CN109939269A - 一种血管支架材料表面修饰方法、及其修饰后得到的血管支架材料和应用 - Google Patents

Abstract

一种血管支架材料表面修饰方法、及其修饰后得到的血管支架材料和应用，属于心血管支架材料表面修饰技术领域，本发明的反应过程与机理主要分为两个部分。第一部分为材料表面多巴胺（简称PDA）聚合薄膜的沉积。首先多巴胺在有氧、碱性条件下可以引发温和的自聚‑交联反应，可与材料发生螯合和自聚合反应，形成稳定的多巴胺聚合物薄膜。第二部分为PDA薄膜表面外泌体的修饰。将沉积有PDA薄膜的材料浸没在外泌体悬液中，反应一段时间即可得到聚多巴胺/外泌体修饰层。由于外泌体带正电属性，可与带负电荷的PDA薄膜发生静电作用，因此所构建的聚多巴胺/外泌体修饰层可与材料稳定结合。

Description

一种血管支架材料表面修饰方法、及其修饰后得到的血管支 架材料和应用

技术领域

本发明属于心血管支架材料表面修饰技术领域，具体涉及一种血管支架材料表面修饰方法、及其修饰后得到的血管支架材料和应用。

背景技术

心血管支架材料表面改性技术发展至今，已逐渐趋于成熟，并广泛应用于临床。但目前临床上所用材料表面疗效，远未达到预期目标。这主要是由于材料表面内皮化延迟或不完整等症状导致的植入晚期血栓和再狭窄等问题。通过在材料表面制备特异性功能修饰层，赋予材料良好的内皮化功能是解决这一难题的有效手段。

要在多种不同心血管支架材料上构建普适性功能层，就需要选择能与多种材料结合的有机分子，在这些材料表面富集结合位点。目前作为表面修饰领域研究热点的聚多巴胺薄膜就可作为连接材料和上层功能分子的活性基团过渡层。多巴胺（Dopamine）是一种脑内极其重要的神经递质，在有氧、碱性条件下可以引发温和的自聚-交联反应，可与几乎任何固体材料发生螯合和自聚合反应，形成稳定的多巴胺聚合物薄膜（PDA）。PDA表面带负电荷可与正电荷的生物分子或颗粒通过静电作用结合，同时PDA本身也具备较好的内皮细胞相容性。基于此，提出在材料表面制备带负电的多巴胺聚合薄膜的方法为正电属性的功能分子或颗粒提供结合位点。

大量研究表明健康血液与内皮细胞，干细胞与内皮细胞，收缩型平滑肌细胞与内皮细胞，以及内皮细胞间的物质与信号交换是维持血管内膜结构与功能完整的细胞学基础，而健康血液、干细胞、血管内皮细胞、收缩型平滑肌细胞等来源的外泌体，正是它们物质与信号交流的分子基础。外泌体，粒径尺寸一般介于40nm-150nm，可进入内皮细胞内部，外泌体中包含着来源细胞的DNA、RNA等遗传物质，以及对应的蛋白质、肽段、抗原等生物因子，可在进入内皮细胞后更直观快速地给予内皮细胞外部周细胞环境释放的良性信号，显著缩短细胞与细胞间交流的级联反应路径，可迅速调控内皮细胞活性和功能，促进材料表面快速内皮化。

综上所述，通过PDA薄膜的沉积和外泌体（健康血液、干细胞、血管内皮细胞、收缩型平滑肌细胞来源）的进一步修饰可制备一种促进材料表面内皮化的修饰层。目前尚无相关报道。

发明内容

本发明的目的在于通过表面改性/修饰促进心血管支架材料内皮化功能而提供一种血管支架材料表面修饰方法、及其修饰后得到的血管支架材料和应用。

本发明实现以上目的采用的技术方案是：

一种血管支架材料表面修饰方法，具体包括如下步骤：

（1）制备多巴胺修饰层

将血管支架材料浸没于盐酸多巴胺溶解液中，20~40℃下共聚合沉积不少于12h，优选12~28h，然后取出沥干；

所述盐酸多巴胺溶解液为溶解有盐酸多巴胺的Tris缓冲液；盐酸多巴胺浓度为2.0mg/ml- 3.0mg/ml；

（2）沉积外泌体层

将步骤（1）中沉积有多巴胺修饰层的血管支架材料置于外泌体悬液中，4℃~37℃反应不少于10min，优选6~36h；反应结束后，冲洗干净即可；

所述外泌体悬液中，外泌体浓度为25µg/ml-200µg/ml。

优选地，步骤（2）中，所述外泌体为来源于血液血清或干细胞、内皮细胞或收缩型平滑肌细胞分泌物的具有标志蛋白CD63和HSP70的蛋白的提取颗粒；所述外泌体粒径尺寸为40nm-150nm。

优选地，所述血管支架材料为镁合金、不锈钢、Ti合金、镍钛合金、可降解聚乳酸或高分子量聚乙二醇。

更优选地，步骤（1）中血管支架材料为316L不锈钢，盐酸多巴胺浓度为2.3~2.6mg/ml，步骤（2）中，外泌体浓度25~50 µg/ml。

更优选地，步骤（1）中血管支架材料为聚乳酸，盐酸多巴胺浓度为2.0mg/ml，步骤（2）中，外泌体浓度100 µg/ml。

更优选地，步骤（1）中血管支架材料为Ti合金，盐酸多巴胺浓度为2.8mg/ml，步骤（2）中，外泌体浓度40 µg/ml。

更优选地，步骤（1）中血管支架材料为Mw3000～20000的聚乙二醇，盐酸多巴胺浓度为2.4mg/ml，步骤（2）中，外泌体浓度60 µg/ml。

更优选地，步骤（1）中血管支架材料为镍钛合金，盐酸多巴胺浓度为3.0mg/ml，步骤（2）中，外泌体浓度80 µg/ml。

优选地，所述Tris缓冲液pH值为7.5-9.0。

优选地，PBS缓冲液的pH为7.4。

上述血管支架材料表面修饰方法所制备的血管支架材料。

所述血管支架材料可用于制备血管支架。

本发明的反应过程与机理主要分为两个部分。第一部分为材料表面多巴胺（简称PDA）聚合薄膜的沉积。首先多巴胺在有氧、碱性条件下可以引发温和的自聚-交联反应，可与材料发生螯合和自聚合反应，形成稳定的多巴胺聚合物薄膜。第二部分为PDA薄膜表面外泌体的修饰。将沉积有PDA薄膜的材料浸没在外泌体悬液中，反应一段时间即可得到聚多巴胺/外泌体修饰层。由于外泌体带正电属性，可与带负电荷的PDA薄膜发生静电作用，因此所构建的聚多巴胺/外泌体修饰层可与材料稳定结合。

此外，PDA表面富集的胺基有助于临近内皮细胞向其表面迁移以及内皮祖细胞向其表面附着。但PDA表面同样会诱导合成型平滑肌细胞向其表面迁移与增殖，干扰表面内皮化。特定来源的外泌体，例如健康血液、干细胞、血管内皮细胞、收缩型平滑肌细胞的外泌体，不仅促进内皮细胞向其表面迁移和增殖，还可调控迁移的平滑肌细胞表型收缩，抑制其过度增殖。目前已有研究报道干细胞外泌体作为注射药物用于心脑血管相关疾病检测和治疗，但与表面改性技术相结合用于心血管支架表面修饰层制备的研究尚未见报道。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

一、在体外材料表面制备出包含粒径小于150nm颗粒的功能特异性修饰层，该颗粒中包含来源细胞的DNA、RNA、特异性蛋白质，肽段和抗原等生物因子。通过该方法，可以显著促进材料表面内皮化，有效抑制介入晚期的血栓和增生等病症。

二、该多功能修饰层的制备工艺简单易操作，无需昂贵复杂的设备，工艺成本较低，效果显著。

三、特定来源外泌体的存在不仅能在细胞层面显著促进表面内皮细胞的覆盖率，同时通过快速进入细胞内部，使周细胞环境的良性信号直接作用于靶细胞内部，显著缩短了细胞层面级联反应时间，进一步完善心血管支架材料表面修饰层的功能，为该生物化表面开辟更加广泛的应用前景。

附图说明

图1为人血源的外泌体（Exosomes）特征表述。其中，图1a为表征外泌体形貌所用的透射电镜(TEM)照片(标尺为100nm)，可以清晰的看到茶杯托状的颗粒，是外泌体的典型形貌；图1b是外泌体的标志蛋白CD63和HSP70的蛋白印迹(Western Blot，WB) 的测试结果(n=3)，结果显示所用外泌体的CD63和HSP70均有高表达；图1c是所用外泌体的纳米粒子跟踪分析 （Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)的测试结果，提示提取颗粒的粒径符合外泌体的基本特征。

图2为316L医用不锈钢、聚多巴胺修饰的材料(PDA)和制备有聚多巴胺/外泌体复合修饰层的材料(PDA/Exosome、PDA-EXO)表面(a)原子力显微镜图和(b)水接触角检测结果。可以发现外泌体确实连接到了聚多巴胺膜层表面。从水接触角结果可以发现，无论是基体材料还是膜层，均具有良好的亲水性。

图3为左旋聚乳酸（PLLA）表面、聚多巴胺修饰的材料(PDA)和制备有聚多巴胺/外泌体复合修饰层的材料(PDA/Exosome)表面外泌体PKH26特异性荧光染色结果和荧光强度三维成像结果(三维空间柱体越高，代表荧光强度越大，修饰的外泌体越多)：

图4为316L医用不锈钢、聚多巴胺修饰的材料(PDA)和制备有聚多巴胺/外泌体复合修饰层的材料(PDA/Exosome)表面血管内皮细胞(a)CD31特异性荧光染色结果（标尺为50um）和（b）视野内部内皮细胞计数柱状图（n=3）。从结果可以发现，PDA/Exosome表面内皮细胞数量和功能都高于于其它材料表面，证明其具有良好的促表面内皮化功能。

图5为Ti合金、聚多巴胺修饰的材料(PDA)和制备有聚多巴胺/外泌体复合修饰层的材料(PDA/Exosome)表面血管内皮细胞迁移结果。图5a为光镜照片(两条虚线之间为无细胞空白表面，虚线之间距离越短证明内皮细胞在表面迁移功能越好)；图5b为以划痕闭合的百分比表示的迁移率（n=3）。PDA/EXO膜层表面的内皮细胞的迁移率明显高于基体材料以及PDA膜层材料。

图6为高分子量聚乙二醇（(Mw3000～20000)）材料表面、聚多巴胺修饰的材料(PDA)和制备有聚多巴胺/外泌体复合修饰层的材料(PDA/EXO层)表面血管内皮细胞分别培养4小时和3天后释放的一氧化氮(NO)检测结果；

图7为制备有聚多巴胺/外泌体复合修饰层 (PDA/Exosome)的镍钛合金表面的外泌体进入血管内皮细胞后的激光共聚焦图片（标尺为20um）：a)为首先在细胞培养基中加入抑制剂Dynasore，再加入到膜层表面进行培养；b)将细胞直接加入膜层表面进行培养。红色荧光由外泌体膜特异性因子PKH26表达，蓝色荧光是血管内皮细胞核染色区域。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的方法作进一步详细的说明。

下述实施例中涉及的PBS缓冲液均为pH=7.4、浓度为10mM的PBS缓冲液。培养箱条件为稳定的温度（37℃）、稳定的CO2水平（5%）、恒定的酸碱度（pH值：7.2-7.4）、较高的相对饱和湿度（95%）。该实例中所使用的外泌体提取试剂均来自SBI公司的ExoQuick以及ExoQuick-TC。α-MEM购自Gibco 公司， DMEM培养基购自ThermoFisher，α-MEM和DMEM直接使用时称为条件培养基，牛胎儿血清（FBS）购自BI，青链霉素混合液（×100）购自索莱宝，将牛胎儿血清和青链霉素混合液按比例加入α-MEM 或DMEM时称为正常培养基，下文中没有特别提示时，使用的均为该种培养基。CD31抗体、CD63抗体及HSP70抗体以及对应二抗购自Abacm，PKH26购自Sigma，Dynasore购自Abmole。ELISA试剂盒测试NO释放，购自索莱宝。BCA蛋白测试试剂盒购自碧云天。使用的骨髓间充质干细胞（MSC）购自中科院上海细胞库，以及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）购自ATCC(USA)，人血液采集自身体健康的志愿者。

实施例1

参见图1，本发明的第一种具体实施方式是人血源外泌体的提取以及鉴定。

提取血液的外泌体步骤如下：

1. 不抗凝普通采血管（红头管）采集人血后，4℃静置1h。凝血结束后，将真空采血管置于离心机中离心，离心条件为：转速3000rpm，5分钟，室温。

2.血清分装入1.5mL离心管，每支0.5mL，后3000g 15min 室温离心，取上清；

3.每250µL滴加63µL Exoquick（SBI）混匀

4.4℃下静置孵育30min

5.1500g低速离心30 min

6.去上清后，1500g 5min离心

7.PBS溶解沉淀物 -80℃保存

将取得的外泌体分别进行透射电镜观察，进行标志蛋白CD63和HSP70的蛋白印迹(Western Blot，WB) 的测试以及纳米粒子跟踪分析 （Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)的测试，结果如图1所示。图1a为表征外泌体形貌所用的透射电镜(TEM)照片，可以清晰的看到茶杯托状的颗粒，是外泌体的典型形貌；图1b是外泌体的标志蛋白CD63和HSP70的蛋白印迹(Western Blot，WB) 的测试结果，结果显示所用外泌体的CD63和HSP70均有强烈表达；图1c是所用外泌体的纳米粒子跟踪分析 （Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)的测试结果，结果显示所用外泌体的粒径分布于100nm左右，可进入细胞内部（<150nm），带正电荷，可以静电结合的方式修饰在PDA表面。

该提取步骤同时可以提取动物血液的外泌体。

实施例2

一种在316L医用不锈钢表面制备促进表面内皮化的聚多巴胺/外泌体修饰层的方法，其制备步骤为：

步骤一：在抛光的316L不锈钢表面制备多巴胺膜层：将46mg盐酸多巴胺溶解在20ml、pH值8.5的Tris缓冲液中，浸没材料，20℃下共聚合沉积24h，

步骤二：316L不锈钢表面的聚多巴胺/外泌体复合修饰层：将步骤一所得的覆盖有聚多巴胺膜层的316L不锈钢，浸没在浓度为50 µg/ml的外泌体（来源：实施例1所得外泌体）PBS悬液中，25℃反应12h，反应完毕后吸除残余反应液，用PBS洗净未固定的外泌体颗粒。

将经过抛光的316L不锈钢、步骤一所得的316L不锈钢表面的聚多巴胺膜层以及步骤二所得的316L不锈钢表面的聚多巴胺/外泌体复合修饰层进行AFM测试以及水接触角测试。AFM选择的测试范围是1nm×1nm，从表面高度差由4.1±2.3nm提升至30.0±2.8nm，可以发现外泌体确实连接到了聚多巴胺膜层表面。从水接触角结果可以发现，无论是基体材料还是修饰膜层，均具有良好的亲水性。

实施例3

左旋聚乳酸（PLLA）表面的聚多巴胺修饰的材料(PDA)和制备有聚多巴胺/外泌体复合修饰层 (PDA/Exosome)的制备过程：

步骤一：提取骨髓间充质干细胞（MSC）的外泌体：

1. 取10mL的1×10⁶个/mL对数生长期的骨髓间充质干细胞的条件培养液，以3000g离心15分钟后，取上清。

2. ExoQuick-TC外泌体试剂盒进行外泌体提取：向条件培养基上清中加入2mL外泌体提取液，混合均匀，并在4℃条件下过夜反应。

3. 1500g低速离心30 min，

4. 去上清后，1500g 5min离心，

5. PBS溶解沉淀物 -80℃保存，

该步骤同样可以用于提取心肌细胞（ARCM）、内皮细胞(HUVEC)或收缩型平滑肌细胞(SMC)的外泌体。

步骤二：在聚乳酸（PLLA）表面制备多巴胺膜层：将40mg盐酸多巴胺溶解在20ml、pH值8.0的Tris缓冲液中，浸没材料，30℃下共聚合沉积24h；

步骤三：外泌体膜层标记

取10µL外泌体（来源：步骤一所得外泌体）冻存液，于37℃溶解后稀释于500µL的PBS溶液中，加入0.5µL的3μM的PKH26溶液，在37℃摇床杂交反应5分钟。使用500uld的BSA（5%）终止荧光染色。重复步骤一的2-5步骤，最后将沉淀稀释在400μL的 PBS溶液中，于4℃保存，避光，待用。

步骤四：左旋聚乳酸（PLLA）表面的聚多巴胺/外泌体复合修饰层：将步骤二所得材料浸没于100µg/ml的外泌体（来源：步骤三所得外泌体）PBS悬液中，37℃避光反应6h，反应完毕后吸除残余反应液，用PBS洗净未固定的外泌体颗粒。

使用共聚焦显微镜观察表面外泌体PKH26特异性荧光染色结果和荧光强度三维成像结果，结果如图3所示。由图3可知，很显然基底材料(Materials)和聚多巴胺修饰的材料(PDA)表面无外泌体，而制备有聚多巴胺/外泌体复合修饰层的材料(PDA/Exosome)表面有外泌体分布，证明聚多巴胺/外泌体复合修饰层成功修饰到材料表面。

实施例4

制备316L医用不锈钢材料表面制备促进表面内皮化的聚多巴胺/外泌体修饰层，

步骤一：在抛光的316L不锈钢表面制备多巴胺膜层：将130mg盐酸多巴胺溶解在50ml、pH值8.0的Tris缓冲液中，浸没材料，35 ℃下共聚合沉积15h，

步骤二：316L不锈钢表面的聚多巴胺/外泌体复合修饰层：将步骤一所得的覆盖有聚多巴胺膜层的316L不锈钢，浸没在浓度为25 µg/ml的外泌体（来源：实施例1所得外泌体）PBS悬液中，30℃反应12h，反应完毕后吸除残余反应液，用PBS洗净未固定的外泌体颗粒。

步骤三：血管内皮细胞与基体的共培养过程

取20mL的2×10⁵个/mL对数生长期的的血管内皮细胞，每100cm²表面加入1ml内皮细胞悬浊液，在培养箱中培养24h后取出。

步骤四：CD31染色流程

使用PBS轻轻冲洗表面，去除表面凋亡的血管内皮细胞；使用1ml、4%多聚甲醛固定30min；使用PBS冲洗表面3遍；使用1ml、5%BSA封闭液反应30min，使用PBS冲洗表面3遍；将CD31抗体(ab28364)原液按照1:100的配比使用PBS进行稀释，按照每个样品表面50µl加入，在37℃摇床孵育60分钟，使用PBS冲洗表面3遍；将二抗 (ab150077)按照1:400的配比使用PBS进行稀释，按照每个样品表面50µl加入，在37℃摇床孵育60分钟，使用PBS冲洗表面3遍。

后使用共聚焦显微镜进行观察，激发波长为488nm，滤光片为500-550nm。结果如图4所示。其中，图4a是内皮细胞CD31抗体的荧光分析结果；图4b是对每个材料表面的细胞个数的计数结果（n=3）。从结果可以发现，PDA/Exosome表面内皮细胞数量和功能都高于于其它材料表面，证明其具有良好的促表面内皮化功能。

实施例5

在医用Ti合金表面制备促进表面内皮化的聚多巴胺/外泌体修饰层，步骤如下：

步骤一：在抛光的Ti合金表表面制备多巴胺膜层：将140mg盐酸多巴胺溶解在50ml、pH值8.0的Tris缓冲液中，浸没材料，32 ℃下共聚合沉积12h；

步骤二：Ti合金表面的聚多巴胺/外泌体复合修饰层：将步骤一所得的覆盖有聚多巴胺膜层的Ti合金，浸没在浓度为40 µg/ml的外泌体（来源：实施例1所得外泌体）PBS悬液中，35℃反应24h，反应完毕后吸除残余反应液，用PBS洗净未固定的外泌体颗粒。

步骤三：血管内皮细胞铺板

取20mL的2×10⁵个/mL对数生长期的的血管内皮细胞，使用24孔板，按照每孔加入1ml内皮细胞悬浊液，在培养箱中过夜后取出。

步骤四：划痕过程

使用PBS清洗孔板底部细胞，去除凋亡细胞；使用10µl移液枪的枪头在孔板底部划出一条均匀的划痕；再次使用PBS清洗孔板底部细胞，去除悬浮细胞。

步骤五：膜层与划痕接触

将基底材料(Materials)、聚多巴胺修饰的材料(PDA)和制备有聚多巴胺/外泌体复合修饰层的材料(PDA/Exosome)均倒扣于划痕表面，加入1ml培养基。在培养箱中静置不同时间后，取出材料，使用PBS清洗表面，并在倒置荧光显微镜的透射光镜下观察划痕愈合情况，结果见图5。

图5a为透射光镜下的照片(两条虚线之间为无细胞空白表面，虚线之间距离越短证明内皮细胞在表面迁移功能越好)；图5b为以划痕闭合的百分比表示的迁移率（n=3）。从结果可以发现，PDA/EXO膜层表面的内皮细胞的迁移率明显高于基体材料以及PDA膜层材料。

实施例6

高分子量聚乙二醇（Mw3000～20000）材料表面制备有聚多巴胺/外泌体复合修饰层：

步骤一：在聚乙二醇表面制备多巴胺膜层：将72mg盐酸多巴胺溶解在30ml、pH值8.3的Tris缓冲液中，浸没材料，25 ℃下共聚合沉积24h，

步骤二：在聚乙二醇表面的聚多巴胺/外泌体复合修饰层：将步骤一所得的覆盖有聚多巴胺膜层的聚乙二醇材料，浸没在浓度为60 µg/ml的外泌体（来源：实施例3所得外泌体）PBS悬液中，37℃反应36h，反应完毕后吸除残余反应液，用PBS洗净未固定的外泌体颗粒。

步骤三：血管内皮细胞与基体的共培养过程

取20mL的2×10⁵个/mL对数生长期的的血管内皮细胞，每100cm²表面加入1ml内皮细胞悬浊液，在培养箱中培养24h后取出。将培养基吸出，放入冻存管，在-20℃保存。

步骤四：使用ELISA试剂盒测试细胞培养液中NO的含量

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加；除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育60min；弃去液体；每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；每孔加入终止液50μL，15min内，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值。

图6是各个样品的NO释放量的柱状图分析，由图6可知，不论是4h还是3天，PDA/EXO层NO释放量均显著高于基体材料和PDA层。NO是血管内皮细胞释放的重要功能分子，对抑制血栓和增生等引起的血管狭窄具有显著的生理抑制作用，结果显示PDA/Exosome修饰层可显著促进其表面内皮细胞功能性因子的释放。

实施例7

镍钛合金表面制备有聚多巴胺/外泌体复合修饰层：

步骤一：在抛光过的镍钛合金表面制备多巴胺膜层：将75mg盐酸多巴胺溶解在25ml、pH值7.8的Tris缓冲液中，浸没材料，30℃下共聚合沉积28h。

步骤二：外泌体膜层标记

取10µL外泌体（来源：实施例3所得外泌体）冻存液，于37℃溶解后稀释于500µL的PBS溶液中，加入0.5µL的3μM的PKH26溶液，在37℃摇床杂交反应5分钟。使用500uld的BSA（5%）终止荧光染色。重复实施例3步骤一的2-5步骤，最后将沉淀稀释在400μL的 PBS溶液中，于4℃保存，避光，待用。

步骤三：在抛光过的镍钛合金表面的聚多巴胺/外泌体复合修饰层：将步骤一所得的覆盖有聚多巴胺膜层的在抛光过的镍钛合金，浸没在浓度为80 µg/ml的外泌体（来源：步骤二所得外泌体）PBS悬液中，25℃避光反应12h，反应完毕后吸除残余反应液，用PBS洗净未固定的外泌体颗粒。

步骤四：血管内皮细胞加入Dynasore

取10mL的5000个/ml对数生长期的的血管内皮细胞，在悬浊液状态加入8µl/ml的Dynasore溶液，在37℃静置30min，标记为A组内皮细胞。

取10mL的5000个/ml对数生长期的的血管内皮细胞，标记为B组内皮细胞。

步骤五：取两个步骤三所得复合膜层，将A、B组内皮细胞，按照每100cm²表面加入1ml内皮细胞悬浊液，在培养箱中培养12h后取出，避光。

步骤六：使用0.05mol/ml的DAPI对步骤五的样品进行5分钟染色，使用PBS冲洗干净表面残留物。

图7中，红色荧光由外泌体膜特异性因子PKH26表达，蓝色荧光是血管内皮细胞核染色区域：图7a显示HUVEC细胞核周围无红色荧光表达，而图7b，细胞内部观察到红色荧光的外泌体，证明外泌体进入细胞内部，开始调控细胞功能。

Claims (10)

1.一种血管支架材料表面修饰方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

（1）制备多巴胺修饰层

将血管支架材料浸没于盐酸多巴胺溶解液中，20~40℃下共聚合沉积不少于12h，然后取出沥干；

所述盐酸多巴胺溶解液为溶解有盐酸多巴胺的Tris缓冲液；盐酸多巴胺浓度为2.0mg/ml- 3.0mg/ml；

（2）沉积外泌体层

将步骤（1）中沉积有多巴胺修饰层的血管支架材料置于外泌体悬液中，4℃~37℃反应不少于10min；反应结束后，冲洗干净即可；

所述外泌体悬液中，外泌体浓度为25µg/ml-200µg/ml。

2.如权利要求1所述血管支架材料表面修饰方法，其特征在于，步骤（2）中，所述外泌体为来源于血液血清或干细胞、内皮细胞或收缩型平滑肌细胞分泌物的具有标志蛋白CD63和HSP70的蛋白的提取颗粒；所述外泌体粒径尺寸为40nm-150nm。

3.如权利要求1所述血管支架材料表面修饰方法，其特征在于，所述血管支架材料为镁合金、不锈钢、Ti合金、镍钛合金、可降解聚乳酸或高分子量聚乙二醇。

4.如权利要求3所述血管支架材料表面修饰方法，其特征在于，步骤（1）中血管支架材料为316L不锈钢，盐酸多巴胺浓度为2.3~2.6mg/ml，步骤（2）中，外泌体浓度25~50 µg/ml。

5.如权利要求3所述血管支架材料表面修饰方法，其特征在于，步骤（1）中血管支架材料为聚乳酸，盐酸多巴胺浓度为2.0mg/ml，步骤（2）中，外泌体浓度100 µg/ml。

6.如权利要求3所述血管支架材料表面修饰方法，其特征在于，步骤（1）中血管支架材料为Ti合金，盐酸多巴胺浓度为2.8mg/ml，步骤（2）中，外泌体浓度40 µg/ml。

7.如权利要求3所述血管支架材料表面修饰方法，其特征在于，步骤（1）中血管支架材料为Mw3000～20000的聚乙二醇，盐酸多巴胺浓度为2.4mg/ml，步骤（2）中，外泌体浓度60 µg/ml。

8.如权利要求3所述血管支架材料表面修饰方法，其特征在于，步骤（1）中血管支架材料为镍钛合金，盐酸多巴胺浓度为3.0mg/ml，步骤（2）中，外泌体浓度80 µg/ml。

9.利用权利要求1~8任一项所述血管支架材料表面修饰方法所制备的血管支架材料。

10.权利要求5所述血管支架材料在血管支架制备中的应用。