CN115957378A - 一种骨修复组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种骨修复组合物及其制备方法和应用，所述制备方法是将GS经过多巴胺弱碱性溶液浸泡至变为黑褐色，随后取出材料，经去离子水反复浸泡冲洗，真空干燥，得到GS‑PDA，随后浸泡GS‑PDA于ADSCs‑Exos溶液中，经去离子水反复浸泡冲洗得到GS‑PDA‑Exos。本发明可与多种生物分子、药物等携带的羧基基团发生二次反应，从而达到材料表面再次修饰的目的，具有良好生物相容性的填充材料，还有易于存储、运输、制备等优势。
Description
技术领域
本发明属于医学骨修复技术领域，涉及一种骨修复组合物及其制备方法。
背景技术
骨缺损是由创伤等多种疾病引起的骨结构不全性疾病，严重危害了患者的生命健康。骨移植仍是临床治疗骨缺损的首选方法，由于自体骨移植及异体骨移植存在种种限制，研制新的人工骨移植材料十分重要。
现有骨移植替代材料仍存在许多不足，包括修复材料生物活性、生物相容性差。因间充质干细胞(MSCs)具有促进损伤组织修复再生的能力，其在骨组织工程与再生医学领域发挥重要作用。尽管使用“种子细胞”的骨组织工程材料具有很多优点，但随着研究深入，使用了“种子细胞”的材料也表现出很多缺点，如细胞存活率低，细胞自体复制及分化能力下降、时间延长，存在机体免疫排斥反应可能，同时MSCs还存在潜在的成瘤风险等，此外种子细胞的处理、存储、运输等技术问题也限制了种子细胞的应用。随着研究的深入，研究者发现间充质干细胞旁分泌作用在组织修复中发挥重要作用。其中外泌体(Exososmes，Exos)作为细胞旁分泌的重要组成部分成为研究的重点Exos由多囊泡体(multivesicularbodies，MVBs)与细胞膜结合后释放到细胞外的一种脂质包裹的囊泡。其内容物丰富，包括脂质、蛋白质、mRNAs、microRNAs等。体内多种细胞可分泌外泌体，根据细胞来源、微环境不同Exos内容物不完全一致。目前发现，Exos具有很多生物学功能，包括参与细胞间信号传递、物质运输、代谢等，分泌至细胞外的Exos可在局部调控周围细胞或进入血液到达身体其他部位参与远距离调控，如果能将Exos使用到骨修复领域就能避免直接使用种子细胞、细胞及生长因子带来的多种风险。
但是现有技术中还没有将外泌体应用到骨修复的技术，骨修复现在的人工材料修复材料生物活性、生物相容性差亟待解决。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种骨修复组合物及其制备方法和应用，构建了新型脂肪间充质干细胞来源的外泌体/聚多巴胺/明胶海绵复合材料(GS-PDA-Exos)，为骨缺损治疗提供新的选择。外泌体(Exos)相比现有人工骨修复材料更加易于存储、运输、制备等优势；由动物胶原蛋白通过水解制备获得的明胶海绵(GS)为骨修复材料提供了很好的生物相容性、生物可降解性等；聚多巴胺(PDA)涂层的强粘附性，可粘附于多种材料表面，可对材料表面进行二次修饰。
具体的，一方面，本发明提供了一种骨修复组合物制备方法，所述制备方法为：GS(明胶海绵)经过多巴胺(DA)弱碱性溶液浸泡至变为黑褐色，随后取出材料，经去离子水反复浸泡冲洗，真空干燥，得到GS-PDA(明胶海绵/聚多巴胺)，随后浸泡GS-PDA于ADSCs-Exos溶液中，经去离子水反复浸泡冲洗得到GS-PDA-Exos(外泌体/聚多巴胺/明胶海绵复合材料)。
具体的，本发明所述GS呈多孔结构，孔径100μm-300μm，纤维表面光滑。
优选的，本发明所述ADSCs-Exos溶液制备方法为：从脂肪抽吸物中取出毛细血管，用磷酸盐缓冲溶液冲洗并切碎，并用胶原酶在低温下消化，过滤消化后的物质，将混合物在室温下离心，弃去上清液；收集的细胞用PBS洗涤，离心后重悬于含有胎牛血清和青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中，在CO2气氛下培养；当细胞传过3代后，获得需要的含有脂肪间充质干细胞的无血清细胞培养基；
通过系列离心和过滤步骤从无血清细胞培养基中纯化源自ADSCs的外泌体。
更进一步的，本发明将收集的所述含有脂肪间充质干细胞的无血清细胞培养基上清液以300g离心10分钟以去除死细胞，以5000g离心10分钟以去除细胞碎片，然后将上清液通过0.22μm过滤器过滤，并以120,000g离心90分钟，将最终颗粒重新悬浮在1mLPBS中并在-80℃储存备用。
具体的，本发明所述明胶海绵将浸泡在2mg/mL、pH8.5的多巴胺溶液中，在37℃下振荡孵育24小时形成聚多巴胺涂层GS-PDA，将GS-PDA在装有蒸馏水的超声波清洗机中轻轻摇动5次后，干燥并用环氧乙烷灭菌，然后将GS-PDA放置在5mg/mL卵磷脂、1mg/mL磷脂及10mg/L珊瑚粉溶液中孵育过夜，随后将获得产物放置在ADSCs-Exos溶液中，在37℃下摇动12小时获得GS-PDA-Exos支架，将GS-PDA-Exos支架在装有蒸馏水的超声波清洗器中轻轻摇动5次从而得到所述骨修复组合物。
更加具体的，本发明所述多巴胺溶液采用10毫升Tris-HCl溶解多巴胺制备获得pH为8.5缓冲溶液。
另外一方面，本发明还提供了一种骨修复组合物，所述骨修复组合物支架为明胶海绵，明胶海绵上设置有聚多巴胺涂层，聚多巴胺涂层上设置有脂肪间充质干细胞来源的外泌体。
具体的，本发明每个所述骨修复组合物中含有1010个脂肪间充质干细胞来源的外泌体颗粒。
第三方面，本发明的骨修复组合物结合其他药物能够促进骨修复。
第四方面，骨修复组合物在制备骨修复器械方面的应用。
本发明有益效果：
本发明采用的间充质干细胞来源的Exos在骨骼、肺、肝脏、肾脏、皮肤等多种组织修复中发挥重要作用。Exos可以促进人BMSCs成骨分化。MSCs来源的Exos通过促进血管、骨组织形成修复骨缺损，BMSCs来源的Exos在骨折的愈合过程中发挥重要作用。
本发明Exos的使用避免了直接使用种子细胞、细胞及生长因子带来的多种风险，而且Exos还有易于存储、运输、制备等优势。
本发明使用1010外泌体颗粒附着与聚合中，该数量级的外泌体可有效促进骨组织修复。
本发明的聚多巴胺涂层PDA可修饰在几乎所有有机和无机基材表面，同时具有非常好的生物相容性，还可再次修饰，PDA涂层在形成过程中会残留大量氨基基团，这些氨基可与多种生物分子、药物等携带的羧基基团发生二次反应，从而达到材料表面再次修饰的目的。
本发明具有良好生物相容性的填充材料。
附图说明
图1为本发明GS-PDA-Exos组合物的形态图；
图2为本发明扫描电镜观察材料表面形貌图；
图3为本发明实施例Micro-CT2D重建显示各组骨缺损部位愈合情况；
图4为本发明实施例Micro-CT3D重建显示各组骨缺损部位愈合情况；
图5为本发明实施例六各组3D模型ROI区域内的BMD量；
图6为本发明实施例六各组3D模型ROI区域内的BV/TV含量；
图7为本发明实施例六各组3D模型ROI区域内的Tb.Th量；
图8为本发明实施例六各组3D模型ROI区域内的Tb,Sp量；
图9为本发明实施例六苏木素-伊红(HE)染色观察骨缺损部位组织愈合情况；
图10为本发明实施例三GS-PDA-EXO材料释放Exos情况；
图11为本发明实施例五光学显微镜下观察P0及P3代ADSCs；
图12为本发明实施例五NTA仪观察ADSCsExos。
图2中，A和B为GS扫描电镜观察材料表面形貌图，C和D为GS-PDA扫描电镜观察材料表面形貌图，E和F为GS-PDA-Exos扫描电镜观察材料表面形貌图；
图3中，A、B、C、D为两周的骨缺损部位愈合情况，E、F、G、H为四周的骨缺损部位愈合情况；
图4中，A、B、C、D为两周的骨缺损部位愈合情况，E、F、G、H为四周的骨缺损部位愈合情况。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本申请做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
以下实施方式中所用材料、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域常规材料、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
实施例一：本发明脂肪间充质干细胞来源的外泌体/聚多巴胺/明胶海绵(GS-PDA-Exos)的制备
如说明书附图1所示：
GS呈乳白色多孔状结构，经过多巴胺弱碱性溶液24h浸泡，GS在溶液中逐渐由乳白色变为黑褐色，随着浸泡时间增加黑褐色逐渐加深。直至材料完全变为黑褐色，随后取出材料，经去离子水反复浸泡冲洗5次，真空干燥，得到GS-PDA。随后浸泡于ADSCs-Exos溶液中，经去离子水反复浸泡冲洗5次后得到GS-PDA-Exos。
实施例二：脂肪间充质干细胞来源的外泌体/聚多巴胺/明胶海绵组合物的构建
将明胶海绵浸泡在采用Tris-HCl缓冲溶液配置的2mg/mL、pH8.5多巴胺(DA)溶液10毫升中，在37℃下振荡孵育24小时形成聚多巴胺(PDA)涂层，将明胶海绵/聚多巴胺(GS-PDA)支架在装有蒸馏水的超声波清洗机中轻轻摇动5次。将GS-PDA支架干燥并用环氧乙烷灭菌。然后将GS-PDA支架放置在ADSCs-Exos溶液(1010个外泌体颗粒/支架)中，在37℃下摇动12小时。将GS-PDA-Exos支架在装有蒸馏水的超声波清洗器中轻轻摇动5次从而得到本发明组成物。
实施例三：脂肪间充质干细胞来源的外泌体/聚多巴胺/明胶海绵组合物的构建
和实施例二不同是将每个GS-PDA支架放置在含有108外泌体颗粒的ADSCs-Exos溶液中或者将每个GS-PDA支架放置在含有1011外泌体颗粒的ADSCs-Exos溶液中。108结合外泌体数量下降，无促骨形成效果。1011以上可能导致过度成果，出现并发症。
如说明书附图10所示，通过酶标仪测定，计算不同时间浸润液中Exos颗粒数量，结果得出，在12h内Exos释放逐渐增加，速率较高，至72h后，GS-PDA-Exos材料仍持续释放Exos颗粒，直至168h，Exos持续释放，但速率趋缓。
实施例四：脂肪间充质干细胞来源的外泌体/聚多巴胺/明胶海绵组合物的构建
将实施例二灭菌后的GS-PDA放置在5mg/mL卵磷脂、1mg/mL磷脂及10mg/L珊瑚粉溶液中孵育过夜，随后将获得产物放置在ADSCs-Exos(1010个颗粒/支架)溶液中，在37℃下摇动12小时获得GS-PDA-Exos支架，将GS-PDA-Exos支架在装有蒸馏水的超声波清洗器中轻轻摇动5次从而得到所述骨修复组合物。
通过对多巴胺的接枝率检测，本发明实施例四的多巴胺的接枝率为81％，没有在5mg/mL卵磷脂、1mg/mL磷脂及10mg/L珊瑚粉溶液中孵育过夜处理的多巴胺的接枝率为35％。对于没有经过5mg/mL卵磷脂、1mg/mL磷脂及10mg/L珊瑚粉溶液处理的，每个GS-PDA支架放置在含有1011外泌体颗粒的ADSCs-Exos溶液中接枝率为37％，每个GS-PDA支架放置在含有108外泌体颗粒的ADSCs-Exos溶液中接枝率为25％。
实施例五：本发明脂肪间充质干细胞外泌体的提取
脂肪间充质干细胞(ADSCs)提取：从脂肪抽吸物中取出毛细血管，用磷酸盐缓冲溶液冲洗并切碎，并用1％胶原酶在37℃下消化1小时。过滤后，将混合物在室温下离心(1000rpm，10分钟)，弃去上清液。收集的细胞用PBS洗涤，离心(1000rpm，5分钟)，然后重悬于含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基(PS)在37℃、5％CO2中培养；当细胞传过3代后，它们被鉴定并用于后续使用。
脂肪间充质干细胞外泌体的提取：通过系列离心和过滤步骤从无血清细胞培养基中纯化源自ADSCs的外泌体。具体为，将收集的上清液以300g离心10分钟以去除死细胞，以5000g离心10分钟以去除细胞碎片。然后将上清液通过0.22μm过滤器过滤，并以120,000g离心90分钟，将最终颗粒重新悬浮在1mLPBS中并在-80℃储存。
如说明书图12所示，根据纳米颗粒追踪分析Exos，A：ADSCs-Exos的直径主要分布于80-180nm之间，峰值为122.1nm；B：可视观察Exos颗粒可见液体中ADSCs-Exos颗粒。
实施例六：动物实验
手术造模过程：
实验动物称重后，腹膜内注射2.5％戊巴比妥钠(40mg/kg)，麻醉后取平卧位固定，左侧后肢膝关节处去毛、消毒。取膝关节内侧纵行切口，逐层进入，暴露股骨远端，使用直径3.0mm钻头，沿膝关节内侧髁中央水平缓慢钻入，方向与股骨纵轴垂直，制造一贯穿内外侧髁的直径3.0mm的骨缺损隧道。钻入过程中使用冰生理盐水持续冲洗、降温。随后大量生理盐水反复冲洗骨缺损隧道，根据分组植入GS材料、GSPDA材料及GS-PDA-Exos材料，对照组无材料植入。使用3-0可吸收锋线逐层关闭切口。术毕，将各组实验动物分笼饲养，每日给予正常饲料、饮水，并观察动物生长、活动及切口情况。分别在术后2w、4w时，每组随机选取3只实验动物，在麻醉下处死，观察手术切口是否愈合，有无红肿、破溃等感染表现，随后收集左侧后肢股骨标本，剥离软组织，观察骨缺损区域生长情况。
Micro-CT检测骨缺损部位愈合情况：
截取取材的股骨标本远端1/2，置于4％多聚甲醛中48h进行固定，取出标本。
置入Micro-CT检测管中，四周使用棉球固定。使用Micro-CT扫描标本区域，分辨率12μm。使用Mimics17.0进行数据分析，3D重建并选定直径3mm的骨缺损区域为感兴趣区域(Regionofinterest，ROI)。统计并分析骨矿物质密度(Bonemineraldensity，BMD)、骨小梁厚度(Trabecularthickness，Tb.Th)、骨小梁分离度(trabecularseparation/spacing，Tb,Sp)、骨体积分数(Bonevolumedensity/totaltissuevolume，BV/TV)等参数。
标本苏木素-伊红(HE)染色观察骨缺损部位组织愈合情况：
(1)使用流水冲洗4％多聚甲醛中固定48h的股骨远端1/2标本。
(2)随后置于10％EDTA脱钙液中脱钙2w，隔日更换脱钙液。
(3)将标本置于流水中，冲洗过夜，以冲洗净残留EDTA。
(4)梯度酒精脱水，二甲苯透明后石蜡包埋。
(5)沿股骨矢状面进行连续切片，厚度5μm。
(6)将石蜡浸于二甲苯中脱蜡，5遍各10min。
(7)依次置于无水乙醇I、II各5min，95％乙醇I、II各5min，80％乙醇5min，70％乙醇5min，蒸馏水3min，进行水化。
(8)进行苏木素染色，将切片置于Harris苏木素液中5min，水洗后使用0.5％盐酸酒精溶液分色3-5s，镜下观察，水洗5～10min至充分蓝化。
(9)进行伊红染色，切片置于95％乙醇伊红液中3～30s，分别浸于95％乙醇I、II，无水乙醇I、II中各5min，二甲苯中透明，2遍各1min。
(10)中性树胶封片。
结果分析：
构建大鼠股骨骨缺损模型分别将支架植入缺损处比较不同材料对于骨缺损局部修复的作用。在2周、4周取材并进行Micro-CT扫描设定骨缺损直径3mm的区域为ROI，通过2D、3D重建观察ROI中新生骨情况。如说明书附图3和附图4所示，显示在2w时CON组ROI外周部位仅有极少量新生骨出现，GS、GS-PDA组可在ROI区域外周见部分新生骨出现，GS-PDA-Exos组ROI中心区域已出现少量新生骨组织，而缺损部位外围则有部分新生骨出现。4w时CON组ROI外围出现部分新生骨，但ROI区域仍有明显缺损，这表明构建的股骨缺损大小超出了其骨组织本身的自愈能力。从附图3和附图4中的F和G可以看出，GS、GS-PDA组ROI内部已看见少量疏松的新生骨组织，仅有部分区域存在缺损。GS-PDA-Exos组ROI区域内部已可见大量新生骨，骨量较多，结构较为紧密。
如图5-8所示，本实施例通过计算各组3D模型ROI区域内的BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb,Sp可以看出，CON组在2w、4w时BMD、BV/TV、Tb.Th均最小同时Tb,Sp最大。GS、GS-PDA、GS-PDA-Exos组BMD、BV/TV、Tb.Th均显著高于同时间点CON组，Tb,Sp低于CON组。其中各时间点GS-PDA-Exos组BMD、BV/TV、Tb.Th均最高，Tb,Sp最低。这表明，GS、GS-PDA材料的填充有助于骨缺损的修复，同时连接ADSCs-Exos后的GS-PDA-Exos材料可显著促进骨缺损的修复。
如图9所示，术后4w的实验动物处死，取材后进行HE染色，结果显示，CON组在缺损区域外围有部分新生骨出现，但内部无明显骨质，仅有少量纤维组织，这表明骨缺损的大小超出了其正常的修复能力，骨缺损无法自行愈合(如图9中的A)。GS、GS-PDA组缺损区域均可见部分新生骨出现，骨结构较为疏松，骨量较少，同时可见部分材料纤维残留(如图9中的B、C)。GS-PDA-Exos组缺损区域可见大量新生骨出现，同时新生骨紧紧围绕在内部少量残余的GS-PDA-Exos材料周围，这表明GS-PDA-Exos材料具有显著的促新生骨形成的能力。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种骨修复组合物制备方法，其特征在于，所述制备方法为：GS经过多巴胺弱碱性溶液浸泡至变为黑褐色，随后取出材料，经去离子水反复浸泡冲洗，真空干燥，得到GS-PDA，随后浸泡GS-PDA于ADSCs-Exos溶液中，经去离子水反复浸泡冲洗得到GS-PDA-Exos。
2.如权利要求1所述的骨修复组合物制备方法，其特征在于，所述GS呈多孔结构，孔径100μm-300μm，纤维表面光滑。
3.如权利要求1所述的骨修复组合物制备方法，其特征在于，所述ADSCs-Exos溶液制备方法为：从脂肪抽吸物中取出毛细血管，用磷酸盐缓冲溶液冲洗并切碎，并用胶原酶在低温下消化，过滤消化后的物质，将混合物在室温下离心，弃去上清液；收集的细胞用PBS洗涤，离心后重悬于含有胎牛血清和青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中，在CO2气氛下培养；当细胞传过3代后，获得需要的含有脂肪间充质干细胞的无血清细胞培养基；
通过系列离心和过滤步骤从无血清细胞培养基中纯化源自ADSCs的外泌体。
4.如权利要求3所述的骨修复组合物制备方法，其特征在于，将收集的所述含有脂肪间充质干细胞的无血清细胞培养基上清液以300g离心10分钟以去除死细胞，以5000g离心10分钟以去除细胞碎片，然后将上清液通过0.22μm过滤器过滤，并以120,000g离心90分钟，将最终颗粒重新悬浮在1mLPBS中并在-80℃储存备用。
5.如权利要求1所述的骨修复组合物制备方法，其特征在于，所述明胶海绵将浸泡在2mg/mL、pH8.5的多巴胺溶液中，在37℃下振荡孵育24小时形成GS-PDA，将GS-PDA在装有蒸馏水的超声波清洗机中轻轻摇动5次后，干燥并用环氧乙烷灭菌，然后将GS-PDA放置在5mg/mL卵磷脂、1mg/mL磷脂及10mg/L珊瑚粉溶液中孵育过夜，随后将获得产物放置在ADSCs-Exos溶液中，在37℃下摇动12小时获得GS-PDA-Exos支架，将GS-PDA-Exos支架在装有蒸馏水的超声波清洗器中轻轻摇动5次从而得到所述骨修复组合物。
6.如权利要求5所述的骨修复组合物制备方法，其特征在于，所述多巴胺溶液采用10毫升Tris-HCl溶解多巴胺制备获得pH为8.5缓冲溶液。
7.如权利要求1-6任一项所述骨修复组合物制备方法制备获得的骨修复组合物，所述骨修复组合物支架为明胶海绵，明胶海绵上设置有聚多巴胺涂层，聚多巴胺涂层上设置有脂肪间充质干细胞来源的外泌体。
8.根据权利要求7所述的骨修复组合物，其特征在于，每个所述骨修复组合物中含有1010个脂肪间充质干细胞来源的外泌体颗粒。
9.如权利要求1-6任一项所述骨修复组合物制备方法制备获得的骨修复组合物在制备骨修复药物方面的应用。
10.如权利要求1-6任一项所述骨修复组合物制备方法制备获得的骨修复组合物在制备骨修复器械方面的应用。
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