ES2325715B1 - Poblacion de celulas madre adultas derivadas de tejido adiposo cardiaco y su uso en regeneracion cardiaca. - Google Patents
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Abstract
Población de células madre adultas derivadas de
tejido adiposo cardiaco y su uso en regeneración cardiaca.
La presente invención se refiere al aislamiento
y caracterización de una nueva población de células madre adultas
derivadas de tejido graso cardiaco que expresan
GATA-4 y/o Cx-43 de forma
constitutiva. Dicha población celular puede utilizarse en
protocolos de terapia celular con el objetivo de regenerar el
tejido miocárdico dañado.
Description
Población de células madre adultas derivadas de
tejido adiposo cardiaco y su uso en regeneración cardiaca.
La presente invención se refiere al aislamiento
y caracterización de una nueva población de células madre adultas
derivadas de tejido graso cardiaco y a sus potenciales aplicaciones
en terapia. En concreto, la invención se refiere al uso de dicha
población de células madre adultas derivadas de tejido graso
cardiaco en protocolos de terapia celular con el objetivo de
regenerar el tejido miocárdico dañado.
El gran impacto social y económico que tienen
actualmente las enfermedades degenerativas en los países
desarrollados, incluidas las patologías cardiovasculares, está
impulsando la búsqueda de precursores celulares que puedan mejorar
las terapias convencionales.
La principal consecuencia de un infarto de
miocardio es la pérdida irreversible de una porción del músculo
cardiaco. Esta pérdida produce una disminución de la capacidad
contráctil del miocardio así como la función de bombeo para
proporcionar el gasto cardiaco necesario. En 1998, solamente en
Estados Unidos había más de 7,5 millones de personas supervivientes
de un infarto de miocardio. Entre ellos, más de un 30% mueren
durante el primer año después del infarto. La supervivencia tras el
infarto depende en gran medida del tamaño de la zona de miocardio
muerta por falta de vascularización. En los humanos un infarto de
más del 45% de la masa del ventrículo izquierdo produce choque
cardiogénico irreversible.
Esta pérdida local de miocardio produce la
re-organización del resto del músculo cardiaco, con
incremento de muerte celular por apoptosis, hipertrofia de las
células musculares y aumento de la fibrosis en el miocardio que
sobrevive. Esta reorganización del músculo cardiaco, comúnmente
conocida con el nombre de "remodelamiento", muy frecuentemente
resulta en la aparición de insuficiencia cardiaca. En esta
situación, el corazón es incapaz de mantener un gasto cardiaco
adecuado resultando en una limitación seria y progresiva de la
capacidad del individuo.
Tras un infarto agudo de miocardio, así como en
aquellos pacientes que han desarrollado insuficiencia cardiaca
congestiva, la terapia actual no consigue la recuperación plena del
miocardio de tales pacientes con disfunción ventricular severa
refractaria. Todas las terapias actualmente en uso para tratar la
pérdida de músculo cardiaco están dirigidas a preservar la función
del miocardio restante.
Dichas terapias tienen como objetivo preservar y
mejorar la función de los cardiomiocitos (las células contráctiles
del corazón) que han sobrevivido y evitar su muerte ya sea por
apoptosis o por necrosis. La mayoría de tratamientos para el infarto
de miocardio intentan restaurar el flujo sanguíneo al área
isquémica para prevenir la pérdida de más células contráctiles.
Estas terapias de reperfusión incluyen el uso de agentes
trombolíticos (que disuelven el trombo formado en la arteria
coronaria), la angioplastia de balón (para abrir la arteria cerrada
por métodos físicos) o el bypass coronario en el que la zona
cerrada es sobrepasada mediante un puente que une la parte proximal
con la parte distal de la arteria obstruida por medio de un injerto
venoso. Solo en 1998, en Estados Unidos, se realizaron más de medio
millón de angioplastias de balón y un número parecido de bypases
quirúrgicos. Estos tratamientos frecuentemente logran
re-establecer el flujo coronario al área dañada y
evitan por un tiempo la pérdida adicional de músculo cardiaco. Sin
embargo, ninguna de ellas logra recuperar el tejido ya muerto en el
momento de la intervención. Si esta pérdida es sustancial, la
consecuencia a largo plazo es el desarrollo de insuficiencia
cardiaca crónica que evoluciona en insuficiencia cardiaca
terminal.
Hasta ahora, la única opción para el tratamiento
de la insuficiencia cardiaca terminal se ha realizado exitosamente
mediante el trasplante cardiaco. Sin embargo, la realización de
trasplantes de órganos presenta numerosas complicaciones tales como
la escasez de donantes, la alta probabilidad de rechazo del órgano
transplantado, etc.
En el caso particular de la insuficiencia
cardiaca, debido a la escasez de donantes, el transplante es una
opción disponible como máximo en un 5% de los pacientes que lo
requieren. Suponiendo que el alto coste de la intervención no fuera
un obstáculo suficientemente limitante, el alto coste de la terapia
inmunosupresora de por vida y el elevado número de neoplasias que
estos enfermos sufren como consecuencia, son otras limitaciones de
ésta modalidad terapéutica.
Tradicionalmente se consideraba que los
miocardiocitos sólo se dividían durante el desarrollo
embrionario-fetal, perdiéndose de forma irreversible
después de un infarto de miocardio. De tal manera que, hasta hace
relativamente poco, los expertos en biología cardiaca consideraban
que el corazón no tenía potencial autoregenerativo. Este concepto,
a la luz de recientes estudios, ha cambiado radicalmente.
La terapia celular o cardiomioplastia, basada en
el principio de la capacidad regenerativa del corazón a partir de
la aplicación de células madre, se vislumbra como una vía
terapéutica prometedora en el tratamiento de las enfermedades
cardiacas. Durante los últimos cinco años se han realizado una
serie de estudios que han puesto de manifiesto los procesos de
regeneración miocárdica, demostrando la presencia de células madre
residentes y/o de origen extracardiaco con potencial regenerativo en
corazones adultos. En este contexto, la observación de quimerismo
cardiaco post-trasplante constituyó una prueba
fehaciente de la existencia de células capaces de colonizar el
tejido miocárdico y adoptar un destino cardiaco
(Bayés-Gens A. et al., 2002,
Host-cell derived cardiomyocytes in
Sex-mismatch cardiac allografts. Cardiovasc Res
2002; 404-410).
Uno de los objetivos principales que persigue la
investigación en este campo es identificar el tipo óptimo de célula
madre que pueda ser aplicado con seguridad y eficacia en las
terapias de regeneración cardiaca. El tipo de célula madre idóneo
para la regeneración del corazón debería ser capaz de expandirse
suficientemente, presentar capacidad de diferenciación a un
miocardiocito plenamente funcional, integrarse en el tejido
miocárdico estableciendo contacto electroquímico con las células
adyacentes y por último, no estar limitada su aplicación por
cuestiones de rechazo inmunológico ni por consideraciones
éticas.
Las células madre se caracterizan por su
capacidad de automantenerse y por su plasticidad, este último
término relacionado con su capacidad de diferenciarse hacia uno o
más linajes celulares bajo los estímulos adecuados. La clasificación
de las células madre se realiza básicamente atendiendo a criterios
de linaje o estirpe celular; órgano o tejido de origen; expresión
de marcadores de superficie específicos, expresión de factores de
transcripción y/o proteínas; y capacidad de diferenciación, es
decir, número y tipo de células especializadas a los que pueden dar
origen.
Dentro de las células madre existe una clara
distinción entre aquellas células madre que pueden obtenerse
durante una de las primeras etapas del desarrollo de un embrión
(blastocito), conocidas como células madre embrionarias, y aquéllas
que proceden de tejidos somáticos del adulto, las denominadas
células madre adultas. Una célula madre adulta es una célula
indiferenciada que se halla en un tejido diferenciado y presenta
capacidad de proliferación y de diferenciación a uno o más tipos
celulares. Las células madre adultas están presentes en diversos
tejidos adultos, encontrándose ampliamente descrita su presencia en
médula ósea, sangre, córnea, retina, cerebro, músculo esquelético,
pulpa dental, epitelio gastrointestinal, hígado y piel. Por su
naturaleza, las células madre adultas autólogas son
inmunocompatibles y su uso no presenta impedimentos de tipo
ético.
Se han realizado ensayos clínicos en humanos
utilizando poblaciones de células madre adultas para la reparación
de tejido miocárdico dañado. Las dos principales aproximaciones
para el tratamiento de la cardiopatía isquémica se han efectuado con
mioblastos (Herreros J et al., 2003. Autologous
intramyocardial injection of cultured skeletal
muscle-derived stem cells in patients with
non-acute myocardial infarction. Eur Heart J. 2003
Nov; 24(22):2012-20; Mathur A. et al.
2004. Stem cells and repair of the heart. Lancet 2004 Jul
10-16; 364(9429):183-92) y
con células madre derivadas de médula ósea (Tomita S et al.,
2002. Bone marrow stromal cells contract synchronously with
cardiomyocytes in a coculture system. Jpn J Thorac Cardiovasc Surg.
2002 Aug; 50(8):321-4;
Fernández-Avilés F et al., 2004. Experimental
and clinical regenerative capability of human bone marrow cells
after myocardial infarction. Circ Res. 2004 Oct 1;
95(7):742-8. Epub 2004 Sep 9). No obstante,
persisten una serie de impedimentos críticos que dificultan su
aplicación clínica.
El tejido adiposo blanco es uno de los tejidos
más abundantes del cuerpo humano, estando localizado en varias
zonas corporales. Dicho tejido adiposo blanco está compuesto por
dos poblaciones celulares que pueden ser fácilmente separadas, por
una parte los adipocitos maduros y por la otra la fracción
estromal-vascular (SVF). Esta última es heterogénea
y puede ser dividida en dos compartimentos, al igual que en el caso
de la médula ósea, la fracción estromal y la compuesta por células
hematopoyéticas. La fracción estromal está compuesta por células de
aspecto fibroblástico que se adhieren en cultivo. Dicha población
celular relativamente homogénea presenta propiedades similares,
aunque no idénticas, a las de las células madre mesenquimales
derivadas de médula ósea (Zuk et al., 2001. Multilineage
cells from human adipose tissue: implications for
cell-based therapies. Tissue Eng. 2001 Apr;
7(2):211-28). Dichas células, denominadas
células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC), son células que
pueden aislarse con facilidad y cultivarse durante meses con un
tiempo de duplicación y niveles de senescencia relativamente bajos.
En el caso de las células madre derivadas de tejido adiposo
subcutáneo, éstas pueden diferenciarse a varios tipos celulares
incluyendo adipocitos, osteoblastos, condrocitos e incluso a
cardiomiocitos, en respuesta a factores de inducción específicos de
cada linaje celular. Asimismo, ha sido publicado que las ADSC
pueden ser una fuente potencial de células autólogas para la
reparación miocárdica (WO2006/127007).
Hasta la fecha, el uso clínico de las células
madre adultas ha dado lugar a resultados bastante modestos en
cuanto a la recuperación de la función cardiaca. Sin embargo, los
ensayos clínicos han demostrado que la terapia celular es segura y
constituye la "prueba de concepto" de que el corazón tiene
capacidad de regenerarse tras la aplicación terapéutica de células
madre.
Así pues, aunque en los últimos años se ha
avanzado mucho en el conocimiento sobre la regeneración del
miocardio, a fecha de hoy, no se ha encontrado una población de
células madre adultas que pueda ser usada con seguridad y eficacia
en terapias de regeneración del corazón, proporcionando un método
simple y eficaz de reparar los daños en el tejido miocárdico.
Actualmente, la proporción de pacientes que pueden beneficiarse de
una terapia post-infarto efectiva es baja, por lo
que es necesario mejorar la eficacia de las terapias existentes,
así como la búsqueda de alternativas que puedan restaurar el daño
cardiaco, en especial, para aquellos pacientes que han sufrido
múltiples infartos.
\newpage
La presente invención hace referencia a una
nueva población de células madre adultas derivadas de tejido
adiposo cardiaco, preferentemente de la zona epicárdica del
miocardio, que, sorprendentemente, presentan cierta predisposición
cardiomiogénica. En concreto, la invención se refiere al uso de
dicha población de células madre adultas derivadas de tejido graso
cardiaco en protocolos de terapia celular con el objetivo de
contribuir a la reparación del corazón en situaciones
fisiopatológicas.
La invención se basa en el hallazgo de que esta
nueva población de células madre adultas que se encuentran en la
grasa que envuelve al corazón (tejido adiposo epicárdico y/o
pericárdico) expresa, in vitro, de manera constitutiva, una
serie de marcadores cardioespecíficos, tanto a nivel de RNA
mensajero (mRNA), como a nivel proteico, presentando cierta
predisposición hacia un linaje cardiomiocítico. Aunque no se desea
estar vinculado a ninguna hipótesis, se cree que dicha
predisposición sea probablemente debida a su ubicación, en íntimo
contacto con el tejido miocárdico y al ambiente que las rodea.
Los inventores han observado que esta nueva
población celular podría presentar un mejor potencial
cardiomiogénico en comparación con el de otras poblaciones de
células madre ya descritas, por lo que esta nueva población de
células madre adultas aisladas de tejido graso cardiaco constituye
un reactivo celular potencialmente útil en la regeneración del
tejido cardiaco y en el tratamiento de situaciones en las que existe
una pérdida de tejido miocárdico funcional, por ejemplo, en
pacientes que han sufrido uno o más infartos de miocardio o en
pacientes que han desarrollado insuficiencia cardiaca
congestiva.
En particular, los inventores han caracterizado
una nueva población de células madre adultas, humanas, derivadas de
tejido adiposo cardiaco, de la zona epicárdica, por su perfil de
marcadores de superficie y han analizado la expresión génica (mRNA)
y proteica de distintos componentes básicos de la célula muscular
cardiaca, entre los que se encuentran los factores de transcripción
cardiacos GATA-4 y Nkx2.5, los componentes del
sarcómero denominados cadena pesada de la beta miosina
(\beta-MyHC), la troponina I cardiaca (cTnI), y
la \alpha-actinina, y los reguladores de la
conexión electroquímica y de la distribución intracelular de calcio
conexina-43 y SERCA-2,
respectivamente. El análisis de la expresión de todos estos
marcadores se ha realizado de forma constitutiva, es decir, sin la
adición al medio de cultivo de ningún tipo de factor de inducción
de la diferenciación hacia un linaje específico.
Se ha efectuado un estudio comparativo del
perfil inmunofenotípico, así como de la expresión génica y proteica
de marcadores cardioespecíficos en poblaciones de células madre
adultas, sustancialmente homogéneas, procedentes de muestras humanas
de tejido adiposo de origen epicárdico (epi-ADSC) y
de tejido adiposo subcutáneo (sub-ADSC). El
aislamiento y expansión de dichas poblaciones celulares se realizó
siguiendo protocolos previamente establecidos para células madre
derivadas de grasa subcutánea. No se observaron diferencias
significativas en cuanto a la expresión de antígenos de superficie
entre ambas poblaciones celulares; sin embargo, en el ensayo
comparativo de caracterización de la expresión génica en
condiciones banales (Ejemplo 3) se puso de manifiesto que dicha
población de células epi-ADSC, sorprendentemente,
presentaba un incremento estadísticamente significativo de los
niveles de expresión génica (mRNA) para el factor de transcripción
cardiaco GATA-4 y la proteina Cx-43,
responsable del acoplamiento electroquímico entre cardiomiocitos
adyacentes, respecto a la expresión de los mismos en células madre
derivadas de tejido adiposo subcutáneo
(sub-ADSC).
Los resultados obtenidos en el análisis de
expresión génica fueron completados con el estudio de la expresión
de dichos marcadores cardioespecíficos a nivel proteico, mediante
Western Blot e inmunofluorescencia (Ejemplo 4). Los resultados del
ensayo de inmunofluorescencia muestran la expresión de
GATA-4 nuclear, \beta-MyHC,
SERCA-2, Cx-43 y
\alpha-actinina, así como la distribución a nivel
celular de las mismas en una población de células madre derivadas
de tejido adiposo cardiaco (epi-ADSC). Los
resultados del Western Blot muestran una comparativa del perfil de
expresión de las células madre derivadas de tejido adiposo
subcutáneo (sub-ADSC) respecto a las células
epi-ADSC confirmando una expresión diferencial de la
proteína GATA-4 nuclear y de Cx-43
y cómo ésta se mantiene o aumenta con el tiempo de cultivo. Además
se observa una expresión diferencial de la cadena pesada de la beta
miosina (\beta-MycHC) con el tiempo de
cultivo.
Los resultados del estudio comparativo de la
expresión de genes específicos de linaje cardiomiocítico en las
poblaciones de células epi-ADSC y
sub-ADSC demuestran que la población de células
madre derivadas de grasa epicárdica (epi-ADSC) está
más comprometida hacia linaje cardiaco que la población de células
madre derivadas de grasa subcutánea del mismo individuo.
Así pues, en un aspecto, la invención se
relaciona con una nueva célula madre adulta, aislada, derivada de
tejido graso cardiaco de mamífero, que expresa
GATA-4 y/o Cx-43 de forma
constitutiva. En una realización particular, dicha célula madre
adulta, aislada, derivada de tejido graso cardiaco de mamífero,
expresa GATA-4 y/o Cx-43 de forma
constitutiva y estable durante su expansión in vitro.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una población, aislada, de dichas células madre adultas derivadas
de tejido graso cardiaco de mamífero.
En otro aspecto, la en un aspecto, la invención
se relaciona con un procedimiento para obtener una composición que
comprende células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco
de mamífero, que expresa GATA-4 y/o
Cx-43 de forma constitutiva. La composición
obtenible según dicho procedimiento constituye un aspecto adicional
de esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una composición farmacéutica que comprende dicha población aislada
de células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco o dicha
composición que comprende dichas células madre derivadas de tejido
graso cardiaco de mamífero y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un biomaterial que comprende dicha población aislada de células
madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco, dicha composición
que comprende dichas células madre derivadas de tejido graso
cardiaco de mamífero o dicha composición farmacéutica.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el uso de dicha población aislada de células madre adultas
derivadas de tejido graso cardiaco, o de dicha composición que
comprende dichas células madre derivadas de tejido graso cardiaco de
mamífero en la elaboración de una composición farmacéutica para la
regeneración de tejido cardiaco, o en la elaboración de una
composición farmacéutica para el tratamiento de una cardiopatía
isquémica, o en la elaboración de una composición farmacéutica para
el tratamiento post-infarto de miocardio y/o para
el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un kit que comprende dicha población aislada de células madre
adultas derivadas de tejido graso cardiaco o dicha composición que
comprende dichas células madre derivadas de tejido graso cardiaco de
mamífero.
En otro aspecto, la invención se relaciona un
método para evaluar in vitro la respuesta celular a un
agente biológico o farmacológico, que comprende poner en contacto
dicho agente con una población aislada de células madre adultas
derivadas de tejido graso cardiaco, o dicha composición que
comprende dichas células madre derivadas de tejido graso cardiaco
de mamífero, opcionalmente, diferenciadas a un tipo celular
concreto, y evaluar los efectos de dichos agentes sobre dicha
población celular en cultivo.
La Figura 1 (A) muestra una fotografía de las
fracciones extraídas de grasa epicárdica y subcutánea; la Figura 1
(B) muestra una imagen microscópica en la que se puede observar la
morfología de las células madre adultas derivadas de tejido adiposo
humano epicárdico (epi-ADSC); y la Figura 1 (C)
muestra una imagen microscópica en la que se puede observar la
morfología de las células madre adultas de derivadas de tejido
adiposo subcutáneo humano (sub-ADSC).
La Figura 2 muestra la caracterización
inmunofenotípica de células madre adultas derivadas de tejido
adiposo humano epicárdico (epi-ADSC) mediante
citometría de flujo (FACS). Se representan los histogramas
correspondientes a los cuatro pacientes (P1-P4) en
estudio [Figura 2A epi-ADSC P1, Figura 2B
epi-ADSC P2, Figura 2C epi-ADSC P3
y Figura 2D epi-ADSC P4]. Los histogramas muestran
en el eje de ordenadas la intensidad de fluorescencia del marcador
en estudio y en el de abscisas el número de células. En cada
histograma se muestran superpuestas las gráficas de expresión del
marcador control (negro) y del marcador en estudio (gris). El grado
de desplazamiento lateral del marcador en estudio respecto al
control en el eje de abscisas indica cuán positiva es la muestra
celular para el marcador en cuestión.
En la Figura 3 se muestra el análisis
comparativo de la expresión génica constitutiva de marcadores
cardioespecíficos entre las poblaciones de células madre adultas
epi-ADSC y sub-ADSC mediante
RT-PCR en tiempo real. Se observa una expresión
diferencial del factor de transcripción GATA4 (a pase 2 y a pase 5)
(Figuras 3A, 3B y 3C), observándose también a pase 5 un incremento
de los niveles de transcrito de Cx-43
(probablemente su expresión sea inducida por GATA4) en las células
madre epi-ADSC respecto a las células madre
sub-ADSC (Figuras 3B y 3C). Para el resto de genes
cardiacos analizados (\alpha-actinina,
\beta-MyHC, troponina I cardiaca,
SERCA-2 y Nkx2.5) no se observaron diferencias
significativas en cuánto a su expresión a lo largo del cultivo de
las células.
La Figura 4 muestra el análisis comparativo de
la expresión de marcadores cardioespecíficos entre las poblaciones
de células madre adultas epi-ADSC (E) y
sub-ADSC (S) mediante Western Blot. La Figura 4A
muestra el análisis comparativo en extractos totales. La Figura 4B
muestra el análisis comparativo efectuado en las fracciones
citoplasmáticas (C) y nucleares (N). Se puede observar un aumento de
los niveles de expresión proteica de Cx-43 y
GATA-4 por parte de las células madre
epi-ADSC respecto a las células madre
sub-ADSC, tanto a pase 2 (p2) como a pase 5 (p5).
Asimismo, se observa una expresión diferencial de
\beta-MyHC a pase 5 en las células madre
epi-ADSC.
La Figura 5 ilustra la expresión de marcadores
cardioespecíficos en la población de células madre adultas
epi-ADSC mediante inmunofluorescencia. En las
microfotografías se muestra la detección mediante anticuerpos
específicos de la expresión de las proteínas cardiacas:
GATA-4, \beta-MyHC (\betaMHC),
\alpha-actinina, SERCA-2 y
conexina-43 (Cx43). Se puede observar que
GATA-4 se encuentra mayoritariamente en el núcleo
de las células, que \beta-MyHC está
estructuralmente bien organizada formando miofibrillas, y que
\alpha-actinina, SERCA-2 y
Cx-43 se distribuyen difusamente por las
células.
La presente invención se refiere, en general, a
una población sustancialmente homogénea de células madre adultas
derivadas del tejido adiposo cardiaco, presente en la zona
epicárdica y/o pericárdica. Los inventores han observado que dicha
población celular presenta cierta predisposición hacia linaje
cardiaco, presentando un mayor potencial miocardiogénico en
comparación con otras células madre de origen diferente. Así pues,
dicha población celular es potencialmente útil en la regeneración de
tejido cardiaco. En concreto, la invención se refiere al uso de
dicha población de células madres adultas derivadas de tejido graso
cardiaco, en protocolos de terapia celular que contribuyan a la
reparación del corazón en situaciones fisiopatológicas. Dicha
población celular puede usarse en la elaboración de una composición
farmacéutica o en un biomaterial para la regeneración del miocardio
en aquellas situaciones en las que existe una pérdida de la
capacidad contráctil del miocardio, por ejemplo, en el tratamiento
de pacientes que han sufrido un infarto de miocardio y/o han
desarrollado insuficiencia cardiaca congestiva.
A fin de facilitar la comprensión de la presente
descripción, se explicará a continuación el significado de algunos
términos y expresiones tal como se utilizan en el contexto de la
invención. Se incluirán definiciones adicionales junto con la
descripción cuando sea necesario.
El término "sujeto" se refiere a un animal,
preferentemente un mamífero, incluyendo no-primates
(e.g., vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata o ratón) y primates
(e.g., mono, ser humano). En una realización preferente, el sujeto
es un ser humano.
El término "células madres adultas" hace
referencia a células presentes en un tejido diferenciado que
presentan características de células madre. Una célula madre adulta
es una célula indiferenciada que se halla en un tejido diferenciado
y presenta capacidad de proliferación y de diferenciación a uno o
más tipos celulares. Las células madre adultas están presentes en
diversos tejidos adultos, encontrándose ampliamente descrita su
presencia en médula ósea, sangre, córnea, retina, cerebro, músculo
esquelético, pulpa dental, epitelio gastrointestinal, hígado y
piel.
El término "tejido adiposo" o "tejido
graso", utilizados indistintamente en esta descripción, hace
referencia al tejido de origen mesenquimal conformado por la
asociación de células que acumulan lípido en su citoplasma: los
adipocitos. El tejido adiposo, por un lado cumple funciones
mecánicas: una de ellas es servir como amortiguador, protegiendo y
manteniendo en su lugar los órganos internos así como a otras
estructuras más externas del cuerpo, y también tiene funciones
metabólicas. En mamíferos se pueden distinguir dos tipos de tejido
adiposo: el tejido adiposo marrón o grasa parda y el tejido adiposo
blanco. Estos tejidos son reconocidos como tejidos distintos en
términos metabólicos y de composición celular. En los recién nacidos
y lactantes menores de 6 meses, la grasa parda está implicada en la
termogénesis como mecanismo compensatorio durante la exposición a
un ambiente frío mientras que en los adultos dicha termogénesis
está mediada por la actividad tiroidea. Recientemente, se ha
publicado un artículo en el que se identifica la grasa parda de
neonatos como fuente de células progenitoras de cardiomiocitos y su
potencial uso en terapia cardiaca regenerativa (Yamada et
al., 2006. Cardiac progenitor cells in brown adipose tissue
repaired damaged myocardium. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Apr 7;
342(2):662-70. Epub 2006 Feb 10). El
conjunto de estudios efectuados sobre el tejido adiposo blanco
muestra que éste interviene de manera directa o indirecta en todas
las principales funciones del organismo. Se trata de un tejido muy
heterogéneo constituido por numerosas poblaciones celulares las
cuales interaccionan entre ellas. En este contexto hay que
considerar la diferencia en la biología y la plasticidad de las
células en función de su localización. La comparación de obesidades
masculinas y femeninas muestra que el desarrollo de tejido adiposo,
en función de su localización tiene consecuencias distintas sobre
el organismo. Asimismo, el potencial de diferenciación de las
células depende de la localización de las mismas. En un estudio
comparativo entre el potencial de diferenciación de la población
celular estromal del tejido adiposo en función del origen del
depósito, publicado en 2006, se demuestra que, en el caso de
ratones, el tejido adiposo que presenta una mayor capacidad de
diferenciación es el tejido adiposo subcutáneo
(Prunet-Marcassus et al., 2006. From
heterogeneity to plasticity in adipose tissues:
site-specific differences. Exp Cell Res. 2006 Apr 1;
312(6):727-36. Epub 2005 Dec 28).
El término "tejido graso cardiaco" hace
referencia al tejido adiposo cardiaco, el cuál por su ubicación
anatómica puede distinguirse en tejido adiposo epicárdico
(recubriendo el miocardio) o tejido adiposo pericárdico (en el área
pericárdica, es decir, en las proximidades del corazón). Es
conocido que el tejido adiposo es un órgano endocrino altamente
complejo que genera moléculas con efectos tanto locales como
sistémicos. A pesar de la similitud en sus propiedades cualitativas,
en la actualidad se reconoce que distintos tipos de tejido adiposo,
en particular depósitos de tejido adiposo subcutáneo y visceral
presentan un perfil de expresión diferencial de ciertas proteínas
sugiriendo características diferenciales en la producción de
moléculas biológicas activas (Dusserre E. et al.; 2000.
Differences in mRNA expression of the proteins secreted by the
adipocytes in human subcutaneous and visceral adipose tissues.
Biochim Biophys Acta. 2000 Jan 3;
1500(1):88-96).
El término "expresión constitutiva" o
"expresión basal" se refiere a la expresión de un gen en
ausencia de factores inductores de la expresión del mismo. Se
entiende por genes de expresión constitutiva aquellos que son
transcritos continuamente.
\newpage
El término "aislada" cuando hace referencia
a una población celular se refiere a una población celular aislada
a partir de un tejido u órgano animal, incluyendo seres humanos, la
cuál se encuentra sustancialmente libre de otras poblaciones
celulares generalmente asociadas con dicha población celular in
vitro o in vivo.
El término "cardiopatía isquémica" se
refiere a la enfermedad resultante de la incapacidad de las
arterias coronarias para llevar el oxígeno necesario a un
determinado territorio del músculo cardiaco, lo que dificulta el
funcionamiento de éste. Las causas más frecuentes de la alteración
de las coronarias es la arterioesclerosis o la aterosclerosis.
Estas dos situaciones dificultan la llegada de la sangre a las
células del corazón, que son muy sensibles a la disminución del
aporte de sangre. Cuando la cantidad de oxígeno que llega al
corazón es insuficiente, se manifiesta la enfermedad coronaria o
cardiopatía isquémica. Sus principales consecuencias son el infarto
de miocardio, la angina de pecho, la insuficiencia coronaria, la
miocardiopatía de origen isquémico y la muerte súbita.
El término "insuficiencia cardiaca",
"insuficiencia cardiaca congestiva" o "ICC" se refiere a
una afección crónica en la que el corazón no puede bombear
suficiente sangre oxigenada como para satisfacer las necesidades de
los demás órganos del cuerpo. Como resultado, los órganos vitales
del organismo no reciben suficiente oxígeno y nutrientes, y los
residuos del organismo van eliminándose más lentamente. A la larga,
los sistemas vitales dejan de funcionar. Generalmente, la
insuficiencia cardiaca es síntoma de un problema cardiaco
subyacente.
El término "infarto de miocardio" o
"infarto agudo de miocardio" o "IAM" hace referencia a
una necrosis isquémica de una parte del miocardio debida a la
obstrucción de una o varias arterias coronarias o sus ramas. El
infarto de miocardio se caracteriza por la pérdida de
cardiomiocitos funcionales, dañándose el tejido miocárdico de manera
irreversible. El miocardio, o músculo del corazón, sufre un infarto
cuando existe una enfermedad coronaria avanzada, en un caso
particular, esto se produce cuando una placa de ateroma que se
encuentra en el interior de una arteria coronaria se ulcera o se
rompe, causando una obstrucción aguda de ese vaso.
El término "regeneración cardiaca",
"regeneración de tejido cardiaco" o "regeneración del
miocardio" hace referencia a la reparación de la pérdida de la
masa celular del tejido cardiaco, mediante la implantación de
células madre capaces de proliferar y diferenciarse a
miocardiocitos, regenerando el tejido miocárdico dañado y la
función cardiaca.
Tal como se usa en este documento, los términos
"tratar", "tratamiento" y "tratando" se refieren a
la mejora, cura o remedio de la situación fisiopatológica, que
resulta de la administración de la composición farmacéutica
proporcionada por la presente invención, que comprende dicha
población de células madres adultas derivadas de tejido graso
cardiaco, a un sujeto necesitado de dicho tratamiento.
La presente invención se basa en la
identificación de una nueva población de células madre adultas
derivadas de tejido adiposo cardiaco que presentan cierta
predisposición cardiomiogénica, por lo que pueden ser utilizadas en
protocolos de terapia celular, en particular, en protocolos de
terapia celular con el objetivo de contribuir a la reparación y/o
regeneración de tejido miocárdico en situaciones fisiopatológicas
en las que ha habido una pérdida de tejido cardiaco funcional.
Por tanto, en un aspecto, la invención se
refiere a una célula madre adulta, aislada, derivada de tejido
graso cardiaco de mamífero, en adelante célula madre de la
invención, que expresa de forma constitutiva GATA-4
y/o conexina 43 (Cx-43).
Las células madre de la invención proceden de
una fuente de tejido adiposo cardiaco, e.g., tejido adiposo
epicárdico o pericárdico, tal como la fracción estromal de dicho
tejido adiposo cardiaco, de un mamífero, tal como un roedor, un
primate, etc., preferentemente, de un ser humano. En una
realización particular, las células madre de la invención se
obtienen a partir de tejido adiposo epicárdico humano.
Las células madre de la invención pueden ser
células de origen autólogo, alogénico o xenogénico. En una
realización particular y preferida, dichas células son de origen
autólogo y se aíslan del tejido adiposo cardiaco del sujeto al que
se le van a administrar.
Además de por su origen, las células madre de la
invención se caracterizan por expresar GATA-4 y/o
Cx-43 de forma constitutiva. En una realización
particular, las células madre de la invención expresan de forma
constitutiva GATA-4 y Cx-43.
GATA-4 es un factor de
transcripción miembro de la familia GATA de factores de
transcripción de dedos de zinc. Los miembros de esta familia
reconocen el motivo GATA, el cual se encuentra presente en los
promotores de varios genes. Dicha proteína se cree que participa en
la regulación de genes implicados en la embriogénesis, así como en
la diferenciación y función cardiaca. Mutaciones en el gen que
codifica dicha proteína GATA-4 han sido asociadas
con defectos en el septo cardiaco.
La conexina 43 (Cx-43), también
denominada GJA1 (gap junction protein), es un miembro de la familia
de las conexinas. Dicha proteína es un componente de las uniones
gap intercelulares, las cuales están compuestas por un conjunto de
canales intercelulares que proporcionan una ruta para la difusión
de material de bajo peso molecular de una célula a otra. La
proteína Cx-43 es una de las principales proteínas
en las uniones gap del corazón las cuales, se cree, juegan un papel
crucial en la sincronización de la contracción del corazón, así
como en el desarrollo embrionario.
Tal como se ha comentado anteriormente, el
músculo esquelético es considerado como una potencial fuente para
la obtención de células para la regeneración del miocardio; sin
embargo, el músculo esquelético no expresa la proteína
Cx-43 y las uniones gap existentes entre
miocardiocitos no se forman. Así pues, la contracción entre los
miotubos resultantes y el miocardio adyacente es asincrónico. Esta
falta de acoplamiento eléctrico es la que posiblemente explique la
aparición de arritmias malignas en algunas series clínicas
(Herreros J et al., 2003. Autologous intramyocardial
injection of cultured skeletal muscle-derived stem
cells in patients with non-acute myocardial
infarction. Eur Heart J. 2003 Nov;
24(22):2012-20).
En una realización particular y preferida, la
expresión de GATA-4 y/o Cx-43 de
forma constitutiva en dicha célula madre de la invención se mantiene
estable durante su expansión in vitro.
Tal como aquí se utiliza, la expresión
"estable" de un gen o una proteína por una célula "durante
su expansión in vitro" se refiere a que la expresión de un
gen o de su producto de expresión (proteína) por parte de una
célula se mantiene sustancialmente al mismo nivel durante, al
menos, dos pases de cultivo celular in vitro; es decir, la
célula se cultiva in vitro bajo condiciones apropiadas
(medio de cultivo, temperatura, atmósfera, dilución, cambio de
medio de cultivo, etc.) para su expansión in vitro, tales
como cultivo en medio de cultivo \alpha-MEM
suplementado con 10% de FBS, L-glutamina 1 mM y 1%
de penicilina-estreptomicina a 37ºC en atmósfera de
aire con 5% de CO_{2}, hasta pre-confluencia,
reemplazando el medio de cultivo cada 3 ó 4 días, tal como se
menciona en el Ejemplo 1.
Las células madre de la invención pueden ser
células de origen autólogo, alogénico o xenogénico. En una
realización particular y preferida, dichas células son de origen
autólogo y se aíslan del tejido adiposo cardiaco del sujeto al que
se le van a administrar.
En una realización particular, dicha célula
madre de la invención expresa, de forma constitutiva, la cadena
pesada de la beta miosina (\beta-MyHC), ausente de
forma constitutiva en otras poblaciones de células madre ya
descritas así como en las células madre derivadas de tejido adiposo
subcutáneo (sub-ADSC) obtenidas del mismo sujeto
que las células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco
(células madre de la invención). Es conocido que esta proteína
juega un papel fundamental en la contracción del músculo del
corazón debido a que forma parte del sarcómero (aparato contráctil
de los cardiomiocitos).
En otra realización particular, la célula madre
de la invención expresa, de forma constitutiva, la proteína
SERCA-2 a lo largo de su cultivo in vitro.
Esta proteína sarcoplásmica (SERCA-2) es una bomba
Ca^{2+}-ATPasa y es responsable de la regulación
de la distribución intracelular de calcio dentro de la célula
muscular cardiaca. Esta función también es básica para la
contracción correcta del músculo cardiaco.
Además, la célula madre de la invención también
puede ser caracterizada por la expresión, o no expresión, de una
serie de marcadores de superficie, tales como CD14, CD29, CD34,
CD44, CD59, CD90, CD105, CD106 y CD117.
Así, en una realización particular, la célula
madre de la invención se caracteriza porque expresa, además, uno o
más marcadores de superficie seleccionados entre CD29, CD44, CD59,
CD90 y CD105; es decir, la célula madre de la invención es positiva
para al menos uno, dos, tres, cuatro, o, preferiblemente, todos los
marcadores de superficie CD29, CD44, CD59, CD90 y CD105.
En otra realización particular, la célula madre
de la invención se caracteriza porque no expresa un marcador de
superficie seleccionado entre CD14, CD34, CD106, CD117 y
combinaciones de los mismos; es decir, la célula madre de la
invención es negativa para al menos uno, dos, tres, o,
preferiblemente, todos los marcadores de superficie CD14, CD34,
CD106 y CD117.
En otra realización particular, la célula madre
de la invención se caracteriza, además de por su origen y de por la
expresión constitutiva de GATA-4 y/o
Cx-43, porque (i) expresa la totalidad de los
marcadores de superficie CD29, CD44, CD59, CD90 y CD 105, y (ii) no
expresa ninguno de los marcadores de superficie CD14, CD34, CD106 y
CD117.
En una realización concreta, la célula madre
adulta de la invención es una célula madre adulta, derivada de
tejido graso (adiposo) cardiaco de mamífero, preferentemente de un
ser humano, aislada, que:
- a)
- expresa de forma constitutiva GATA-4 y/o Cx-43;
- b)
- expresa de forma constitutiva \beta-MyHC;
- c)
- expresa la totalidad de los marcadores de superficie CD29, CD44, CD59, CD90 y CD105; y
- d)
- no expresa ninguno de los marcadores de superficie CD14, CD34, CD106 y CD117.
\newpage
En una realización particular y preferida, la
expresión de GATA-4 y/o Cx-43 de
forma constitutiva en dicha célula madre de la invención se mantiene
estable durante su expansión in vitro.
La expresión de los genes y proteínas de interés
(e.g., GATA-4, Cx-43,
\beta-MyHC, \alpha-actinina,
etc.) puede ser determinada por métodos convencionales conocidos
por los técnicos en la materia bien a nivel de ácido nucleico (e.g.,
a nivel de mRNA) o a nivel de proteína.
En una realización particular, la expresión de
un gen dado puede ser determinada mediante análisis de su expresión
génica sin adición al medio de cultivo de ningún componente capaz
de inducir la diferenciación hacia un linaje específico, es decir,
en condiciones de expresión constitutiva. A modo ilustrativo, no
limitativo, la expresión de dichos genes en una célula puede ser
analizada mediante técnicas convencionales tales como
RT-PCR en tiempo real, Northern blot o DNA
microarrays. La RT-PCR en tiempo real es una
variante de la transcripción inversa-reacción en
cadena de la polimerasa que permite una detección cuantitativa del
gen a medida que se amplifica. La RT-PCR en tiempo
real se ha utilizado en el Ejemplo 3 para determinar los niveles de
expresión génica (mRNA) de las proteínas cardioespecíficas de
interés. La técnica de Northern blot permite la identificación,
localización y cuantificación de secuencias de mRNA mediante la
transferencia de todo el mRNA desde un gel a una membrana de nylon
o nitrocelulosa. La presencia de un mRNA particular se detecta por
hibridación con una sonda apropiada. La técnica de DNA microarrays
se basa en la utilización de una superficie sólida a la cual se
unen una serie de fragmentos de DNA. Las superficies empleadas para
fijar el DNA son muy variadas (e.g., vidrio, plástico e incluso
chips de silicio); esta técnica permite averiguar la expresión de
numerosos genes, pudiendo monitorizarse los niveles de expresión de
un gran número de genes de forma simultánea.
Alternativamente, la expresión de una proteína
puede ser analizada mediante técnicas inmunológicas, e.g., ELISA,
Western Blot o inmunofluorescencia. La técnica de Western Blot se
basa en la detección de proteínas previamente separadas por
electroforesis e inmovilizadas en una membrana, generalmente de
nitrocelulosa, mediante la incubación con un anticuerpo específico
y un sistema de revelado, e.g., quimioluminiscente. El análisis
mediante inmunofluorescencia se refiere al uso de un anticuerpo
específico contra una proteína de interés para el análisis de su
expresión y localización subcelular mediante microscopía.
Generalmente, las células en estudio son previamente fijadas con
paraformaldehído y permeabilizadas con un detergente no iónico. Las
técnicas de Western Blot e inmunofluorescencia han sido utilizadas
en el Ejemplo 4. La técnica de ELISA, está basada en el uso de
antígenos o anticuerpos marcados con enzimas de forma que los
conjugados resultantes poseen actividad tanto inmunológica como
enzimática. Al estar uno de los componentes marcado e
insolubilizado sobre un soporte, la reacción
antígeno-anticuerpo queda inmovilizada y, por
tanto, puede ser revelada con facilidad mediante la adición de un
sustrato específico que produce una reacción cuantificable
mediante, por ejemplo, espectrofotometria. Esta técnica no permite
la localización subcelular exacta ni la determinación del peso
molecular de las proteínas estudiadas pero permite una detección muy
específica y altamente sensible de proteínas de interés por ejemplo
en fluidos biológicos de interés clínico (suero, sobrenadantes de
cultivos celulares, fluido ascítico, etc...).
Asimismo, los marcadores fenotípicos de las
células madre de la invención pueden identificarse por cualquier
técnica apropiada basada, normalmente, en una selección
positivo/negativo. En una realización particular, pueden utilizarse
anticuerpos, preferentemente, anticuerpos monoclonales, frente a
dichos marcadores fenotípicos cuya presencia o ausencia en las
células madre de la invención debe ser confirmada para caracterizar
adicionalmente las células madre de la invención mediante su perfil
inmunocitoquímico, aunque también pueden utilizarse otras técnicas
convencionales conocidas por los expertos en la materia. Por tanto,
en una realización particular, se utilizan anticuerpos monoclonales
frente a, al menos, los marcadores de superficie celular CD29,
CD44, CD59, CD90 y CD105, con el fin de confirmar la presencia de
dichos marcadores en las células seleccionadas o los niveles de
expresión detectable de al menos uno de dichos marcadores, y
preferentemente de todos, y se usan anticuerpos monoclonales frente
a, al menos, CD14, CD34, CD106 y CD117, para confirmar la ausencia
de los mismos. Dichos anticuerpos monoclonales son conocidos o
pueden ser obtenidos por cualquier persona experta en la materia
mediante procedimientos convencionales. En el Ejemplo 2 se
describe, a modo ilustrativo y no limitativo, una manera de llevar
a cabo la caracterización inmunofenotipica de una población de
células madre proporcionada por esta invención.
Si se desea, la célula madre de la invención
puede ser modificada genéticamente por cualquier método
convencional incluyendo, a modo ilustrativo, no limitativo,
procesos de transgénesis, deleciones o inserciones en su genoma que
modifiquen la expresión de genes que sean importantes para sus
propiedades básicas (proliferación, migración, transdiferenciación,
etc.). Así por ejemplo, es conocido que las células madre adultas
expandidas ex vivo o trasplantadas dentro de los tejidos
dañados envejecen con rapidez debido al acortamiento de sus
telómeros. Para evitar este y otros fenómenos, puede ser deseable
transducir las células utilizando por ejemplo, partículas víricas
retrovirales que contengan construcciones génicas cuya expresión
contrarreste el efecto de esta y otras alteraciones no deseadas.
Las células madre de la invención poseen
capacidad de proliferación y auto-renovación por lo
que pueden ser expandidas in vitro (ex vivo), una vez
aisladas y caracterizadas. Por tanto, las células madre de la
invención, una vez aisladas, pueden mantenerse y proliferar in
vitro en un medio de cultivo apropiado. A modo ilustrativo, no
limitativo, dicho medio comprende medio \alpha-MEM
(Minimum Essential Medium eagle-alpha modification
(Sigma Ref. M4526). Eagle, H. Media for animal cell culture. Tissue
Culture Association Manual. 3,517-520.1976),
antibióticos y glutamina, y se complementa con suero de bovino
fetal (FBS). Depende de la experiencia de cada técnico en la materia
el modificar o modular las concentraciones de los medios y/o los
complementos de medios según se requiera para las células usadas.
Los sueros a menudo contienen factores y componentes celulares que
son necesarios para la viabilidad y la expansión celular. Ejemplos
ilustrativos, no limitativos, de tales sueros, incluyen FBS, suero
de bovino (BS), suero de ternero (CS), suero de carnero fetal
(FCS), suero de carnero neonato (NCS), suero de cabra (GS), suero de
caballo (HS), suero porcino, suero de ovejas, suero de conejo,
suero de rata (RS), etc. También se contempla, si las células madre
de la invención son de origen humano, complementar el medio de
cultivo celular con un suero humano, preferentemente de origen
autólogo. Se entiende que los sueros pueden inactivarse por calor
si se considera necesario para inactivar los componentes de la
cascada del complemento. Puede usarse también la modulación de las
concentraciones de suero, la retirada de suero del medio de cultivo
para promover la supervivencia de uno o más tipos celulares
deseados. En otra realización, las células madre de la invención
pueden expandirse en un medio de cultivo de composición definida,
en el que se reemplaza el suero por una combinación de albúmina de
suero, transferrina, selenio y proteínas recombinantes incluyendo,
aunque sin limitarse a ello, insulina, factor de crecimiento
derivado de plaquetas y un factor de crecimiento, e.g., factor
básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF).
Muchos medios de cultivo celular ya contienen
aminoácidos; no obstante, algunos requieren ser complementados
antes de cultivar las células. Ejemplos ilustrativos, no
limitativos, de dichos aminoácidos incluyen
L-alanina, L-arginina, ácido
L-aspártico, L-cisteína,
L-cistina, ácido L-glutámico,
L-glutamina, L-glicina, etc.
También se usan normalmente agentes antimicrobianos en el cultivo de
células para mitigar una eventual contaminación bacteriana,
micoplasmática y/o fúngica. Normalmente, los compuestos
antibióticos o antimicóticos usados son mezclas de penicilina y
estreptomicina, aunque pueden incluir también, otros compuestos
antibióticos o antimicóticos, tales como, por ejemplo, anfotericina,
ampicilina, gentamicina, bleomicina, higromacina, kanamicina,
mitomicina, etc. También pueden añadirse hormonas al cultivo
celular, incluyendo, aunque sin limitarse,
D-aldosterona, dietilestilbestrol (DES),
dexametasona, b-estradiol, hidrocortisona, insulina,
prolactina, progesterona, somatostatina/hormona del crecimiento
humano (HGH), etc.
El mantenimiento de las células madre de la
invención puede requerir la incorporación de factores celulares que
permiten que las células permanezcan en una forma no diferenciada.
Resultará evidente para el técnico en la materia que, antes de
proceder a diferenciar las células madre de la invención hacia
células diferenciadas deben eliminarse del medio de cultivo dichos
factores que inhiben la diferenciación celular. Es evidente también
que no todas las células requerirán estos factores. De hecho, estos
factores pueden provocar efectos no deseados, dependiendo del tipo
de célula.
Si se desea, las células madre de la invención
pueden expandirse clonalmente usando un procedimiento adecuado para
clonar poblaciones celulares. A modo ilustrativo, una población
proliferada de células madre de la invención puede recogerse
físicamente y sembrarse en una placa separada (o en los pocillos de
una placa "multi-pocillo"). Alternativamente,
células madre de la invención pueden subclonarse en una placa
"multi-pocillo" en una relación estadística
para facilitar la operación de colocar una única célula en cada
pocillo (e.g., desde aproximadamente 0,1 a cerca de una
célula/pocillo o incluso de unas 0,25 a 0,5 células/pocillo, por
ejemplo 0,5 células/pocillo). Por supuesto, las células pueden
clonarse a baja densidad (por ejemplo, en un disco de Petri u otro
sustrato adecuado) y aislarlas de otras células usando dispositivos
tales como anillos de donación. La producción de una población
clonal puede expandirse en cualquier medio de cultivo adecuado. En
cualquier caso, las células aisladas pueden cultivarse hasta un
punto adecuado cuando su fenotipo de desarrollo pueda evaluarse.
Cualquiera de los pasos y procedimientos para aislar las células
madre de la invención puede realizarse manualmente, si se desea;
alternativamente, pueden utilizarse los dispositivos adecuados,
conocidos por los técnicos en la materia, para facilitar el
aislamiento de las células.
El análisis de la capacidad de las células madre
de la invención de diferenciarse en uno o más tipos o linajes
celulares puede evaluarse mediante procedimientos convencionales de
inducción de la diferenciación, conocidos por los técnicos en la
materia. Para ello, las células madre, en general, se someten a los
protocolos de diferenciación específicos apropiados para cada tipo
o linaje celular, los cuales incluyen el cultivo de las células
madre en los medios de diferenciación específicos apropiados.
Los inventores, tras el análisis de los
resultados obtenidos en estudios preliminares de diferenciación
siguiendo los protocolos habituales para inducir la diferenciación
específica a adipocito, osteocito y condrocito, consideran que las
células madre de la invención presentan una capacidad de
diferenciación reducida (menor) respecto a la de otras poblaciones
de células madre adultas mesenquimales también positivas para los
marcadores CD29, CD44, CD59, CD90 y CD105, e.g. células madre
derivadas de tejido adiposo subcutáneo (sub-ADSC).
En concreto (Ejemplo 5), las células madre de la invención fueron
sometidas a protocolos de diferenciación adipogénica, osteogénica y
condrogénica previamente establecidos para células madre derivadas
de tejido adiposo subcutáneo (Zuk et al., 2002. Human adipose
tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002
Dec; 13(12):4279-95) y se observó que las
células madre de la invención presentaban una menor capacidad de
diferenciación a dichos linajes respecto a células madre derivadas
de tejido adiposo subcutáneo. No obstante, no se puede descartar
que sea posible obtener una mayor capacidad de diferenciación
mediante modificaciones en los protocolos de diferenciación
específicos de linajes adipogénico, condrogénico y osteogénico
utilizados. Así pues, aunque no se desea estar vinculado por ninguna
conclusión, parecen existir indicios que hacen pensar que las
células madre de la invención presentan un perfil de diferenciación
a linajes mesenquimales distinto al de otras poblaciones de células
madre adultas mesenquimales también positivas para los marcadores
CD29, CD44, CD59, CD90 y CD105; no obstante, conviene realizar
ensayos adicionales para confirmar el perfil de diferenciación de la
población celular de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una población, aislada, sustancialmente homogénea, de células
madre, en adelante "población celular de la invención", que
comprende un conjunto de células madre adultas derivadas de tejido
graso cardiaco de mamífero que expresan de forma constitutiva
GATA-4 y/o Cx-43 (células madre de
la invención).
En una realización particular, la población
celular de la invención comprende células madre adultas derivadas
de tejido graso cardiaco de mamífero que expresan de forma
constitutiva GATA-4 y Cx-43.
En otra realización particular y preferida, la
población celular de la invención comprende células madre de la
invención en las que la expresión de forma constitutiva de
GATA-4 y/o Cx-43 se mantiene estable
durante su expansión in vitro.
En otra realización particular, la población
celular de la invención comprende células madre de la invención
que, además, expresan, de forma constitutiva,
\beta-MyHC y/o SERCA-2.
En otra realización particular, la población
celular de la invención comprende células madre de la invención
que, además, expresan uno o más marcadores de superficie
seleccionados entre CD29, CD44, CD59, CD90 y CD105. En una
realización concreta, la población celular de la invención presenta
una expresión significativa de, al menos, uno, dos, tres, cuatro,
o, preferiblemente, todos los marcadores de superficie CD29, CD44,
CD59, CD90 y CD105. Tal como aquí se utiliza, "expresión
significativa" significa que, en dicha población celular, al
menos el 30% de las células muestran una señal para un marcador de
superficie celular específico determinado por citometría de flujo,
por encima de la señal de fondo, preferiblemente un 40%, 50%, 60%,
70% y más preferiblemente un 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% ó 100%.
En otra realización particular, la población
celular de la invención comprende células madre de la invención que
no expresan uno, dos, tres o ninguno de los marcadores de
superficie seleccionados entre CD14, CD34, CD106 y CD117. En una
realización concreta, la población celular de la invención carece de
expresión significativa de, al menos, uno, dos, tres, o,
preferiblemente, todos los marcadores de superficie CD14, CD34,
CD106 y CD117. Tal como aquí se utiliza, "carece de expresión
significativa" significa que, en dicha población celular, menos
del 30% de las células muestran una señal para un marcador de
superficie celular específico en citometría de flujo por encima de
la señal de fondo, preferiblemente menos de un 20%, 15% ó 10%, más
preferiblemente menos de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ó 1%.
En otra realización particular, la población
celular de la invención comprende células madre de la invención que
se caracterizan, además de por su origen y por la expresión
constitutiva de GATA-4 y/o Cx-43,
porque (i) expresa la totalidad de los marcadores de superficie
CD29, CD44, CD59, CD90 y CD105, y (ii) no expresa ninguno de los
marcadores de superficie CD14, CD34, CD106 y CD117.
En otra realización particular, la población
celular de la invención comprende células madre adultas, derivadas
de tejido graso (adiposo) cardiaco de mamífero, preferentemente de
un ser humano, aisladas, que a) expresan de forma constitutiva,
GATA-4 y/o Cx-43; b) expresan de
forma constitutiva \beta-MyHC; c) expresan la
totalidad de los marcadores de superficie CD29, CD44, CD59, CD90 y
CD105; y d) no expresan ninguno de los marcadores de superficie
CD14, CD34, CD106 y CD117.
En otra realización particular, la población
celular de la invención comprende células madre de la invención
obtenidas a partir de tejido adiposo cardiaco, e.g., epicárdico o
pericárdico, de un mamífero, tal como un roedor, un primate, etc.,
preferentemente, de un ser humano. En una realización particular, la
población celular de la invención comprende células madre de la
invención obtenidas a partir de tejido adiposo epicárdico de un ser
humano.
En otra realización particular, la población
celular de la invención comprende células madre de la invención
obtenidas a partir de la fracción estromal de tejido adiposo
cardiaco.
En otra realización particular, la población
celular de la invención comprende células madre de la invención de
origen autólogo, alogénico o xenogénico. En una realización
particular y preferida, dichas células son de origen autólogo y se
aíslan del tejido adiposo cardiaco del sujeto al que se le van a
administrar.
Dicha población celular de la invención, si se
desea, puede encontrarse en un banco de células para transplante.
En una realización particular, dicho banco de células comprende una
pluralidad de células madre de la invención homocigotas para, al
menos, uno o más genes de antígenos críticos, es decir, genes que
codifican antígenos de histocompatibilidad (e.g., un alelo del
complejo principal de histocompatibilidad (CMH) presente en la
población humana). A partir de dicho banco pueden seleccionarse las
células de la invención homocigotas para uno o más alelos de
antígenos de histocompatibilidad compatibles con el alelo del CMH
del sujeto necesitado de transplante o implante celular.
Si se desea, la población celular de la
invención puede ser mantenida congelada bajo condiciones que no
afecten ni comprometan su viabilidad después de su
reconstitución.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un procedimiento para obtener una composición que comprende células
madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero que
expresan GATA-4 y/o Cx-43 de forma
constitutiva, en adelante procedimiento de la invención, que
comprende:
- a)
- obtener una suspensión celular de una muestra de tejido graso cardiaco de un mamífero;
- b)
- separar las células de dicha suspensión celular;
- c)
- cultivar dichas células en un medio de cultivo sobre un soporte sólido bajo condiciones que permiten a dichas células adherirse a dicho soporte sólido; y
- d)
- recuperar las células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero que expresan GATA-4 y/o Cx-43 de forma constitutiva.
La muestra de tejido graso cardiaco puede
obtenerse a partir de tejido graso epicárdico o de tejido graso
pericárdico, preferentemente, de tejido adiposo epicárdico. Dicha
muestra de tejido graso cardiaco procede de un mamífero, tal como un
roedor, un primate, etc., preferentemente, un ser humano. Dicha
muestra de tejido graso cardiaco de mamífero puede obtenerse por
métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia. En
una realización particular, dicha muestra de tejido graso cardiaco
se extrae de la fracción estromal del tejido graso. Una fuente
apropiada de tejido graso cardiaco procede de la zona próxima a la
arteria coronaria derecha proximal o de la base del corazón
alrededor de la arteria aorta, de donde el tejido graso cardiaco
puede ser obtenido en el contexto de cirugía cardiaca rutinaria. En
el Ejemplo 1 se describe de manera detallada una forma de obtención
de una muestra de tejido graso cardicaco (en particular,
epicárdico) humano.
La muestra de tejido graso cardiaco extraida se
lava y se corta en fragmentos pequeños que son digeridos
enzimáticamente (o por otros medios convencionales) con el fin de
obtener una suspensión celular que se somete a centrifugación
obteniéndose un pellet celular que se resuspende en un medio
apropiado (e.g., un medio de cultivo que comprende medio
\alpha-MEM suplementado con suero, glutamina y
antibióticos) y se siembra sobre un soporte sólido (e.g., plástico,
placa de cultivo, frasco de cultivo, etc.) bajo condiciones que
permiten que las células se adhieran a dicho soporte sólido (e.g., a
37ºC y atmósfera de aire con 5% de CO_{2}); una vez que se
observa que las células se han adherido (e.g., al cabo de 24 horas
aproximadamente dependiendo de las condiciones del cultivo), se
retira el medio de cultivo y se lavan las células adheridas antes de
proceder a su expansión in vitro. Para ello, las células
adheridas (células madre de la invención) se cultivan en presencia
de un medio de cultivo apropiado (e.g., medio
\alpha-MEM suplementado con suero, glutamina y
antibióticos) y bajo condiciones apropiadas (e.g., 37ºC, atmósfera
de aire con 5% de CO_{2}) y se mantienen en cultivo en tales
condiciones hasta pre-confluencia (e.g., hasta que
se alcanza un grado de confluencia del 80% aproximadamente)
reemplazando la totalidad o parte del medio de cultivo
periódicamente (e.g., cada 3 o 4 días). Las células pueden ser
sub-cultivadas repetidamente (pases) hasta alcanzar
una cantidad de material celular (es decir, un número mínimo de
células) que permita su análisis. En una realización particular,
dichas células se sub-cultivan, al menos, dos veces
(es decir, se someten a 2 pases), típicamente, 3, 4, 5 o más veces.
En una realización concreta, dichas células se
sub-cultivaron 2 veces (pase 2), mientras que, en
otra realización concreta se sub-cultivaron 5
veces, es decir, hasta pase 5 (3-4 meses), a las
diluciones apropiadas. Operando de esta manera se puede obtener una
densidad celular de 5-6x10^{3} células madre de la
invención/cm^{2}, tras ser despegadas del soporte sólido (e.g.,
placa de cultivo, etc.). En ambos casos (pases 2 y 5), se analizó
la expresión de GATA-4 y Cx-43
observándose que la expresión constitutiva de dichos marcadores
cardioespecíficos se mantiene sustancialmente estable a lo largo de
la expansión in vitro de dichas células (células madre de la
invención). En el Ejemplo 1 se describe de manera detallada la
obtención, identificación, caracterización y aislamiento de células
madre de la invención a partir de tejido graso epicárdico
humano.
La composición resultante, que comprende células
madre de la invención, obtenible según el procedimiento de la
invención, previamente descrito, constituye un aspecto adicional de
esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una composición farmacéutica, en adelante composición farmacéutica
de la invención, que comprende una cantidad terapéuticamente
efectiva de dicha población celular de la invención, o de dicha
composición que comprende células madre de la invención obtenible
según el procedimiento de la invención, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Tal como aquí se utiliza, el término "cantidad
terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de células
madre de la invención presentes en dicha población celular de la
invención, o en dicha composición que comprende células madre de la
invención obtenible según el procedimiento de la invención, que debe
contener la composición farmacéutica de la invención, para ser
capaz de producir el efecto terapéutico deseado; en general, dicha
cantidad terapéuticamente efectiva vendrá determinada, entre otros
factores, por las propias características de las células y el efecto
terapéutico deseado que se persigue. En general, la cantidad
terapéuticamente efectiva de células de la invención que debe
administrarse dependerá, entre otros factores, del grado de la
enfermedad a tratar, de las propias características del sujeto, de
la zona afectada, etc. Por este motivo, las dosis mencionadas en
esta descripción deben tenerse en cuenta sólo como guía para el
experto en la materia, que debe ajustar dicha dosis dependiendo de
los factores anteriormente descritos. Como ejemplo ilustrativo y no
limitativo, la composición farmacéutica de la invención puede
administrarse como una dosis única, que contenga aproximadamente
entre 1x10^{5} y 1x10^{9}, preferentemente entre 1x10^{6} y
1x10^{8}, más preferentemente entre 1x10^{7} y 5x10^{7}
células madre de la invención, las cuáles pueden estar parcial o
totalmente diferenciadas, o combinaciones de las mismas. La dosis
puede repetirse, dependiendo del estado y evolución del paciente, en
intervalos temporales de días, semanas o meses que debe establecer
el especialista en cada caso.
Las células madre de la invención contenidas en
la población celular de la invención o en dicha composición que
comprende células madre de la invención obtenible según el
procedimiento de la invención, pueden ser células de origen
autólogo, alogénico o xenogénico. En una realización particular y
preferida, dichas células son de origen autólogo y se aíslan del
tejido adiposo cardiaco del sujeto al que se le van a administrar,
reduciendo así las complicaciones potenciales asociadas con las
respuestas antigénicas y/o inmunogénicas a dichas células.
Si se desea, las células madre de la invención
contenidas en la población celular de la invención o en dicha
composición que comprende células madre de la invención obtenible
según el procedimiento de la invención, pueden purificarse, tal como
se ha mencionado anteriormente, usando una selección de células
positivas y/o negativas por medio de anticuerpos a fin de
enriquecer la población celular para aumentar la eficacia, reducir
la morbilidad o facilitar el procedimiento.
De acuerdo con la invención, las células madre
de la invención contenidas en la población celular de la invención
o en dicha composición que comprende células madre de la invención
obtenible según el procedimiento de la invención, pueden
administrarse al paciente sin un procesamiento adicional o
siguiendo procedimientos adicionales para purificar, modificar,
estimular o cambiar de otro modo adicionalmente las células. Por
ejemplo, las células madre de la invención obtenidas a partir de un
sujeto pueden administrarse a otro sujeto que las necesite tras ser
cultivadas antes de su administración. Asimismo, la población
celular de la invención o dicha composición que comprende células
madre de la invención obtenible según el procedimiento de la
invención, pueden ser administradas aisladas o junto con otras
poblaciones celulares, por ejemplo, junto con el resto de
componentes de la fracción estromal del tejido adiposo cardiaco. En
una realización particular, la recogida de tejido adiposo cardiaco
se llevará a cabo junto a la cama del paciente. Puede usarse control
hemodinámico para monitorizar el estado clínico del paciente. De
acuerdo con la invención aquí descrita, la composición farmacéutica
de la invención puede administrarse al paciente poco tiempo después
de efectuarse la extracción del tejido adiposo cardiaco. Por
ejemplo, la composición farmacéutica de la invención puede
administrarse inmediatamente después de procesar el tejido adiposo
cardiaco para aislar la población celular de la invención o la
composición que comprende células madre de la invención obtenible
según el procedimiento de la invención, y haberla dispuesto en un
vehículo farmacéuticamente adecuado. En otra realización, el plazo
de entrega dependerá de la disponibilidad del paciente y el tiempo
requerido para procesar el tejido adiposo cardiaco y aislar la
población celular de la invención.
El término "vehículo aceptable
farmacéuticamente" se refiere a un vehículo que debe estar
aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o un
gobierno estatal o enumerado en la Farmacopea Estadounidense o la
Farmacopea Europea, u otra farmacopea reconocida generalmente para
su uso en animales, y más concretamente en humanos.
El término "vehículo" se refiere a un
diluyente, coadyuvante, excipiente o portador con el que se debe
administrar las células de la población celular de la invención o
de dicha composición que comprende células madre de la invención
obtenible según el procedimiento de la invención; obviamente, dicho
vehículo debe ser compatible con dichas células. Ejemplos
ilustrativos, no limitativos, de dicho vehículo incluyen cualquier
vehículo fisiológicamente compatible, por ejemplo, soluciones
isotónicas (e.g., solución salina estéril (0,9% NaCl), solución
salina tamponada con fosfatos (PBS), solución
Ringer-lactato, etc.), opcionalmente suplementadas
con suero, preferiblemente con suero autólogo; medios de cultivo
celular (e.g., DMEM, etc.); o, alternativamente, un medio soporte
sólido, semisólido, gelatinoso o viscoso, tal como colágeno,
colagen-glicosamino-glicano,
fibrina, cloruro de polivinilo, poliaminoácidos, tales como
polilisina, o poliornitina, hidrogeles, agarosa, sulfato de dextrano
silicona. Asimismo, si se desea, el medio de soporte puede, en
realizaciones específicas, contener factores de crecimiento u otros
agentes. Si el soporte es sólido, semisólido, o gelatinoso, las
células pueden ser introducidas en una fase líquida del vehículo que
es tratada posteriormente de forma tal que se convierte en una fase
más sólida. En algunas realizaciones de la invención en las que el
vehículo tenga una estructura sólida, dicho vehículo podrá ser
conformado de acuerdo con la forma de la lesión.
La composición farmacéutica de la invención, si
se desea, puede contener también, cuando sea necesario, aditivos
para aumentar, controlar o dirigir de otro modo el efecto
terapéutico deseado de las células, los cuales comprenden dicha
composición farmacéutica, y/o sustancias auxiliares o sustancias
farmacéuticamente aceptables, tales como agentes tamponantes,
tensioactivos, codisolventes, conservantes, etc. También, para
estabilizar la suspensión celular, es posible añadir quelantes de
metales. La estabilidad de las células en el medio líquido de la
composición farmacéutica de la invención puede mejorarse mediante
la adición de sustancias adicionales, tales como, por ejemplo,
ácido aspártico, ácido glutámico, etcétera. Dichas sustancias
farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en la composición
farmacéutica de la invención son conocidas, en general, los
técnicos en la materia y se usan normalmente en la elaboración de
composiciones celulares. Ejemplos de vehículos farmacéuticos
adecuados se describen, por ejemplo, en "Remington's
Pharmaceutical Sciences", de E.W. Martin. Puede encontrarse
información adicional sobre dichos vehículos en cualquier manual de
tecnología farmacéutica (Farmacia Galénica).
La composición farmacéutica de la invención
contendrá una cantidad terapéuticamente efectiva de la población
celular de la invención o de dicha composición que comprende
células madre de la invención obtenible según el procedimiento de
la invención, preferentemente una población celular sustancialmente
homogénea de la invención, tras ser aislada y expandida,
conjuntamente con el vehículo adecuado en la cantidad apropiada
para proporcionar la forma de administración correcta al
sujeto.
La composición farmacéutica de la invención se
formulará de acuerdo con la forma de administración elegida. La
formulación se adecuará al modo de administración. En una
realización particular, la composición farmacéutica de la invención
se prepara en un modo de dosificación líquido o gel, por ejemplo, en
forma de suspensión, para ser inyectada o perfundida al sujeto
necesitado de tratamiento. Ejemplos ilustrativos, y no limitativos,
incluyen la formulación de la composición farmacéutica de la
invención en una suspensión estéril con un excipiente
farmacéuticamente aceptable, tal como una solución isotónica, por
ejemplo, solución salina tamponada con fosfatos (PBS), o cualquier
otro vehículo farmacéuticamente aceptable apropiado, para la
administración a un sujeto vía parenteral, e.g., un ser humano,
preferentemente vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, etc.,
aunque también son posibles otras rutas alternativas de
administración.
La administración de la composición farmacéutica
de la invención al sujeto que la necesita se llevará a cabo por los
medios convencionales. En una aplicación específica, dicha
composición farmacéutica se puede administrar a dicho sujeto por vía
intravenosa utilizando los dispositivos adecuados, tales como
jeringas, catéteres, trocares, cánulas, etc. En todos los casos, la
composición farmacéutica de la invención se administrará utilizando
los equipos, aparatos y dispositivos adecuados a la administración
de composiciones celulares y conocidos por el experto en la
técnica.
En una forma de realización específica, la
administración de la composición farmacéutica de la invención se
realiza por vía intravenosa e incluye una administración
intravenosa a través de dispositivos estándar, por ejemplo, un
catéter intravenoso periférico estándar, un catéter venoso central
o un catéter arterial pulmonar, etc. El flujo de las células se
puede controlar por inflado y desinflado en serie de globos distales
y proximales ubicados dentro de la vasculatura del paciente.
En otra realización particular, la
administración directa de la composición farmacéutica de la
invención al sitio que se pretende beneficiar puede ser ventajosa.
De este modo, la administración directa de la composición
farmacéutica de la invención al órgano o tejido deseado se puede
lograr por administración directa (e.g., por inyección, etc.) en la
superficie externa del órgano o tejido afectado por medio de
inserción de un dispositivo adecuado, e.g., una cánula apropiada,
por perfusión arterial o venosa (incluyendo mecanismos de flujo
retrógrado) o por otros medios mencionados en esta descripción o
conocidos en la técnica. En una realización preferida, se efectuará
una administración directa de la composición farmacéutica de la
invención en la zona dañada del miocardio mediante, por ejemplo,
inyección intracoronaria o por inyección transmiocárdica mediante
un catéter. Se han descrito catéteres diseñados para la liberación
de principios activos de forma específica en un área dañada del
corazón, en particular, en el área infartada (véanse, por ejemplo,
las patentes norteamericanas US 6.102.926, US 6.120.520, US
6.251.104, US 6.309.370, US 6.432.119 y US 6.485.481). El sistema
de administración utilizado, puede incluir, por ejemplo, un aparato
para la administración intracardiaca de medicamentos alternativos,
que incluye un sensor para el posicionamiento intracardiaco y un
sistema de liberación para administrar el principio activo deseado
en la cantidad deseada en la posición del sensor.
La composición farmacéutica de la invención, si
se desea, se puede almacenar hasta el momento de su aplicación
mediante los procedimientos convencionales conocidos por los
técnicos en la materia. Esta composición farmacéutica también se
puede almacenar junto a medicamentos adicionales, útiles en el
tratamiento post-infarto de miocardio y/o de la
insuficiencia cardiaca congestiva, en una forma activa que
comprende una terapia combinada. Para el almacenamiento a corto
plazo (menos de 6 horas), la composición farmacéutica de la
invención puede almacenarse a temperatura ambiente o por debajo de
ésta en un recipiente sellado complementándola o no con una solución
nutriente. El almacenamiento a medio plazo (menos de 48 horas) se
realiza preferentemente a 2-8ºC, y la composición
farmacéutica de la invención incluirá una solución
iso-osmótica y tamponada en un contenedor compuesta
de, o revestida de, material que previene la adhesión celular. El
almacenamiento a más largo plazo se lleva a cabo preferentemente
por me-
dio de crioconservación adecuada y almacenamiento en condiciones que promueven la retención de la función celular.
dio de crioconservación adecuada y almacenamiento en condiciones que promueven la retención de la función celular.
En una forma de realización concreta, la
composición farmacéutica de la invención se utiliza en una terapia
combinada. En una realización particular, dicha composición
farmacéutica se administra en combinación con una composición
farmacéutica adicional para el tratamiento
post-infarto de miocardio y/o de la insuficiencia
cardiaca congestiva. Por tanto, las células madre de la invención
contenidas en la población celular de la invención pueden utilizarse
como un tratamiento único o combinadas con otros tratamientos
convencionales para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular,
y, en particular, de la cardiopatía isquémica, tal como, por
ejemplo, la realización de un bypass coronario, una angioplastia
(con o sin stents), la administración de promotores de la
angiogénesis, la implantación de un dispositivo de asistencia
ventricular la administración de agentes trombolíticos,
antiagregantes plaquetarios (ácido acetilsalicílico y/o
clopidogrel), antihipertensivos (inhibidores de la enzima
conversora de la angiotensina (IECA), antagonistas del receptor de
la angiotensina I (ARA-II), bloqueantes de los
receptores \beta, diuréticos, antilipemiantes, digoxina, nitratos
y/o antagonistas del calcio.
En una realización particular, la terapia
combinada se administra a un sujeto con una cardiopatía isquémica,
en particular, a un paciente que ha sufrido un infarto de miocardio
y/o padece de insuficiencia cardiaca congestiva que no responde a
los tratamientos convencionales.
La composición farmacéutica de la invención
puede utilizarse en una terapia combinada con medicación adicional
útil en el tratamiento post-infarto de miocardio y/o
de la insuficiencia cardiaca congestiva, tal y como se ha descrito
previamente. Dichos medicamentos adicionales pueden formar parte de
la misma composición farmacéutica o se pueden suministrar, de forma
alternativa, en forma de una composición aparte para la
administración simultánea o sucesiva (secuencial en el tiempo) con
respecto a la administración de la composición farmacéutica de la
invención. En una forma de realización concreta, dicha composición
farmacéutica adicional se administra de forma simultánea o
secuencial a la composición farmacéutica que comprende la población
celular de la invención, espaciada en el tiempo, en cualquier orden,
es decir primero puede administrarse la composición farmacéutica de
la invención, luego los otros medicamentos adicionales u otra
composición farmacéutica para el tratamiento de una cardiopatía
isquémica o primero puede administrarse los otros medicamentos
adicionales u otra composición farmacéutica para el tratamiento de
una cardiopatía isquémica y luego la composición farmacéutica de la
invención. Alternativamente, puede mezclarse cualquiera de estos
dos componentes en la misma composición y administrarlos
conjuntamente. En otra forma de realización alternativa, dicha
composición farmacéutica de la invención y otros medicamentos
adicionales u otra composición farmacéutica para el tratamiento de
una cardiopatía isquémica se administran simultáneamente.
Los pacientes pueden ser monitorizados antes de
y durante la administración de la composición farmacéutica de la
invención. Tras la administración de la composición farmacéutica,
los pacientes pueden requerir un periodo aproximado de 24 horas de
monitorización por si se produjeran efectos adversos. Se recomienda
realizar estudios de seguimiento para evaluar las mejoras
funcionales.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un biomaterial, en adelante biomaterial de la invención, que
comprende dicha población celular de la invención, dicha
composición que comprende células madre de la invención obtenible
según el procedimiento de la invención, o dicha composición
farmacéutica de la invención.
La ingeniería de tejidos consiste en el
transplante en los tejidos dañados de biomateriales que están
compuestos por estructuras biocompatibles adecuadas para su
implantación en el organismo que han sido recubiertas de células con
capacidad de adherirse y proliferar. Dichas estructuras pueden ser,
entre otras: suturas, matrices, membranas, espumas, geles y
cerámicas. Se conocen diversos materiales que han sido utilizados
en la construcción de matrices y otras estructuras biocompatibles,
entre los cuáles se incluyen: materiales inorgánicos, por ejemplo,
metales; polímeros naturales tales como fibrina o alginatos;
polímeros sintéticos tales como polihidroxiácidos, por ejemplo,
ácido poliglicólico (PGA) y copolímeros de los mismos (e.g., ácido
poliglicólico-ácido láctico (PLGA), etc.). En una realización
preferida, dichos polímeros son biodegradables, de tal manera que
se degradan con el tiempo y la estructura polimérica es
completamente reemplazada por células. En una realización
particular, dicho biomaterial de la invención comprende, o está
compuesto por, una estructura biocompatible que comprende uno o más
polímeros biodegradables y la población celular de la invención o
una composición farmacéutica de la invención.
En otra realización particular, dicha estructura
polimérica puede estar recubierta con moléculas bioactivas, es
decir, con moléculas capaces de interaccionar de manera específica
con las células, o bien con otro polímero con mejores propiedades de
adherencia con el fin de aumentar el grado de adherencia y
proliferación de las células.
Los inventores han observado que la población
celular de la invención así como dicha composición que comprende
células madre de la invención obtenible según el procedimiento de
la invención, presentan un buen potencial cardiomiogénico, mejor que
el de otras poblaciones de células madre de origen distinto ya
descritas, por lo que la población celular de la invención así como
dicha composición que comprende células madre de la invención
obtenible según el procedimiento de la invención, constituyen unos
reactivos celulares potencialmente útiles en la regeneración del
tejido cardiaco y/o en el tratamiento de situaciones en las que
existe una pérdida de tejido miocárdico funcional (cardiopatía
isquémica), por ejemplo, en pacientes que han sufrido uno o más
infartos de miocardio o en pacientes que han desarrollado
insuficiencia cardiaca congestiva.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con el uso de una población celular de la invención, o de
dicha composición que comprende células madre de la invención
obtenible según el procedimiento de la invención, en la elaboración
de una composición farmacéutica para la regeneración de tejido
cardiaco, o en la elaboración de una composición farmacéutica paró
el tratamiento de una cardiopatía isquémica, o en la elaboración de
una composición farmacéutica para el tratamiento
post-infarto de miocardio y/o para el tratamiento
de la insuficiencia cardiaca congestiva.
Para regenerar el tejido cardiaco, o para el
tratamiento de una cardiopatía isquémica,
post-infarto de miocardio y/o insuficiencia cardiaca
congestiva, la composición farmacéutica de la invención que
comprende una población celular de la invención o una composición
que comprende células madre de la invención obtenible según el
procedimiento de la invención, se administra al sujeto en necesidad
de tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de dicha
composición farmacéutica. Como ya se ha mencionado, las células
madre de la invención (presentes en dicha población celular de la
invención), derivan de tejido adiposo cardiaco y expresan
GATA-4 y/o Cx-43, preferentemente,
ambas, de manera constitutiva. La proteína Cx-43 es
una de las principales proteínas en las uniones gap que conectan
eléctricamente a los cardiomiocitos, por lo que el hecho de que
dichas células madre de la invención expresen Cx-43
de manera constitutiva sugiere un buen acoplamiento eléctrico con el
tejido cardiaco preexistente tras el trasplante de dicha población
celular que comprende células madre de la invención.
Las células madre de la invención, la población
celular de la invención, o dicha composición que comprende células
madre de la invención obtenible según el procedimiento de la
invención, pueden ser utilizadas para obtener un número apropiado
de células capaces de regenerar el tejido isquémico cardiaco o bien
mejorar la funcionalidad del corazón tras uno o más infartos de
miocardio. En una realización particular, dicha mejora es debida a
la diferenciación de las células madre de la invención presentes en
dicha población celular de la invención a miocardiocitos, músculo
liso y/o tejido endotelial vascular. Tal como se ha descrito
previamente, la administración de la composición farmacéutica de la
invención al sujeto que la necesita puede llevarse a cabo por
medios convencionales. En una forma de realización concreta, dicha
composición farmacéutica se puede administrar al sujeto que la
necesita directamente en la zona dañada
del miocardio, como por ejemplo mediante inyección intracoronaria o por inyección transmiocárdica mediante catéter.
del miocardio, como por ejemplo mediante inyección intracoronaria o por inyección transmiocárdica mediante catéter.
En otro aspecto la invención se relaciona con un
kit que comprende una célula madre de la invención, una población
celular de la invención o una composición que comprende células
madre de la invención obtenible según el procedimiento de la
invención. Las características de dichas células madre y población
celular de la invención, así como de dicha composición que
comprende células madre de la invención obtenible según el
procedimiento de la invención, ya han sido descritas anteriormente.
Las células madre de la invención, presentes en la población celular
de la invención o en dicha composición que comprende células madre
de la invención obtenible según el procedimiento de la invención,
que forman parte de dicho kit pueden ser de origen alogénico o
xenogénico.
Dicho kit puede ser utilizado con fines
diagnóstico y/o para investigación in vitro, por lo que,
para tales fines, si se desea, las células madre de la invención
pueden ser inmortalizadas de manera que sean capaces de expandirse
de manera indefinida.
Por tanto, en una realización particular, las
células madre de la invención se someten a un proceso de
inmortalización, por ejemplo, a un proceso de inmortalización
reversible, con el fin de obtener células madre inmortalizadas,
preferentemente, células madre de la invención inmortalizadas de
forma reversible. En este sentido, tal como aquí se utiliza, el
término "inmortalización" o "inmortalizada" se refiere a
una célula, o a un proceso para la creación de una célula, que
proliferará indefinidamente en cultivo sin entrar en senescencia.
Según la presente invención, la inmortalización se refiere a un
proceso por el que un cultivo celular es transformado de modo que
las células se comporten en algunos aspectos como células
tumorales, en particular, en lo relativo a las características
proliferativas de las células tumorales. Así, una "célula
inmortalizada de forma reversible" se refiere a una célula que,
en un momento dado se encuentra en un estado inmortalizado pero que
puede ser devuelta a un estado no-inmortalizado en
un momento posterior, utilizando un proceso de inmortalización
inverso. En una realización particular, las células madre de la
invención son inmortalizadas reversiblemente mediante un
procedimiento que comprende: (a) transformar células madre de la
invención con un vector que comprende un "polinucleótido
retirable" que contiene un oncogén (o una combinación de
oncogenes), con el fin de obtener células madre de la invención
inmortalizadas; (b) crecer dichas células madre de la invención
inmortalizadas; y (c) seleccionar aquellas líneas celulares clonales
de células madre de la invención inmortalizadas que mantienen las
propiedades funcionales de las células de la invención; si se
desea, se puede retirar el oncogén (o combinación de oncogenes) de
las células madre de la invención inmortalizadas. A modo
ilustrativo, se pueden inmortalizar poblaciones celulares mediante
sobreexpresión individual o en combinación de algunos oncogenes,
tales como el antígeno T largo de SV40, la subunidad catalítica de
la telomerasa, Bmi-1, etc. La sobreexpresión de
estos oncogenes podría ser revertida mediante el flanqueo con
dianas de recombinasas (e.g., introduciendo la recombinasa Cre que
reconoce las dianas loxP, etc.), y, además, añadiendo el gen
suicida de la timidina kinasa que permitiría la destrucción de las
células inmortalizadas.
En otro aspecto, la invención se relaciona un
método para evaluar in vitro la respuesta celular frente a
un agente biológico o farmacológico, que comprende poner en
contacto dicho agente con una población celular de la invención, que
comprende una pluralidad de células madre de la invención, o con
una composición que comprende células madre de la invención
obtenible según el procedimiento de la invención, opcionalmente,
diferenciadas a un tipo celular concreto, y evaluar los efectos de
dichos agentes sobre dicha población celular en cultivo.
A modo ilustrativo, se puede evaluar in
vitro la respuesta celular frente a un agente biológico o
farmacológico mediante un procedimiento que comprende: (a) aislar
una población celular de la invención o una composición que
comprende células madre de la invención obtenible según el
procedimiento de la invención, a partir de un individuo o de un
grupo de individuos; (b) opcionalmente, diferenciar la totalidad o
parte de las células madre de la invención presentes en dicha
población celular, o en dicha composición que comprende células
madre de la invención obtenible según el procedimiento de la
invención, a un tipo o linaje celular concreto; (c) expandir in
vitro las células resultantes de la etapa (a) o (b) en cultivo;
(d) opcionalmente, diferenciar las células expandidas en la etapa
(c) a un tipo celular concreto; (e) poner en contacto la población
celular resultante de la etapa (c) o (d) en cultivo con uno o más
agentes biológicos o farmacológicos; y (f) evaluar los efectos de
dichos agentes sobre la población celular en cultivo.
En una realización particular, las células madre
de la invención, presentes en la población celular de la invención
o en la composición que comprende células madre de la invención
obtenible según el procedimiento de la invención„ son diferenciadas
a cardiomiocitos. La etapa de diferenciación puede tener lugar bien
tras el aislamiento de la población celular de la invención [etapa
(b)] o bien tras su expansión in vitro [etapa (d)].
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deberán ser considerados en sentido limitativo de la misma.
Se aislaron dos poblaciones de células madre
sustancialmente homogéneas a partir de muestras de grasa humana de
origen epicárdico y subcutáneo de un mismo individuo y se
compararon tanto su fenotipo como la expresión basal de marcadores
cardioespecíficos.
Las muestras de grasa epicárdica y subcutánea se
obtuvieron de 4 pacientes (P1, P2, P3 y P4) en el contexto de
cirugía cardiaca rutinaria previo consentimiento informado,
extrayéndose una muestra de cada tipo de grasa de cada uno de ellos.
En la cirugía cardiaca, en primer lugar, se realiza la disección
del tejido cutáneo y subcutáneo hasta exponer el esternón. De la
grasa del tejido subcutáneo torácico expuesta en este proceso se
obtuvo un fragmento (alrededor de 2 a 5 g) utilizando pinzas
quirúrgicas. A continuación, se realiza esternotomía media y
disección del pericardio con la consiguiente exposición del
corazón. El tejido adiposo epicárdico (alrededor de 0,5 a 2 g) se
obtuvo de la base del corazón alrededor de la arteria aorta. Este
tejido adiposo se seleccionó mediante pinzas quirúrgicas y se
resecó utilizando tijeras quirúrgicas habituales. El estudio fue
aprobado por el Comité Ético del Hospital de la Santa Creu i Sant
Pau.
Ambos tipos de muestras de grasa (epicárdica y
subcutánea) fueron lavadas repetidamente con tampón PBS (Gibco
Invitrogen Corp.) y cortadas en fragmentos pequeños usando bisturi
previa disección de vasos sanguíneos
presentes.
presentes.
A continuación, los fragmentos de tejido adiposo
fueron digeridos enzimáticamente con una solución de colagenasa
tipo II al 0,05% en \alpha-MEM (Gibco Invitrogen
Corp) durante 30 minutos a 37ºC en agitación. La reacción fue
detenida añadiendo medio \alpha-MEM suplementado
con 10% de suero de bovino fetal (FBS), L-glutamina
1 mM (Gibco Invitrogen Corp) y 1% de
penicilina-estreptomicina (Gibco Invitrogen Corp).
Seguidamente la suspensión se centrifugó a 1.200 g durante 10
minutos a temperatura ambiente. Se descartó el sobrenadante, el
pellet se resuspendió con medio completo de cultivo
\alpha-MEM suplementado con 10% de FBS,
L-glutamina 1 mM y 1%
penicilina-estreptomicina y se sembró en frascos de
cultivo (a 37ºC y atmósfera de aire con 5% de CO_{2}). Pasadas 24
horas se retiró el medio de cultivo y se lavaron las células
adheridas con PBS.
Las células adheridas se cultivaron en presencia
de \alpha-MEM suplementado con 10% de FBS,
L-glutamina 1 mM y 1% de
penicilina-estreptomicina a 37ºC en atmósfera de
aire con 5% de CO_{2}. Las células se mantuvieron en cultivo bajo
las mismas condiciones hasta que se alcanzó un grado de confluencia
de aproximadamente el 80% (pre-confluencia)
reemplazando el medio de cultivo cada 3 ó 4 días. Las células fueron
repetidamente subcultivadas al llegar a
pre-confluencia hasta pase 5 (3-4
meses), a una dilución 1:3, lo cuál corresponde a una densidad de
5-6x10^{3} células/cm^{2}, tras ser despegadas
de la placa de cultivo mediante una solución de
tripsina\cdotEDTA.
Se seleccionó y expandió en cultivo in
vitro una población de células madre adultas derivadas de
tejido adiposo epicárdico y una población de células madre adultas
derivadas de tejido adiposo subcutáneo procedentes del mismo
individuo. La Figura 1A muestra las fracciones extraídas de grasa
epicárdica y subcutánea. La morfología de las células madre adultas
derivadas de tejido adiposo humano epicárdico
(epi-ADSC) se muestra en la Figura 1B, mientras que
la morfología de las células madre adultas derivadas de tejido
adiposo subcutáneo humano (sub-ADSC) se muestra en
la Figura 1C.
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Mediante citometría de flujo se analizó la
expresión de diversos marcadores de superficie con el fin de
caracterizar la población de células madre derivadas de tejido
adiposo epicárdico (epi-ADSC) y se compararon los
resultados obtenidos con los de la población celular aislada de
tejido adiposo subcutáneo (sub-ADSC).
El análisis inmunofenotípico mediante citometría
de flujo se efectuó en cuatro poblaciones celulares derivadas de
tejido adiposo epicárdico (células epi-ADSC)
aisladas de cuatro muestras de pacientes identificadas como P1, P2,
P3 y P4, y se compararon frente a una muestra representativa de
células sub-ADSC. Las células
epi-ADSC P1 y P2 fueron caracterizadas tras ser
cultivadas durante 3-4 semanas (pase bajo) mientras
que las células epi-ADSC P3 y P4 fueron
caracterizadas tras ser cultivadas durante 9-12
semanas (pase alto).
Se lavaron las células con PBS a 4ºC y se
despegaron de la placa con tripsina/EDTA 0,05% (Gibco) durante 5
minutos en condiciones de cultivo. Una vez bloqueada la acción de
la tripsina, las células se centrifugaron a 1.400 rpm durante 5
minutos en refrigeración. Las células se mantuvieron en buffer de
tinción refrigerado (PBS IX con 1% de FCS) durante todo el proceso
de tinción. La tinción se llevó a cabo mediante anticuerpos
específicos frente a distintos antígenos de superficie: CD3, CD9,
CD10, CD11B CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD28, CD29, CD31,
CD34, CD36, CD38, CD44, CD45, CD49a, CD49d, CD49e, CD49f, CD50,
CD51, CD54, CD55, CD56, CD58, CD59, CD61, CD62e, CD621, CD62p,
CD71, CD90, CD95, CD102, CD104, CD105, CD106, CD117, CD133/2, CD59,
CD235a, HLAI, HLAII, NGFR y \beta2-microglobulina
(todos ellos, procedentes de Serotec).
Para revelar la presencia de dichos antígenos en
la membrana celular se usaron dos fluoróforos, isotiocianato de
fluoresceína (FITC) y ficoeritrina (PE), diluidos 1/50 en buffer de
tinción durante 20 minutos protegidos de la luz y a 4ºC. Las
muestras fueron analizadas en citómetro Coulter EPICS XL y mediante
un software específico (FCS Express 3 software).
En la Figura 2 se muestran los resultados
positivos obtenidos del perfil inmunofenotípico de las muestras
epi-ADSC. El parámetro estadístico usado para el
análisis fue el "% positivo". Este parámetro mide el porcentaje
de las células aceptadas en la fórmula de adquisición que considera
positivas con respecto al control. Estadísticamente el programa FCS
Express hace una sustracción numérica y considera como resultado
positivo un valor mayor del 30% del parámetro "porcentaje de
células positivas".
En base a esto los resultados del análisis del
perfil inmunofenotípico mediante citometría de flujo muestran que
más de un 90% de los marcadores estudiados presentan una expresión
similar en ambas poblaciones celulares (epi-ADSC y
sub-ADSC). En concreto, la población de células
epi-ADSC es muy positiva para CD9, CD29, CD44,
CD51, CD54, CD55, CD59, CD90, CD105, HLA-I y
\beta2-microglobulina, al igual que en el caso de
la población de células sub-ADSC (Tabla 1). El resto
de los marcadores específicos de sub-ADSC negativos
lo son también para las células epi-ADSC. No
obstante, se ha detectado una diferencia en relación con la
expresión del marcador de superficie celular CD54 que es positivo
en el caso de las células epi-ADSC y negativo en
las células sub-ADSC.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se analizó la expresión basal de los marcadores
cardioespecíficos: \beta-MyHC,
GATA-4, Nkx2.5, troponina I cardiaca (cTnI),
SERCA-2, \alpha-actinina
sarcomérica y conexina-43 mediante la técnica de
RT-PCR en tiempo real.
Se extrajo el RNA total de las células aisladas
con el kit QuickPrep Total RNA Extraction (Amersham) según
las instrucciones del fabricante. A partir de 2 \mug de RNA total
se efectuó la síntesis del cDNA mediante una reacción de
transcripción inversa utilizando el kit Script
One-Step RT-PCR con hexámeros
aleatorios (Bio-Rad Laboratories) a 50ºC durante 10
minutos. Una vez obtenido el cDNA se prepararon todas las
reacciones de PCR con cebadores marcados con FAM®, específicos para
todos los genes estudiados, en el kit TaqMan Universal PCR master
mix (Applied Biosystems). Los cebadores utilizados fueron:
GATA-4 (Hs00171403_ml), Nkx2.5 (Hs00231763_ml),
\alpha-actinina sarcomérica (Hs00241650_ml),
\beta-MyHC (Hs00165276_ml),
conexina-43 (Hs00748445_sl), SERCA-2
(Hs00544877_ml), cTnI (Hs00165957_ml) y GAPDH (Hs99999905_ml)
(Applied Biosystems) y las condiciones de reacción: 2 minutos a
50ºC, 10 minutos a 95ºC y 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC y 1
minuto a 60ºC para todos los cebadores. Finalmente, se analizó la
amplificación mediante el sistema ABI Prism 7000 Sequence
Detection (Applied Byosistems). Para la cuantificación de la
expresión génica los datos obtenidos se analizaron con el programa
ABI Prism 7000 SDS software. Todas las muestras se
analizaron por duplicado. Se utilizó el método de comparación de Ct
(\Delta Ct); Ct es el ciclo de PCR en el que se detecta el primer
incremento de fluorescencia por encima del nivel basal) para
calcular la expresión relativa de cada gen analizado utilizando el
gen de expresión constitutiva GAPDH como control de referencia
endógeno.
Como se muestra en la Tabla 2 y en la Figura 3A,
a pase 2 se detectó un incremento estadísticamente significativo de
los niveles génicos para el factor de transcripción cardiaco
GATA-4 en la población de células
epi-ADSC en comparación con las células
sub-ADSC extraídas del mismo individuo (p<0,001).
Por el contrario, no se detectaron diferencias significativas en
cuanto a la expresión génica del resto de marcadores
cardioespecíficos (\alpha-actinina,
\beta-MyHC, cTnI, Cx-43,
SERCA-2 y Nkx2.5) entre los dos tipos de
poblaciones celulares estudiadas (Figura 3A). Merece la pena
destacar que a pase 5 la diferencia de expresión de
GATA-4 se incrementa (p<0,001) y se detecta
también una diferencia significativa respecto a los niveles de
transcrito para Cx-43 (p=0,031) (Figuras 3B y 3C).
Estos resultados indican que la población de células madre de grasa
epicárdica (epi-ADSC) está más comprometida hacia
linaje cardiaco en comparación con la población de células
procedentes de grasa subcutánea (sub-ADSC) del
mismo individuo.
Se analizó la expresión basal de los marcadores
cardioespecíficos \beta-MyHC,
GATA-4, Nkx2.5, troponina I cardiaca,
SERCA-2, \alpha-actinina
sarcomérica y conexina-43, a nivel de proteína
mediante las técnicas de inmunofluorescencia y Western blot.
Las células se lavaron repetidamente con tampón
PBS frío y se homogeneizaron en tampón de lisis [Tris 25 mM pH 7,6,
NaCl 150 mM, EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 1 mM, EGTA
(ácido etilenglicoltetraacético) 1 mM, 1% de SDS (laurilsulfato de
sodio), PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonil) 1 mM, 1 \mug/ml de
aprotinina y 1 \mug/ml de leupeptina] durante 30 minutos a 4ºC. La
fracción SDS-insoluble se obtuvo mediante
centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. La
concentración de proteína de los extractos totales fue determinada
mediante el kit Bio-Rad DC protein (BioRad)
utilizando BSA como estándar. 50 \mug de proteína se
transfirieron a membranas de nitrocelulosa de 0,45 mm de poro y se
revelaron con anticuerpos específicos para los distintos marcadores
cardioespecíficos analizados: Cx-43 (1/100) (BD
Transduction Laboratories), GATA-4 (1/100),
SERCA-2 (1/100), anti-troponina I
cardiaca (cTnI) (1/100) (los 3 anteriores de Santa Cruz
Biotechnology), \beta-MyHC (1/10) (Chemicon) y
\alpha-actinina sarcomérica (1/100) (Sigma)). Se
utilizó un sistema de detección quimioluminiscente para la
visualización de las bandas específicas correspondientes (Pierce)
según instrucciones del fabricante.
Las células, cultivadas en placas de 35 mm con
fondo de cristal de 0,17 mm, especiales para su estudio mediante
microscopia confocal (FluoroDish, WPI Inc.), fueron lavadas
repetidamente con tampón PBS y fijadas con 4% de PFA
(paraformaldehido) preparado en PBS durante 15 minutos a temperatura
ambiente. A continuación, las células fueron permeabilizadas con 1%
de BSA (albúmina de suero bovino)/0,1% de saponina en PBS durante
30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente las células fueron
incubadas con anticuerpos específicos para los distintos marcadores
cardioespecíficos analizados: Cx-43 (1/100) (BD
Transduction Laboratories), GATA-4 (1/100),
SERCA-2 (1/100), troponina I cardiaca (cTnI) (1/100)
(Santa Cruz Biotechnology), \beta-MyHC (no
diluido) (Chemicon) y \alpha-actinina sarcomérica
(1/100) (Sigma)) y finalmente fueron analizadas bajo un microscopio
confocal de fluorescencia (Leica).
Los resultados del estudio de la expresión de
dichos marcadores a nivel proteico complementan los resultados
obtenidos en el análisis de la expresión génica de los mismos.
De esta forma, se observó que, en ausencia de
factores o estímulos cardiogénicos adicionales en el medio de
cultivo, únicamente las células epi-ADSC expresaban
Cx-43 y GATA-4 tanto a pase 2 como
a pase 5 (Figuras 4A y 4B). Se observó también un aumento de los
niveles de expresión de Cx-43 y
GATA-4 en las células epi-ADSC a lo
largo de su expansión in vitro (de pase 2 a pase 5).
Cabe destacar la ausencia de expresión, a nivel
de proteína, de la bomba de calcio SERCA-2 y de
\beta-MyHC en ambas poblaciones celulares a pase
2. Sin embargo, a pase 5 se detectó un incremento en la expresión de
\beta-MyHC y SERCA-2 en ambas
poblaciones celulares (Figuras 4 y 5), las células
epi-ADSC presentan un incremento en la expresión de
\beta-MyHC superior al observado en las células
sub-ADSC procedentes de un mismo individuo (Figura
4).
La existencia de esta expresión diferencial a
nivel proteico puede deberse a diferencias en los mecanismos de
regulación del proceso de traducción de transcrito o mRNA a
proteína madura entre las dos poblaciones celulares estudiadas.
En relación con los restantes genes/proteínas
analizadas hay un alto grado de coincidencia entre los resultados
obtenidos mediante la RT-PCR a tiempo real y los
experimentos de Western blot e inmunofluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la capacidad de diferenciación de las
células madre derivadas de grasa de epicardio
(epi-ADSCs) a linaje adipogénico, osteogénico y
condrogénico.
Se utilizaron protocolos de diferenciación
específicos para cada uno de los linajes celulares: diferenciación
osteogénica, diferenciación adipogénica y diferenciación
condrogénica.
La inducción de la diferenciación a osteocitos
se efectuó siguiendo un protocolo ya establecido para células madre
derivadas de tejido adiposo subcutáneo y para otros tipos celulares
(Zuk et al., 2002. Human adipose tissue is a source of
multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002 Dec;
13(12):4279-95).
Tras mantener las células 1 semana en cultivo
(medio DMEM, L-glutamina 2 mM (Gibco), 100 U/mL de
penicilina/estreptomicina (Gibco), se indujo la diferenciación a
osteocitos mediante el cultivo durante dos semanas en un medio de
diferenciación específico compuesto por: DMEM
(BE12-614F Cambrex, Biowhitaker), 10% de FBS (5253
Linus Cultek), L-glutamina 2 mM (Gibco), 100 U/mL de
penicilina/estreptomicina (Gibco), dexametasona 100 nM (Sigma),
ácido 2-fosfato ascórbico 50 \muM (Sigma) y
beta-glicerofosfato 10 mM (Sigma).
La inducción de la diferenciación a adipocitos
se efectuó siguiendo un protocolo ya establecido para células madre
derivadas de tejido adiposo subcutáneo y para otros tipos celulares
(Zuk et al., 2002, citado supra; Awad et al.,
2003. Effects of transforming growth factor betal and dexamethasone
on the growth and chondrogenic differentiation of
adipose-derived stromal cells.Tissue Eng. 2003 Dec;
9(6):1301-12).
Tras mantener las células 1 semana en cultivo en
medio DMEM, L-glutamina 2 mM (Gibco), 100 U/mL de
penicilina/estreptomicina (Gibco), se indujo la diferenciación a
adipocitos mediante la alternancia de dos medios de cultivo (Medio A
y Medio B), cuya composición se especifica a continuación:
- \quad
- Medio A: DMEM (BE12-614F Cambrex, Biowhitaker), 10% de FBS (5253 Linus Cultek), L-glutamina 2 mM (Gibco), 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (Gibco), dexametasona 1 \muM (Sigma), indometacina 0,2 mM (Sigma), 10 \mug/ml de insulina (Sigma) y 3-isobutil-1-metilxantina 0,5 mM (Sigma).
- \quad
- Medio B: DMEM (BE12-614F Cambrex, Biowhitaker), 10% de FBS (5253 Linus Cultek), L-glutamina 2 mM (Gibco), 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (Gibco) y 10 \mug/ml de insulina (Sigma).
La inducción de la diferenciación a condrocitos
se efectuó siguiendo un protocolo ya establecido para células madre
derivadas de tejido adiposo subcutáneo y para otros tipos celulares
(Zuk et al., 2002, citado supra). Se indujo la
diferenciación mediante la combinación de un cambio de medio y el
sometimiento de las células a una baja concentración de
oxígeno.
- \quad
- Preinducción: Se centrifugaron los clones en placas de 96 pocillos de fondo cónico, y se dejaron crecer los aglomerados de células durante 24 horas en DMEM con 1% de FBS.
- \quad
- Inducción: Los clones se mantuvieron durante 20 días en un medio específico, cambiando el medio cada 3 días, con medio compuesto de DMEM (BE12-614F Cambrex, Biowhitaker), 1% de FBS (5253 Linus Cultek), L-glutamina 2 mM (Gibco), 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (Gibco), 6,25 de \mug/ml de insulina (Sigma), 10 ng/mL de TGFB-1 (R&D) y ácido ascórbico-2-fosfato 50 nM (Sigma).
Se usaron diferentes protocolos de tinción
adecuados para cada una de las diferenciaciones:
Se fijaron las células con etanol al 50% durante
15 minutos a 4ºC. La tinción se realizó con Rojo Alizarina al 1% en
agua destilada (pH = 4,1) a temperatura ambiente en agitación
durante 45 minutos. Las colonias que han diferenciado y, por tanto,
han generado calcio a su alrededor, quedan teñidas de rojo
intenso.
Se fijaron las células con una dilución 1:10 de
formaldehído al 37% en PBS (pH 7,4) durante 20 minutos a
temperatura ambiente. La tinción se realizó con "Oil Red" (0,3
g de "Oil Red" en 100 ml de isopropanol, dilución 1:2 en agua
destilada) e incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Los lípidos acumulados en las vacuolas de las células que han
diferenciado quedan teñidos de rojo.
Se fijaron las células con una dilución de
formaldehído al 4% durante 1 hora a temperatura ambiente. La
tinción se realizó con una dilución de 0,1% de azul de Alcian en
"alcohol ácido" (70% de etanol, 1% de HCl en agua destilada)
incubando a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar se
vuelve a fijar la tinción con PFA al 4%. Las células diferenciadas
quedan teñidas de azul.
El análisis de los resultados de tinción
específica para los linajes adipogénico, osteogénico y condrogénico
muestra que las células madre derivadas de grasa de tejido graso de
corazón, en particular de la zona del epicardio
(epi-ADSC) se tiñen significativamente peor que las
células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo
(sub-ADSC). La aparición de una coloración intensa
es indicativa de un mayor grado de diferenciación, por lo que se
puede concluir que las células madre derivadas de tejido adiposo
cardiaco (epi-ADSC) presentan una menor capacidad de
diferenciación hacia adipocito, osteocito y condrocito respecto a
las células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo
(sub-ADSC).
Claims (19)
1. Una célula madre adulta, aislada, derivada de
tejido graso epicárdico humano, que expresa GATA-4
y/o Cx-43 de forma constitutiva.
2. Célula según la reivindicación 1, que,
además, expresa de forma constitutiva
\beta-MyHC.
3. Célula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, que expresa, además, uno o más marcadores
de superficie seleccionados entre CD105, CD44, CD59, CD29 y
CD90.
4. Célula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que no expresa uno, dos, tres o,
preferiblemente, ninguno de los marcadores de superficie CD117,
CD106, CD34 y CD14.
5. Célula según cualquiera de las
reivindicaciones 3 ó 4, que (i) expresa uno, dos, tres, cuatro o,
preferiblemente, todos los marcadores de superficie CD105, CD44,
CD59, CD29 y CD90, y (ii) no expresa uno, dos, tres o,
preferiblemente, ninguno de los marcadores de superficie CD117,
CD106, CD34 y CD14.
6. Célula según la reivindicación 5, que (i)
expresa la totalidad de los marcadores de superficie CD105, CD44,
CD59, CD29 y CD90, y (ii) no expresa ninguno de los marcadores de
superficie CD117, CD106, CD34 y CD14.
7. Una población, aislada, de células madre
adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero, que
comprende un conjunto de células según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6.
8. Un procedimiento para obtener una composición
que comprende células madre adultas derivadas de tejido graso
epicárdico humano que expresan GATA-4 y/o
Cx-43 de forma constitutiva, que comprende:
- a)
- obtener una suspensión celular de una muestra de tejido graso epicárdico de un humano;
- b)
- separar las células de dicha suspensión celular;
- c)
- cultivar dichas células en un medio de cultivo sobre un soporte sólido bajo condiciones que permiten a dichas células adherirse a dicho soporte sólido; y
- d)
- recuperar las células madre adultas derivadas de tejido graso epicárdico humano que expresan GATA-4 y/o Cx-43 de forma constitutiva.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Una composición que comprende células madre
adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero que expresan
GATA-4 y/o Cx-43 de forma
constitutiva obtenible mediante un procedimiento según la
reivindicación 8.
10. Una composición farmacéutica que comprende
una población celular según la reivindicación 7, o una composición
según la reivindicación 9, y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
11. Composición farmacéutica según la
reivindicación 10, para su administración por vía parenteral.
12. Un biomaterial que comprende una población
celular según la reivindicación 7, una composición según la
reivindicación 9 o una composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 10 u 11.
13. Uso de una población celular según la
reivindicación 7, o una composición según la reivindicación 9, en
la elaboración de una composición farmacéutica para la regeneración
de tejido cardiaco, o en la elaboración de una composición
farmacéutica para el tratamiento de una cardiopatía isquémica, o en
la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento
post-infarto de miocardio y/o para el tratamiento
de la insuficiencia cardiaca congestiva.
14. Uso según la reivindicación 13, en el que
dicha composición farmacéutica es administrada junto con uno o más
agentes terapéuticos diferentes, de manera simultánea o
secuencial.
15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
13 ó 14, en el que las células contenidas en dicha población
celular son de origen autólogo.
16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
13 ó 14, en el que las células contenidas en dicha población
celular son de origen alogénico.
17. Un kit que comprende una población celular
según la reivindicación 7, o una composición según la
reivindicación 9.
\newpage
18. Un método para evaluar in vitro la
respuesta celular a un agente biológico o farmacológico, que
comprende poner en contacto dicho agente con una población celular
según la reivindicación 7, que comprende una pluralidad de células
madre según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una
composición según la reivindicación 9, opcionalmente, diferenciadas
a un tipo celular concreto, y evaluar los efectos de dichos agentes
sobre dicha población celular en cultivo.
19. Método según la reivindicación 18, en el que
dichas células madre son diferenciadas a cardiomiocitos.
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