-Hydrogel-Exos组数值均显著高于CTRL组和Hydrogel组数值，说明Bi-Hydrogel和Bi-Hydrogel-Exos仿生支架具有良好的软骨再生的效果。同时，在术后6周，Bi-Hydrogel-Exos组织学评分显著高于Bi-Hydrogel组（P <0.01），表明外泌体在修复早期具有增强脱细胞基质支架修复的作用。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (8)

1.一种复合支架，其特征在于，所述复合支架包含使用第一生物墨水和第二生物墨水通过3D打印制造的两个部分，所述第一生物墨水包含主体材料、软骨脱细胞基质和外泌体，所述第二生物墨水包含主体材料和骨脱细胞基质和外泌体；所述主体材料包含括甲基丙烯酸酐明胶、氧化的透明质酸和多巴胺修饰的透明质酸；所述第一生物墨水和第二生物墨水中外泌体的终浓度为 10 -1000μg/mL，所述外泌体来自间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述第一生物墨水和第二生物墨水中甲基丙烯酸酐明胶的质量比例为6%-12%。

3.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述第一生物墨水和第二生物墨水中氧化的透明质酸的质量比例为0.5-4%。

4.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述第一生物墨水和第二生物墨水中多巴胺修饰的透明质酸的质量比例为0.5-4%。

5.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述第一生物墨水和第二生物墨水还包含光引发剂。

6.如权利要求5所述的复合支架，其特征在于，光引发剂的质量比例为0.1-0.5%。

7.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述第一生物墨水包含质量比例9%的甲基丙烯酸酐明胶、质量比例2%的氧化的透明质酸、质量比例2% 的多巴胺修饰的透明质酸、质量比例2%的软骨脱细胞基质、和质量比例0.4%的光引发剂、以及浓度为100μg/mL的外泌体。

8.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述第二生物墨水包含质量比例9%的甲基丙烯酸酐明胶、质量比例2%的氧化的透明质酸、质量比例2% 的多巴胺修饰的透明质酸、质量比例2%的骨脱细胞基质、和质量比例0.4%的光引发剂、以及浓度为100μg/mL的外泌体。

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