CN101820890A - 心脏脂肪组织来源的成体干细胞群及其在心脏再生中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及源自脂肪心脏组织的新成体干细胞群的分离和表征，所述成体干细胞组成型表达GATA-4和/或Cx43。所述细胞群可用在细胞治疗方法中以再生损伤的心肌组织。

Description

心脏脂肪组织来源的成体干细胞群及其在心脏再生中的用途

发明领域

本发明涉及分离和表征源自脂肪心脏组织的新成体干细胞群及其潜在的治疗应用。具体地，本发明涉及在细胞治疗方法中使用所述源自脂肪心脏组织的成体干细胞群，以再生损伤的心肌组织。

发明背景

包括心血管病理在内的退行性疾病(degenerative disease)目前在发达国家中的巨大社会和经济影响促进了对可改进常规疗法的细胞前体的研究。

心肌梗死的主要后果是不可逆地丧失了一部分心肌，这部分心肌被瘢痕组织所替代。这种丧失导致提供必要心输出量的心肌收缩能力以及泵功能的降低，这使得继续存在的心肌负荷过重并最终导致心力衰竭。1998年，仅在美国就有750万人在心肌梗死中存活下来。在这些幸存者中，超过30％在梗死后的第一年内死亡。梗死后的存活主要取决于缺乏血管化(vascularization)而导致的死亡心肌区域的大小。在人体内，超过左心室质量45％的梗死引起不可逆的心源性休克(cardiogenic shock)。

这种心肌的局部丧失导致剩余心肌的再组织(reorganization)，并伴有凋亡导致的更多细胞死亡，肌肉细胞肥大和继续存在的心肌中的纤维化。这种心肌的再组织，一般称为“重塑(remodeling)”，很经常地导致心力衰竭的发作。在这种情况下，心脏不能维持适当的心输出量，从而导致个体能力的严重和进行性限制。

在急性心肌梗死之后，以及在出现了充血性心力衰竭的那些患者中，目前的治疗不能完全恢复这些患有严重的难治疗心室机能障碍的患者的心肌。所有当前使用的治疗心肌丧失的疗法旨在保留剩余心肌的功能。

所述治疗的目的是保留和改善存活的心肌细胞(心脏的可收缩细胞)的功能，并防止它们由于凋亡或坏死导致的死亡。大部分心肌梗死治疗试图恢复向缺血区域的血流，以防止丧失更多的可收缩细胞。这种再灌注治疗包括使用血栓溶解剂(其溶解在冠状动脉中形成的血栓)，球囊血管成形术(通过物理方法打开关闭的动脉)，或冠状动脉搭桥术，其中通过静脉移植将阻塞的动脉的近端和远端桥接而越过关闭的区域。在1998年，仅在美国就进行了超过50万的球囊血管成形术和类似数量的搭桥手术。这些治疗通常实现了重建流向损伤区域的冠状动脉血流，并在一定时间避免了心肌的额外丧失。但是，它们都未能恢复在介入时已经死亡的组织。如果这种丧失是大量的，则长期后果是出现发展成晚期(terminal)心力衰竭的慢性心力衰竭。

迄今为止，使得完全恢复心脏功能的晚期心力衰竭治疗的唯一选择是心脏移植。但是，器官移植呈现出许多难题，例如缺乏供体、排斥移植的器官的高可能性，等等。

对于心力衰竭的特定情况，由于缺乏供体，对于最多5％的需要移植的患者而言，移植是可用的选择。假定介入的高成本是不够充分的限制性障碍，长期免疫抑制治疗的高成本和大量这些患者由此产生的瘤形成则是这种治疗模式的其它限制。

传统上认为，心肌细胞仅在胚胎-婴儿发育期间分裂，在心肌梗死后不可逆地丧失，从而，直至前不久，心脏生物学专家还认为心脏没有自身再生的潜力。鉴于最近的研究，这种观点已经从根本上被改变了。

基于来自干细胞应用的心脏再生能力原理，细胞治疗或心肌成形术(cardiomyoplasty)被认为是治疗心脏疾病的有希望的治疗途径。在最近5年，已进行了一系列的研究，这些研究清楚地显示了心肌再生的过程，从而证实，在成体心脏中存在具有再生潜力的驻留(resident)干细胞和/或心外干细胞。在这种背景下，对移植后心脏嵌合状态(cardiac chimerism)的观察是对能够定居于(colonize)心肌组织并接受心脏命运的细胞的存在的可靠检验[Bayés-Genís A.et al.，2002，Host-cell derived cardiomyocytes inSex-mismatch cardiac allografts(性别错配心脏同种异体移植中的宿主细胞来源心脏细胞).Cardiovasc Res 2002；404-410]。

本领域研究所寻求的主要目的之一是鉴定最佳类型的干细胞，该干细胞可安全有效地用在心脏再生治疗中。用于心脏再生的适合类型的干细胞必须能够有效地扩充，从而显示出分化完全功能的心肌细胞的能力，被整合在心肌组织并与邻近细胞建立电化学接触，以及最后，所述适合类型的干细胞的应用不被免疫排斥或伦理考虑的问题所限制。

干细胞的特征在于它们的自我维持(self-maintenance)能力和它们的可塑性，后一术语指它们在适合的刺激下分化为一种或多种细胞系的能力。干细胞基本上根据以下标准分类：细胞系或细胞株、器官或组织来源；特异性表面标志物的表达，转录因子和/或蛋白的表达；以及分化能力，即可以生成的特化细胞的数量和类型。

在干细胞中，称为胚胎干细胞的，可在胚胎发育的第一阶段之一期间获得的那些干细胞(胚细胞)和称为成体干细胞的，来自成体体细胞组织的那些干细胞之间有明显区别。成体干细胞是在分化的组织中发现的未分化的细胞，并具有增殖和分化为一种或多种细胞类型的能力。成体干细胞存在于各种成体组织中，它们在骨髓、脂肪组织、血液、角膜、视网膜、脑、骨骼肌、牙髓、胃肠上皮、肝和皮肤中的存在有广泛的描述。自体成体干细胞由于它们性质而是免疫相容的，并且其使用无伦理问题。

尽管已鉴定了驻留的心脏干细胞[Beltrami，A.P.et al.Adult cardiacstem cells are multipotent and support myocardial regeneration(成体心脏干细胞是多能性的并且支持心肌再生).Cell 114，763-76(2003)；Oh，H.et al.Cardiac progenitor cells from adult myocardium：homing，differentiation，andfusion after infarction(来自成体心肌的心脏祖细胞：梗死后的归巢、分化和融合).Proc Natl Acad Sci USA 100，12313-8(2003)]，但是损伤后组织修复是不足的，并且已研究了可选的成体非心脏干细胞群[Goldstein，G.etal.Human umbilical cord blood biology，transplantation and plasticity(人脐带血生物学、移植和可塑性).Curr Med Chem 13，1249-59(2006)；Orlic，D.et al.Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice(移植的成体骨髓细胞修复小鼠中的心肌梗死).Ann N Y Acad Sci 938，221-9；discussion(讨论)229-30(2001)；Pittenger，M.F.& Martin，B.J.Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics(间充质干细胞和它们作为心脏治疗物的可能性).Circ Res 95，9-20(2004)；Rangappa，S.，Fen，C.，Lee，E.H.，Bongso，A.& Sim，E.K.Transformation of adultmesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes(将分离自脂肪组织的成体间充质干细胞转化为心肌细胞).Ann Thorac Surg75，775-9(2003)；Zvaifler，N.J.et al.Mesenchymal precursor cells in theblood of normal individuals(正常个体血液中的间充质前体细胞).ArthritisRes 2，477-88(2000)]。

已在从小鼠到人的各种损伤后哺乳动物心脏中测试了成体干细胞。在小鼠中，极高的期望来自骨髓来源的干细胞，尽管这种期望被显示它们用于心脏再生的潜力有限且有争议的报道[Balsam，L.B.et al.Haematopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischaemicmyocardium(造血干细胞在缺血心肌中接受成熟造血命运).Nature 428，668-73(2004)；Murry，C.E.et al.Haematopoietic stem cells do nottransdifferentiate into cardiac myocytes in myocardialinfarcts(造血干细胞不在心肌梗死中转分化为心肌细胞).Nature 428，664-8(2004)]所降低。在人体内，尽管在初步临床研究中显示了心脏功能的某些改善[Assmus，B.et al.Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement inAcute Myocardial Infarction(TOPCARE-AMI)(祖细胞的移植和急性心肌梗死中的再生增强(TOPCARE-AMI)).Circulation 106，3009-17(2002)；Strauer，B.E.et al.Repair of infarcted myocardium by autologousintracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans(通过自体冠状动脉内单核骨髓细胞移植修复人体内的梗死心肌).Circulation106，1913-8(2002)]，但是最近的临床研究仅显示了提供细胞后心脏功能不大的增强[Dohmann，H.F.et al.Multicenter Double Blind Trial ofAutologous Bone Marrow Mononuclear Cell Transplantation throughIntracoronary Injection post Acute Myocardium Infarction a MiHeart/AMIStudy(急性心肌梗死后通过冠状动脉内注射进行的自体骨髓单核细胞移植的多中心双盲试验，MiHeart/AMI研究).Trials 9，41(2008)]。

对于治疗缺血性心脏疾病所遵循的主要手段包括基于使用成肌细胞[Herreros J et al.，2003.Autologous intramyocardial injection of culturedskeletal muscle-derived stem cells in patients with non-acute myocardialinfarction(在患有非急性心肌梗死的患者内自体心肌内注射培养的骨骼肌来源的干细胞).Eur Heart J.2003Nov；24(22)：2012-20；Mathur A.et al.2004.Stem cells and repair of the heart(干细胞和心脏修复).Lancet 2004Jul 10-16；364(9429)：183-92]或骨髓来源的干细胞[Tomita S et al.，2002.Bone marrow stromal cells contract synchronously with cardiomyocytes in acoculture system(在共培养系统中骨髓基质细胞与心肌细胞同步收缩).Jpn J Thorac Cardiovasc Surg.2002Aug；50(8)：321-4；Fernández-Avilés F etal.，2004.Experimental and clinical regenerative capability of human bonemarrow cells after myocardial infarction(心肌梗死后人骨髓细胞的实验和临床再生能力).Circ Res.2004 Oct 1；95(7)：742-8.Epub 2004Sep 9]的那些手段。然而，仍存在一系列的关键性障碍，使得它们难以临床应用。

因此，搜寻恢复心脏功能的新类型的成体干细胞仍然是重要挑战。

白色脂肪组织是人体内最丰富的组织之一，并且位于身体不同区域。所述白色脂肪组织由两种可容易地分离的细胞群组成，一种是成熟脂肪细胞，另一种是基质-血管部分(stromal-vascular fraction)(SVF)。如在骨髓中的情况，基质-血管部分是异质性的，并且可分为两部分，即基质部分和由造血细胞构成的部分。基质部分由在培养时附着的成纤维细胞样细胞组成。所述相对同质的细胞群具有类似的性质，尽管与骨髓来源的间充质干细胞的不同[Zuk et al.，2001.Multilineage cells from human adiposetissue：implications for cell-based therapies(来自人脂肪组织的多细胞系细胞：对基于细胞的治疗的影响).Tissue Eng.2001 Apr；7(2)：211-28]。所述细胞，一般指脂肪组织来源的干细胞(ADSC)，是可容易地分离并以相对低的复制时间和老化水平培养数月的细胞。对于皮下脂肪组织来源的干细胞，后者可对每种细胞系的特异性诱导因子做出应答而分化为几种细胞类型，包括脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞，甚至分化为心肌细胞。还公开的是，ADSC可以是用于心肌修复的自体细胞的潜在来源(WO2006/127007)。

迄今为止，就心脏功能恢复而言，临床使用成体干细胞得到了相当有限的结果。但是，临床试验证实，细胞治疗是安全的，并且是“概念证实(proof of concept)”，即心脏有能力在干细胞治疗应用后再生。

因此，尽管最近几年对心肌再生的了解取得了重要进展，但是还未发现可安全有效地用于心脏再生疗法中并由此提供修复心肌组织损伤的简单且有效的方法的成体干细胞群。目前，可从有效的梗死后治疗受益的患者比例不高；因此，亟需改进现有疗法的有效性以及探寻可恢复心脏损伤的备选方案，尤其是对于经受了多发性梗死的那些患者。

发明概述

本发明涉及心脏脂肪组织来源的新成体干细胞群，优选来自心肌的心外膜区域，其出人意料地具有某种心肌形成素质(cardiomyogenicpredisposition)。具体地，本发明涉及在细胞治疗方法中使用所述源自脂肪心脏组织的成体干细胞群，以便在病理生理状况下促进心脏修复。

本发明是基于这样的发现，即这种位于围绕心脏的脂肪(心外膜和/或心包脂肪组织)中的新成体干细胞群在体外，既在信使RNA(mRNA)水平又在蛋白水平上组成型表达一系列心脏特异性标志物，并且具有某种接近心肌细胞系的素质。无意被任何假设所束缚，可认为所述素质可能是由于它们的位置与心肌组织紧密接触以及由于围绕它们的环境。

本发明人观察到，这种新细胞群与已经描述的其它干细胞群相比具有更好的心肌形成潜力，因此这种从脂肪心脏组织分离的新成体干细胞群是基于细胞的试剂，可能在心脏组织再生和在治疗丧失功能性心肌组织的状况中有用，例如在已患有一种或多种心肌梗死的患者中或在已出现了充血性心力衰竭的患者中有用。

本发明人尤其表征了人心脏脂肪组织来源的心外膜区域的新成体干细胞群，所述表征是通过它们的表面标志物情况(profile of surface marker)实现的，并分析了心肌细胞的不同基本组分的基因(mRNA)和蛋白表达，包括心脏转录因子GATA-4和Nkx2.5，称为β-肌球蛋白重链(β-MHC)、心脏肌钙蛋白I(cTnI)和α-辅肌动蛋白的肌节组分，以及电化学连接和细胞内钙分布的调节子，分别是连接蛋白-43(Cx43)和SERCA-2。组成型地分析了所有这些标志物的表达，即无需向培养基添加任何类型的用于向特定细胞系分化的诱导因子。

已在来自人心外膜脂肪组织(epi-ADSC)和皮下脂肪组织(sub-ADSC)样品的基本上同质的成体干细胞群中进行了免疫表型概况(immunophenotypic profile)以及心脏特异性标志物的基因和蛋白表达的比较研究。根据以前建立的用于皮下脂肪来源干细胞的方法进行所述细胞群的分离和扩充。对于表面抗原的表达，没有观察到两种细胞群之间的显著差异；但是，在用于表征基线状况的基因表达的比较测定(实施例3)中清楚地显示，与皮下脂肪组织来源的干细胞(sub-ADSC)中心脏转录因子GATA-4和Cx43蛋白的表达相比，所述epi-ADSC细胞群出人意料地表现出心脏转录因子GATA-4和Cx43蛋白的统计学上显著增加的基因(mRNA)表达水平，所述Cx43蛋白负责邻近心肌细胞之间的电化学偶联。

通过蛋白印迹(Western Blot)和免疫荧光(实施例4)进行的对所述心脏特异性标志物在蛋白水平的表达的研究使得在基因表达分析中获得的结果完整。免疫荧光测定结果显示了心脏脂肪组织来源的干细胞群(epi-ADSC)中核GATA-4、β-MHC、SERCA-2、Cx43和α-辅肌动蛋白的表达以及它们在细胞水平上的分布。蛋白印迹的结果显示了皮下脂肪组织来源的干细胞(sub-ADSC)相对于epi-ADSC细胞的表达谱(expressionprofile)的比较，这证实了核蛋白GATA-4和Cx43的差异表达，以及Cx43是如何被维持或随培养时间增加的。还观察到β-肌球蛋白重链(β-MycHC)随培养时间的差异表达。

对epi-ADSC和sub-ADSC细胞群中心肌细胞系特异性基因表达的比较研究的结果证实，心外膜脂肪来源的干细胞群(epi-ADSC)比来自相同个体的皮下脂肪来源的干细胞群更定型于心脏细胞系。

基于对最初表达和体外分化实验的分析，本发明人以所述人心脏脂肪组织来源的成体干细胞(心脏ADSC)群进行的其它研究证实，所述心脏ADSC具有固有的心脏类型表型，并且不能分化为脂肪细胞，尽管它们在培养中分化为内皮细胞系。所述心脏ADSC分泌促血管生成因子(proangiogenic factor)，并且在大鼠心肌梗死模型中，当将这些细胞移植进损伤的心肌中时，所注射的细胞表达心脏和内皮蛋白，增加血管化，降低梗死的大小，并由此在体内改善心脏功能(实施例6和7)；因此，所述心脏ADSC可认为是心肌细胞治疗的有效候选者。

因此，一方面，本发明涉及源自哺乳动物脂肪心脏组织的分离的新成体干细胞，所述成体干细胞组成型表达GATA-4和/或Cx43。在具体实施方案中，所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的分离的成体干细胞，在其体外扩充中，以组成型和稳定的方式表达GATA-4和/或Cx43。

另一方面，本发明涉及所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞的分离的细胞群。

另一方面，本发明涉及获得包含源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞的组合物的方法，所述成体干细胞组成型表达GATA-4和/或Cx43。根据所述方法获得的组合物是本发明另外的方面。

另一方面，本发明涉及从所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞获得分化的细胞的方法，其包括在适合的特异性分化培养基中培养所述干细胞。根据所述方法获得的分化的细胞是本发明另外的方面。

另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含所述源自脂肪心脏组织的成体干细胞的分离的细胞群，或所述包含所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的干细胞的组合物，或包含所述分化的细胞的组合物，所述分化的细胞获得自所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞，以及药物可接受的媒介物(vehicle)。

另一方面，本发明涉及生物材料，其包含所述源自脂肪心脏组织的成体干细胞的分离的细胞群，所述包含所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的干细胞的组合物，所述包含所述分化的细胞的组合物，所述分化的细胞获得自所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞，或所述药物组合物。

另一方面，本发明涉及所述源自脂肪心脏组织的成体干细胞的分离的细胞群，或所述包含所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的干细胞的组合物，或所述包含所述分化的细胞的组合物，所述分化的细胞获得自所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞，在制备用于心脏组织再生的药物组合物中，或在制备用于治疗缺血性心脏疾病的药物组合物中，或在制备用于心肌梗死后治疗或用于治疗充血性心力衰竭的药物组合物中，或在制备刺激血管生成的药物组合物中的用途。

另一方面，本发明涉及所述源自脂肪心脏组织的成体干细胞的分离的细胞群，或所述包含所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的干细胞的组合物，或所述包含所述分化的细胞的组合物，所述分化的细胞获得自所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞，以用于心脏组织再生，或用于治疗缺血性心脏疾病，或用于心肌梗死后治疗或用于治疗充血性心力衰竭，或用于刺激血管生成。

另一方面，本发明涉及用于心脏组织再生，或用于治疗缺血性心脏疾病，或用于心肌梗死后治疗，或用于治疗充血性心力衰竭，或用于刺激血管生成的方法，其包括向有需要的个体给药治疗有效量的源自脂肪心脏组织的成体干细胞，或所述包含所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的干细胞的组合物，或所述包含所述分化的细胞的组合物，所述分化的细胞获得自所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞，或所述药物组合物。

另一方面，本发明涉及试剂盒，其包含所述源自脂肪心脏组织的成体干细胞的分离的细胞群，或所述包含所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的干细胞的组合物，或所述包含所述分化的细胞的组合物，所述分化的细胞获得自所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞。

另一方面，本发明涉及在体外评价对生物学或药理学试剂的细胞应答的方法，其包括使所述试剂与源自脂肪心脏组织的成体干细胞的分离的细胞群，或所述包含所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的干细胞的组合物接触，所述细胞任选地分化为特定的细胞类型，以及评价所述试剂对培养中的所述细胞群的影响。

另一方面，本发明涉及获得生长因子和/或细胞因子的方法，其包括在适合于表达和产生所述生长因子和/或细胞因子的条件下，培养所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞，或所述从所述干细胞分化的细胞，以及，如果需要，分离所述生长因子和/或细胞因子。

附图简述

图1(A)显示了提取的心外膜脂肪和皮下脂肪提取部分的照片；图1(B)显示了显微镜图像，其中可观察到人心外膜脂肪组织来源的成体干细胞(epi-ADSC)的形态；图1(C)显示了显微镜图像，其中可观察到人皮下脂肪组织来源的成体干细胞(sub-ADSC)的形态。

图2显示了通过流式细胞术(FACS)进行的对人心外膜脂肪组织来源的成体干细胞(epi-ADSC)的免疫表型表征。显示了对应于研究中的4名患者(P1-P4)的直方图[图2A epi-ADSC P1，图2B epi-ADSC P2，图2Cepi-ADSC P3，图2D epi-ADSC P4]。该直方图在y轴显示所研究的标志物的荧光强度，在x轴显示细胞的数量。每一直方图都显示对照标志物(黑)和所研究的标志物(灰)重叠的表达图。所研究的标志物相对于对照在x轴上的测向位移程度显示细胞样品对于所考虑的标志物的阳性程度。

图3显示了通过实时RT-PCR进行的对成体干细胞群epi-ADSC和sub-ADSC之间心脏特异性标志物的组成型基因表达的比较分析。观察到转录因子GATA4的差异表达(第2代和第5代时)(图3A、3B和3C)；在第5代时，相对于sub-ADSC干细胞，还观察到epi-ADSC干细胞中增加的Cx43转录物水平(其表达可能由GATA4诱导)(图3B和3C)。对于剩余的所分析的心脏基因(α-辅肌动蛋白、β-MHC、心脏肌钙蛋白I、SERCA-2和Nkx2.5)，在整个细胞培养期间，对于它们的表达，未观察到明显的差异。

图4显示了通过蛋白印迹进行的对epi-ADSC(E)和sub-ADSC(S)成体干细胞群之间心脏特异性标志物表达的比较分析。图4A显示了总提取物中的比较分析。图4B显示了在细胞质(C)和细胞核(N)部分中进行的比较分析。既在第2代(p2)又在第5代(p5)，可观察到epi-ADSC干细胞相对于sub-ADSC干细胞增加的Cx43和GATA-4蛋白表达水平。在第5代时，还在epi-ADSC干细胞中观察到β-MHC的差异表达。

图5通过免疫荧光显示了epi-ADSC成体干细胞群中心脏特异性标志物的表达。显微照片显示通过特异性抗体对心脏蛋白表达的检测：GATA-4、β-MHC(βMHC)、α-辅肌动蛋白、SERCA-2和连接蛋白-43(Cx43)。可观察到，GATA-4主要存在于细胞的细胞核中；β-MHC在结构上被很好地组织从而形成肌原纤维；以及α-辅肌动蛋白、SERCA-2和Cx43弥散分布在整个细胞内。

图6显示了心脏ADSC的分离和表征。图6a显示了开心(open-heart)手术期间人心脏的图；观察到夹住取在邻近近端右冠状动脉的心脏脂肪组织的活组织检查的手术钳(clamp)。(AO，主动脉；LV，左心室)。图6b显示了融合之前心脏ADSC的原代培养物(20x放大)。图6c是显示心脏ADSC流式细胞免疫表型(immunophenotyping)分析结果的条形图。

图7显示了在脂肪形成分化培养基中培养后，通过心脏ADSC(图7a)和皮下ADSC(图7b)的茜素红S染色进行的脂肪形成分化分析。图7c是显示对于测定的不同细胞群(心脏ADSC和皮下ADSC)，3和4周处理后，脂肪细胞类型阳性细胞百分比的条形图。

图8是显示与皮下ADSC相比，心脏ADSC中心肌形成基因的实时RT-PCR结果的条形图。值表明一种细胞类型相对于来自相同患者的其它细胞类型表达的倍数(本例中，心脏ADSC与皮下ADSC比较)。与皮下ADSC相比，在心脏ADSC中观察到GATA4和Cx43转录物统计学显著的增加(GATA4，p＜0.001；Cx43，p＝0.031)。

图9显示了经蛋白印迹和免疫细胞荧光测定的心脏ADSC中心脏标志物的基础表达。图9a显示了心脏和皮下(Sub)ADSC裂解物的蛋白印迹分析结果；将成体人心脏蛋白的提取物用作对照。图9b至9d分别显示了β-MHC、SERCA2和肌节α-辅肌动蛋白在心脏ADSC中的表达(红)。图9e显示了GATA4(绿)和Cx43(红)在心脏ADSC中的表达。图9c和9d的图版(panel)中的细胞核以Hoescht 33342染色(蓝)。比例尺为50μm。

图10显示了心脏ADSC与新生心肌细胞的共培养。心脏eGFP+-ADSC(绿：a、e、i、l和p)；cTnI(红：b、f和j)；β-MHC(蓝：c)；采用DAPI的细胞核复染(counterstaining)(青：d)(蓝：g、h’和s)。(h’、k’和o’)分别是在h、k和o中的点线的xz模式中所观察的。这些图像用共焦显微镜拍摄，并显示了心脏标志物在心脏ADSC中的共定位(co-location)。Cx43(红：m)，肌节α-辅肌动蛋白(青：n)，SERCA2(红：q)和GATA4(青：r)。(d、h、h’、k、k’、o、o’和s)是融合图像。比例尺为50μm(a至d和p至s)，25μm(e至h和l至o)以及10μm(i至k)。

图11显示了培养中心脏ADSC分化为内皮细胞。图11a是条形图，该条形图显示，通过实时RT-PCR确定的，与未处理对照细胞相比，经EGM-2处理的细胞的促血管生成标志物的表达倍数。图11b显示了分化处理后，DiI-Ac-LDL对心脏ADSC的掺入(incorporation)。图11c至11e显示了用基质胶涂层(Matrigel coating)培养心脏ADSC 2、4和7小时后小管的形成(10x放大)。图11f和11g显示了在具有基质胶的涂层中形成的小管的GSLI同工凝集素B4染色。比例尺为50μm。

图12显示了不同的超声波心动描记(echocardiographic)功能参数值：缩短分数(fractional shortening)(FS)[图12a]；射血分数(EF)[图12b]；以及前壁厚度(AWT)[图12c]。

图13显示了大鼠心脏形态测量分析的结果。图13a和13b显示了手术后30天，穿过梗死心肌的大鼠心脏横切片的Masson三色染色(Masson’strichrome staining)结果(e，对照；f，处理的)。图13c和13d显示了对照组和经细胞处理组中，大鼠LV梗死大小百分比和LV壁厚度。

图14显示了将人心脏ADSC植入患有梗死的大鼠心脏的结果，其中可观察到体内心脏和内皮分化。图14a显示了注射在心肌中的绿色心脏eGFP+-ADSC，并且显示了对人核抗原(HNA，红)的免疫染色结果以证实所注射的心脏eGFP+-ADSC来源于人。图14b至14d显示了在注射了心脏ADSC的心脏切片中的针对cTnI(b)、肌节α-辅肌动蛋白(c)和CD31(d)的免疫染色结果(都为红色)。重要的是，观察到细胞分布在整个缺血组织中，尽管只是注射在边界区域中。比例尺为50μm。

图15显示了eGFP+(ROI1)细胞和背景(ROI2)细胞的发射光谱的测量结果。

图16显示了梗死的心肌中毛细血管密度分析的结果，特别是以GSLI同工凝集素B4染色的，对照心肌(图16a)和经心脏ADSC处理的心肌(图16b)的边界区域内的毛细血管。图16c是显示对照组和经心脏ADSC处理的组中，梗死边界和远端区域中每mm²的毛细血管数的条形图。未在远端区域中观察到明显的差异。比例尺为50μm。

发明详述

本发明主要涉及心脏脂肪组织来源的，存在于心外膜和/或心包区域的，基本上同质的成体干细胞群。本发明人观察到，所述细胞群具有某种心脏细胞系的素质，并且与不同来源的其它干细胞相比具有更大的心肌形成潜力。因此，所述细胞群潜在地用于心脏组织再生中。具体地，本发明涉及所述源自脂肪心脏组织的成体干细胞群在细胞治疗方法中的用途，其在病理生理状况下有助于心脏修复。所述细胞群可用在药物组合物的制备中，或用在用于丧失心肌收缩能力的那些状况中的心肌再生的生物材料中，例如用在患有心肌梗死和/或出现了充血性心力衰竭的患者的治疗中。

定义

为了帮助理解本说明书，以下将解释用在本发明上下文中的一些术语和词句的含义。其它的定义在必要时与说明书一起被包括进来。

术语“个体”指动物，优选哺乳动物，包括非灵长类(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠或小鼠)和灵长类(例如，猴、人)。在优选的实施方案中，个体是人。

术语“成体干细胞”指存在于分化的组织中，并具有干细胞特征的细胞。成体干细胞是在分化的组织中发现的未分化的细胞，并且具有增殖和分化为一种或多种细胞类型的能力。成体干细胞存在于不同的成体组织中，它们的存在在骨髓、脂肪组织、血液、角膜、视网膜、脑、骨骼肌、牙髓、胃肠上皮、肝和皮肤中有广泛的描述。

术语“脂肪组织(adipose tissue)”或“脂肪组织(fatty tissue)”在本说明书中不加区分地使用，并指通过在它们细胞质中积累脂质的细胞(脂肪细胞)的联合而形成的间充质组织。一方面，脂肪组织行使机械功能，该机械功能包括用作缓冲(buffer)，保护内部器官以及身体的其它较外部的结构并将它们保持在合适位置，另一方面，脂肪组织也行使代谢功能。在哺乳动物中可辨别两种类型的脂肪组织：褐色脂肪组织或褐色脂肪和白色脂肪组织。在代谢术语中以及就细胞组成而言，这些组织被认为是不同的组织。在6个月以内的新生儿和婴儿中，作为暴露于冷环境期间的补偿机制，褐色脂肪与生热作用有关；而在成人中，所述生热作用被甲状腺活性所介导(mediate)。最近发表的文章中将新生儿褐色脂肪鉴定为心肌细胞的祖(干)细胞的来源，并且鉴定了新生儿褐色脂肪在再生心脏治疗中的潜在用途(Yamada et al.，2006.Cardiac progenitor cells in brownadipose tissue repaired damaged myocardium(褐色脂肪组织中的心脏祖细胞修复损伤的心肌).Biochem Biophys Res Commun.2006 Apr 7；342(2)：662-70.Epub 2006 Feb 10)。在白色脂肪组织上进行的一系列研究显示，白色脂肪组织直接或间接地与有机体的所有主要功能有关。白色脂肪组织是非常异质的组织，由彼此相互作用的许多细胞群组成。就此而言，有必要考虑细胞取决于它们的位置的生物学和可塑性的差异。对雄性和雌性肥胖症的比较显示，取决于脂肪组织的位置，脂肪组织的发育对有机体有不同的影响。细胞的分化潜力也取决于其位置。在对取决于沉积来源的脂肪组织的基质细胞群的分化潜力之间的比较研究中证实，对于小鼠，具有最大分化能力的脂肪组织是皮下脂肪组织(Prnet-Marcassus et al.，2006.From heterogeneity to plasticity in adiposetissues：site-specific differences(脂肪组织中从异质性到可塑性：位点特异性差异).Exp Cell Res.2006Apr 1；312(6)：727-36.Epub 2005Dec 28)。

术语“脂肪心脏组织”指心脏脂肪组织，由于其解剖学位置，可分为心外膜脂肪组织(覆盖心肌)或心包脂肪组织(在心包区域，即邻近心脏)。已知脂肪组织为高度复杂的内分泌器官，其生成具有局部和全身作用的分子。尽管它们在定性性质上类似，但是目前已知不同类型的脂肪组织，尤其是皮下和内脏脂肪组织沉积，具有某些蛋白的差异表达谱，这提示了在产生活性生物分子方面的差异特征(Dusserre E.et al.；2000.Differences in mRNA expression of the proteins secreted by the adipocytes inhuman subcutaneous and visceral adipose tissues(人皮下和内脏脂肪组织中脂肪细胞分泌的蛋白的mRNA表达差异).Biochim Biophys Acta.2000 Jan3；1500(1)：88-96)。

术语“组成型表达”或“基础表达”指基因在缺乏诱导其表达的因子的情况下的表达。组成型表达基因被认为是持续转录的那些基因。

当术语“分离的”指细胞群时，其指从包括人在内的动物的器官或组织分离的细胞群，其基本上不含通常在体外或体内与所述细胞群相关联的其它细胞群。通常，在下述情况下获得了“基本上不含”其它细胞群的细胞群：其与至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，仍然更优选至少90％，以及，仍然甚至更优选至少95％、96％、97％、98％或甚至99％的通常在体外或体内与所述细胞群相关联的其它细胞群分离。

术语“缺血性心脏疾病”指冠状动脉不能将必要的氧气输送至心肌的决定区(determined territory)，使得所述心肌难以工作而导致的疾病。冠状动脉改变的最常见原因是动脉硬化或动脉粥样硬化。这两种情况使得血液难以到达心脏细胞，而心脏细胞对血液供给的减少非常敏感。当到达心脏的氧的量不足时，出现冠心病或缺血性心脏疾病。其主要后果是心肌梗死、心绞痛、冠状动脉功能不全(coronary insufficiency)、心肌缺血和猝死。

术语“心力衰竭”、“充血性心力衰竭”或“CHF”指慢性疾病，其中心脏不能泵送足够的含氧血来满足身体其它器官的需要。结果是，有机体的生命器官不能接收到足够的氧和营养物，并且有机体的废物清除更缓慢。从长远来看，生命系统会停止工作。心力衰竭通常是潜在的心脏问题的症状。

术语“心肌梗死”或“急性心肌梗死”或“AMI”指由于一条或几条冠状动脉或它们的分枝堵塞而导致的心肌的部分的缺血性坏死。心肌梗死的特征是功能性心肌细胞的丧失、心肌组织不可逆的损伤。当存在晚期冠心病(coronary disease)时，心肌(myocardium)或心肌(heart muscle)遭受梗死，在具体病例中，当位于冠状动脉内的粥样斑块(atheromatousplaque)溃烂或破裂时，发生这种情况，从而导致该血管的急性堵塞。

术语“心脏再生”、“心脏组织再生”或“心肌再生”指通过植入能够增殖并分化为心肌细胞，再生损伤的心肌组织和心脏功能的干细胞来修复心脏组织细胞块(cell mass)的丧失。

如本文所用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”指改善、治愈或补救病理生理状况，其产生于向需要所述治疗的个体给药本发明所提供的药物组合物，其包含所述源自脂肪心脏组织的成体干细胞群。

本发明的干细胞

本发明基于对心脏脂肪组织来源的新成体干细胞群的鉴定，该成体干细胞具有某种心肌形成素质，因此它们可用在细胞治疗方法中，尤其是用在为了在丧失了功能性心脏组织的病理生理状况下促进修复和/或再生心肌组织的细胞治疗方法中。

因此，一方面，本发明涉及源自哺乳动物脂肪心脏组织的分离的成体干细胞，所述成体干细胞组成型表达GATA-4和/或连接蛋白43(Cx43)，即下文中的本发明的干细胞。

本发明的干细胞，其在本说明书中有时也称为“心脏ADSC”，来自心脏脂肪组织来源，例如，心外膜或心包脂肪组织，例如所述哺乳动物心脏脂肪组织的基质部分，该哺乳动物例如啮齿类，灵长类等，优选人。在具体的实施方案中，本发明的干细胞是从人心外膜脂肪组织获得的。

本发明的干细胞可以是自体、同种异体或异种的细胞。在具体并优选的实施方案中，所述细胞是自体的，并且分离自个体的心脏脂肪组织，其中要向该个体给药所述细胞。

本发明的干细胞的特征在于，除了它们的来源以外，还组成型表达GATA-4和/或Cx43。在具体实施方案中，本发明的干细胞组成型表达GATA-4和Cx43。

GATA-4是锌指转录因子GATA家族的转录因子成员。该家族的成员识别存在于几个基因的启动子中的GATA基序。所述蛋白被认为参与了调节与胚胎发生以及心脏的分化和功能有关的基因。编码所述GATA-4蛋白的基因的突变与心脏隔膜中的缺陷相关。

连接蛋白43(Cx43)，也称为GJA1(间隙连接蛋白)，是连接蛋白家族的成员。所述蛋白是细胞间的间隙连接的组分，该间隙连接由一组细胞间通道构成，为低分子量物质从一个细胞到另一细胞的扩散提供途径。Cx43蛋白是心脏的间隙连接的主要蛋白之一，并且被认为在心脏收缩的同步以及胚胎发育中发挥关键作用。

如之前所讨论的，骨骼肌被认为是获得用于心肌再生的细胞的潜在来源；但是，骨骼肌不表达Cx43蛋白，并且存在于心肌细胞之间的间隙连接未形成。因此，所得的肌管与邻近的心肌之间的收缩是不同步的。电偶联的缺乏可能解释了一些临床系列中恶性心律失常的发作(HerrerosJ et al.，2003.Autologous intramyocardial injection of cultured skeletalmuscle-derived stem cells in patients with non-acute myocardial infarction(在患有非急性心肌梗死患者内自体心肌内注射培养的骨骼肌来源的干细胞).Eur Heart J.2003Nov；24(22)：2012-20)。

在具体并优选的实施方案中，所述本发明的干细胞中GATA-4和/或Cx43的组成型表达在该干细胞的体外扩充期间保持稳定。

如本文所用的，细胞“在其体外扩充期间”“稳定”地表达基因或蛋白指细胞在体外至少两次传代的细胞培养中，基因或其表达产物(蛋白)的表达基本上维持在相同水平；即，对于细胞的体外扩充，在体外，将该细胞于合适条件(培养基、温度、空气、稀释度、培养基更换等)下进行培养，例如，如实施例1中所述，在补充了10％FBS、1mM L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素的α-MEM培养基中，于37℃下，在含5％CO₂的空气中进行培养，直至融合前(pre-confluence)，每3天或4天更换培养基。。

本发明的干细胞可以是自体、同种异体或异种的细胞。在具体并优选的实施方案中，所述细胞是自体的，并且分离自个体的心脏脂肪组织，其中要向该个体给药所述细胞。

在具体实施方案中，所述本发明的干细胞组成型表达β-肌球蛋白重链(β-MHC)，该β-肌球蛋白重链不组成型地存在于其它已经描述的干细胞群以及皮下脂肪组织来源的干细胞(sub-ADSC)中，该皮下脂肪组织来源的干细胞获得自从与源自脂肪心脏组织的成体干细胞(本发明的干细胞)相同的个体。已知这种蛋白在心肌的收缩中起重要作用，原因是该蛋白形成了肌节(心肌细胞的收缩结构(apparatus))的一部分。

在另一具体实施方案中，本发明的干细胞在其体外培养期间始终组成型表达SERCA-2蛋白。这种肌浆蛋白(SERCA-2)是Ca²⁺-ATP酶泵，并且负责调节心肌细胞内钙的细胞内分布。这种功能对于心肌的正确收缩也是基本的。

而且，本发明的干细胞的特征还在于表达或不表达一系列的表面标志物，例如CD14、CD29、CD34、CD44、CD59、CD90、CD105、CD106和CD117，以及任选的标志物CD45、CD133、CD166和VEGFR2。

在具体实施方案中，本发明的干细胞的特征在于，其还表达一种或多种选自CD29、CD44、CD59、CD90和CD105的表面标志物；即本发明的干细胞对下述表面标志物的至少一种、两种、三种、四种或优选全部下述表面标志物是阳性的：CD29、CD44、CD59、CD90和CD105。在另一具体实施方案中，本发明的干细胞的特征在于，其还表达表面标志物CD166。因此，在另一具体实施方案中，本发明的干细胞的特征在于，其还表达一种或多种选自CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166的表面标志物；即本发明的干细胞对下述表面标志物的至少一种、两种、三种、四种、五种或优选全部下述表面标志物是阳性的：CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166。

在另一具体实施方案中，本发明的干细胞的特征在于，其不表达选自CD14、CD34、CD106、CD117的表面标志物及其组合；即本发明的干细胞对下述表面标志物的至少一种、两种、三种或优选全部下述表面标志物是阴性的：CD14、CD34、CD106和CD117。在另一具体实施方案中，本发明的干细胞的特征在于，其不表达(或非常微弱地表达)表面标志物VEGFR2。因此，在另一实施方案中，本发明的干细胞的特征在于，其对下述表面标志物的至少一种、两种、三种、四种或优选全部下述表面标志物是阴性的：CD14、CD34、CD106、CD117和VEGFR2。

在另一具体实施方案中，本发明的干细胞的特征在于，除了其来源和组成型表达GATA-4和/或Cx43之外，(i)其表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD59、CD90和CD105，以及(ii)其不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106和CD117。

在另一具体实施方案中，本发明的干细胞的特征在于，除了其来源和组成型表达GATA-4和/或Cx43之外，(i)其表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD90、CD105和CD166，以及(ii)其不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。

在另一具体实施方案中，本发明的干细胞的特征在于，除了其来源和组成型表达GATA-4和/或Cx43之外，(i)其表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166，以及(ii)其不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。

在具体实施方案中，本发明的成体干细胞是源自哺乳动物心脏脂肪(fatty)(脂肪(adipose))组织的分离的成体干细胞，该哺乳动物优选人，所述成体干细胞：

a)组成型表达GATA-4和/或Cx43；

b)组成型表达β-MHC；

c)表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD59、CD90和CD105；以及

d)不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106和CD117。

在另一具体实施方案中，本发明的成体干细胞是源自哺乳动物心脏脂肪(fatty)(脂肪(adipose))组织的分离的成体干细胞，该哺乳动物优选人，所述成体干细胞：

a)组成型表达GATA-4和/或Cx43；

b)组成型表达β-MHC；

c)表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD90、CD105和CD166；以及

d)不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。

在另一具体实施方案中，本发明的成体干细胞是源自哺乳动物心脏脂肪(fatty)(脂肪(adipose))组织的分离的成体干细胞，该哺乳动物优选人，所述成体干细胞：

a)组成型表达GATA-4和/或Cx43；

b)组成型表达β-MHC；

c)表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166；以及

d)不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。

在具体并优选的实施方案中，所述本发明的干细胞中GATA-4和/或Cx43的组成型表达在该干细胞的体外扩充期间保持稳定。

感兴趣的基因和蛋白(例如GATA-4、Cx43、α-MHC、β-辅肌动蛋白等)的表达可通过本领域普通技术人员已知的常规方法在核酸水平(例如mRNA水平)或在蛋白水平上确定。

在具体实施方案中，给定的基因的表达可通过在不向培养基添加任何能够诱导分化成特定细胞系的组分情况下，即在组成型表达条件下，分析该基因的基因表达来确定。作为非限定性示例，所述基因在细胞中的表达可通过常规技术如实时RT-PCR、RNA印迹(Northern blot)或DNA微阵列来分析。实时RT-PCR是逆转录聚合酶链式反应的变体，其允许在扩增基因时对该基因进行定量检测。实施例3和6中采用实时RT-PCR来确定感兴趣的心脏特异性蛋白的基因表达水平(mRNA)。通过将所有的mRNA从凝胶转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜，RNA印迹技术允许鉴定、定位和定量mRNA序列。通过与合适探针杂交来检测特定mRNA的存在。DNA微阵列技术基于使用与一系列DNA片段结合的固体表面。用于固定DNA的表面有相当多的种类(例如，玻璃、塑料和甚至硅片)；这种技术允许确定多个基因的表达，并且可以同时监测大量基因的表达水平。

或者，可通过免疫学技术如ELISA、蛋白印迹或免疫荧光来分析蛋白的表达。蛋白印迹技术基于对预先通过电泳分离并固定在通常是硝酸纤维素膜的膜上的蛋白的检测，并且通过与特异性抗体和诸如化学发光的显影系统(developing system)一起孵育来进行。通过免疫荧光的分析涉及使用对感兴趣的蛋白特异性的抗体来分析该蛋白的表达，以及通过显微术进行的亚细胞定位。通常，预先将所研究的细胞以低聚甲醛固定，并用非离子除垢剂通透化(permeabilized)。实施例4和6中采用了蛋白印迹和免疫荧光技术。ELISA技术基于使用以酶标记的抗原或抗体，从而所得的偶联物(conjugate)既具有免疫活性又具有酶活性。由于组分之一被标记并且在支持物上不溶解，所以抗原-抗体反应是固定的，因而可通过添加特异性底物来容易地显影，其产生可通过例如分光光度测定法定量的反应。这种技术不能做到确切的亚细胞定位，也不能确定所研究蛋白的分子量，但是其确实允许非常特异和高度灵敏地检测，例如在临床上感兴趣的生物液体(血清、细胞培养上清液、腹水等)中的感兴趣的蛋白。

本发明的干细胞的表型标志物也可通过通常基于阳性/阴性选择的任何适合技术来鉴定。在具体实施方案中，可使用抗所述表型标志物的抗体，优选单克隆抗体，所述表型标志物必须被证实是否存在于本发明的干细胞中，以便通过它们的免疫细胞化学概况(immunocytochemicalprofile)来另外表征本发明的干细胞，尽管也可以使用本领域技术人员已知的其它常规技术。因此，在具体实施方案中，使用抗至少细胞表面标志物CD29、CD44、CD59、CD90和CD105的单克隆抗体，来证实所述标志物存在于所选的细胞中，或至少一种所述标志物并优选全部所述标志物的可检测的表达水平；并且使用抗至少CD14、CD34、CD106和CD117的单克隆抗体，来证实它们的不存在。在另一具体实施方案中，使用抗至少细胞表面标志物CD29、CD44、CD90、CD105和CD166的单克隆抗体，来证实所述标志物存在于所选的细胞中，或至少一种所述标志物并优选全部所述标志物的可检测的表达；并且使用抗至少CD14、CD34、CD106、CD117和VEGFR2的单克隆抗体，来证实它们的不存在。同样地，在另一具体实施方案中，使用抗至少CD14、CD29、CD34、CD44、CD59、CD90、CD105、CD106、CD117、CD166和VEGFR2的单克隆抗体，来证实所述标志物是否存在于所选的细胞中，或至少一种所述标志物并优选全部所述标志物的可检测的表达。

所述单克隆抗体是已知的，或者任何本领域技术人员通过常规方法可获得所述单克隆抗体。作为非限定性示例，实施例2和6中描述了进行本发明提供的干细胞群的免疫表型表征的方式。

如果需要，本发明的干细胞可通过任何常规方法进行遗传修饰，作为非限定性示例，该常规方法包括转基因方法，本发明的干细胞的基因组中的缺失或插入，这改变了对其基本性质(增殖、迁移、转分化等)重要的基因的表达。因此，例如已知离体扩充或移植进损伤的组织内的成体干细胞，由于它们的端粒缩短而迅速老化。为了防止这种以及其它现象，期望利用例如，含有基因构建体(construct)的逆转录病毒颗粒来转导细胞，该构建体的表达抵消这种和其它不期望的变化的影响。

本发明的干细胞能够增殖并自我更新，因此它们可在被分离和表征后在体外(离体)进行扩充。因而，一旦分离了本发明的干细胞，它们就可在适合的培养基中体外维持并增殖。作为非限定性示例，所述培养基包含α-MEM培养基(eagle-α改良最小必需培养基(Minimum EssentialMedium eagle-alpha modification)(Sigma Ref.M4526).Eagle，H.Media foranimal cell culture(动物细胞培养的培养基).Tissue Culture AssociationManual(组织培养协会手册).3.517-520.1976)、抗生素和谷氨酰胺，并且所述培养基补充了胎牛血清(fetal bovine serum)(FBS)。改变或调节所用的细胞需要的培养基浓度和/或培养基添加物取决于每位本领域普通技术人员的经验。血清通常含有细胞存活和扩充所必需的细胞组分和因子。这类血清的说明性、非限定性实例包括FBS、牛血清(bovine serum)(BS)、小牛血清(calfserum)(CS)、胎牛血清(fetal calfserum)(FCS)、新生小牛血清(neonatal calf serum)(NCS)、山羊血清(GS)、马血清(HS)、猪血清、绵羊血清、兔血清、大鼠血清(RS)等。如果本发明的干细胞是人源的，则还考虑向细胞培养基补充人血清，优选自体血清。应当理解，如果认为有必要让添加物的级联组分失活，则可通过加热来灭活血清。也可采用调节血清浓度、从培养基除去血清来促进一种或多种期望的细胞类型的存活。在另一实施方案中，本发明的干细胞可在具有确定组成的培养基中扩充，其中血清由血清白蛋白、转铁蛋白、硒和重组蛋白的组合替换，该重组蛋白包括但不限于胰岛素、血小板衍生生长因子和生长因子，例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

很多细胞培养基已经含有氨基酸；然而，仍然需要在培养细胞之前补充某些氨基酸。所述氨基酸的说明性、非限定性实例包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸等。通常也在细胞培养中使用抗微生物剂，以减少可能的细菌、支原体和/或真菌污染。所用的抗生素或抗真菌化合物通常是青霉素和链霉素的混合物，尽管也可包括其它的抗生素或抗真菌化合物，例如两性霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、博来霉素、潮霉素、卡那霉素、丝裂霉素等。也可向细胞培养中添加激素，该激素包括但不限于D-醛固酮、己烯雌酚(DES)、地塞米松、b-雌二醇、氢化可的松、胰岛素、催乳素、孕酮、生长抑素/人生长激素(HGH)等。

本发明的干细胞的维持可要求加入细胞因子，以使得细胞保持在未分化形式。对于本领域普通技术人员显而易见的是，必须在开始让本发明的干细胞分化为分化的细胞之前，将所述抑制细胞分化的因子从培养基移除。还显而易见的是，不是所有的细胞都需要这些因子。实际上，取决于细胞类型，这些因子可导致不良影响。

如果需要，可利用克隆细胞群的合适方法来克隆扩充本发明的干细胞。作为示例，可物理收集本发明干细胞的增殖的细胞群，并将该细胞群接种在不同的板上(或接种在“多孔”板的孔内)。或者，可以统计学比率将本发明的干细胞亚克隆进“多孔”板内，以协助将单个细胞放入每个孔的操作(例如，约0.1个细胞/孔至约1个细胞/孔，或甚至约0.25个细胞/孔至0.5个细胞/孔，例如0.5个细胞/孔)。当然，可以低密度将细胞克隆(例如在皮氏培养皿(Petri dish)中或其它适合的基质中)，并利用诸如克隆环的装置将该细胞与其它细胞分离。克隆群的产生可在任何适合的培养基中进行扩充。任何情况下，都可将分离的细胞培养至可评价它们的发育表型的适当点。如果需要，分离本发明的干细胞的任何步骤和方法都可手动进行；或者，可将本领域普通技术人员已知的适合装置用于协助分离细胞。

可通过本领域普通技术人员已知的诱导分化的常规方法来评价本发明的干细胞分化为一种或多种细胞系或类型的能力的分析。为此，通常使干细胞经受用于每种细胞类型或细胞系的适当的特异性分化方法，该方法包括在适合的特异性分化培养基中培养干细胞。

在分析了根据用于诱导特异性分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的普通方法进行的初步分化研究中获得的结果后，本发明人认为，相对于也对标志物CD29、CD44、CD59、CD90和CD105是阳性的其它成体间充质干细胞群，例如皮下脂肪组织来源的干细胞(sub-ADSC)，本发明的干细胞具有降低的(较低的)分化能力。具体地(实施例5)，使本发明的干细胞经受之前为皮下脂肪组织来源的干细胞建立的脂肪形成、成骨和软骨形成分化方法[Zuk et al.，2002.Human adipose tissue is a source ofmultipotent stem cells(人脂肪组织是多能干细胞的来源).Mol Biol Cell.2002 Dec；13(12)：4279-95]，并且观察到，相对于皮下脂肪组织来源的干细胞，本发明的干细胞具有较低的分化为所述细胞系的能力。但是，不能忽视通过修改所用的特异性脂肪形成、成骨和软骨形成细胞系分化方法来获得更大分化能力的可能性。因此，尽管无意与任何结论相关联，但是似乎有这样的迹象，其使得考虑，本发明的干细胞具有不同于也对标志物CD29、CD44、CD59、CD90和CD105是阳性的其它成体间充质干细胞群的，分化为间充质细胞系的情况(profile)。实际上，本发明人进行的其它测定似乎证实，与皮下脂肪组织来源的干细胞(sub-ADSC)不同，本发明的干细胞不分化为脂肪细胞(实施例6)，这显示了较低的可塑性和较高程度的定型(commitment)，。

本发明的细胞群

另一方面，本发明涉及基本上同质的，分离的干细胞群，以下称为“本发明的细胞群”，其包含一组源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞，所述成体干细胞组成型表达GATA-4和/或Cx43(本发明的干细胞)。

在具体实施方案中，本发明的细胞群包含源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞，所述成体干细胞组成型表达GATA-4和Cx43。

在另一具体并优选的实施方案中，本发明的细胞群包含本发明的干细胞，其中在其体外扩充期间，GATA-4和/或Cx43的组成型表达保持稳定。

在另一具体实施方案中，本发明的细胞群包含还组成型表达β-MHC和/或SERCA-2的本发明的干细胞。

在另一具体实施方案中，本发明的细胞群包含还表达一种或多种选自CD29、CD44、CD59、CD90和CD105的表面标志物的本发明的干细胞。在具体实施方案中，本发明的细胞群显著地表达下述表面标志物的至少一种、两种、三种、四种或优选所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD59、CD90和CD105。在另一具体实施方案中，本发明的干细胞特征在于，其还表达表面标志物CD166。因此，在另一具体实施方案中，本发明的干细胞显著地表达下述表面标志物的至少一种、两种、三种、四种、五种或优选所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166。如本文所用的，“显著地表达”指，在所述细胞群中，通过流式细胞术确定，至少30％的细胞显示了高于背景信号的，对特异性细胞表面标志物的信号，优选40％、50％、60％、70％，并且更优选80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在另一具体实施方案中，本发明的细胞群包含不表达选自CD14、CD34、CD106和CD117的一种、两种、三种或任意种表面标志物的本发明干细胞。在具体实施方案中，本发明的细胞群缺乏对下述表面标志物的至少一种、两种、三种或优选所有下述表面标志物的显著表达：CD14、CD34、CD106和CD117。在另一具体实施方案中，本发明的干细胞的特征在于，其不表达(或非常微弱地表达)表面标志物VEGFR2。因此，在另一具体实施方案中，本发明的干细胞缺乏对下述表面标志物的至少一种、两种、三种、四种或优选所有下述表面标志物的显著表达：CD14、CD34、CD106、CD117和VEGFR2。如本文所用的，“缺乏显著表达”指，在所述细胞群中，在流式细胞术中，少于30％的细胞显示高于背景信号的，对特异性细胞表面标志物的信号，优选少于20％、15％或10％，更优选少于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

在另一具体实施方案中，本发明的细胞群包含本发明的干细胞，其特征在于，除了它们的来源和组成型表达GATA-4和/或Cx43之外，(i)它们表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD59、CD90和CD105，以及(ii)它们不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106和CD117。

在另一具体实施方案中，本发明的细胞群包含本发明的干细胞，其特征在于，除了它们的来源和组成型表达GATA-4和/或Cx43之外，(i)它们表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD90、CD105和CD166，以及(ii)它们不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。

在另一具体实施方案中，本发明的细胞群包含本发明的干细胞，其特征在于，除了它们的来源和组成型表达GATA-4和/或Cx43之外，(i)它们表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166，以及(ii)它们不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。

在另一具体实施方案中，本发明的细胞群包含源自优选人的哺乳动物心脏脂肪(fatty)(脂肪(adipose))组织的分离的成体干细胞，其a)组成型表达GATA-4和/或Cx43；b)组成型表达βMHC；c)表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD59、CD90和CD105；以及d)不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106或CD117。

在另一具体实施方案中，本发明的细胞群包含源自优选人的哺乳动物心脏脂肪(fatty)(脂肪(adipose))组织的分离的成体干细胞，其a)组成型表达GATA-4和/或Cx43；b)组成型表达β-MHC；c)表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD90、CD105和CD166；以及d)不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。

在另一具体实施方案中，本发明的细胞群包含源自优选人的哺乳动物心脏脂肪(fatty)(脂肪(adipose))组织的分离的成体干细胞，其a)组成型表达GATA-4和/或Cx43；b)组成型表达β-MHC；c)表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166；以及d)不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。

在另一具体实施方案中，本发明的细胞群包含从诸如心外膜或心包脂肪组织的哺乳动物心脏脂肪组织获得的本发明的干细胞，该哺乳动物例如啮齿类、灵长类等，优选人。在具体实施方案中，本发明的细胞群包含从人心外膜脂肪组织获得的本发明的干细胞。

在另一具体实施方案中，本发明的细胞群包含从心脏脂肪组织的基质部分获得的本发明的干细胞。

在另一具体实施方案中，本发明的细胞群包含自体、同种异体或异种来源的本发明的干细胞。在具体并优选的实施方案中，所述细胞是自体的，并且分离自个体的心脏脂肪组织，其中要向该个体给药所述细胞。

如果需要，所述本发明的细胞群可在用于移植的细胞库中找到。在具体实施方案中，所述细胞库包含多种本发明的干细胞，它们对于至少一个或多个关键抗原的基因，即编码组织相容性抗原的基因(例如，存在于人群中的主要组织相容性复合体(MHC)的等位基因)是纯合的。可从所述细胞库中选择与需要细胞移植或植入的个体的MHC等位基因相容，且对一个或多个组织相容性抗原的等位基因纯合的本发明的细胞。

如果需要，可在既不影响也不损害本发明的细胞群存活力的条件下，将其冷冻保存。

获得包含本发明的干细胞的组合物的方法

另一方面，本发明涉及获得包含源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞的组合物的方法，所述成体干细胞组成型表达GATA-4和/或Cx43，该方法以下称为本发明的方法，包括：

a)获得哺乳动物脂肪心脏组织样品的细胞悬液；

b)从所述细胞悬液分离细胞；

c)在固体支持物上的培养基中，在允许所述细胞附着至所述固体支持物的条件下，培养所述细胞；以及

d)收集源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞，所述成体干细胞组成型表达GATA-4和/或Cx43。

脂肪心脏组织样品可从脂肪心外膜组织或从脂肪心包组织获得，优选从心外膜脂肪组织获得。所述脂肪心脏组织样品来自哺乳动物，例如啮齿类、灵长类等，优选人。所述哺乳动物脂肪心脏组织样品可通过本领域普通技术人员已知的常规方法获得。在具体实施方案中，所述脂肪心脏组织样品提取自脂肪组织的基质部分。脂肪心脏组织的适合来源是来自接近近端右冠状动脉的区域，或来自围绕主动脉的心脏基部(base)，从该处可在常规心脏手术情况下获得脂肪心脏组织。实施例1详细描述了获得人脂肪心脏(尤其是心外膜)组织样品的方式。

将所提取的脂肪心脏组织样品洗涤并切成小片段，通过酶(或通过其它常规方式)将该小片段消化以获得细胞悬液，将该细胞悬液离心，将获得的细胞团(cell pellet)重悬浮在适合的培养基(例如，包含补充了血清、谷氨酰胺和抗生素的α-MEM培养基的培养基)中，并接种在固体支持物(例如，塑料、培养板、培养瓶等)上，该操作是在允许细胞附着至所述固体支持物的条件(例如，37℃和含5％CO₂的空气)下进行的；一旦观察到细胞附着(例如，约24小时后，取决于培养条件)，除去培养基，并在进行细胞的体外扩充之前，将附着的细胞洗涤。为此，在适合的培养基(例如，补充了血清、谷氨酰胺和抗生素的α-MEM培养基)的存在下，于适合的条件下(例如，37℃，含5％CO₂的空气)，培养附着的细胞(本发明的干细胞)，并在这种条件下将该细胞维持培养直至融合前(例如，直至达到约80％的融合度)，并且定期地更换全部或部分培养基(例如，每3天或4天)。可将细胞重复转种(传代)，直至达到允许对细胞材料进行分析的量的细胞材料(即最小数量的细胞)。在具体实施方案中，将所述细胞转种至少两次(即将它们传代2次)，通常3、4、5或更多次。在具体实施方案中，以适当的稀释度，将所述细胞转种2次(第2代)，而在另一具体实施方案中，将所述细胞转种5次，即高达第5代(3至4个月)。通过以这种方式操作，从固体支持物(例如，培养板等)剥离(peel off)后，获得的细胞密度为5×10³个本发明的干细胞/cm²至6×10³个本发明的干细胞/cm²。在两种情况下(第2代和第5代)，都分析了GATA-4和Cx43的表达，并观察到在整个所述细胞(本发明的干细胞)的体外扩充中，所述心脏特异性标志物的组成型表达基本保持稳定。实施例1和6详细描述了从人脂肪心外膜组织获得、鉴定、表征和分离本发明的干细胞。

根据前述本发明的方法获得的，包含本发明的干细胞的所得组合物是本发明的另一方面。

分化的细胞

另一方面，本发明涉及获得分化的细胞的方法，包括在适合的特异性分化培养基中培养本发明的干细胞。在具体实施方案中，所述特异性分化培养基是用于分化为心肌形成细胞系的特异性培养基。在另一具体实施方案中，所述特异性分化培养基是用于分化为内皮细胞系的特异性培养基。在另一具体实施方案中，所述特异性分化培养基是用于分化为心肌形成、成骨或软骨形成的特异性培养基。所述特异性分化培养基是本领域普通技术人员已知的。

从所述细胞分化方法获得的分化的细胞，以下称为本发明的分化的细胞，是本发明另外的方面。在具体实施方案中，所述本发明的分化的细胞是心肌细胞、骨细胞或软骨细胞。

另一方面，本发明还涉及包含所述本发明的分化的细胞及适合的培养基的组合物。

药物组合物

另一方面，本发明涉及药物组合物，以下称为本发明的药物组合物，其包含治疗有效量的所述本发明的细胞群，或所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物，或所述包含本发明的分化的细胞的组合物，以及药物可接受的媒介物。

如本文所用的，术语“治疗有效量”指存在于所述本发明的细胞群中，或存在于所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物中的本发明的干细胞的量，或所述包含本发明的分化的细胞的组合物的量，其必须包含本发明的药物组合物，来用于能够产生期望的治疗效果，；所述治疗有效量通常由细胞的自身特征和所寻求的期望治疗效果等因素来确定。必须给予的本发明的细胞的治疗有效量通常取决于待治疗疾病的级别、个体自身特征、受影响的部位等因素。为此，本领域技术人员必须仅作为指导原则来考虑本说明书中所述的剂量，并且根据上述因素来调整所述剂量。作为说明性和非限定性实例，本发明的药物组合物可作为单次剂量来给药，其含有约1×10⁵至1×10⁹，优选1×10⁶至1×10⁸，更优选1×10⁷至5×10⁷个本发明的干细胞，它们可以是部分或完全分化的，或者是它们的组合。取决于患者的状况和进展，可间隔数天、数周或数月来重复剂量，专科医生必须为每一病例进行制定。

包含在本发明的细胞群中，或在所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物中的本发明的干细胞，以及包含在所述组合物中的本发明的分化的细胞可以是自体、同种异体或异种的细胞。在具体并优选的实施方案中，所述细胞是自体的，并且分离自个体的心脏脂肪组织，其中要向该个体给药所述细胞，因此减少了与对所述细胞的抗原性和/或免疫原性应答有关的潜在并发症。

如果需要，如上文所述的，利用通过抗体的阳性和/或阴性细胞的选择来富集细胞群，可将包含在本发明的细胞群中，或在所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物中的本发明的干细胞纯化，以增加功效、降低发病率或促进方法。

根据本发明，不进行另外的处理，就可向患者给药包含在本发明的细胞群中，或在所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物中的本发明的干细胞，以及本发明的分化的细胞；或者在用于纯化、刺激或以其它方式改变细胞的额外处理后，向患者给药上述细胞。例如，可在获得自个体的本发明的干细胞的给药之前的培养后，向需要该干细胞的另一个体给药该干细胞。也可将本发明的细胞群或所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物，或所述本发明的分化的细胞单独地，或与其它细胞群进行给药，例如与心脏脂肪组织基质部分的剩余组分一起。在具体实施方案中，对心脏脂肪组织的收集可在患者病床边完成。血流动力学控制(Hemodynamic control)可用于监测患者的临床状况。根据本文描述的本发明，可在心脏脂肪组织提取后立即向患者给药本发明的药物组合物。例如，可在处理心脏脂肪组织以分离本发明的细胞群或包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物，并将所述本发明的细胞群或包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物置于药物适合的媒介物中后，立即给药本发明的药物组合物。在另一实施方案中，递送时间取决于患者的利用度(availability)以及处理心脏脂肪组织和分离本发明的细胞群所需的时间。

术语“药物可接受的媒介物”指媒介物，其在动物，特别是在人中的用途必须被联邦政府或国家政府管理机构批准，或列在美国药典或欧洲药典或另一普遍接受药典中。

术语“媒介物”指稀释剂、共佐剂(coadjuvant)、赋形剂或载体(carrier)，本发明的细胞群或所述包含根据本发明的方法获得的本发明的细胞的组合物的细胞必须与它们一起进行给药；显然，所述媒介物必须与所述细胞相容。所述媒介物的说明性、非限定性实例包括任何生理相容的媒介物，例如等渗溶液(例如无菌盐水(0.9％NaCl)、磷酸缓冲盐水(PBS)、林格乳酸盐溶液(Ringer-lactate solution)等)，任选地补充了血清，优选自体血清；细胞培养基(例如DMEM等)；或可选择地，固体、半固体、胶状或粘性支持物，例如胶原蛋白、胶原蛋白-葡糖胺-聚糖、纤维蛋白、聚氯乙烯、诸如聚赖氨酸或聚鸟氨酸的聚氨基酸、水凝胶、琼脂糖、硅酮硫酸葡聚糖(silicone dextran sulfate)。如果需要，在具体实施方案中，支持物还可含有生长因子或其它试剂。如果支持物为固体、半固体或胶状的，则可将细胞导入媒介物的液相中，随后对该媒介物进行处理使得其转变为较固态的相。在媒介物具有固体结构的本发明的一些实施方案中，可根据损伤形状来形成所述媒介物。

如果需要，本发明的药物组合物在必要时还可含有增加、控制或以其它方式操纵(direct)包含在所述药物组合物中的细胞的期望治疗效果的添加剂，和/或辅助物质或药物可接受的物质，例如缓冲剂、表面活性剂、共溶剂、防腐剂等。还可能添加金属螯合剂。本发明的药物组合物的液体介质中细胞的稳定性，可通过添加其它物质如天冬氨酸、谷氨酸等来加以改善。可用在本发明的药物组合物中的所述药物可接受的物质通常是本领域普通技术人员已知的，并且通常用在细胞组合物的制备中。例如，在E.W.Martin的“雷明顿制药科学(Remington′s PharmaceuticalSciences)”中描述了适合的药物媒介物的实例。关于所述媒介物的其它信息可在任何药物技术手册(植物药学(Galenic Pharmacy))中找到。

本发明的药物组合物含有治疗有效量的本发明的细胞群，或所述包含根据本发明方法获得的本发明的干细胞的组合物，或所述包含本发明的分化的细胞的组合物，优选在分离并扩充后基本上同质的本发明的细胞群，连同合适量的适合媒介物以为个体提供适当剂型。

本发明的药物组合物可根据所选的剂型来配制。制剂将根据给药模式来调整。在具体实施方案中，将本发明的药物组合物制备为液体药剂(liquid dosage)或凝胶形式，例如悬浮液形式，来用于注射或灌注至需要治疗的个体。说明性和非限定性实例包括无菌悬浮液中的本发明的药物组合物与药物可接受的赋形剂，例如等渗溶液，如磷酸缓冲盐水(PBS)，或者与任何其它适合的药物可接受媒介物的制剂，来用于向诸如人的个体胃肠外给药，优选静脉内、腹膜内、皮下给药等，尽管其它的可选给药途径也是可能的。

向需要本发明的药物组合物的个体给药本发明的药物组合物可通过常规手段进行。在具体应用中，可利用适合的装置向所述个体静脉内给药所述药物组合物，该合适的装置例如注射器、导管、套针、插管等。在所有情况下，都利用适合于细胞组合物给药，并且本领域技术人员已知的设备、仪器和装置来给药本发明的药物组合物。

在具体实施方案中，静脉内给药本发明的药物组合物，并且包括通过标准装置的静脉内给药，该标准装置例如标准外周静脉内导管、中心静脉导管或肺动脉导管等。可通过让位于患者脉管系统内的远端和近端球状物(globe)连续充气(inflate)或放气(deflate)来控制细胞流量。

在另一具体实施方案中，直接向想要受益的位置给药本发明的药物组合物可以是有利的。因此，如果需要，将本发明的药物组合物直接给药(植入、移植等)至期望的器官或组织，从而通过插入适合的装置如适合的插管、导管等，通过动脉或静脉灌注(包括逆流机制)，或通过本说明书中所述或本领域中已知的其它手段，直接将本发明的药物组合物应用(例如通过注射等)至受影响的器官或组织的外表面。在优选的实施方案中，通过例如冠状动脉内注射，或通过借助导管的跨心肌注射(transmyocardialinjection)，向心肌的损伤区域直接给药本发明的药物组合物。设计为特异地在心脏的受损区域、特别是梗死区域释放活性成分的导管已有描述(参见，例如美国专利US6,102,926、US6,120,520、US6,251,104、US6,309,370、US6,432,119和US6,485,481)。所用的给药系统可包括，例如用于可选药物的心脏内给药的仪器，其包括用于心脏内定位的传感器和用于在该传感器的位置给药期望量的期望活性成分的释放系统。

如果需要，可将本发明的药物组合物保存至通过本领域普通技术人员已知的常规方法进行使用的时候。这种药物组合物也可与用于心肌梗死后治疗和/或充血性心力衰竭的其它药物，以活性形式一起保存，从而构成(comprise)联合治疗。对于短期保存(少于6小时)，本发明的药物组合物可在室温下，或在低于所述温度下，于密封容器中进行保存，并且向该药物组合物补充或不补充营养液。中期保存(少于48小时)优选在2℃至8℃，并且本发明的药物组合物包含等渗缓冲溶液，并处于由防止细胞附着的材料制成或涂覆有该材料的容器中。更长期的保存优选通过适当的冷冻进行，并保存在促进细胞功能保留的条件下。

在具体实施方案中，本发明的药物组合物用在联合治疗中。在具体实施方案中，所述药物组合物与用于心肌梗死后治疗和/或充血性心力衰竭的其它药物组合物联合给药。因此，包含在本发明细胞群中的本发明的干细胞可作为单一治疗使用，或与用于治疗心血管疾病，尤其是缺血性心脏疾病的其它常规治疗联合使用，例如与进行冠状动脉搭桥术，血管成形术(使用或不使用支架)，给药血管生成促进剂(promoter)，植入心室辅助装置，给药血栓溶解剂、抗血小板凝集剂(乙酰水杨酸和/或氯吡格雷(clopidogrel))、抗高血压剂(血管紧张肽转变酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽I受体拮抗剂(ARA-II)、β受体阻断剂、利尿剂、降血脂剂(antilipidemic agent)、地高辛、硝酸盐和/或钙拮抗剂联合使用。

在具体实施方案中，将组合治疗给予患有缺血性心脏疾病的个体，特别是患有心肌梗死和/或患有对常规治疗无应答的充血性心力衰竭的患者。

如上文所述，本发明的药物组合物可用于与用在心肌梗死后治疗和/或充血性心力衰竭的其它药物的联合治疗中。所述其它药物产品可形成相同药物组合物的一部分，或者可选择地，所述其它药物产品可以分离的组合物的形式提供，来用于相对于本发明的药物组合物给药的同时或连续(时间上顺序的)的给药。在具体实施方案中，将所述其它药物组合物与包含本发明的细胞群的药物组合物同时给药，或顺序给药，并且在时间上分开，以任意的顺序进行，即可首先给药本发明的药物组合物，然后给药用于治疗缺血性心脏疾病的其它药物或其它药物组合物，或者可首先给药用于治疗缺血性心脏疾病的其它药物或其它药物组合物，然后给药本发明的药物组合物。可选择地，可将这两种组分的一种混合在相同组合物中并一起给药。在另一可选实施方案中，将所述本发明的药物组合物与用于治疗缺血性心脏疾病的其它药物或其它药物组合物同时给药。

可在本发明的药物组合物的给药之前和给药期间监测患者。给药药物组合物后，可能需要将患者监测约24小时的时间段，以防出现不良反应。建议进行随访研究来评价功能性改善。包含本发明的细胞群的生物材料

另一方面，本发明涉及生物材料，以下称为本发明的生物材料，其包含所述本发明的细胞群，所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物，或所述包含本发明的分化的细胞的组合物，或所述本发明的药物组合物。

组织工程由在损伤组织内移植的生物材料组成，该生物材料由适合于将它们植入有机体内的生物相容结构组成，并且被具有附着和增殖能力的细胞所覆盖。所述结构可以是缝线、基质、膜、泡沫、凝胶和陶瓷等。可用于构建基质和其它生物相容结构的不同材料是已知的，并包括：无机材料，例如金属；天然聚合物，例如纤维蛋白或藻酸盐；合成聚合物，例如多羟基酸，如聚乙醇酸(PGA)及其共聚物(例如，聚(乳酸乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid))(PLGA)等)。在优选的实施方案中，所述聚合物是生物可降解的，从而它们随时间降解，并且聚合结构完全被细胞所替换。在具体实施方案中，所述本发明的生物材料包含生物相容结构，或由其组成，所述本发明的生物材料包含一种或多种生物可降解聚合物和本发明的细胞群，或本发明的分化的细胞的组合物，或本发明的药物组合物。

在另一具体实施方案中，所述聚合结构可被生物活性分子覆盖，即被能够特异地与细胞相互作用的分子覆盖，或被具有更好的附着性质的另一聚合物覆盖，以增强细胞的附着程度和增殖。本发明的细胞群，或所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物，或所述包含本发明的分化的细胞的组合物，在制备用于治疗病变(pathology)的药物中的用途

本发明人观察到，本发明的细胞群，以及所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物具有良好的心肌形成潜力，并且好于已经描述的不同来源的其它干细胞群，因此，本发明的细胞群以及所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物是潜在地用于心脏组织再生和/或治疗功能性心肌组织丧失(缺血性心脏疾病)状况的基于细胞的试剂，例如用于患有一次或多次心肌梗死的患者，或用于出现充血性心力衰竭的患者，以及在适合刺激血管生成的状况下，用于刺激血管生成。

因此，另一方面，本发明涉及本发明的细胞群，或所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物，或所述包含本发明的分化的细胞的组合物，在制备用于心脏组织再生的药物组合物中，或在制备用于治疗缺血性心脏疾病的药物组合物中，或在制备用于心肌梗死后治疗或用于治疗充血性心力衰竭的药物组合物中，或在制备刺激血管生成的药物组合物中的用途。

另一方面，本发明涉及本发明的细胞群，或所述包含所述本发明的干细胞的组合物，或所述包含本发明的分化的细胞的组合物，以用于心脏组织再生，或用于治疗缺血性心脏疾病，或用于心肌梗死后治疗，或用于治疗充血性心力衰竭和/或刺激血管生成。

为了再生心脏组织，或用于治疗缺血性心脏疾病，或用于心肌梗死后治疗，或用于治疗充血性心力衰竭，或刺激血管生成，向需要治疗的个体给药本发明的药物组合物、治疗有效量的所述药物组合物，其包含本发明的细胞群、或包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物、或所述包含本发明的分化的细胞的组合物。如上文所述，本发明的干细胞(存在于所述本发明的细胞群中)源自心脏脂肪组织，并组成型表达GATA-4和/或Cx43，优选二者都表达。Cx43蛋白是电连接心肌细胞的间隙连接的主要蛋白之一；因此所述本发明干细胞组成型表达Cx43的事实提示，在移植了包含本发明的干细胞的所述细胞群后，与先前存在的心脏组织有良好的电偶联。

本发明的干细胞，本发明的细胞群，或所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物，或所述包含本发明的分化的细胞的组合物，可用于获得适当数量的细胞，该细胞能够再生缺血心脏组织或改善一次或多次心肌梗死后心脏的功能。在具体实施方案中，所述改善是由于存在于所述本发明的细胞群中的本发明的干细胞分化为心肌细胞、平滑肌和/或血管内皮组织。如上文所述，可通过常规手段完成向需要本发明的药物组合物的个体给药本发明的药物组合物。在具体实施方案中，可在心肌的损伤区域，将所述药物组合物直接给药至需要该药物组合物的个体，例如通过冠状动脉内注射，或通过借助导管的跨心肌注射。

本发明的干细胞，本发明的细胞群，或所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物，或所述包含本发明的分化的细胞的组合物，可用于获得适当数量的细胞，该细胞能够在需要刺激血管生成的病理状况下，刺激血管生成。

基于使用本发明的干细胞或本发明的分化的细胞，用于心脏组织再生，或用于治疗缺血性心脏疾病，或用于心肌梗死后治疗，或用于治疗充血性心力衰竭，或刺激血管生成的方法

本发明还涉及心脏组织再生，涉及治疗丧失功能性心肌组织(例如缺血性心脏疾病)的病理性状况，例如患有一次或多次心肌梗死的个体(患者)，或出现充血性心力衰竭的患者。同样地，本发明还涉及在适当或合理状况下，刺激血管生成。

因此，另一方面，本发明涉及用于心脏组织再生，或用于治疗缺血性心脏疾病，或用于心肌梗死后治疗，或用于治疗充血性心力衰竭，或刺激血管生成的方法，包括向有需要的个体给药治疗有效量的本发明的干细胞，或包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物，或所述包含本发明的分化的细胞的组合物，或本发明的药物组合物。

如之前所述，为了再生心脏组织，或用于治疗缺血性心脏疾病，用于心肌梗死后治疗，用于治疗充血性心力衰竭、或刺激血管生成，可通过本领域普通技术人员已知的常规方法(例如，通过冠状动脉内注射、跨心肌注射等，直接向心肌的损伤区域给药)，以治疗有效量，向需要治疗的个体给药所述本发明的干细胞，所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物，所述包含本发明的分化的细胞的组合物，或所述本发明的药物组合物。

试剂盒

另一方面，本发明涉及试剂盒，其包含本发明的干细胞，本发明的细胞群，包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物，或所述包含本发明的分化的细胞的组合物。所述本发明的干细胞和细胞群，以及所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物，和所述包含本发明的分化的细胞的组合物的特征之前已有描述。形成所述试剂盒的一部分的，存在于本发明细胞群中，或存在于所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物中的本发明的干细胞，与存在于所述组合物中的所述本发明的分化的细胞一样，可以是同种异体或异种来源的。

所述试剂盒可用于诊断目的和/或用于体外研究，因此，为此目的，如果需要，本发明的干细胞可以是永生化的，从而它们能够无限扩充。

因此，在具体实施方案中，可对本发明的干细胞进行永生处理，例如可逆的永生处理，以便得到永生化的本发明的干细胞，优选可逆永生化的干细胞。在这种意义上，如本文所用的，术语“永生”或“永生化”指细胞或产生细胞的方法，该细胞在培养中无限地增殖，而不进入衰老。根据本发明，永生指方法，通过这种方法使细胞培养转化，从而该细胞在某些方面的行为类似于肿瘤细胞，特别是与肿瘤细胞的增殖特征有关的方面。因此，“可逆永生化的细胞”指细胞，其在给定时间处于永生化状态，但是后来利用可逆永生方法，可返回非永生化状态。在具体实施方案中，通过包括下述步骤的方法使本发明的干细胞可逆永生化：(a)用包含“可移除的多核苷酸”的载体(vector)转化本发明的干细胞，以获得永生化的本发明的干细胞，该“可移除的多核苷酸”含有癌基因(或癌基因的组合)；(b)使所述永生化的本发明的干细胞生长；以及(c)选择保持了本发明细胞功能属性的永生化的本发明的干细胞的那些克隆细胞系(cell line)；如果需要，可从永生化的本发明的干细胞移除该癌基因(或癌基因的组合)。作为示例，可通过单独的过量表达，或与一些癌基因如SV40大T抗原、端粒酶催化亚基、Bmi-1等联合，来使细胞群永生化。可通过在侧面加上(flank)重组酶靶标(例如，引入识别loxP靶标的Cre重组酶等)，而且通过添加能够破坏永生化的细胞的胸苷激酶自杀基因来逆转这些癌基因的过量表达。

在体外评价细胞对生物学或药理学试剂的应答的方法

另一方面，本发明涉及在体外评价细胞对生物学或药理学试剂的应答的方法，包括使所述试剂与包含多个本发明的干细胞的本发明的细胞群，或与包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物，所述干细胞任选地分化为特定的细胞类型，或与所述包含本发明的分化的细胞的组合物接触，并评价所述试剂对培养中的所述细胞群的影响。

作为示例，细胞对生物学或药理学试剂的应答可在体外通过包括下述步骤的方法进行评价：(a)从个体或一组个体分离本发明的细胞群，或包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物；(b)任选地，使全部或部分存在于所述细胞群，或存在于所述包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物中的本发明的干细胞，分化为特定的细胞类型或细胞系；(c)在培养中，体外扩充步骤(a)或(b)所得的细胞；(d)任选地，使在步骤(c)中扩充的细胞分化为特定的细胞类型；(e)在培养中，使步骤(c)或(d)所得的细胞群与一种或多种生物学或药理学试剂接触；以及(f)评价所述试剂对培养中的细胞群的影响。

在具体实施方案中，使存在于本发明的细胞群中，或存在于包含根据本发明的方法获得的本发明的干细胞的组合物中的本发明的干细胞，分化为心肌细胞。分化步骤可在分离本发明的细胞群之前[步骤(b)]，或在所述细胞的体外扩充之后[步骤(d)]进行。

获得生长因子和/或细胞因子的方法

另一方面，本发明涉及获得生长因子和/或细胞因子的方法，包括在适合于表达并产生所述生长因子和/或细胞因子的条件下，培养本发明的干细胞或本发明的分化的细胞，并且，如果需要，分离所述生长因子和/或细胞因子。所述条件是本领域普通技术人员已知的，或者可由本领域技术人员根据包含在本说明书中的信息容易地推断。

以下的实施例说明本发明，而不应被考虑为对本发明的限制。

实施例1

sub-ADSC和epi-ADSC成体干细胞的细胞分离和培养

从同一个体的心外膜和皮下来源的人脂肪样品分离了两种基本上同质的干细胞群，并比较了它们的表型和心脏特异性标志物的基础表达。

材料与方法

获得心外膜和皮下脂肪样品

在得到知情同意书后，在常规心脏手术中，从4名患者(P1、P2、P3和P4)获得心外膜和皮下脂肪样品，并且从每名患者提取每种类型的脂肪样品。在心脏手术期间，首先切开皮肤和皮下组织，直至暴露胸骨。利用手术钳，从该过程中暴露的胸皮下组织获得脂肪碎片(约2g至5g)。然后随着心脏的暴露，进行正中胸骨切开术并剥离心包膜。从围绕主动脉的心脏基部获得心外膜脂肪组织(约0.5g至2g)。通过手术钳选择该脂肪组织，并采用普通手术剪切下。这项研究得到了Santa Creu i Sant Pau医院伦理委员会的批准。

从心外膜和皮下脂肪样品分离epi-ADSC和sub-ADSC细胞群

将两种类型的脂肪样品(心外膜和皮下)用PBS缓冲液(GibcoInvitrogen Corp.)重复洗涤，并在剥离存在的血管后用手术刀切成小碎片。

然后，在搅拌和37℃下，用含有0.05％II型胶原酶的α-MEM(GibcoInvitrogen Corp)溶液将脂肪组织碎片酶促消化30分钟。通过添加补充了10％胎牛血清(FBS)、1mM L-谷氨酰胺(Gibco Invitrogen Corp)和1％青霉素-链霉素(Gibco Invitrogen Corp)的α-MEM培养基终止反应。然后，将悬浮液在室温下以1,200g离心10分钟。弃去上清液，将团(pellet)用补充了10％FBS、1mM L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素的α-MEM完全培养基重悬浮，并接种在培养瓶中(37℃下，含有5％CO₂的空气)。24小时后，除去培养基并用PBS洗涤附着的细胞。

之前分离的细胞的体外扩充

于37℃下和含有5％CO₂的空气中，在补充了10％FBS、1mM L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素的α-MEM的存在下，培养附着的细胞。在相同条件下，将细胞维持在培养中，直至达到约80％的融合度(融合前)，并且每3天或4天更换培养基。在细胞达到融合前时，在通过胰蛋白酶/EDTA溶液从培养板剥离后，将该细胞以1∶3的稀释度重复转种，这对应于5×10³个细胞/cm²至6×10³个细胞/cm²的密度，直至第5代(3至4个月)。

结果

选择并在体外培养中扩充了来自相同个体的成体心外膜脂肪组织来源的干细胞群和成体皮下脂肪组织来源的干细胞群。图1A显示了心外膜脂肪和皮下脂肪的提取部分。人心外膜成体脂肪组织来源的干细胞(epi-ADSC)的形态显示在图1B中，而人成体皮下脂肪组织来源的干细胞(sub-ADSC)的形态显示在图1C中。

实施例2

epi-ADSC成体干细胞群的免疫表型表征

通过流式细胞术分析不同表面标志物的表达，以便表征心外膜脂肪组织来源的干细胞群(epi-ADSC)，并将所得的结果与分离自皮下脂肪组织的细胞群(sub-ADSC)的结果进行比较。

材料与方法

流式细胞术

在源自心外膜脂肪组织的4种细胞群(epi-ADSC细胞)中，通过流式细胞术进行免疫表型分析，该4种细胞群分离自来自指定为P1、P2、P3和P4的患者的4个样品，并将它们与sub-ADSC细胞的代表性样品进行比较。在培养3至4周后(低传代)，对P1和P2epi-ADSC细胞进行表征，而在培养9至12周后(高传代)，对P3和P4epi-ADSC细胞进行表征。

在4℃下，用PBS洗涤细胞，并在培养条件下使用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco)，保持5分钟将细胞从培养板剥离。在阻断了胰蛋白酶的作用后，于低温条件下，以1,400rpm将细胞离心5分钟。在整个染色过程中，将细胞保持在冷却的染色缓冲液(含1％FCS的1X PBS)中。通过对下述不同表面抗原特异性的抗体进行染色：CD3、CD9、CD10、CD11B、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD28、CD29、CD31、CD34、CD36、CD38、CD44、CD45、CD49a、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD54、CD55、CD56、CD58、CD59、CD61、CD62e、CD621、CD62p、CD71、CD90、CD95、CD102、CD104、CD105、CD106、CD117、CD133/2、CD59、CD235a、HLAI、HLAII、NGFR和β2-微球蛋白(都来自Serotec)。

将两种荧光团(fluorophor)，即异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE)用于显示所述抗原在细胞膜中的存在，将该两种荧光团于4℃下，在染色缓冲液中避光稀释1/50，保持20分钟。在Coulter EPICS XL细胞计数器中并通过特定软件(FCS Express 3软件)分析样品。

结果

图2显示了epi-ADSC样品的免疫表型概况所得到的阳性结果。用于分析的统计学参数为“％阳性”。该参数测量获取公式(acquisition formula)中所接受的细胞的百分比，并且将该接受的细胞视为对于对照是阳性的。FCS Express程序在统计学上进行数值减法(numerical subtraction)，并将高于“细胞阳性百分比”参数30％的值视为阳性结果。

因此，通过流式细胞术分析免疫表型概况的结果显示，大于90％的标志物研究在两种细胞群(epi-ADSC和sub-ADSC)中有类似的表达。具体地，如在sub-ADSC细胞群中的情况，epi-ADSC细胞群对CD9、CD29、CD44、CD51、CD54、CD55、CD59、CD90、CD105、HLA-I和β2-微球蛋白具有强阳性(表1)。sub-ADSC的剩余的阴性特异性标志物对epi-ADSC细胞也是阴性的。然而，关于细胞表面标志物CD54的表达检测到了差异，该细胞表面标志物CD54对epi-ADSC细胞是阳性的，对sub-ADSC细胞是阴性的。

表1

通过流式细胞术分析的，与sub-ADSC细胞代表性样品相比，epi-ADSC细胞不同样 品中表面标志物表达的结果

[注意：仅显示了具有阳性结果(高于30％的表达)的那些标志物]

实施例3

sub-ADSC和epi-ADSC干细胞群中心脏特异性标志物基因表达的比较研 究

通过实时RT-PCR技术分析心脏特异性标志物β-MHC、GATA-4、Nkx2.5、心脏肌钙蛋白I(cTnI)、SERCA-2、肌节α-辅肌动蛋白和连接蛋白-43的基础表达。

材料与方法

实时RT-PCR

用QuickPrep总RNA提取试剂盒(Amersham)，根据制造商的说明，提取分离的细胞的总RNA。利用2μg的总RNA，通过逆转录反应合成cDNA，该反应采用带有随机六聚体的Script单步RT-PCR(Script One-StepRT-PCR)试剂盒(Bio-Rad Laboratories)，于50℃下在10分钟内进行。获得cDNA后，用标记了FAM

，对全部研究的基因特异性的引物，在TaqMan通用PCR master mix(TaqMan Universal PCR master mix)试剂盒(Applied Biosystems)中，准备所有的PCR反应。所用的引物为：GATA-4(Hs00171403_m1)、Nkx2.5(Hs00231763_m1)、肌节α-辅肌动蛋白(Hs00241650_m1)、β-MHC(Hs00165276_m1)、连接蛋白-43(Hs00748445_s1)、SERCA-2(Hs00544877_m1)、cTnI(Hs00165957_m1)和GAPDH(Hs99999905_m1)(Applied Biosystems)，反应条件为：对于所有引物，50℃、2分钟，95℃、10分钟，以及95℃、15秒和60℃、1分钟的40个循环。最后通过ABI Prism 7000序列检测系统(AppliedByosistems)来分析扩增。为了定量基因表达，用ABI Prism 7000 SDS软件程序来分析所得到的数据。所有的样品都分析两份。使用Ct(ΔCt)比较方法；Ct是PCR循环，其中检测基础水平之上的荧光的首次增加(firstincrease)，以计算每个基因的相对表达，并且将组成型表达基因GAPDH用作内源参照(reference control)。

结果

如表2和图3A中所示，在第二代时，与提取自相同个体的sub-ADSC细胞相比，在epi-ADSC细胞群中，检测到心脏转录因子GATA-4的基因水平的统计学显著的增加(p＜0.001)。相反地，对于剩余的心脏特异性标志物(α-辅肌动蛋白、β-MHC、cTnI、Cx43、SERCA-2和Nkx2.5)的基因表达，在所研究的两种类型的细胞群之间，未检测到显著的差异(图3A)。应当指出，在第5代时，GATA-4的表达差异增加(p＜0.001)，并且对于Cx43的转录水平也检测到显著的差异(p＝0.031)(图3B和3C)。这些结果表明，与来自相同个体的皮下脂肪的细胞群(sub-ADSC)相比，心外膜脂肪来源的干细胞群(epi-ADSC)更加向心脏细胞系定型。

表2

基因表达水平的定量

实施例4

在蛋白水平上epi-ADSC细胞和sub-ADSC细胞中心脏特异性标志物表达 的比较研究

通过免疫荧光和蛋白印迹技术，在蛋白水平上分析了心脏特异性标志物β-MHC、GATA-4、Nkx2.5、心脏肌钙蛋白I、SERCA-2、肌节α-辅肌动蛋白和连接蛋白-43的基础表达。

材料与方法

蛋白印迹

在4℃下，将细胞用冷PBS缓冲液重复洗涤，并在裂解缓冲液[25mMTris pH7.6、150mM NaCl、1mM EDTA(乙二胺四乙酸)、1mM EGTA(乙二醇四乙酸)、1％SDS(月桂基硫酸钠)、1mM PMSF(苯基甲基磺酰氟(phenylmethyl sulfonyl fluoride))、1μg/ml抑蛋白酶肽和1μg/ml亮抑蛋白酶肽]中匀浆30分钟。在4℃下，以13,000rpm离心30分钟获得SDS不溶部分。总提取物的蛋白浓度通过Bio-Rad DC蛋白试剂盒(BioRad)来确定，并且将BSA用作标准。将50μg的蛋白转移至孔径为0.45mm的硝酸纤维素膜，并用对所分析的不同心脏特异性标志物特异性的抗体来显影：Cx43(1/100)(BD Transduction Laboratories)、GATA-4(1/100)、SERCA-2(1/100)、抗心脏肌钙蛋白I(cTnI)(1/100)(前三种来自Santa CruzBiotechnology)、β-MHC(1/10)(Chemicon)和肌节α-辅肌动蛋白(1/100)(Sigma))。根据制造商的说明，将化学发光检测系统用于观察对应的特异性带(Pierce)。

免疫荧光

在室温下，将培养在专用于细胞的通过共焦显微镜(FluoroDish，WPIInc.)研究的，具有0.17mm玻璃底的35mm板中的细胞用PBS缓冲液重复洗涤，并用配制于PBS中的4％PFA(低聚甲醛)固定15分钟。然后，在室温下，用含1％BSA(牛血清白蛋白)/0.1％皂苷的PBS将细胞通透化30分钟。最后，将细胞与对所分析的不同心脏特异性标志物特异性的抗体一起孵育：Cx43(1/100)(BD Transduction Laboratories)、GATA-4(1/100)、SERCA-2(1/100)、心脏肌钙蛋白I(cTnI)(1/100)(Santa CruzBiotechnology)、β-MHC(未稀释)(Chemicon)和肌节α-辅肌动蛋白(1/100)(Sigma))，最后在荧光共焦显微镜(Leica)下进行分析。

结果

所述标志物蛋白水平表达的研究结果对其基因表达分析中获得的结果进行了补充。

由此观察到，在培养基中缺乏另外的心脏生成刺激物或因子时，只有epi-ADSC细胞在第2代和第5代时表达Cx43和GATA-4(图4A和4B)。还在epi-ADSC细胞的整个体外扩充期间(第2代至第5代)，观察到Cx43和GATA-4表达水平的增加。

应当指出，在第2代时，两种细胞群在蛋白水平上都缺乏钙SERCA-2泵和β-MHC的表达。但是，在第5代时，在两种细胞群中都检测到β-MHC和SERCA-2表达的增加(图4和5)，epi-ADSC细胞的β-MHC表达的增加比在来自同一个体的sub-ADSC细胞中所观察到的β-MHC表达的增加更多(图4)。

蛋白水平上这种差异表达的存在可能是由于所研究的两种细胞群之间转录翻译过程的调节机制的差异，或者是由于将mRNA翻译为成熟蛋白的过程的差异。

对于剩下的所分析的基因/蛋白，通过实时RT-PCR和蛋白印迹以及免疫荧光实验所获得的结果之间有高度的一致性。

实施例5

源自脂肪心外膜组织的干细胞(epi-ADSC)分化能力的分析

分析了源自心外膜脂肪的干细胞(epi-ADSC)分化为脂肪形成、成骨和软骨形成细胞系的能力。

材料与方法

将epi-ADSC细胞分化为成骨、脂肪形成和软骨形成细胞系

对每种细胞系采用特定的分化方法：成骨分化、脂肪形成分化和软骨形成分化。

○成骨分化

按照已经为皮下脂肪组织来源的干细胞和为其它细胞类型所建立的方法来进行分化为骨细胞的诱导(Zuk et al.，2002.Human adipose tissue isa source of multipotent stem cells(人脂肪组织是多能干细胞的来源).MolBiol Cell.2002Dec；13(12)：4279-95)。

在培养(DMEM培养基，2mM L-谷氨酰胺(Gibco)，100U/mL青霉素/链霉素(Gibco))中将细胞保持1周后，通过在特异性分化培养基中培养两周来诱导向骨细胞的分化，该分化培养基由DMEM(BE12-614F Cambrex，Biowhitaker)、10％FBS(5253Linus Cultek)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、100U/mL青霉素/链霉素(Gibco)、100nM地塞米松(Sigma)、50μM抗坏血酸-2-磷酸盐(Sigma)和10mM β-磷酸甘油(Sigma)组成。

○脂肪形成分化

按照已经为皮下脂肪组织来源的干细胞和为其它细胞类型建立的方法来进行分化为脂肪细胞的诱导(Zuk et al.，2002，上文所引用的；Awad etal.，2003.Effects of transforming growth factor betal and dexamethasone onthe growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells(转化生长因子β1和地塞米松对脂肪来源的基质细胞的生长和软骨形成分化的影响).Tissue Eng.2003Dec；9(6)：1301-12)。

在DMEM培养基、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、100U/mL青霉素/链霉素(Gibco)中，将细胞在培养中保持1周后，通过两种培养基(培养基A和培养基B)的交替(alternation)来诱导向脂肪细胞的分化，两种培养基的组成具体如下：

培养基A：DMEM(BE 12-614F Cambrex，Biowhitaker)、10％FBS(5253Linus Cultek)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、100U/mL青霉素/链霉素(Gibco)、1μM地塞米松(Sigma)、0.2mM吲哚美辛(Sigma)、10μg/ml胰岛素(Sigma)和0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Sigma)。培养基B：DMEM(BE12-614F Cambrex，Biowhitaker)、10％FBS(5253Linus Cultek)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、100U/mL青霉素/链霉素(Gibco)和10μg/ml胰岛素(Sigma)。

○软骨形成分化

按照已经为皮下脂肪组织来源的干细胞和为其它细胞类型建立的方法来进行分化为软骨细胞的诱导(Zuket al.，2002，上文所引用的)。通过改变培养基和使细胞处于低氧浓度的组合来诱导分化

诱导前(Preinduction)：将克隆在锥形底96孔板中离心，并使细胞团块(cell agglomerate)在含有1％FBS的DMEM中生长24小时。

诱导：将克隆在特定的培养基中维持20天，每3天更换培养基，并且培养基由DMEM(BE12-614F Cambrex，Biowhitaker)、1％FBS(5253Linus Cultek)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、100U/mL青霉素/链霉素(Gibco)、6.25μg/ml胰岛素(Sigma)、10ng/mL TGFB-1(R&D)和50nM抗坏血酸-2-磷酸盐(ascorbic acid-2-phosphate)(Sigma)组成。

分化为骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的epi-ADSC细胞的染色

使用了适合于每种分化的不同染色方法：

○成骨分化的染色：

在4℃下，将细胞用50％乙醇固定15分钟。在搅拌和室温下，用含1％茜素红的蒸馏水(pH＝4.1)染色45分钟。集落(colony)被染为强烈的红色，所述集落已经分化并因此在它们周围产生钙。

○脂肪形成分化的染色：

在室温下，将细胞用含1∶10稀释的37％甲醛的PBS(pH7.4)固定20分钟。用油红(100ml异丙醇中含0.3g油红，在蒸馏水中1∶2稀释)进行染色，并在室温下孵育20分钟。积累在分化的细胞的液泡中的脂质被染为红色。

○软骨形成分化的染色：

在室温下，将细胞用4％甲醛稀释液固定1小时。用含0.1％稀释度的爱茜蓝的“酸醇”(蒸馏水中含70％乙醇、1％HCl)进行染色，并在室温下孵育1小时。洗涤后，将染色再用4％PFA固定。分化的细胞被染为蓝色。

结果

对脂肪形成、成骨和软骨形成细胞系特异性的染色结果的分析显示，源自心脏脂肪组织的干细胞，特别是源自心外膜区域的干细胞(epi-ADSC)的染色明显弱于皮下脂肪组织来源的干细胞(sub-ADSC)。强烈颜色的出现表明较大程度的分化，因此可得出结论，相对于皮下脂肪组织来源的干细胞(sub-ADSC)，心脏脂肪组织来源的干细胞(epi-ADSC)具有较弱的分化为脂肪细胞、骨细胞和成骨细胞的能力。

实施例6

人心脏脂肪组织来源的干细胞(ADSC)的分离和表征

1.材料与方法

1.1心脏脂肪组织和细胞培养物的收集

从在开始心肺转流术(cardiopulmonary bypass)之前接受心脏手术的患者获得心脏脂肪组织的活组织检查样品。从接近心脏并围绕主动脉获取心外膜脂肪组织的活组织检查样品(平均约0.5g至1.0g)。将来自117名患者(年龄：67.5±9.2岁)的心脏脂肪组织的活组织检查用于进行这项研究，所述患者提供了他们的知情同意书。本研究得到Santa Creu i SantPau医院伦理委员会的批准。

如Martinez-Estrada，O.M.，et al.，Human adipose tissue as a source ofFlk-1+cells：new method of differentiation and expansion(人脂肪组织为Flk-1+细胞的来源：新的分化和扩充方法).Cardiovasc Res 65，328-33(2005)所述，处理并分离样品。在补充了10％FBS和1％青霉素-链霉素的α-MEM培养基(Gibco Invitrogen Corp.，Grand Island，NY，USA)中，使附着的细胞生长，直至亚融合(subconfluence)，并在通常条件下进行培养。

1.2产克隆(clonogenic)测定

根据McFarland[McFarland，D.C.Preparation of pure cell cultures bycloning(通过克隆制备纯细胞培养物).Methods Cell Sci 22，63-6(2000)]描述的方法进行产克隆测定。简言之，将细胞以400个细胞/100cm²的密度接种在培养板内，使单个的克隆发展至它们达到几毫米(mm)的直径。然后，除去培养基，并将克隆环围绕集落放置。向克隆环内添加补充了20％FBS和1％青霉素-链霉素的α-MEM完全培养基，并将板以通常条件进行培养。

1.3畸胎瘤的评价

为了评价人心脏ADSC的致畸潜力，对4只12周大SCID小鼠(CB17xC57B1/6)(30g，Charles River Laboratories Inc.Wilmington，MA，USA)进行了皮下和肌肉内注射(1.5×10⁶个细胞)。每周检查动物以评价肿瘤的形成。细胞注射后4个月后，收集皮肤、骨骼肌、肝和脾并对它们进行组织学分析。

1.4脂肪形成和成骨分化测定

对扩充的原代细胞培养物进行测定以确定脂肪形成和成骨潜力。如之前的描述[Phillis，B.D.，et al.Modification of d-amphetamine-inducedresponses by baclofen in rats(大鼠中通过巴氯芬改变d-苯丙胺诱导的应答).Psychopharmacology(Berl)153，277-84(2001)；Roura，S.et al.Effect ofaging on the pluripotential capability of human CD105+mesenchymal stemcells(老化对人CD105+间充质干细胞的多能能力的影响).Eur J HeartFail 8，555-63(2006)]，进行分化和茜素红S染色测定。

1.5流式细胞术

在第二代收集细胞，并用对CD105(Serotec)、CD44、CD166、CD29、CD90、CD117、CD106、CD34、CD45、CD14、CD133和VEGFR2特异性的单克隆抗体(BD Pharmingen)对细胞进行免疫染色。每种抗原的流式细胞水平通过特异性抗体与IgG同种型对照(Caltag Laboratories，Burlingame，CA，USA)之间的比率来定义(1＝无差异)。将Coulter EPICS XL流式细胞仪(Beckman Coulter，Miami，FL，USA)用于获得全部数据，并利用Expo32程序(Beckman Coulter)进行分析。

1.6免疫抑制测定

为了分析心脏ADSC对外周血淋巴细胞(PBL)增殖的影响，在存在或不存在适当的刺激物(PHA 5μg/ml)的情况下，将心脏ADSC与2×10⁵个PBL接种在5×10³板中。将供体L100605(CMDL)的皮下ADSC接种在板中作为免疫抑制的对照。刺激4天后，向培养基添加BrdU，保持24小时，并按制造商的说明(细胞增殖ELISA BrdU，Roche)，通过ELISA来确定增殖。将实验重复三次。显示了关于无祖细胞PBL增殖的数据。

1.7基因芯片表达的分析

利用QuickPrep总RNA提取试剂盒(Amersham，Freiburg，Germany)，根据制造商的说明，于第2代，分离4名不同患者的心脏ADSC的总RNA。从RNA制备cRNA，与Affymetrix HG-U133 Plus 2.0芯片杂交，并进行分析以确定差异表达的基因。如以前的描述[Virtaneva，K.et al.Expressionprofiling reveals fundamental biological differences in acute myeloidleukemia with isolated trisomy 8 and normal cytogenetics(表达谱揭示具有单独的8三体性与正常细胞遗传学的急性髓细胞白血病中的基本生物学差异).Proc Natl Acad Sci USA 98，1124-9(2001)]，由Instituto deInvestigacióen Biomedicina(生物医学研究院(Institute of BiomedicalResearch))(Barcelona，Spain)的Grupo de Genómica Funcional(功能基因组小组(Functional Genomic Group))，根据制造商的说明(Affymetrix，SantaClara，CA)，处理基因芯片微阵列。在惠普基因阵列扫描仪(Hewlett-Packard GeneArray Scanner)中扫描表达信号。

利用R对数据进行统计学分析。首先，采用R中所提供的gcRMA算法，使未经处理的数据标准化，然后利用FLUSH[Calza，S.et al.Filteringgenes to improve sensitivity in oligonucleotide microarray data analysis(过滤基因以改进寡核苷酸微阵列数据分析的灵敏度).Nucleic Acids Res 35，e102(2007)]来过滤探针，并利用GenePattern[Reich，M.et al.GenePattern2.0.Nat Genet 38，500-1(2006)]来提取相关的变化。将所得的结果与从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/；注册ID：GDS2366)获得的那些关于未分化的皮下脂肪组织来源的细胞的公开阵列的结果[Tchkonia，T.et al.Identification of depot-specific human fat cell progenitors throughdistinct expression profiles and developmental gene patterns(通过不同的表达谱和发育基因模式鉴定部位特异性人脂肪细胞祖细胞).Am J PhysiolEndocrinol Metab 292，E298-307(2007)]进行比较。为此，将阵列中的每组以百分比范围策略(percentage range strategy)进行分类(两项研究都在相同平台中进行)，然后在这2项研究之间比较这种百分比范围。使用百分比范围而不是强度值使得能防止可能存在于任何杂交中的任何系统偏差。

1.8定量实时RT-PCR

如之前所解释的，分离心脏ADSC和皮下ADSC的总RNA。利用随机六聚体(Qiagen)和ScriptTM单步RT-PCR试剂盒(BioRad Laboratories)，根据制造商的方法，从2mg的总RNA合成cDNA。定量实时RT-PCR方法的细节描述如下。

简言之，通过PCR，用2ml的cDNA进行扩增，并且最终体积为50μl，其含有25ml的TaqMan 2X通用PCR Master Mix和用从AppliedBiosystems(Foster City，CA，USA)获得的FAM标记的每种探针/引物2ml：GATA4(Hs00171403_m1)、连接蛋白43(Cx43)(Hs00748445_s1)、SERCA2(Hs00544877_m1)、心脏肌钙蛋白I(cTn-I)(Hs00165957_m1)、肌节α-辅肌动蛋白(Hs00241650_m1)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)(Hs00165276_m1)、VCAM-1(Hs00365486_m1)、冯维勒布兰德(vonWillebrand)因子(vWF)(Hs00169795_m1)、VE-钙粘着蛋白(Hs00174344_m1)、CD34(Hs00990732_m1)、EGR-3(Hs00231780_m1)、CD102(Hs00168384_m1)、CD36(Hs00169627_m1)、VEGF-A(Hs00173626_m1)、EGR-1(Hs00152928_m1)、CD31(Hs00169777_m1)、SDF-1(Hs00930455_m1)、CXCR-4(Hs00237052_m1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(Hs99999905_m1)。在ABI Prism 7000(ABI)序列检测系统中收集并分析数据。每个样品分析两次。如已经描述的[Pfaffl]，M.W.A newmathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR(实时RT-PCR中用于相对定量的新数学模型).Nucleic Acids Res 29，e45(2001)]，将Δ阈值循环方法(Ct)用于(Ct是PCR循环，其中第一次检测到高于起初水平的指示剂荧光的增加)计算每个基因表达的相对定量，并且将GAPDH用作内源参照。

1.9蛋白提取和蛋白印迹

根据已经描述的方法[Roura，S.et al.Idiopathic dilated cardiomyopathyexhibits defective vascularization and vessel formation(特发性扩张型心肌病显示有缺陷的血管化和血管形成).Eur J Heart Fail 9，995-1002(2007)]来获得蛋白提取物。通过Bio-Rad DC蛋白测定(Bio-Rad)，用牛血清白蛋白(BSA)来将蛋白水平标准化，并且将样品在5％至10％的SDS-PAGE凝胶中分离。将蛋白转移至硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上，分别用对GATA4(1∶500)、SERCA2(1∶100)、α-肌动蛋白(1∶300)、cTnI(1∶300)(Santa CruzBiotech.)、Cx43(1∶500)(BD Transduction，Lexington，KY，USA)、β-MHC(1∶10)(Chemicon，Temecula，CA，USA)和肌节α-肌动蛋白(1∶500)(Sigma，St.Louis，MO，USA)特异性的单克隆抗体(AcM)对蛋白进行检查。将增强的化学发光检测系统(Amersham BioSciences)用于观察蛋白带。

1.10免疫细胞荧光染色

在室温下，将细胞通透化，在5％正常山羊血清(normal goat serum)中封闭30分钟，并用抗-GATA4、抗SERCA2、抗cTnI(2μg/ml)(Santa CruzBiotechnology)、抗α肌节肌动蛋白(1∶500稀释)(Sigma)、抗β-MHC(不稀释)(Chemicon)和抗Cx43(2.5μg/ml)(BD Transduction)的抗体标记1小时。应用与Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 568偶联的第二抗体(5μg/ml)(Molecular Probes)，并用共焦激光扫描显微镜(Leica TCS SP5)来观察信号。

1.11心脏ADSC共培养

如之前描述的[Gandia，C.et al.Human dental pulp stem cells improveleft ventricular function，induce angiogenesis，and reduce infarct size in ratswith acute myocardial infarction(人牙髓干细胞在患有急性心肌梗死的大鼠中改善左心室功能、诱导血管生成并减小梗死大小).Stem Cells 26，638-45(2008)]，通过病毒转导，用eGFP标记心脏ADSC。如之前描述的[Fukuhara，S.et al.Direct cell-cell interaction of cardiomyocytes is key forbone marrow stromal cells to go into cardiac lineage in vitro(直接细胞细胞相互作用对于骨髓基质细胞在体外成为心脏细胞系是关键的).J ThoracCardiovasc Surg 125，1470-80(2003)]，通过酶分散，从初生大鼠(1天至3天大)分离新生大鼠心肌细胞。在4∶1DMEM∶M-199(Sigma)中，将心肌细胞以5×10⁴个细胞/cm²的密度维持在涂覆有2％明胶的板上，用于实验，该4∶1DMEM∶M-199(Sigma)补充了5％FBS、10％马血清(Invitrogen)、1％青霉素-链霉素和100μM胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(Sigma)。然后将eGFP+ADSC和新生心肌细胞以1∶25的比率混合，并将它们以5×10⁴个细胞/cm²的细胞密度接种。在37℃下和含5％CO₂的空气中，将这些细胞不间断地一起培养(共培养)30天。

1.12内皮分化测定

如之前描述的[Heydarkhan-Hagvall，S.et al.Human adipose stem cells：a potential cell source for cardiovascular tissue engineering(人脂肪干细胞：心血管组织工程的潜在细胞来源).Cells Tissues Organs 187，263-74(2008)；Liu，J.W.et al.Characterization of endothelial-like cells derived from humanmesenchymal stem cells(源自人间充质干细胞的内皮样细胞的表征).JThromb Haemost 5，826-34(2007)]，扩充心脏ADSC并分析内皮分化。将Dil-Ac-LDL(10μg/ml，Biomedical Technologies)的掺入用于评价内皮分化。

1.13血管结构的体外形成

为了诱导管腔化(tubulogenesis)，将心脏ADSC以每cm² 26,000个细胞的密度接种在涂覆有1％ECMatrix^TM(Chemicon International)的板上，并且用生物素化的GSLI同工凝集素B4(Griffonia Simplicifolia I B4凝集素)(Vector Labs)，在2、4和7小时检查小管形成。将偶联了Alexa Fluor568的链霉亲和素(5μg/ml)(Molecular Probes)用于检测被标记的细胞。

1.14心脏ADSC的成血管(vasculoeenesis)潜能

在常氧(21％O₂)、中度低氧(5％O₂)和重度低氧(1％O₂)下培养24小时的第二代中，从10,000个细胞/cm²获得条件培养基。利用多重免疫测定(Procarta细胞因子测定试剂盒(Cytokine Assay Kit)，Panomics)来分析血管生成细胞因子浓度。条件培养基中所分析的的细胞因子为IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF、PDGF_BB和bFGF。结果表示为收集培养基时，10⁶个细胞所分泌的因子的平均值±s.d.(pg)。

2.结果

2.1心脏ADSC的分离和表征

从所有经历心脏手术患者的心脏脂肪组织样品成功地分离干细胞(祖细胞)群，并在单层培养中扩充和进行表征(图6)。在所描述的条件下培养3天后，出现类似于连接的成纤维细胞的一些伸长的细胞(图6b)。

这些细胞是产克隆的，复制时间(Td)约为5天的，并且不在SCID小鼠中诱导畸胎瘤形成(数据未显示)。有趣的是，观察到用脂肪形成和成骨培养基培养心外膜脂肪组织来源的干细胞(epi-ADSC)未引起脂滴(lipiddrop)的细胞内积累，也未引起细胞外钙沉积(图7a)；然而，相反地，皮下脂肪组织来源的干细胞(sub-ADSC)容易地获得脂肪形成细胞系(图7b)。

对表面标志物情况进行检查以在免疫表型上表征所分离的心脏ADSC。超过90％的细胞表达间充质干细胞(MSC)类型模式。所述细胞对CD105、CD44、CD166、CD29和CD90为强阳性，对CD106、CD117、CD34、CD45、CD14和CD133以及VEGFR2为弱阳性或阴性(图6c)。

另外，心脏ADSC可部分地抑制外周血淋巴细胞增殖(42％增殖减少)，这表明了心脏ADSC中等的免疫抑制能力。

2.2心脏ADSC的心肌形成细胞系分化

进行微阵列基因芯片分析以分析心脏ADSC的基因表达谱。将结果与从GEO数据库得到的未分化的皮下脂肪组织来源的细胞的基因表达进行比较。在检查的约22,000个基因中，与皮下脂肪组织来源的干细胞相比，发现了心脏ADSC内一些心脏标志物的差异表达(表3)。

利用定量实时RT-PCR(图8)，与分离的皮下脂肪组织干细胞相比，在心脏ADSC中检测到GATA4转录因子和连接蛋白43(Cx43)非常高的表达，该连接蛋白43为负责邻近心肌细胞间电化学偶联的蛋白。SERCA2、cTnI、肌节α-辅肌动蛋白和β-MHC的转录水平在两种细胞群中类似。

在蛋白水平上，在初始培养基中，心脏ADSC表达β-MHC、SERCA2、肌节α-肌动蛋白、Cx43和GATA4(图9a)以及痕量的Tbx5(数据未显示)。通过蛋白印迹(图9a)和免疫荧光(图9b至9e)证实了这些结果。如所观察到的，β-MHC纤维已显示出确定的胞质分布(图9b)。相反地，皮下ADSC显示出缺乏β-MHC、Cx43、cTnI和GATA4，以及肌节α-肌动蛋白的较低表达(图9a)。

人心脏ADSC和新生大鼠心肌细胞的共培养显示了所分析的人细胞的心脏生成潜力。共培养中β-MHC(图10c)、肌节α-肌动蛋白(图10n)、Cx43(图10m)、SERCA2(图10q)和GATA4(图10r)的强度和配置(disposition)增强了，并且与在新生心肌细胞中所观察到的强度和配置相当。更重要的是，共培养刺激了肌钙蛋白I的表达，其是重要的肌节蛋白，而在未刺激的培养中没有观察到该肌钙蛋白I的表达(图10b、10f和10j)。肌钙蛋白I胞质中的排列也类似于在培养中的心肌细胞内所观察到的亚细胞肌节组织(organization)。

2.3培养中的心脏ADSC向内皮细胞系的分化

如之前所述的，在心脏ADSC中进行的基因芯片微阵列分析，及其与未分化的皮下脂肪组织来源的细胞的比较显示了心脏ADSC中具有更大百分比范围的促血管生成基因的表达。另外，血管生成抑制剂的表达显著地低(表4)。

为了确定人心脏ADSC的内皮细胞系潜力，用EGM-2分化培养基培养细胞。处理与未处理(对照)细胞的内皮转录水平的比较显示出内皮标志物CD34、VEGF-α、VCAM-1、VE-钙粘着蛋白、ERG-1、ERG-3、CD31和SDF-1表达的增加(图11)。有趣的是，观察到SDF-1因子表达出现了120倍的增加，该SDF-1因子有助于内皮祖细胞的迁移及增强成血管[Yamaguchi，J.et al.Stromal cell-derived factor-1 effects on ex vivoexpanded endothelial progenitor cell recruitment for ischemicneovascularization(基质细胞衍生因子-1对为缺血性新血管形成所募集的离体扩充的内皮祖细胞的影响).Circulation 107，1322-8(2003)；Zhang，M.et al.SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic supportof cardiac myocytes after myocardial infarction(间充质干细胞的SDF-1表达导致对心肌梗死后心肌细胞的营养支持).Faseb J 21，3197-207(2007)]，而CD31、ERG1和ERG3分别增加15、10和16倍以上。而且，也通过DiI-Ac-LDL的快速掺入和代谢证实了这些细胞的内皮分化[Voyta，J.C.etal.Identification and isolation of endothelial cells based on their increaseduptake of acetylated-low density lipoprotein(基于内皮细胞对乙酰化低密度脂蛋白摄取的增加而鉴定并分离内皮细胞).J Cell Biol 99，2034-40(1984)](图11b)。

还进行了功能性血管生成测定，以证实心脏ADSC分化为内皮细胞系的能力。在基质胶涂层内和通常条件下培养细胞后，形成了管状结构。这些结构快速发展以形成管状网络，并且在其组织结构和其直径方面生长(图11c至11e)。还对所述细胞进行染色以检测特异性内皮标志物GSLI同工凝集素B4(图11f和11g)。

2.4心脏ADSC分泌促血管生成因子

在低氧条件下分析了促血管生成因子的体外分泌，以测试，当将心脏ADSC注射入心肌缺血时，该心脏ADSC是否在宿主组织中分泌这些因子，从而增强血管形成。在常氧下，细胞分泌显著量的IL-6(53.677±24.613pg/ml/10⁶个细胞)和VEGF(3.201±1.011pg/ml/10⁶个细胞)，以及少量的bFGF(161.0±31.2pg/ml/10⁶个细胞)和TNF-α(59.1±16.0pg/ml/10⁶个细胞)。未检测到IL-1β或PDGF_BB的表达。在中度低氧(5％O₂)和重度低氧(1％O₂)下，VEGF的分泌大量增加(92％；p＝0.04)，IL-6、bFGF和TNF-α浓度增加约20％。IL-1β和PDGF_BB的水平仍然是不可检测的。

实施例7

心肌梗死后心脏ADSC的移植改善心脏功能

1.材料与方法

1.1心肌梗死和细胞移植模型

1.1.1大鼠

将总共16只雄性裸大鼠(200g至250g；NIH-Foxn1^rnu，Charles RiverLaboratories Inc.Willmington，MA，USA)用于这项研究。如之前所述的[Gandia，C.et al.Human dental pulp stem cells improve left ventricularfunction，induce angiogenesis，and reduce infarct size in rats with acutemyocardial infarction(人牙髓干细胞在患有急性心肌梗死的大鼠中改善左心室功能、诱导血管生成并减小梗死大小).Stem Cells 26，638-45(2008)]，将左冠状动脉结扎。将大鼠插管，用O₂/喜保福宁(Sevorane)混合物麻醉，并进行机械通气(Harvard Apparatus 683型小动物换气机(HarvardApparatus model 683 small animal ventilator))，并且在胸廓切开术后，通过用6-0聚丙烯纺织纤维永久性结扎LAD冠状动脉来诱导急性心肌梗死。将切口用3-0丝缝线闭合。一周后，将大鼠麻醉，并通过正中胸骨切开术再次打开，以便进行心肌内移植(悬浮在盐水中的106个心脏GFP-ADSC细胞或等体积盐水)，用汉密尔顿注射器(Hamilton syringe)在梗死边界区域的5个点注射5次5μl的体积。

注射细胞约30天后，用终止液(68.4mM NaCl、59mM KCl、11.1mM葡萄糖、1.9mM NaHCO₃、29.7mM BDM(2，3-丁二酮-单肟(2，3-butanedione-monoxime))、1,000U肝素)将心脏停止在舒张期，将心脏切开、固定、冷冻于含30％蔗糖的PBS中，包埋在OCT(Sakura，Torrance，California，USA)中，并用液氮在冷却的异戊烷中快速冷冻。将组织块保存在-80℃，直到将它们切片。

在所有过程中，使用实验室动物研究所的实验室动物管理与使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Institute ofLaboratory Animal Research)(NIH Pub.No.86-23，1996年修订)的标准。

1.1.2超声波心动描记法

为了评价心脏功能，如以前描述的[Friedrich，J.et al.31P nuclearmagnetic resonance spectroscopic imaging of regions of remodeledmyocardium in the infarcted rat heart(梗死大鼠心脏中重塑心肌区域的31P核磁共振光谱成像).Circulation 92，3527-38(1995)]，在大鼠中进行经胸廓超声波心动描记法。使用配备了10MHz线性网络传感器(transducer)的超声波心动描记系统(General Electric)，并且在初始水平(梗死前1天)和细胞移植后15及30天进行测量。在胸骨旁短轴观(view)进行中央乳头二维(2-D)M模式超声波心动描记。利用常规方法[Litwin，S.E.，Katz，S.E.，Morgan，J.P.& Douglas，P.S.Serial echocardiographic assessment of leftventricular geometry and function after large myocardial infarction in the rat(大鼠中大面积心肌梗死后左心室几何形状和功能的连续超声波心动描记评价).Circulation 89，345-54(1994)]，在5个连续心脏循环上计算功能参数。

对舒张期和收缩期中前壁和后壁(AW和PW)的尺寸、舒张末期(LVDd)和收缩末期(LVDd)LV的尺寸、舒张末期面积(EDA)和收缩末期面积(ESA)进行定量。AW和PW的变化分别计算为(AWs/AWd-1)x100和(PWs/PWd-1)x100。缩短分数(FS)按[(LVDd-LVDs)/LVDd]x100计算，射血分数(EF)按[(LVEDV-LVESV)/LVEDV]x 100计算。

1.2形态测量

1.2.1大鼠

将大鼠心脏横切为三个节段：顶部、中部(包含结扎)和基部。为了测量，将中部节段的10μm厚的冷冻切片(6个切片，分开200μm)用Masson三色连续染色，并利用图像分析软件(ImageJ，NIH)确定形态测量参数。梗死大小根据总LV壁表面内平均瘢痕面积的百分比来测量。梗死厚度根据部分心内(endocardial)梗死面积的总和来计算[Takagawa，J.et al.Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model：comparison of area-and length-based approaches(小鼠慢性梗死模型中的心肌梗死大小测量：基于面积和基于长度的方法的比较).J Appl Physiol 102，2104-11(2007)]。对所有的切片都进行盲检(examine blindly)，并利用Leica立体镜(Leica TL RCI)照相。

1.2.2免疫荧光组织学

对大鼠心脏的冷冻切片进行双重免疫染色。将组织与抗CD31(1∶25)(Abcam)和肌节α-肌动蛋白(1∶500稀释)(Sigma)或cTnI(2μg/ml)(SantaCruz Biotechnology)的第一抗体一起孵育。为了对大鼠心脏中的人细胞进行免疫组织学检测，将组织切片与抗人核抗原抗体(HNA，Chemicon)一起孵育。使用与Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568和Alexa Fluor 647偶联的第二抗体(5μg/ml)(Molecular Probes)。用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylyndole)(DAPI，Sigma)对切片进行复染，并用LeicaTCS SP5进行分析。

1.2.3毛细血管密度

为了确定梗死的边界区域中和梗死的远端心肌中的毛细血管密度，利用生物素化的GSLI同工凝集素B4(Vector Labs)将心脏切片染色。将偶联了Alexa Fluor 568的链霉亲和素用作检测系统。在4只对照动物和5只处理的动物的至少12个随机选择的部位(6个边界区域+6个远端区域)中对毛细血管记数。结果表示为每mm²组织面积的平均毛细血管数量。两名对处理不知情的独立观察者分析了对照组和处理组，并且组间相关系数(correlation coefficient between classes)(CHF)在边界区域中为0.821(p＜0.001)，在远端区域中为0.743(p＜0.001)。考虑到研究者获得的值是类似的，每个点的最终结果为平均值±SEM。

1.2.4统计学分析

所有的切片都由两名研究者进行盲检、记数和审核(review)。FS、EF和AWT数据的统计学显著性通过用于组间多重比较的方差分析(双因素ANOVA(two-way ANOVA))来评价，并应用Greenhouse校正。MI期间和30天后的超声波心动描记参数(表5)，以及对照组与细胞之间的形态测量值都利用t检验进行比较。结果表示为平均值±SD。利用t检验，还比较边界和远端区域内对照组与细胞之间的毛细血管密度差异。p＜0.05的值被认为在组间是显著的。用SPSS进行描述统计。

2.结果

2.1心脏ADSC移植改善心肌梗死后的心脏功能

在最初水平，心肌梗死(MI)后，以及向裸大鼠注射细胞高达30天后获得对照组和心脏ADSC组的超声波心动描记参数(表5)。在最初水平和MI后，所分析的超声波心动描记参数值在处理和未处理的动物中类似，这表明相似水平的组织损伤。MI后，在MI与30天之间，在处理的组中检测到明显的功能改善(表5)。对照组的发展显示出由于左心室(LV)的重塑而引起的心脏功能参数的进行性(progressive)恶化，这通过LV的直径和舒张末期及收缩末期LV的面积来确定(表5)。利用双因素ANOVA系统发现，对照组与用细胞处理的组在缩短分数(p＝0.024)和射血分数(p＝0.003)方面有显著差异(图12a和12b)。而且，在心脏ADSC处理30天后，前壁显著地更厚(p＝0.014)(图12c)。心脏活动性的视频记录显示了心脏ADSC组中收缩性的改善，但对照组中并非如此。

2.2心脏ADSC移植减少梗死大小

将Masson三色染色的横切片用于测量MI大鼠模型中形态参数。在结扎LAD后出现了中度瘢痕(LV面积的约20％)，并且心脏ADSC的有益效果是非常明显的。与对照动物相比，处理的动物中纤维瘢痕组织面积百分比低75％，并且处理的动物中LV壁厚45％。因此，通过组织病理学，注射心脏ADSC 30天后，心脏ADSC有效地降低了梗死大小。

2.3人心脏ADSC移植和体内分化

通过跟踪eGPF表面荧光(eGPF epifluorescence)来分析人心脏ADSC图，并且通过HNA(人核抗原)检测(红色信号)来证实来源于人(图14a)。还通过染色分离的光谱分析(λ考察(lambda exploration))来证实eGFP的特异性信号(图15)。有趣的是，观察到细胞均匀地位于组织的瘢痕区域内，并且与针对梗死边界区域的注射无关，这表明细胞能够向可能特别需要它们的地方迁移(图14b)。为了分析所注射细胞的心脏和内皮分化水平以及它们在宿主组织内的移植，进行了针对心脏标志物(肌节α-辅肌动蛋白和肌钙蛋白I)和内皮标志物(CD31)的双重免疫染色。心脏eGFP+-ADSC再次显示出肌钙蛋白I的表达(图14b)，并且对肌节α-辅肌动蛋白是阳性的(图14c)。在心脏eGPF+-ADSC中也观察到CD31的表达，其在形成管状结构的组织内普遍排列(arrange)，这提示这些细胞有助于新血管的形成(图14d)。

2.4心脏ADSC导致血管密度增加

最后，将GSLI同工凝集素B4用于评价纤维化组织(fibrotic tissue)边界区域内和心脏ADSC移植一段时间后的毛细血管密度。如图16c所示，接收了心脏ADSC的动物中边界区域内的毛细血管密度比对照动物高1.6倍(p＝0.003)(图16a和16b)，并且还发现了远端区域内毛细血管密度增加的趋势(p＝0.057)。这些血管的管腔(lumen)内血细胞的存在表明这些血管是有功能的。

3.讨论

本说明书所附的实施例1至7中所示的结果清楚地表明，已经鉴定并表征了心脏脂肪组织来源的新成体干细胞群(心脏ADSC)。所述心脏ADSC表达类似于间充质干细胞(MSC)的表面标志物，并保留了产克隆能力；而且，尽管所述心脏ADSC来自脂肪组织，但是它们不像MSC那样分化为脂肪细胞，这表明了较低的可塑性和更为确定的状况。而且，心脏ADSC表达几种必要的心肌形成标志物，例如GATA4、Cx43、β-MHC、肌节α-辅肌动蛋白或SERCA2。心脏ADSC和皮下ADSC的基因表达及心肌形成蛋白的比较显示，这些蛋白在心脏ADSC中表达明显更高。这些结果提示，尽管新心脏ADSC位于脂肪细胞环境中，但是它们可在心脏内环境稳定中起作用。围绕心脏的脂肪还可充当细胞的预留(reservation)，来用于更新心肌组织；然而，梗死后产生的面临风险的大量心肌超出了组织修复的内环境稳定能力。

当心脏ADSC受新生大鼠心肌细胞的影响时，心肌形成标志物的表达被明显上调(α-辅肌动蛋白肌节、β-MHC、SERCA2)，或被从头激活(肌钙蛋白I)。较早的研究证实，新生心肌细胞刺激的心脏分化的机制可以是分化因子的分泌、细胞间相互作用以及电和机械刺激。而且，心脏ADSC在基质胶或在内皮分化培养基中的培养导致管状结构的形成，导致Dil-Ac-LDL的掺入，以及导致内皮标志物表达的增强。体内实验也证实了心脏ADSC分化为心脏细胞系的能力。当心脏ADSC被移植入梗死的心肌中时，观察到所述心脏ADSC表达肌节α-辅肌动蛋白、cTnI和CD31，并且被有效地移植在心肌中。细胞相互作用连同组织的电和机械影响刺激了心脏ADSC的分化。细胞移植获得了改善的心脏功能，并且用细胞处理的动物中射血分数、缩短分数和LV壁厚度有明显增加。心脏ADSC的有益效果等同或优于通过骨髓细胞[Agbulut，O.et al.Comparison ofhuman skeletal myoblasts and bone marrow-derived CD 133+progenitors forthe repair of infarcted myocardium(用于修复梗死的心肌的人骨骼成肌细胞和骨髓来源CD133+祖细胞的比较).J Am Coll Cardiol44，458-63(2004)]和成体心脏干细胞[Beltrami，A.P.et al.Adult cardiac stem cells aremultipotent and support myocardial regeneration(成体心脏干细胞是多能性的并支持心肌再生).Cell 114，763-76(2003)]所观察到的有益效果，所述骨髓细胞和所述成体心脏干细胞分别改善射血分数7％和9.7％；或者等同或优于通过脐带血单核细胞[Henning，R.J.et al.Human umbilical cordblood mononuclear cells for the acute myocardial infarction treatment(用于急性心肌梗死治疗的人脐带血单核细胞).Cell Transplant 13，729-39(2004)]所观察到的有益效果，当所述脐带血单核细胞被移植入梗死的心肌中时，它们显示了27％的射血分数降低。

为了确定心脏ADSC是否能够在缺血性组织中存活并有益于血管生成，将细胞在中度和重度低氧条件下培养，并分析促血管生成因子向培养基中的分泌。结果显示，与常氧相比，VEGF、TNF-β、bFGF和IL-6增加了。已有报道，当向动脉硬化患者提供单一的血管生成因子时，新血管形成应答仅是有限的。这种结果可能的解释是，血管网络的形成及其扩充是需要多种因子协同作用的过程。因此，心脏ADSC基线条件下促血管生成因子的组合的分泌以及该促血管生成因子在低氧状况下的增加使得这些细胞潜在地用于它们在心肌缺血中的注射。事实上，在将心脏ADSC移植入梗死的心脏后，观察到了毛细血管密度的明显增加。所有这些情况综合地提示，这些细胞(心脏ADSC)可对心肌缺血有旁分泌效果，从而有益于新血管的形成。大量的毛细血管改善了心肌中的氧限制，因此有益于这样的梗死大小明显减小，即大鼠中43％的减少。而且，有报道显示SDF-1的增加可在梗死后改善心肌细胞的存活并诱导新血管形成[Penn，M.S.& Mangi，A.A.Genetic enhancement of stem cell engraftment，survival，and efficacy(干细胞植入、存活和功效的遗传增强).Cire Res 102，1471-82(2008)]。因此，心脏ADSC体内内皮细胞系的证实和体外内皮分化后观察到的SDF-1明显的过量表达提示，SDF-1具有对心肌细胞的心脏保护效果以及血管生成效果。

应当观察到，尽管心脏ADSC被注射在梗死的边界区域内，但是细胞却位于纤维化瘢痕内。这表明了心脏ADSC从注射位点向特别需要它们的缺血区域迁移的能力。利用其它干细胞系的较早期实验证实了类似的结果，这通过由于低氧条件下VEGF的趋化效应所导致的细胞迁移应答(migration response)得到了解释[Gandia，C.et al.Human dental pulp stemcells improve left ventricular function，induce angiogenesis，and reduceinfarct size in rats with acute myocardial infarction(人牙髓干细胞在患有急性心肌梗死的大鼠中改善左心室功能、诱导血管生成并减小梗死大小).Stem Cells 26，638-45(2008)；Matsushita，K.et al.The role of vascularendothelial growth factor in human dental pulp cells：induction of chemotaxis，proliferation，and differentiation and activation of the AP-1-dependentsignaling pathway(血管内皮生长因子在人牙髓细胞中的作用：诱导趋化性、增殖和分化并激活AP-1依赖性信号途径).J Dent Res 79，1596-603(2000)]。在同级别的证据中，在鸡胚胎中进行的研究显示，心脏损伤是吸引人脐带血来源的干细胞的有力刺激[Torre-Perez，N.et al.Migrationand differentiation of human umbilical cord stem cells after heart injury inchicken embryos(鸡胚胎中人脐带血干细胞在心脏损伤后的迁移和分化).Stem Cells Dev(2008)]。

心脏脂肪组织围绕心脏紧密排列，因而心脏ADSC的获取是不利条件。尽管可容易地进行左侧胸廓切开术以获得心脏脂肪活组织检查来分离这些心脏ADSC，但是这种方法看来在心肌梗死的紧急状况下，在临床上是不合适的，虽然其可在稳定的缺血性患者的冠状动脉搭桥手术之前使用。但是，心脏ADSC具有类似于对其它类型的间充质干细胞描述的免疫抑制能力的事实使得在将来有在同种异体治疗上使用这些细胞的可能性。

总之，本发明描述了具有内在内皮和心脏潜力的新类型的干细胞(祖细胞)，所述细胞在体外和体内可分化为心脏细胞系，并且，在MI后将它们注射入损伤心肌时具有有益的功能和组织病理学效果。无意被任何理论所束缚，认为可能存在重塑衰减的双重机制，其中所述细胞具有替代损失的心肌细胞和内皮细胞的潜力，并且还对增强血管生成具有旁分泌效果。这些性质，连同免疫抑制能力和不存在致畸性，使得心脏ADSC是安全的，并且对于它们将来用在再生损伤心肌的细胞治疗中是有希望的候选物。

Claims (28)

1.源自哺乳动物脂肪心脏组织的分离的成体干细胞，所述成体干细胞组成型表达GATA-4和/或Cx43。

2.如权利要求1所述的细胞，还组成型表达β-MHC。

3.如权利要求1或2中任一权利要求所述的细胞，还表达一种或多种选自CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166的表面标志物。

4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的细胞，不表达下述表面标志物的一种、两种、三种、四种或优选任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。

5.如权利要求3或4中任一权利要求所述的细胞，其(i)表达下述表面标志物的一种、两种、三种、四种、五种或优选全部下述表面标志物：CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166，以及(ii)不表达下述表面标志物的一种、两种、三种、四种或优选任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。

6.如权利要求5所述的细胞，选自

a)(i)表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD59、CD90和CD105，并且(ii)不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106或CD117的细胞；

b)(i)表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD90、CD105和CD166，并且(ii)不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2的细胞；以及

c)i)表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166，并且(ii)不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2的细胞。

7.如权利要求1至6中任一权利要求所述的细胞，其中所述脂肪心脏组织为脂肪心外膜组织。

8.如权利要求1至7中任一权利要求所述的细胞，其中所述哺乳动物为人。

9.如权利要求1至8中任一权利要求所述的细胞，其中所述GATA-4和/或Cx43的组成型表达在所述细胞的体外扩充期间保持稳定。

10.源自哺乳动物脂肪心脏组织的分离的成体干细胞，选自：

(i)源自脂肪心脏组织的成体干细胞，其：

a)组成型表达GATA-4和/或Cx43；

b)组成型表达β-MHC；

c)组成型表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD59、CD90和CD105；以及

d)不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106或CD117；

(ii)源自脂肪心脏组织的成体干细胞，其：

a)组成型表达GATA-4和/或Cx43；

b)组成型表达β-MHC；

c)表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD90和CD105及CD166；以及

d)不表达任何下述表面标志物CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2；以及

(iii)源自脂肪心脏组织的成体干细胞，其：

a)组成型表达GATA-4和/或Cx43；

b)组成型表达β-MHC；

c)表达所有下述表面标志物：CD29、CD44、CD59、CD90和CD105及CD166；以及

d)不表达任何下述表面标志物：CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。

11.如权利要求10所述的细胞，其中所述GATA-4和/或Cx43的组成型表达在所述细胞的体外扩充期间保持稳定。

12.源自哺乳动物脂肪心脏组织的分离的成体干细胞群，包含一组如权利要求1至11中任一权利要求所述的源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞。

13.获得包含源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞的组合物的方法，所述成体干细胞组成型表达GATA-4和/或Cx43，所述方法包括：

a)获得哺乳动物脂肪心脏组织样品的细胞悬液；

b)从所述细胞悬液分离所述细胞；

c)在固体支持物上的培养基中，在允许所述细胞附着至所述固体支持物的条件下，培养所述细胞；以及

d)收集所述源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞，所述成体干细胞组成型表达GATA-4和/或Cx43。

14.包含通过如权利要求13所述的方法获得的源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞的组合物，所述成体干细胞组成型表达GATA-4和/或Cx43。

15.获得分化的细胞的方法，包括培养如权利要求1至11中任一权利要求所述的源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞，或通过如权利要求13所述的方法获得的源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞，并包括在适当的特异性分化培养基中培养所述干细胞。

16.通过如权利要求15所述的方法获得的分化的细胞。

17.包含通过如权利要求15所述的方法获得的分化的细胞的组合物。

18.包含如权利要求12所述的细胞群，或如权利要求14所述的组合物，或如权利要求17所述的组合物以及药物可接受的媒介物的药物组合物。

19.如权利要求18所述的药物组合物，用于其胃肠外给药。

20.包含如权利要求12所述的细胞群，如权利要求14所述的组合物，如权利要求18或19中任一权利要求所述的药物组合物，或如权利要求17所述的组合物的生物材料。

21.如权利要求12所述的细胞群，或如权利要求14所述的组合物，或如权利要求17所述的组合物，在制备用于心脏组织再生的药物组合物中，或在制备用于治疗缺血性心脏疾病的药物组合物中，或在制备用于心肌梗死后治疗或用于治疗充血性心力衰竭的药物组合物中，或在制备刺激血管生成的药物组合物中的用途。

22.如权利要求21所述的用途，其中所述药物组合物与一种或多种不同的治疗剂同时或顺序地给药。

23.如权利要求20或21中任一权利要求所述的用途，其中包含在所述细胞群中的细胞是自体的。

24.如权利要求20或21中任一权利要求所述的用途，其中包含在所述细胞群中的细胞是同种异体的。

25.包含如权利要求12所述的细胞群，或如权利要求14所述的组合物，或如权利要求17所述的组合物的试剂盒。

26.在体外评价对生物学或药理学试剂的细胞应答的方法，包括使所述试剂与如权利要求12所述的细胞群，所述细胞群包含多个如权利要求1至11中任一权利要求所述的干细胞，或与如权利要求14所述的组合物，所述细胞任选地分化为特定的细胞类型，或与如权利要求17所述的组合物接触，并评价所述试剂对培养中的所述细胞群的影响。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述干细胞分化为心肌细胞。

28.获得生长因子和/或细胞因子的方法，包括在适合于表达和产生所述生长因子和/或细胞因子的条件下，培养如权利要求1至11中任一权利要求所述的源自哺乳动物脂肪心脏组织的成体干细胞，或根据如权利要求13所述的方法获得的干细胞，或根据如权利要求15所述的方法获得的分化的细胞，以及，如果需要，分离所述生长因子和/或细胞因子。

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