ES2885080T3 - Composición inyectable que comprende fibroblastos para su utilización en el tratamiento de cardiopatías - Google Patents
Composición inyectable que comprende fibroblastos para su utilización en el tratamiento de cardiopatías Download PDFInfo
- Publication number
- ES2885080T3 ES2885080T3 ES18758465T ES18758465T ES2885080T3 ES 2885080 T3 ES2885080 T3 ES 2885080T3 ES 18758465 T ES18758465 T ES 18758465T ES 18758465 T ES18758465 T ES 18758465T ES 2885080 T3 ES2885080 T3 ES 2885080T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- fibroblasts
- cells
- human
- less
- positive
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 title claims abstract description 286
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 title description 12
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 claims abstract description 221
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 claims abstract description 43
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 160
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims description 42
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims description 42
- 102000001045 Connexin 43 Human genes 0.000 claims description 13
- 108010069241 Connexin 43 Proteins 0.000 claims description 13
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 78
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 description 42
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 38
- 206010007558 Cardiac failure chronic Diseases 0.000 description 37
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 33
- 210000001054 cardiac fibroblast Anatomy 0.000 description 23
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 22
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 21
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 21
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 20
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 20
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 17
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 17
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 16
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 16
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 14
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 13
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 13
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 12
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 12
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- 238000002592 echocardiography Methods 0.000 description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 10
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 10
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 10
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 10
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 9
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 7
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 7
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 6
- 230000003205 diastolic effect Effects 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 4
- GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N Nitrous Oxide Chemical compound [O-][N+]#N GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 4
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 4
- 210000002458 fetal heart Anatomy 0.000 description 4
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 4
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 4
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 4
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 4
- 238000007898 magnetic cell sorting Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- ALZOLUNSQWINIR-UHFFFAOYSA-N quinmerac Chemical compound OC(=O)C1=C(Cl)C=CC2=CC(C)=CN=C21 ALZOLUNSQWINIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 4
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 4
- 102000010970 Connexin Human genes 0.000 description 3
- 108050001175 Connexin Proteins 0.000 description 3
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 3
- 230000027902 cell growth involved in cardiac muscle cell development Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 3
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 208000003663 ventricular fibrillation Diseases 0.000 description 3
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCSKNASZPVZHEG-UHFFFAOYSA-N 3,6-dimethyl-1,4-dioxane-2,5-dione;1,4-dioxane-2,5-dione Chemical compound O=C1COC(=O)CO1.CC1OC(=O)C(C)OC1=O LCSKNASZPVZHEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 HFDM-1(+) Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 206010024119 Left ventricular failure Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- HZHFFEYYPYZMNU-UHFFFAOYSA-K gadodiamide Chemical compound [Gd+3].CNC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC(=O)NC HZHFFEYYPYZMNU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000003976 gap junction Anatomy 0.000 description 2
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 2
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 235000013842 nitrous oxide Nutrition 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000011816 wild-type C57Bl6 mouse Methods 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 208000019300 CLIPPERS Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 206010056370 Congestive cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 201000010046 Dilated cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000028180 Glycophorins Human genes 0.000 description 1
- 108091005250 Glycophorins Proteins 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 1
- HOBWAPHTEJGALG-JKCMADFCSA-N [(1r,5s)-8-methyl-8-azoniabicyclo[3.2.1]octan-3-yl] 3-hydroxy-2-phenylpropanoate;sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O.C([C@H]1CC[C@@H](C2)[NH+]1C)C2OC(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1.C([C@H]1CC[C@@H](C2)[NH+]1C)C2OC(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 HOBWAPHTEJGALG-JKCMADFCSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229960002028 atropine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- GMTYREVWZXJPLF-AFHUBHILSA-N butorphanol D-tartrate Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O.N1([C@@H]2CC3=CC=C(C=C3[C@@]3([C@]2(CCCC3)O)CC1)O)CC1CCC1 GMTYREVWZXJPLF-AFHUBHILSA-N 0.000 description 1
- 229960001590 butorphanol tartrate Drugs 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 208000021930 chronic lymphocytic inflammation with pontine perivascular enhancement responsive to steroids Diseases 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- QTCANKDTWWSCMR-UHFFFAOYSA-N costic aldehyde Natural products C1CCC(=C)C2CC(C(=C)C=O)CCC21C QTCANKDTWWSCMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000035617 depilation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000006718 epigenetic regulation Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 206010020871 hypertrophic cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003983 inhalation anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- ISTFUJWTQAMRGA-UHFFFAOYSA-N iso-beta-costal Natural products C1C(C(=C)C=O)CCC2(C)CCCC(C)=C21 ISTFUJWTQAMRGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000005246 left atrium Anatomy 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229960004882 medetomidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- VPNGEIHDPSLNMU-UHFFFAOYSA-N medetomidine hydrochloride Chemical compound Cl.C=1C=CC(C)=C(C)C=1C(C)C1=CNC=N1 VPNGEIHDPSLNMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- DDLIGBOFAVUZHB-UHFFFAOYSA-N midazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NC=C2CN=C1C1=CC=CC=C1F DDLIGBOFAVUZHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003793 midazolam Drugs 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 210000004115 mitral valve Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940028444 muse Drugs 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000010244 region-of-interest analysis Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 102000035087 single-pass transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005496 single-pass transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004683 skeletal myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000002627 tracheal intubation Methods 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002087 whitening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/33—Fibroblasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Composición inyectable que comprende fibroblastos para su utilización en el tratamiento de insuficiencia cardíaca, cardiopatía isquémica o infarto de miocardio, en la que los fibroblastos contienen fibroblastos positivos para CD106 y en la que la composición inyectable se debe inyectar en una región de tejido cardíaco necrótico o sus inmediaciones, y/o infundir en una arteria coronaria.
Description
DESCRIPCIÓN
Composición inyectable que comprende fibroblastos para su utilización en el tratamiento de cardiopatías SECTOR TÉCNICO
La presente invención se refiere a una composición inyectable que comprende fibroblastos, más específicamente, se refiere a una composición inyectable para su utilización en el tratamiento de insuficiencia cardíaca, cardiopatía isquémica o infarto de miocardio, comprendiendo la composición fibroblastos que expresan una proteína particular. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El pronóstico de supervivencia tras la insuficiencia cardíaca por infarto de miocardio o miocardiopatía es muy malo, y su procedimiento terapéutico fundamental, en la actualidad, se limita al trasplante cardíaco. Sin embargo, en la actualidad, es insuficiente el número de donantes para los pacientes en todo el mundo, no solo en Japón, y no pueden recibir la terapia suficiente, lo cual es problemático. Por lo tanto, en los últimos años, el tratamiento de las cardiopatías mediante medicina regenerativa está llamando la atención y se están desarrollando sus tecnologías. Por ejemplo, el documento de Patente 1 y similares dan a conocer láminas de células, y se está estudiando el desarrollo de estas láminas para mioblastos esqueléticos autólogos. El documento de Patente 2 y similares estudian el tratamiento de una cardiopatía con una lámina de miocardio que utiliza células madre pluripotentes inducidas. Sin embargo, a pesar de estos estudios, no se ha informado sobre un procedimiento que permita la recuperación significativa y a largo plazo de una función cardíaca que se ha perdido, y existe una demanda para establecer un procedimiento que permita la curación fundamental y a largo plazo de una región de tejido cardíaco necrótico para permitir la recuperación de una función cardíaca.
En estas circunstancias, los inventores de la presente invención descubrieron que se puede obtener una lámina de células cardíacas funcionales utilizando fibroblastos que son positivos para la molécula 1 de adhesión de células vasculares (VCAM-1, CD106) (véase el documento de Patente 3).
DOCUMENTOS DEL ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
[Documentos de Patente]
[Documento de Patente 1] JP 2010-081829 A
[Documento de Patente 2] WO 2013/137491
[Documento de Patente 3] WO 2016/006262
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN PROBLEMAS QUE DEBE RESOLVER LA INVENCIÓN
Un objetivo de la presente invención es dar a conocer un procedimiento que aún no se ha establecido y que es útil para conseguir una curación fundamental y a largo plazo de una región de tejido cardíaco necrótico, para permitir la recuperación de una función cardíaca.
MEDIOS PARA RESOLVER LOS PROBLEMAS
Los inventores de la presente invención llevaron a cabo un estudio para resolver el problema anterior y, como resultado, descubrieron que una cardiopatía se puede tratar mediante la administración (infusión) de un tipo particular de fibroblastos a una región de tejido cardíaco necrótico, completando de este modo la presente invención. La presente invención incluye los siguientes aspectos.
(1) Una composición inyectable que contiene fibroblastos para su utilización en el tratamiento de insuficiencia cardíaca, cardiopatía isquémica o infarto de miocardio, en la que los fibroblastos contienen fibroblastos positivos para CD106 y en la que la composición inyectable se debe inyectar en una región del tejido cardíaco necrótico o sus inmediaciones, y/o infundir dentro de una arteria coronaria.
(2) La composición inyectable para su utilización, según el aspecto (1), en la que los fibroblastos contienen fibroblastos positivos para CD90.
(3) La composición inyectable para su utilización, según los aspectos (1) o (2), en la que los fibroblastos contienen fibroblastos positivos para conexina 43.
(4) La composición inyectable para su utilización, según cualquiera de los aspectos (1) a (3), en la que la proporción (en términos del número de células) de los fibroblastos positivos para CD106 respecto a la cantidad total de fibroblastos contenidos en la composición inyectable no es inferior al 0,03 %.
EFECTO DE LA INVENCION
Mediante la presente invención, se dan a conocer medios eficaces para su utilización en la curación de una región de tejido cardíaco necrótico para recuperar una función cardíaca.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS
La figura 1A muestra gráficos que ilustran la localización de la proteína VCAM-1 en fibroblastos cardíacos de ratón positivos para CD106.
La figura 1B muestra imágenes de inmunofluorescencia positiva para VCAM-1 de fibroblastos cardíacos de ratón positivos para CD106 (fotografías de sustitución de dibujos).
La figura 1C muestra imágenes de inmunofluorescencia positiva para conexina 43 de cada tipo de fibroblastos (fotografías de sustitución de dibujos).
La figura 2A muestra un gráfico que ilustra una función cardíaca (fracción de eyección, fracción de eyección del ventrículo izquierdo) después de la inyección de fibroblastos cardíacos de ratón positivos para CD106.
La figura 2B muestra un gráfico que ilustra una función cardíaca (acortamiento fraccional, acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo) después de la inyección de fibroblastos cardíacos de ratón positivos para CD106.
La figura 2C muestra imágenes ecocardiográficas de corazones de rata (fotografías de sustitución de dibujos). La figura 3A muestra imágenes de áreas de infarto fibrótico de colágeno en corazones de rata (fotografías de sustitución de dibujos).
La figura 3B muestra un gráfico que muestra las áreas de infarto fibrótico de colágeno en corazones de rata.
La figura 4 muestra un gráfico que ilustra una función cardíaca (el acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (FS, fractional shortening) y la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (EF, ejection fraction)).
La figura 5 muestra un programa de seguimiento de la función cardíaca para un modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas, cuyo seguimiento se llevó a cabo mediante ecocardiografía. Para confirmar el efecto terapéutico de los fibroblastos de rata positivos para CD106 sobre la insuficiencia cardíaca crónica, se llevó a cabo un seguimiento de las funciones cardíacas mediante ecocardiografía desde el día de la administración de las células hasta la semana 18 a intervalos de dos semanas.
La figura 6 muestra un programa de seguimiento de la función cardíaca para un modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas, cuyo seguimiento se llevó a cabo mediante ecocardiografía. Para confirmar el efecto terapéutico de los fibroblastos humanos positivos para CD106 sobre la insuficiencia cardíaca crónica, se llevó a cabo un seguimiento de las funciones cardíacas mediante ecocardiografía desde el día de la administración de las células hasta la semana 18 a intervalos de dos semanas. Para estudiar la dosis óptima de fibroblastos humanos positivos para CD106, se realizó un seguimiento de las funciones cardíacas mediante ecocardiografía desde el día de la administración de las células hasta la semana 8 a intervalos de dos semanas. Para proporcionar un control, se realizó un seguimiento de las funciones cardíacas mediante ecocardiografía en la semana 2, semana 4, semana 8, semana 12, semana 16 y semana 18 después de la administración de un medio.
La figura 7 muestra el efecto de la administración de fibroblastos de rata positivos para CD106 (2,0 x 106 células/50 |o.l) sobre la recuperación de las funciones cardíacas en un modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas. (A) representa la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF = (LVIDd3 - LVIDs3) / LVIDd3); (B) representa el acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (LVFs = (LVIDd - LVIDs) x 100 / LVIDd); (C) representa el volumen telediastólico del ventrículo izquierdo (LVEDV, left ventricular end-diastolic volume); y (D) representa el volumen telesistólico del ventrículo izquierdo (LVESV, left ventricular end-sistolic volume). N = 4.
La figura 8 muestra las proporciones de células positivas para CD106 y CD90 (%) en diversos fibroblastos cardíacos. Se sometieron a análisis comparativo fibroblastos derivados del corazón de fetos caucásicos (semana 21) (c21wFCF), fibroblastos derivados del corazón de adultos caucásicos (en la cincuentena) (c50yACF) y fibroblastos derivados del corazón de adultos negros (en la sesentena) (b60yACF).
La figura 9 muestra la proporción de células positivas para CD106-CD90 (%) en fibroblastos humanos positivos para CD106 recogidos por clasificación mediante autoMACS.
La figura 10 muestra: la proporción de células positivas para Oct3/4 (%) en fibroblastos humanos positivos para CD106 (A); la proporción de células positivas para Nanog (%) en fibroblastos humanos positivos para CD106 (B); y la proporción de células positivas para Sox2 (%) en fibroblastos humanos positivos para CD106 (C). N = 3. N. S. = no significativo.
La figura 11 muestra las propiedades celulares de fibroblastos humanos positivos para CD106. Se evaluaron las localizaciones de un marcador de células estromales/células madre mesenquimales (vimentina), un marcador de células epiteliales (citoqueratina) y un marcador de unión gap de cardiomiocitos (conexina 43).
La figura 12 muestra la proporción de células positivas para STRO-1 (%) en fibroblastos humanos positivos para CD106. Después del reconocimiento del área celular con FSC-A y SSC-A, se evaluó la proporción (%) de células positivas para STRO-1 (FITC-A) en una población celular que es doblemente positiva para CD106 (VioBlue-A) y CD90 (PE-A). Como controles negativos, se utilizaron controles de isotipo para los anticuerpos anteriores.
La figura 13 muestra el efecto de la administración de fibroblastos humanos positivos para CD106 (2,0 x 106 células/50 |o.l) sobre la recuperación de las funciones cardíacas en un modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas. (A) representa la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF = (LVIDd3 - LVIDs3) / LVIDd3); (B) representa el acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (LVFS = (LVIDd - LVIDs) x 100 / LVIDd); (C) representa el volumen telediastólico del ventrículo izquierdo (LVEDV); y (D) representa el volumen telesistólico del
ventrículo izquierdo (LVESV). N = 4.
La figura 14 muestra los efectos de la administración de fibroblastos humanos positivos para CD106 a diferentes dosis sobre la recuperación de las funciones cardíacas en un modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas. (A) representa la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF = (LVIDd3 - LVIDs3) / LVIDd3); (B) representa el acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (LVFs = (LVIDd - LVIDs) x 100 / LVIDd); (C) representa el volumen telediastólico del ventrículo izquierdo (LVEDV); y (D) representa el volumen telesistólico del ventrículo izquierdo (LVESV). N = 4. N. S. = no significativo.
La figura 15 muestra los resultados de la evaluación de las funciones cardíacas en un modelo de insuficiencia cardíaca crónica porcina, cuya evaluación se llevó a cabo el día antes de la administración de fibroblastos humanos positivos para CD106 (fotografías de sustitución de dibujos).
La figura 16 muestra los resultados de la evaluación de las funciones cardíacas en un modelo de insuficiencia cardíaca crónica porcina, cuya evaluación se llevó a cabo cuatro semanas después de la administración de fibroblastos humanos positivos para CD106 (fotografías de sustitución de dibujos).
La figura 17 muestra los resultados de la evaluación de las funciones cardíacas en un modelo de insuficiencia cardíaca crónica porcina, cuya evaluación se llevó a cabo ocho semanas después de la administración de fibroblastos humanos positivos para CD106 (fotografías de sustitución de dibujos).
MODO DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN
La presente invención se describe, a continuación, en detalle mediante realizaciones específicas. Sin embargo, la presente invención no queda limitada por las realizaciones específicas descritas.
Se describe una composición inyectable para su utilización en el tratamiento de insuficiencia cardíaca, cardiopatía isquémica o infarto de miocardio, comprendiendo la composición fibroblastos, en la que los fibroblastos contienen fibroblastos positivos para CD106 (a continuación, denominados también CD106+).
Entre los fibroblastos se incluye cualquier célula que finalmente se convierta en fibroblastos o miofibroblastos. Es decir, el alcance de los fibroblastos incluye células que están en proceso de diferenciación o maduración y que finalmente se convierten en fibroblastos o miofibroblastos incluso en los casos en los que las células no pueden identificarse como fibroblastos o miofibroblastos en ese momento. El alcance de los fibroblastos también incluye células que no se denominan fibroblastos, tales como células estromales, células precursoras, células madre y mioblastos, siempre que sean células CD106+ que tengan funciones similares a las de los fibroblastos.
Los fibroblastos CD106+ se caracterizan por ser positivos para la vimentina, que es un marcador citoesquelético de fibroblastos y células madre mesenquimales, y negativos para STRO-1, que es uno de los marcadores moleculares más conocidos de células madre mesenquimales (MSC, mesenchymal stem cells).
El origen de los fibroblastos no está limitado, y estas células se pueden obtener mediante diferenciación de células madre pluripotentes o células madre multipotentes, tales como células madre embrionarias (células ES), células madre pluripotentes inducidas (células iPS) o células Muse, o de células madre adultas, tales como las células madre mesenquimales. Se pueden utilizar células primarias recogidas de un animal (incluido el ser humano), o se puede utilizar una línea celular establecida. Se utilizan, preferentemente, fibroblastos derivados del corazón y, más preferentemente, se utilizan fibroblastos derivados del epicardio.
En particular, cuando se utilizan fibroblastos derivados de seres humanos, se puede obtener un efecto terapéutico elevado sobre una cardiopatía mediante inyección. Los fibroblastos derivados de seres humanos, en comparación con los de ratón y similares, muestran una proporción mucho menor de fibroblastos CD106+. Según un estudio de los inventores de la presente invención, la proporción es, como máximo, el 9,1 %, aproximadamente (en términos del número de células). De este modo, la composición descrita en la presente memoria descriptiva puede incluir también una población de fibroblastos de origen humano en la que la proporción de fibroblastos CD106+ de origen humano aumenta mediante la etapa de cribado mencionada posteriormente y/o similares. Por ejemplo, la población de fibroblastos de origen humano descrita en la presente memoria descriptiva puede ser una población de fibroblastos de origen humano en la que la proporción (en términos del número de células) de fibroblastos CD106+ de origen humano en el total de fibroblastos de origen humano no sea menos del 10 %. La proporción (en términos del número de células) de fibroblastos CD106+ en el total de fibroblastos puede ser no menos del 15 %, puede ser no menos del 20 %, puede ser no menos del 25 %, puede ser no menos del 30 %, puede ser no menos del 40 %, puede ser no menos del 50 %, puede ser no menos del 60 %, puede ser no menos del 70 %, puede ser no menos del 80 %, puede ser no menos del 90 % o puede ser del 100 %. La población de fibroblastos de origen humano descrita en la presente memoria descriptiva puede ser una población de fibroblastos derivados de corazón humano, puede ser fibroblastos derivados de corazón humano adulto o puede ser una población de fibroblastos derivados de corazón fetal humano.
Seleccionando células que se sabe que son CD106+, se puede omitir el proceso de clasificación de células.
La CD106, también llamada VCAM-1, es una proteína conocida como molécula de adhesión celular expresada en células endoteliales vasculares y similares. En la presente invención, los fibroblastos CD106+, es decir, positivos
para VCAM-1 (VCAM-1+) se proporcionan como una composición inyectable para su utilización en el tratamiento de insuficiencia cardíaca, cardiopatía isquémica o infarto de miocardio.
Los fibroblastos CD106+ proporcionados como una composición inyectable son para su utilización en el tratamiento de insuficiencia cardíaca, cardiopatía isquémica o infarto de miocardio mediante inyección directa en una región de tejido miocárdico necrótico. Además, las células se pueden inyectar en las inmediaciones de una región de tejido miocárdico necrótico, se pueden infundir en una arteria coronaria o se pueden infundir en una vena, arteria, ganglio linfático o vaso linfático. La infusión en una arteria coronaria, o la infusión en una vena, arteria o vaso linfático se puede llevar a cabo mediante inyección en el vaso o mediante infusión a través de un catéter, o se puede utilizar otro procedimiento conocido para ello.
El procedimiento de inyección no está limitado, y se puede aplicar al mismo un procedimiento de inyección conocido, tal como inyección con aguja o inyección sin aguja. El procedimiento de infusión utilizando un catéter tampoco está limitado, y se puede aplicar al mismo un procedimiento conocido.
La composición inyectable también puede contener otro tipo de fibroblastos u otro componente siempre que la composición contenga una cantidad eficaz terapéuticamente de fibroblastos CD106+ como componente eficaz. En los casos en los que se contenga otro tipo de fibroblastos, la proporción de los fibroblastos CD106+ respecto a la cantidad total de fibroblastos contenidos en la composición inyectable, en términos del número de células puede ser no menos del 0,03 %, puede ser no menos del 0,1 %, puede ser no menos del 1 %, puede ser no menos del 2 %, puede ser no menos del 4 %, puede ser no menos del 5 %, puede ser no menos del 10 %, puede ser no menos del 20 %, puede ser no menos del 30 %, puede ser no menos del 40 %, puede ser no menos del 50 %, puede ser no menos del 60 %, puede ser no menos del 70 %, puede ser no menos del 80 %, puede ser no menos del 90 %, puede ser no menos del 95 %, puede ser no menos del 98 % o puede ser no menos del 99 %.
Los fibroblastos CD106+ contenidos en la composición inyectable pueden ser células preparadas mediante cultivo conjunto con otras células, por ejemplo, cardiomiocitos.
Entre los ejemplos de cardiopatías descritas en la presente memoria descriptiva se incluyen, sin limitación a las mismas, enfermedades causadas por trastornos, deficiencias, disfunciones o similares de un tejido miocárdico, tales como insuficiencia cardíaca, cardiopatías isquémicas, infarto de miocardio, miocardiopatía, miocarditis, miocardiopatía hipertrófica y miocardiopatía dilatada.
Los fibroblastos CD106+ contenidos en la composición inyectable pueden ser positivos para CD90 (CD90+). Es decir, la composición inyectable puede contener fibroblastos positivos para CD90. CD90, también llamado Thy-1, es una molécula unida a glicosilfosfatidilinositol (GPI) rica en cadenas de azúcar. CD90 se expresa en diversas líneas de células estromales de tejidos nerviosos, tejidos conectivos y similares, pero no se expresa en cardiomiocitos. De este modo, la expresión "fibroblastos CD90+" pretende estar libre de cardiomiocitos. Para la expresión "fibroblastos CD90+ libres de cardiomiocitos", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la presencia de cierta cantidad de cardiomiocitos es aceptable. La cantidad de cardiomiocitos puede ser no más del 5 %, no más del 4 %, no más del 3 %, no más del 2 %, no más del 1 %, no más del 0,5 %, no más del 0,1 % o no más del 0,01 % en términos del número de células, con respecto al total de células contenidas en la composición inyectable.
La proporción (en términos del número de células) de fibroblastos CD90+ en los fibroblastos CD106+ puede ser no menos del 30 %, puede ser no menos del 40 %, puede ser no menos del 50 %, puede ser no menos del 60 %, puede puede ser no menos del 70 %, puede ser no menos del 80 %, puede ser no menos del 90 %, puede ser no menos del 95 %, puede ser no menos del 98 % o puede ser del 100 %.
Puede proporcionarse una población de fibroblastos que contenga fibroblastos CD106+ CD90+. En la población de fibroblastos, la proporción de fibroblastos CD106+ CD90+, en términos del número de células, puede ser superior al 8,2 %, no menos del 8,5 %, no menos del 9 %, no menos del 10 %, no menos del 15 %, no menos del 20 %, no menos del 30 %, no menos del 40 %, no menos del 50 %, no menos del 60 %, no menos del 70 %, no menos del 80 %, no menos del 90 %, no menos del 95 %, no menos del 97 %, no menos del 98 %, no menos del 99 % o del 100 %. En estos modos, los fibroblastos CD106+ CD90+ pueden derivar, por ejemplo, de seres humanos. Los fibroblastos CD106+ CD90+ pueden ser, por ejemplo, fibroblastos derivados del corazón. Los fibroblastos CD106+ CD90+ pueden ser, por ejemplo, fibroblastos derivados del corazón humano. Los fibroblastos CD106+ CD90+ se pueden obtener, por ejemplo, concentrando células CD106+ CD90+ a partir de un tejido utilizando un clasificador de células o similar. En estos modos, los fibroblastos pueden ser fibroblastos recogidos de un feto humano.
Los fibroblastos CD106+ CD90+ son capaces de controlar la respuesta inflamatoria mediante la secreción de citocinas y similares para el mantenimiento de la homeostasis de los órganos. Las citocinas, quimiocinas y similares secretadas forman microambientes adecuados para la regeneración de los tejidos del músculo cardíaco y promueven el crecimiento de los cardiomiocitos, el control del latido de los cardiomiocitos y/o la angiogénesis, permitiendo de esta manera la mejora de las funciones cardíacas. Además, los fibroblastos CD106+ CD90+ son capaces de suprimir la progresión de la fibrosis.
Por consiguiente, la presente descripción puede incluir una invención de un agente de control de la respuesta inflamatoria cardíaca (o un agente supresor de la inflamación cardíaca) que contiene fibroblastos CD106+ CD90+ o un producto purificado de las células. La presente descripción también puede incluir una invención de un agente promotor de la secreción de citocinas para células cardíacas, agente que contiene fibroblastos CD106+ CD90+ o un sobrenadante de cultivo de estas células; o un agente de control de la secreción de citocinas que contiene un lisado celular o un sobrenadante de cultivo de fibroblastos CD106+ CD90+, o que contiene un producto purificado de estas células. La presente descripción también puede incluir una invención de un agente formador de microambiente para tejidos cardíacos, agente que contiene fibroblastos CD106+ CD90+. La presente descripción también puede incluir una invención de un agente de crecimiento de cardiomiocitos, un agente de control de latidos para cardiomiocitos o un agente para promover la maduración o angiogénesis de cardiomiocitos, que contiene fibroblastos CD106+ CD90+.
En otras palabras, se describe un procedimiento para controlar la respuesta inflamatoria cardíaca, procedimiento que incluye una etapa de inyectar fibroblastos CD106+ CD90+ en una región de tejido cardíaco necrótico o sus inmediaciones, y/o infundir estas células en una arteria coronaria. Además, se describe un procedimiento para controlar la secreción de citocinas o un procedimiento para promover la secreción de citocinas, procedimiento que incluye una etapa de inyectar fibroblastos CD106+ CD90+ en una región de tejido cardíaco necrótico o sus inmediaciones, y/o infundir estas células en una arteria coronaria. Además, se describe un procedimiento para formar un microambiente en un tejido cardíaco, procedimiento que incluye una etapa de inyectar fibroblastos CD106+ CD90+ en una región de tejido cardíaco necrótico o sus inmediaciones, y/o infundir estas células en una arteria coronaria.
Las citocinas son proteínas responsables de la transducción de señales implicadas en la inmunidad o la inflamación e incluyen citocinas conocidas.
Los fibroblastos CD106+ contenidos en la composición inyectable pueden ser fibroblastos positivos para conexina 43 (conexina 43+). Es decir, la composición inyectable puede contener fibroblastos positivos para conexina 43.
La conexina 43 es una proteína transmembrana que se sabe que se expresa en la pared vascular junto con placas arterioescleróticas y que se une, como una unión gap de un cardiomiocito, a una célula adyacente para participar en la propagación de la excitación eléctrica del corazón. Los inventores de la presente invención piensan que la positividad de la conexina 43 permite la transmisión de señales eléctricas en un tejido miocárdico, lo que conduce a una mejora del efecto terapéutico de la composición inyectable.
La proporción (en términos de número de células) de fibroblastos conexina 43+ en los fibroblastos CD106+ puede ser no menos del 30 %, puede ser no menos del 40 %, puede ser no menos del 50 %, puede ser no menos del 60 %, puede ser no menos del 70 %, puede ser no menos del 80 %, puede ser no menos del 90 %, puede ser no menos del 95 %, puede ser no menos del 98 % o puede ser del 100 %.
La composición inyectable puede contener otros componentes aceptables fisiológicamente como composición inyectable. Entre los ejemplos de dichos otros componentes se incluyen solución salina fisiológica, líquidos de conservación celular, medios de cultivo celular, hidrogeles, matrices extracelulares y líquidos de crioconservación. La proporción de fibroblastos CD106+ contenidos en la composición inyectable se puede establecer apropiadamente basándose, por ejemplo, en el modo de inyección o infusión, de manera que una cantidad eficaz terapéuticamente de fibroblastos CD106+ esté contenida como componente eficaz. Por lo general, la proporción, en términos del número de células, de fibroblastos CD106+ respecto a la cantidad total de células en la composición inyectable puede ser no menos del 0,03 %, puede ser no menos del 1 %, puede ser no menos del 5 %, puede ser no menos del 10 %, puede ser no menos del 25 %, puede ser no menos del 50 %, puede ser no menos del 90 %, puede ser no menos del 95 %, puede ser no menos del 98 % o puede ser del 100 %.
El número de fibroblastos CD106+ contenidos en la composición inyectable puede ser, por ejemplo, no menos de 1.0 x 102 células/ml, no menos de 1,0 x 103 células/ml, no menos de 1,0 x 104 células/ml, no menos de 1,0 x 105 células/ml, no menos de 4,0x106 células/ml o no menos de 1,0 x 107 células/ml. El número de fibroblastos CD106+ CD90+ contenidos en la composición inyectable puede ser, por ejemplo, no menos de 1,0 x 102 células/ml, no menos de 1,0 x 103 células/ml, no menos de 1,0 x 104 células/ml, no menos de 1,0 x 105 células/ml, no menos de 5.0 x 106 células/ml o no menos de 1,0 x 107 células/ml. El número de fibroblastos CD106+ contenidos en la composición inyectable puede aumentar o disminuir adicionalmente dependiendo de las condiciones de la cardiopatía.
El procedimiento para producir los fibroblastos contenidos en la composición inyectable se describe a continuación. Para el procedimiento para producir los fibroblastos, se puede hacer referencia a un informe anterior de los inventores de la presente invención (Patente WO 2016/006262), y el procedimiento se puede llevar a cabo según este informe.
(Etapa de proporcionar fibroblastos)
En la etapa de proporcionar los fibroblastos, el origen de los fibroblastos no está limitado, tal como se ha mencionado anteriormente. Se puede utilizar un procedimiento basado en el trasplante autólogo y, en tales casos, se utilizan fibroblastos cardíacos aislados de un tejido cardíaco de un paciente con una cardiopatía, o fibroblastos cardíacos aislados después de la diferenciación de células madre adultas (somáticas) de un paciente. Los fibroblastos también pueden ser fibroblastos recogidos después de la diferenciación de células iPS. Además, se puede utilizar un procedimiento basado en trasplante alogénico y, en estos casos, se utilizan fibroblastos cardíacos aislados de un tejido cardíaco derivado de un donante que proporciona células cardíacas, o aislados de un tejido cardíaco preparado utilizando un animal o similar; o fibroblastos cardíacos aislados después de la diferenciación de células madre adultas (somáticas) de un donante. Los fibroblastos también pueden ser fibroblastos recogidos después de la diferenciación de células iPS derivadas de un donante.
(Etapa de separación de fibroblastos)
Los fibroblastos obtenidos se pueden someter, normalmente, a tratamiento utilizando una enzima, tal como dispasa o colagenasa, para conseguir el aislamiento para el cultivo. La separación se puede realizar bien con la enzima, tal como dispasa o colagenasa, o bien mediante otro tratamiento, tal como un tratamiento mecánico, siempre que permita la separación requerida antes del cultivo primario.
(Etapa de cribado de fibroblastos positivos para CD90)
Los fibroblastos se pueden cribar para aumentar la proporción de fibroblastos CD90+. Mediante este cribado, se pueden eliminar los cardiomiocitos de los fibroblastos. Entre los ejemplos del cribado se incluyen procedimientos de clasificación de células, tales como citometría de flujo, procedimiento de perlas magnéticas, procedimiento de columna de afinidad y procedimiento de inmunoadsorción, utilizando un anticuerpo anti-CD90. Más específicamente, por ejemplo, se puede utilizar la clasificación de células magnéticas (MACS, magnetic cell sorting) o la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS, fluorescence-activated cell sorting). El anticuerpo anti-CD90 puede ser un producto disponible en el mercado o se puede preparar mediante un procedimiento conocido. Se puede utilizar un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal, pero, desde el punto de vista de la especificidad, se utiliza preferentemente un anticuerpo monoclonal. Alternativamente, el cribado se puede llevar a cabo mediante la introducción de un gen de resistencia a fármacos para la eliminación de fibroblastos negativos para CD90. Alternativamente, se puede introducir un gen que codifica una proteína fluorescente, y posteriormente se pueden aislar las células positivas para la proteína de fluorescencia mediante clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) o similar.
(Etapa de cribado de células que tienen adhesividad)
El cribado de fibroblastos se puede realizar mediante la utilización de una diferencia en la adhesividad. Dado que los fibroblastos positivos para CD90 tienen propiedades que permiten su adherencia a una placa de cultivo que no está revestida (no sometida a revestimiento con gelatina o similar), la pureza de los fibroblastos se puede aumentar mediante esta etapa. Más específicamente, los fibroblastos se siembran en placas de cultivo sin revestir y el cultivo se lleva a cabo durante, por ejemplo, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas o 24 horas. Recogiendo los fibroblastos adheridos a la placa de cultivo, se puede realizar el cribado.
(Etapa de cribado de fibroblastos CD106+)
Para la inclusión de fibroblastos CD106+ en la composición inyectable, los fibroblastos se someten, normalmente, a una etapa de cribado de fibroblastos CD106+. En los casos en los que se puedan obtener fibroblastos CD106+ sin realizar esta etapa, esta etapa se puede omitir. Entre los ejemplos del cribado de fibroblastos CD106+ se incluyen procedimientos de clasificación de células, tales como citometría de flujo, procedimiento de perlas magnéticas, procedimiento de columna de afinidad y procedimiento de inmunoadsorción, utilizando un anticuerpo anti-CD106 (anticuerpo anti-VCAM-1). Más específicamente, por ejemplo, se puede utilizar la clasificación de células magnéticas (MACS) o la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS). El anticuerpo anti-CD106 puede ser un producto disponible en el mercado o se puede preparar mediante un procedimiento conocido. Alternativamente, el cribado se puede llevar a cabo mediante la introducción de un gen de resistencia a fármacos para la eliminación de fibroblastos negativos para CD106. Alternativamente, se puede introducir un gen que codifica una proteína fluorescente, y posteriormente se pueden aislar las células positivas para la proteína de fluorescencia mediante clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) o similar. Se puede utilizar un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal, pero, desde el punto de vista de la especificidad, se utiliza, preferentemente, un anticuerpo monoclonal. Alternativamente, se puede utilizar un procedimiento tal como PCR en tiempo real, secuenciación de próxima generación o hibridación in situ para confirmar la expresión del gen CD106 en las células, y posteriormente se puede aislar un grupo que expresa el gen CD106.
(Etapa de cultivo)
Los fibroblastos se pueden someter a una etapa de cultivo con el fin de, por ejemplo, conseguir un número de células deseado y/o permitir que las células tengan una función deseada. Las condiciones de cultivo no están limitadas y el cultivo se puede llevar a cabo mediante un procedimiento de cultivo celular conocido.
El medio de cultivo utilizado para el cultivo se puede establecer de manera apropiada dependiendo, por ejemplo, del tipo de células a cultivar. Entre los ejemplos de medios de cultivo que pueden utilizarse se incluyen DMEM, a-MEM, HFDM-1(+) y RPMI-1640. Se pueden añadir al medio de cultivo sustancias nutricionales, tales como FCS y FBS; factores de crecimiento; citocinas; antibióticos y similares.
El número de días del período de cultivo se puede establecer apropiadamente con el propósito de, por ejemplo, conseguir un número de células deseado y/o permitir que las células tengan una función deseada. Entre los ejemplos del período de cultivo se incluyen períodos, tales como 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses y 6 meses.
La temperatura de cultivo se puede establecer de manera apropiada dependiendo del tipo de células que se van a cultivar. La temperatura de cultivo puede ser, por ejemplo, no menos de 10 °C, no menos de 15 °C, no menos de 20 °C, no menos de 25 °C o no menos de 30 °C, y puede ser, por ejemplo, no más de 60 °C, no más de 55 °C, no más de 50 °C, no más de 45 °C o no más de 40 °C.
La etapa de cultivo se puede llevar a cabo una pluralidad de veces. Por ejemplo, el cultivo se puede llevar a cabo cada vez que se aumenta la pureza de los fibroblastos deseados mediante cribado.
(Etapa de recogida)
Los fibroblastos cultivados se recogen mediante una etapa de recogida. En la etapa de recogida, las células se pueden separar utilizando una proteasa, tal como tripsina y posteriormente recogerse. Alternativamente, se puede utilizar una placa de cultivo sensible a la temperatura, y las células se pueden separar cambiando la temperatura, seguido de la recogida de las células.
También se describe un procedimiento para producir fibroblastos para tratamiento, procedimiento que comprende, entre las etapas descritas anteriormente, la etapa de cribado de fibroblastos CD106+.
Además, se describe también un procedimiento para producir fibroblastos para tratamiento, procedimiento que comprende, entre las etapas descritas anteriormente, la etapa de cribado de fibroblastos CD106+ y la etapa de cribado de fibroblastos CD90+.
Además, se describe también un procedimiento para producir fibroblastos para tratamiento, procedimiento que comprende una de las etapas descritas anteriormente, o una combinación arbitraria de dos o más de las mismas. En la presente invención, se da a conocer una composición inyectable para su utilización en el tratamiento de insuficiencia cardíaca, cardiopatía isquémica o infarto de miocardio, en la que los fibroblastos contienen fibroblastos CD106+ y en la que la composición inyectable se debe inyectar en una región del tejido cardíaco necrótico o sus inmediaciones, y/o infundir en una arteria coronaria.
Además, se describe la utilización de fibroblastos como una composición inyectable, en la que los fibroblastos contienen fibroblastos CD106+.
También se describe un tejido celular plano o tridimensional que contiene fibroblastos CD106+. Aunque los fibroblastos CD106+ se pueden conformar en un tejido celular plano o tridimensional después del cultivo conjunto con otro tipo de células, tales como los cardiomiocitos, los fibroblastos CD106+ pueden funcionar eficazmente como un tejido celular plano o tridimensional incluso sin el cultivo conjunto. Entre los ejemplos de tejido celular plano o tridimensional se incluyen, sin limitación a los mismos, láminas de células; fibras celulares y tejidos celulares formados mediante una impresora 3D.
EJEMPLOS
La presente invención se describe a continuación con más detalle por medio de ejemplos. [Mejora de las funciones cardíacas mediante la administración de fibroblastos CD106+ de ratón]
<Animales y reactivos>
Se adquirieron ratones C57BL/6 de tipo salvaje y ratas S1c: SD de tipo salvaje de Japan SLC Inc. (Shizuoka, Japón).
Se utilizaron los siguientes anticuerpos para la tinción por inmunofluorescencia y la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS): anti-CD106 (VCAM-1)-PE monoclonal de ratón (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania), anti-conexina 43 policlonal de conejo (Cell signaling technology, Massachussets), anti-vimentina monoclonal de ratón (Abcam, Cambridge, Reino Unido) y solución Hoechst 33258 (St. Louis, Missouri).
Se adquirió un anticuerpo secundario de Jackson Immuno Reserch Laboratories (West Grove, Pennsylvania).
<Fibroblastos y cardiomiocitos>
Se obtuvieron fibroblastos cardíacos de ratón de un ratón C57BL/6 de tipo salvaje (recién nacido, 1 día de vida) según un informe anterior (Matsuura K, et al., Biomaterials. 2011; 32:7355-7362). Las células obtenidas se cultivaron en DMEM con alto contenido de glucosa FBS al 10 % en una placa de cultivo de 10 cm. De tres a cinco días después del comienzo del cultivo, las células se separaron con tripsina/EDTA al 0,05 % y posteriormente se subcultivaron en otra placa de cultivo de 10 cm.
Se adquirieron cardiomiocitos (Cor.AT) derivados de células madre embrionarias de ratón (células ES) de Axiogenesis AG (Colonia, Alemania). La diferenciación en cardiomiocitos y la purificación de las células se llevaron a cabo según las instrucciones.
<Clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) de fibroblastos cardíacos de ratón CD106+>
Se tiñeron fibroblastos cardíacos de ratón (2 x 107 células/experimento) con un anticuerpo anti-CD106 (VCAM-1)-PE de ratón. La tinción se llevó a cabo según las instrucciones. Los fibroblastos CD106+ se separaron mediante un clasificador de células S3e (Bio-Rad, Pennsylvania).
<Tinción por inmunofluorescencia>
Las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % y posteriormente se sometieron a tinción por inmunofluorescencia, tal como se describe en un informe anterior (Matsuura K, et al., Biomaterials. 2011; 32:7355-7362). La muestra teñida se analizó utilizando IN Cell Analyzer 2200 (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) y IN Cell Developer Toolbox 1.9.2 (GE Healthcare).
<Procedimiento de tratamiento quirúrgico>
Se indujo insuficiencia cardíaca de rata ocluyendo la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD, left anterior descending) durante 30 minutos bajo anestesia por inhalación y posteriormente permitiendo la reperfusión del flujo sanguíneo. Más específicamente, en primer lugar, se proporcionaron ratas macho S1c: SD de 11 días a 12 semanas de vida (369,0-506,5 g, Japan SLC Inc., Shizuoka). Se proporcionó una mezcla que contenía 0,15 mg/kg de hidrocloruro de medetomidina, 2 mg/kg de midazolam y 2,5 mg/kg de tartrato de butorfanol y posteriormente se diluyó con solución salina fisiológica. La dilución resultante en un volumen de 10 ml/kg se administró por vía intraperitoneal a cada rata para la anestesia, y posteriormente se cortó y eliminó el pelo de la periferia del tórax. Después de la depilación, se intubó oralmente un tubo traqueal y se realizó respiración artificial (volumen corriente: 2,0 a 2,5 ml/respiración, frecuencia respiratoria: 75 respiraciones/min) utilizando un respirador para animales pequeños (modelo SN-480-7 x 2T, Shinano Manufacturing Co., Ltd.). La anestesia se mantuvo con isoflurano al 2 % utilizando un aparato de anestesia por inhalación (modelo KN-1071, Natsume Seisakusho Co., Ltd.), y la rata se fijó en posición supina o lateral.
El sitio de la incisión se desinfectó con solución de isodina y posteriormente se roció lidocaína para aliviar el dolor. El corazón se expuso mediante toracotomía en el lado lateral del tórax y se administró sulfato de atropina (0,02 mg/kg) por vía intramuscular para prevenir la arritmia, cuando fue necesario. Utilizando una aguja atraumática (6-0 VICRYL) (Johnson & Johnson, New Jersey), se ocluyó la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) durante 30 minutos. Mediante la monitorización del electrocardiograma, se investigó la presencia o ausencia de oclusión (aparición de isquemia miocárdica) basándose en la elevación del potencial ST y el blanqueamiento del músculo cardíaco (observación visual). En los casos en los que apareció fibrilación ventricular (VF), se realizó reanimación (estimulación directa del corazón mediante pinzas anulares) para terminar la fibrilación ventricular. Al permitir la reperfusión del flujo sanguíneo después de 30 minutos de la oclusión, se preparó un modelo de isquemiareperfusión.
Después de la reperfusión, se realizó una inyección intramiocárdica. Posteriormente se cerró el tórax y se suturó con una aguja atraumática (3-0 VICRYL) (Johnson & Johnson, New Jersey), seguido de la desinfección del sitio de sutura con solución de isodina.
Las ratas se dividieron en los siguientes cuatro grupos de tratamiento.
(S1) Inyección de fibroblastos CD106+ de ratón y cardiomiocitos de ratón (50 |o.l de DMEM con alto contenido de glucosa suero de ternero recién nacido al 10 % (NBCS, New Born Calf Serum) que contenía 4 x 105
fibroblastos y 1,6 x 106 cardiomiocitos)
(52) Inyección de fibroblastos CD106+ de ratón (50 |jJ de DMEM con alto contenido de glucosa NBCS al 10 % que contenía 2 x 106 fibroblastos)
(53) Un grupo sometido solo a tratamiento quirúrgico
(54) Un grupo sin tratamiento quirúrgico
La inyección de las células se llevó a cabo en dos posiciones cercanas a la región dañada (25 pl/inyección).
<Evaluación de las funciones cardíacas>
Para la evaluación comparativa de las funciones del ventrículo izquierdo de la rata modelo preparada, se monitorizaron las funciones cardíacas realizando una ultrasonografía cardíaca (ecocardiografía) desde la semana 0 a la semana 10 a intervalos de dos semanas después de la inyección de las células.
La ultrasonografía cardíaca (ecocardiografía) se llevó a cabo utilizando un aparato de diagnóstico ultrasónico (Nolus, Hitachi, Ltd.). Más específicamente, se colocó una sonda lineal superficial en el tórax de la rata, y se llevó a cabo la medición mediante modo M para el diámetro telediastólico del ventrículo izquierdo (LVIDd), el diámetro telesistólico del ventrículo izquierdo (LVlDs), el diámetro telediastólico del ventrículo izquierdo (LVIDs), el espesor telediastólico de la pared anterior del ventrículo izquierdo (LVAWd), espesor telediastólico de la pared libre del ventrículo izquierdo (LVPWd) y espesor telediastólico de la pared libre del ventrículo izquierdo (LVPWs). Como el volumen telediastólico del ventrículo izquierdo (LVEDV) y volumen telesistólico del ventrículo izquierdo (LVESV), se utilizaron valores calculados automáticamente por el aparato ecocardiográfico. Además, basándose en las imágenes dibujadas en modo M, se midió el desplazamiento de la superficie epicárdica del ventrículo izquierdo (D2). Se calculó un índice para la extensibilidad del ventrículo izquierdo EMI = (LVPWs - LVPWd) / (LVPWs x D2) y su índice simplificado DWS = (LVPWs - LVPWd) / LVPWs. Además, según las siguientes ecuaciones y la figura 4, se calcularon el acortamiento fraccional (FS) del ventrículo izquierdo y la fracción de eyección (EF) del ventrículo izquierdo.
Acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (FS) = (LVIDd - LVIDs) / LVIDd x 100
Fracción de eyección del ventrículo izquierdo (EF) = (LVEDV - LVESV) / LVEDV) x 100
<Experimento histológico>
El ventrículo izquierdo del corazón extirpado se fijó por inmersión en una solución de formalina tamponada al 10 %. El ventrículo izquierdo se dividió en la dirección del eje corto en tres porciones de modo que la longitud en la dirección del eje largo entre la posición inmediatamente debajo de la ligadura y el vértice cardíaco se dividió igualmente en tres partes. Cada porción de músculo cardíaco se incluyó en un bloque de parafina de modo que el lado de origen se sitúe en el lado incluido. Después de la preparación de rodajas finas, se llevó a cabo la tinción con tricrómico de Masson. Las imágenes de las muestras después de la tinción con tricrómico de Masson se capturaron en un analizador de imágenes (procesador de imágenes de utilización general "Win ROOF Version 5.5", Mitani Corporation), y se midió el área de infarto de miocardio (%) para cada una de las tres porciones mediante el analizador de imágenes.
<Análisis estadístico>
Los resultados de la evaluación de las funciones cardíacas se representan como promedio ± E. E. (error estándar). Todos los demás datos se representan como promedio ± D. E. (desviación estándar). La diferencia de variación entre tres o más grupos se calculó mediante un análisis de varianza de una vía. Posteriormente, se calculó la diferencia significativa entre los tres grupos mediante la prueba de comparación múltiple de Tukey-Kramer. Se asumió la significación de la diferencia cuando el valor p era menor que 0,05. Todos los cálculos estadísticos se llevaron a cabo utilizando el software Statcel.
<Localización de la proteína VCAM-1 entre fibroblastos cardíacos de ratón>
Para la separación de fibroblastos CD106+, que mejoran el crecimiento y la migración de cardiomiocitos, se investigó la expresión de la proteína VCAM-1 en fibroblastos cardíacos de ratón (figura 1A). La región de fibroblastos CD106+ se seleccionó estrictamente para la eliminación de células negativas. Aproximadamente el 39,2 % de los fibroblastos cardíacos eran fibroblastos CD106+. Posteriormente, para evaluar si los fibroblastos CD106+ expresan uniformemente VCAM-1 durante un período prolongado, los fibroblastos CD106+ se cultivaron in vitro hasta la semana 18 para evaluar la expresión de la proteína VCAM-1 (figura 1B). En todos los fibroblastos CD106+, se mantuvieron niveles elevados de expresión de la proteína VCAM-1 durante las 18 semanas. Además, los fibroblastos CD106+ expresaron de manera elevada conexina 43, es decir, una proteína de unión gap para la transmisión de la red eléctrica del miocardio (figura 1C). Basándose en estos descubrimientos, se puede entender que los fibroblastos CD106+ tienen la capacidad de continuar la expresión de la proteína VCAM-1 y de propagar la excitación eléctrica del corazón.
<Mejora de las funciones cardíacas mediante fibroblastos CD106+ de ratón después de un infarto de miocardio Según la ecocardiografía, en la semana 2 a la semana 10 después de la inyección, los grupos S1 y S2 mostraron una mejora en la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (EF) y el acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (FS) en comparación con los grupos S3 y S4. Por otra parte, no hubo diferencia significativa en EF o FS entre los grupos S1 y S2 (figura 1A, figura 2B). De este modo, se puede entender que la administración de fibroblastos CD106+ provocó una mejora de la capacidad de bombeo del corazón dañado por el infarto de miocardio. La presencia de cardiomiocitos no fue importante para la composición de la composición inyectable.
<Mejora del área de infarto fibrótico de colágeno mediante fibroblastos CD106+ de ratón>
En la semana 10 después de la inyección, se preparó una muestra de tejido patológico del corazón y se sometió a tinción con tricrómico de Masson. Como resultado, se pudo confirmar que las áreas de infarto fibrótico de colágeno en los grupos S1 y S2 eran significativamente pequeñas (figura 3A). Además, como resultado de la medición del área (%) del infarto fibrótico de colágeno utilizando un software de análisis de imágenes, se descubrió que el área de fibrosis era significativamente pequeña en S2 (figura 3B). De este modo, se puede entender que la administración de fibroblastos CD106+ provocó no solo una mejora de la función sistólica del corazón dañado por infarto de miocardio y similares, sino también una supresión significativa de la fibrosis de colágeno. La presencia de cardiomiocitos no fue importante para la composición de la composición inyectable.
Mediante los experimentos anteriores, se demostró en primer lugar la importancia de los fibroblastos positivos para VCAM-1 para el tratamiento eficaz de una cardiopatía isquémica, y se puede entender que la administración de fibroblastos CD106+ puede producir un resultado deseable en el tratamiento de una cardiopatía. La administración de fibroblastos positivos para VCAM-1 se puede utilizar en el tratamiento para la mejora eficaz de una cardiopatía isquémica. Además, dado que se descubrió una mejora notable de las funciones cardíacas y una supresión notable de la fibrosis de colágeno como resultado de la administración de fibroblastos cardíacos que expresan VCAM-1, se puede entender que la administración también es eficaz para el tratamiento de otras cardiopatías.
[Mejora de las funciones cardíacas mediante la administración de fibroblastos CD106+ de rata] Posteriormente, se investigó la mejora de las funciones cardíacas mediante la administración a ratas de fibroblastos CD106+ de rata.
<Fibroblastos y cardiomiocitos>
De una rata fetal S1c: SD (día embrionario 20), se extrajo el corazón y se homogeneizó su tejido utilizando gentleMACS (Miltenyi Biotec), seguido de la recogida de fibroblastos cardíacos de rata según la diferencia en la adhesividad a la superficie del material de cultivo base. Las células obtenidas se cultivaron en DMEM con alto contenido de glucosa complementado con NBCS al 10 % en una placa de cultivo de 10 cm. De tres a cinco días después del comienzo del cultivo, las células se separaron con tripsina/EDTA al 0,05 % y posteriormente se subcultivaron en otra placa de cultivo de 10 cm.
<Clasificación de células>
Las células se sometieron a inmunotinción primaria con anticuerpos CD106 (VCAM-1)-Biotina, de rata (Miltenyi Biotec), y, posteriormente, a inmunotinción secundaria con Microperlas Anti-Biotina (Miltenyi Biotec). A partir de las células teñidas, se recogieron células positivas para CD106 solas mediante autoMACS (Miltenyi Biotec) para proporcionar fibroblastos CD106+ de rata.
<Preparación y medición ecocardiográfica del modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas>
Se adquirieron ratas desnudas macho (F344/N Jcl-rnu/rnu) de 8 semanas de vida de CLEA Japan, Inc. (Tokio, Japón). Después de 1 semana de aclimatación, cada animal fue sometido a anestesia por inhalación con isoflurano al 2 % (adyuvante anestésico; gas hilarante: oxígeno = 7:3) utilizando un aparato de anestesia por inhalación para animales de experimentación (Soft Lander (Shin-ei Industries, Inc., Saitama, Japón)) y, posteriormente, se les cortó el pelo. Inmediatamente después, se llevó a cabo intubación traqueal y se introdujo directamente en el respirador gas anestésico por inhalación de isoflurano a del 0,5 al 2 % (adyuvante anestésico; gas hilarante: oxígeno = 7:3) para mantener la anestesia. Bajo gestión respiratoria artificial, se fijó al animal en decúbito supino y se realizó toracotomía cortando longitudinalmente, a nivel del cartílago costal, dos o tres costillas entre la tercera y la quinta costilla izquierda. Utilizando un separador, se expandió el campo operatorio y se desprendió la membrana pericárdica para exponer el corazón. Se levantó la aurícula izquierda y se pasó un hilo a una profundidad de, aproximadamente, 2 mm a través de una longitud de 4 a 5 mm en el ventrículo izquierdo utilizando una aguja redonda atraumática débilmente curvada para vasos sanguíneos (6-0: Nescosuture). Se combinaron ambos extremos del hilo y se pasó a su través un lazo preparado con un tubo de polietileno (PESO, Becton Dickinson). El hilo se apretó utilizando una pinza de arteria (procedimiento de lazo) para causar isquemia de la arteria coronaria
durante 30 minutos. Posteriormente, se llevó a cabo la reperfusión. Una vez que las condiciones se estabilizaron, se confirmó la ausencia de sangrado y se llevó a cabo drenaje torácico, seguido de sutura de la capa muscular y la piel. Para la piel se realizó sutura subcuticular. Cuando se realizó la sutura normal, se llevó a cabo la retirada de la sutura en función de las condiciones postoperatorias monitorizadas. Una semana después de la preparación del modelo, es decir, un día antes de la administración de las células, se llevó a cabo la medición ecocardiográfica utilizando un aparato de diagnóstico por imágenes ultrasónicas (Xario SSA-660A, Toshiba Medical Systems Corporation, Tochigi, Japón). Los individuos que tenían una fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF = (LVIDd3 - LVIDs3) / LVIDd3) de no más del 55 % se consideraron un modelo de insuficiencia cardíaca crónica y se sometieron a un experimento de administración de fibroblastos CD106+ humanos.
<Administración de fibroblastos CD106+ de rata al modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas>
El día del ensayo de administración, se diluyeron fibroblastos CD106+ humanos con DMEM con alto contenido de glucosa NBCS al 10 % y se administraron a cada individuo 2,0 x 106 células/50 |j.l, en términos del número de células vivas, de la suspensión celular. Para un control, se administraron solamente 50 |o.l de DMEM NBCS al 10 %. Cada grupo se constituyó con N = 4.
Mientras que la anestesia se mantuvo por el mismo procedimiento que en la preparación del modelo, la cantidad total, 50 |o.l, de la suspensión celular se administró al animal utilizando un catéter con una aguja 30-G, dividida en dos posiciones en la región del infarto bajo gestión respiratoria artificial. Una vez estabilizadas las condiciones, se confirmó la ausencia de fuga del líquido administrado o sangrado y se llevó a cabo drenaje torácico, seguido de sutura de la capa muscular y la piel. Para la piel se realizó sutura subcuticular. Cuando se realizó la sutura normal, se llevó a cabo la retirada de la sutura en función de las condiciones postoperatorias monitorizadas.
<Evaluación de las funciones cardíacas del modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas mediante ecocardiografía>
Se siguió el modelo de insuficiencia cardíaca crónica al que se administraron los fibroblastos CD106+ de rata mientras que la medición ecocardiográfica se llevó a cabo utilizando un aparato de diagnóstico por imágenes ultrasónicas (Xario SSA-660A, Toshiba Medical Systems Corporation, Tochigi, Japón) según el programa que se muestra en la figura 5. Más específicamente, se cortó el pelo del tórax del animal con un cortapelo y se colocó una sonda en el tórax para medir los siguientes elementos mediante el modo M. Como elementos principales, se midieron la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF = (LVIDd3 - LVIDs3) / LVIDd3), el acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (LVFS = (LVIDd - LVIDs) x 100 / LVIDd), el volumen telediastólico del ventrículo izquierdo (LVEDV) y el volumen telesistólico del ventrículo izquierdo (LVESV). Como subelementos, se midieron el diámetro telediastólico del ventrículo izquierdo (LVIDd), el diámetro telesistólico del ventrículo izquierdo (LVIDs), el espesor telediastólico de la pared anterior del ventrículo izquierdo (LVAWd = IVSTd), el espesor telediastólico de la pared posterior del ventrículo izquierdo (LVPWTd) y la frecuencia cardíaca (FC). Los valores de la función cardíaca, excepto la FC, se expresan con un decimal (redondeando a un decimal) y la FC, que es un subelemento, se expresa con dos decimales (redondeando a dos decimales).
[Mejora de las funciones cardíacas mediante la administración de fibroblastos CD106+ humanos] Posteriormente, se investigó la mejora de las funciones cardíacas mediante la administración de fibroblastos CD106+ humanos a ratas o cerdos.
<Células y anticuerpos>
Los fibroblastos cardíacos se adquirieron de los siguientes fabricantes. Fibroblastos derivados del corazón de fetos caucásicos (semana 21) (c21wFCF, Cell Applications, San Diego, California)
Fibroblastos derivados del corazón de adultos caucásicos (en la cincuentena) (c50yACF, Cell Applications, San Diego, California)
Fibroblastos derivados del corazón de adultos negros (en la sesentena) (b60yACF, Lonza, Basilea, Suiza) <Clasificación de células>
Las células se sometieron a inmunotinción primaria con anticuerpos CD106 (VCAM-1)-Biotina, humanos (Miltenyi Biotec), y posteriormente a inmunotinción secundaria con Microperlas Anti-Biotina (Miltenyi Biotec). A partir de las células teñidas, se recogieron células positivas para CD106 solas mediante autoMACS (Miltenyi Biotec) para proporcionar fibroblastos CD106+ humanos.
Los anticuerpos se adquirieron de los siguientes fabricantes.
IgG2a BV421 de rata, control de isotipo RUO (BD Biosciences)
Control de isotipo PE-REA Control (S) (Miltenyi Biotec)
Oct3/4-PE (Miltenyi Biotec)
Nanog-PE (Miltenyi Biotec)
Sox2-PE (Miltenyi Biotec)
Anti-conexina 43 policlonal de conejo (Cell signaling technology)
Anticuerpo humano conjugado con STRO-1 Alexa Fluor 488 (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota)
Todos los demás anticuerpos se adquirieron de Abcam.
Se adquirió un anticuerpo secundario de Jackson Immuno Reserch Laboratories.
Para los anticuerpos que reconocen una proteína de la superficie de la membrana celular, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % y, posteriormente, se llevó a cabo la tinción por inmunofluorescencia. Para Oct3/4-PE, Nanog-PE y Sox2-PE, los fibroblastos CD106+ humanos se sometieron a un tratamiento de permeabilización de la membrana celular con Triton-X al 0,1 % (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri) durante 30 minutos (temperatura ambiente) y, posteriormente, se llevó a cabo la tinción por inmunofluorescencia.
<Citometría de flujo>
Después de la tinción por inmunofluorescencia, las células se prepararon a una densidad de 1,0 x 106 células/por ensayo, y posteriormente se analizaron con un citómetro de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec). Después del reconocimiento del área celular con FSC-A y SSC-A, se evaluó la proporción de células positivas (%, en términos del número de células) para cada proteína marcadora.
<Preparación y medición ecocardiográfica del modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas>
Mediante el mismo procedimiento descrito anteriormente, se preparó un modelo de insuficiencia cardíaca crónica y se llevó a cabo una medición ecocardiográfica.
<Administración de fibroblastos CD106+ humanos al modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas>
El día del ensayo de administración, se diluyeron fibroblastos CD106+ humanos con DMEM con alto contenido de glucosa NBCS al 10 % y se administraron 2,0 x 106 células/50 |o.l o 5,0 x 105 células/50 |o.l, en términos del número de células vivas, de la suspensión celular a cada individuo. Cada grupo se constituyó con N = 4. El mantenimiento de la anestesia en cada animal, el procedimiento de administración de células y la sutura y la eliminación de la sutura se llevaron a cabo mediante los mismos procedimientos descritos anteriormente.
<Evaluación de las funciones cardíacas del modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas mediante ecocardiografía>
Se realizó un seguimiento del modelo de insuficiencia cardíaca crónica al que se administraron los fibroblastos CD106+ humanos a la vez que se llevó a cabo la medición ecocardiográfica utilizando un aparato de diagnóstico por imágenes ultrasónicas (Xario SSA-660A, Toshiba Medical Systems Corporation, Tochigi, Japón) a intervalos de dos semanas según el programa que se muestra en la figura 6. El procedimiento concreto fue el mismo que se ha descrito anteriormente.
<Preparación y medición ecocardiográfica del modelo de insuficiencia cardíaca crónica porcina>
Se compraron cerdos domesticados SPF de la estirpe LWD, de 35 a 40 kg, (Okayama JA Livestock Co., Ltd., Okayama, Japón). Se preparó un modelo de insuficiencia cardíaca porcina inflando la periferia de la rama descendente anterior izquierda durante 60 minutos con un catéter con globo y posteriormente, después de un intervalo de 30 minutos, volviendo a inflar la porción intermedia de la rama descendente anterior izquierda durante 60 minutos.
Una semana después de la preparación del modelo, es decir, un día antes de la administración de las células, se llevó a cabo la medición ecocardiográfica mediante resonancia magnética. Los individuos con una fracción de eyección (EF) del ventrículo izquierdo de menos del 45 % se consideraron modelos de insuficiencia cardíaca crónica y se sometieron a un experimento de administración de fibroblastos CD106+ humanos.
<Administración de fibroblastos CD106+ humanos al modelo de insuficiencia cardíaca crónica porcina> Después de la inducción de la anestesia, el modelo de insuficiencia cardíaca porcina preparado se fijó en una mesa de operaciones en posición supina. De la misma manera que en la preparación del modelo de insuficiencia cardíaca crónica porcina anterior, se insertó una vaina de 6 Fr desde la ingle y se insertó un catéter guía de 6 Fr, precedido por un alambre guía de 0,035 pulgadas, en la porción de la aorta ascendente. Se retiró el alambre guía de 0,035 pulgadas y posteriormente se retiró el aire en el catéter guía, seguido de permitir el acoplamiento en el tronco principal izquierdo. Después del acoplamiento, se tomaron imágenes de confirmación en los ángulos mediano y LAO de 30° para confirmar el estado de la arteria coronaria. A lo largo de un alambre guía de 0,014 pulgadas, se insertó un microcatéter en la posición inmediatamente posterior a la porción ostial de la rama descendente anterior
izquierda. Una jeringa de 50 ml llena de forma preliminar con fibroblastos CD106+ humanos (2,0 x 107 células/40 ml) se colocó en una bomba de jeringa y posteriormente se conectó al microcatéter insertado, seguido de la administración a un caudal de 1 ml/min durante 40 minutos. Después de la administración de las células, se administraron 5 ml de solución salina fisiológica al mismo caudal para realizar el lavado del microcatéter. Una vez completadas todas las administraciones, se retiraron el catéter y la vaina. Después de la hemostasia por presión en el sitio de inserción de la vaina, se dejó que el cerdo se recuperara de la anestesia y se volvió a meter en la jaula. La administración de fibroblastos CD106+ humanos se llevó a cabo con N = 1.
<Evaluación de las funciones cardíacas del modelo de insuficiencia cardíaca crónica porcina por resonancia magnética>
El cerdo se sometió a una imagen por resonancia magnética (MRI) antes del día de la administración de las células, cuatro semanas después de la administración y ocho semanas después de la administración. El cerdo, bajo anestesia profunda, fue colocado sobre una mesa de exploración en una sala de MRI. En una posición supina, el cerdo se conectó con una tubería de un aparato de anestesia y un tubo traqueal. Se colocó un electrodo de electrocardiograma en el tórax. Se colocó una bobina de modo que cubriera el tórax y el cerdo se colocó en el cilindro del cuerpo de la MRI (Signa EXCITE XI TwinSpeed 1.5T Ver. 11.1, GE Healthcare), seguido de la realización de la obtención de imágenes. Más específicamente, en primer lugar, se utilizó cine MRI para obtener imágenes Fiesta en 2D de un área que cubre el corazón a lo largo de una sección transversal del eje del cuerpo (sección transversal axial). Posteriormente, a partir de los datos obtenidos, se llevó a cabo una proyección de imagen Fiesta en 2D de 20 cortes por latido en un corte transversal que pasa por el vértice cardíaco y el eje largo del ventrículo izquierdo. A partir de los datos de las imágenes, se seleccionaron cortes en la fase diastólica y se llevaron a cabo imágenes Fiesta en 2D en una sección transversal del eje largo que pasa a través del vértice cardíaco y las inmediaciones de la válvula mitral. Además, se seleccionaron cortes en la fase diastólica y se llevaron a cabo imágenes Fiesta en 2D en una sección transversal perpendicular al eje largo del ventrículo izquierdo a intervalos de 6 a 8 mm de ancho para 10 a 12 cortes desde el vértice cardíaco (secciones transversales de eje corto). Los datos obtenidos por las imágenes se analizaron utilizando una aplicación de software Cardiac VX. Como elementos de evaluación de las funciones cardíacas, se calcularon la LVEF (fracción de eyección del ventrículo izquierdo, %), el SV (volumen sistólico, ml), el EDV (volumen telediastólico, ml) y el ESV (volumen telediastólico, ml). Como índices relacionados con las frecuencias, se calcularon la FC (frecuencia cardíaca, lpm), la PFR (frecuencia máxima de llenado, ml/s) y la PER (frecuencia máxima de eyección, ml/s). Además, se calcularon la masa ED (g), el gasto cardíaco (l/min), la masa (g), la masa ES (g), el volumen epicárdico telediastólico (ml) y el volumen epicárdico telesistólico (ml).
Además, se llevaron a cabo análisis de perfusión del cambio temporal del miocardio y análisis de LGE para el cálculo cuantitativo del área de infarto/fibrótica presente en el sitio anómalo del músculo cardíaco. En el análisis de perfusión del cambio temporal del miocardio, en primer lugar, se administró por vía intravenosa un agente de contraste (inyección intravenosa de Omniscan al 32 % para inyección intravenosa) por vía venosa (intravenosa) mediante inyección en bolo, y se fotografió el proceso del primer pase del agente de contraste a través del músculo cardíaco (sección transversal de eje corto). Los datos obtenidos por las imágenes se analizaron utilizando una aplicación de software Cardiac VX. En el análisis de LGE, en primer lugar, se administró por vía intravenosa un agente de contraste (inyección intravenosa de Omniscan al 32 % para inyección intravenosa, 0,25 ml/kg). A continuación, se tomaron imágenes de GRE rápido, de 10 a 20 minutos después (sección transversal de eje corto). Los datos obtenidos por las imágenes se analizaron utilizando una aplicación de software Cardiac VX. Dado que las áreas de infarto y las áreas fibróticas aparecen con señales altas, sus diferencias con las áreas normales se calcularon cuantitativamente mediante el análisis de Región de interés (ROI, Región of Interest). De manera similar al análisis de la función ventricular izquierda, la medición se llevó a cabo automáticamente para varios puntos particulares. Sin embargo, cuando parecía que la medición se llevó a cabo para un área claramente incorrecta, se aplicó la modificación. La proporción de sitios de infarto en el tejido del músculo cardíaco también se representó como un porcentaje.
<Análisis estadístico>
Los datos de los ensayos in vitro se representan como promedio ± D. E. (desviación estándar). Los datos de los ensayos in vivo se representan como promedio ± E. E. (error estándar). La diferencia significativa entre dos grupos se calculó mediante la prueba t de Student. La diferencia de variación entre tres o más grupos se calculó mediante un análisis de varianza de una vía. Posteriormente, se calculó la diferencia significativa entre los tres grupos mediante la prueba de comparación múltiple de Tukey-Kramer. Se asumió la significación de la diferencia cuando el valor p era menor que 0,05.
Los resultados experimentales fueron los siguientes.
<Efecto terapéutico de los fibroblastos CD106+ de rata en el modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas> Los fibroblastos CD106+ de rata recogidos después de la clasificación celular se administraron por vía intramiocárdica al modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas, y se evaluó el efecto sobre la recuperación de
la insuficiencia cardíaca crónica durante 18 semanas después de la administración de las células. Los resultados se muestran en la figura 7. Se descubrió que el grupo en el que se administraron los fibroblastos CD106+ de rata mostró una mejora del 32,9 % de la EF y del 12,4 % del FS en comparación con el control, en la semana 18 después de la administración. No se descubrió ni un aumento/disminución extremos de LVEDV ni un aumento de LVESV durante las 18 semanas posteriores a la administración. Los resultados de los elementos principales (LVEF, LVFS, LVEDV y LVESV) y los resultados de los subelementos (LVIDd, LVIDs, IVSTd, LVPWTd y FC) se muestran en las tablas 1 a 9.
[Tabla 1]
Tabla 1: Tendencia de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas mediante la administración de los fibroblastos CD106+ de rata re resentados como “VCF” en la tabla
[Tabla 2]
Tabla 2: Tendencia del acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (LVFS) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas mediante la administración de los fibroblastos CD106+ de rata re resentados como “VCF” en la tabla
[Tabla 3]
Tabla 3: Tendencia del volumen telediastólico del ventrículo izquierdo (LVEDV) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas mediante la administración de los fibroblastos CD106+ de rata re resentados como “VCF” en la tabla
[Tabla 4]
Tabla 4: Tendencia del volumen telesistólico del ventrículo izquierdo (LVESV) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas mediante la administración de los fibroblastos CD106+ de rata re resentados como “VCF” en la tabla
[Tabla 5]
Tabla 5: Tendencia del diámetro telediastólico del ventrículo izquierdo (LVIDd) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas mediante la administración de los fibroblastos CD106+ de rata re resentados como “VCF” en la tabla
[Tabla 6]
Tabla 6: Tendencia del diámetro telesistólico del ventrículo izquierdo (LVIDs) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas mediante la administración de los fibroblastos CD106+ de rata re resentados como “VCF” en la tabla
[Tabla 7]
Tabla 7: Tendencia del espesor telediastólico de la pared anterior del ventrículo izquierdo (LVAWd = IVSTd) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas mediante la administración de los fibroblastos CD106+ de rata re resentados como “VCF” en la tabla
[Tabla 8]
Tabla 8: Tendencia del espesor telediastólico de la pared posterior del ventrículo izquierdo (LVPWTd) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas mediante la administración de los fibroblastos CD106+ de rata (representados como “VCF” en la tabla
[Tabla 9]
Tabla 9: Tendencia de la frecuencia cardíaca (FC) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas mediante la administración de los fibroblastos CD106+ de rata re resentados como “VCF” en la tabla
Mediante los experimentos anteriores, se ha demostrado la importancia de los fibroblastos positivos para VCAM-1 para el tratamiento eficaz de la insuficiencia cardíaca crónica, y se puede entender que la administración de fibroblastos CD106+ puede producir un resultado deseable en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca crónica. Dado que la inyección de fibroblastos positivos para VCAM-1 permitió el tratamiento no solo de la insuficiencia cardíaca crónica, sino también del infarto de miocardio, tal como se ha descrito anteriormente, se cree que también es eficaz para el tratamiento de otras cardiopatías.
<Localización de fibroblastos CD106+ humanos entre fibroblastos cardíacos humanos>
Se proporcionaron fibroblastos cardíacos recogidos de un corazón fetal humano (FCF) y dos tipos de fibroblastos cardíacos recogidos de corazones humanos adultos (ACF) y se evaluaron mediante citometría de flujo los niveles de expresión de CD106 humano y CD90 humano, que tienen homologías con CD106 de ratón y CD90 de ratón, respectivamente. Los resultados se muestran en la figura 8. Se proporcionaron dos tipos de ACF teniendo en cuenta la influencia de la epigenética. Como resultado, se descubrió la siguiente localización para c21wFCF: proporción de células positivas para CD106, 9,13 %; proporción de células positivas para CD90, 24,5 %; proporción de células doblemente positivas (fibroblasto CD106+ humano), 8,20 %. Se descubrió la siguiente localización para c50yACF: proporción de células positivas para CD106, 12,53 %; proporción de células positivas para CD90, 5,79 %; proporción de células doblemente positivas (fibroblasto CD106+ humano), 1,79 %. Se descubrió la siguiente localización para b60yACF: proporción de células positivas para CD106, 5,55 %; proporción de células positivas para CD90, 96,39 %; proporción de células doblemente positivas (fibroblasto CD106+ humano), 5,43 %. Todas las proporciones de células positivas descritas anteriormente son valores en términos del número de células.
A partir de estos resultados, quedó claro que todos los fibroblastos cardíacos contenían fibroblastos CD106+ humanos localizados en ellos.
<Clasificación celular de fibroblastos CD106+ humanos>
Para recoger los fibroblastos CD106+ humanos con alta pureza a partir de fibroblastos cardíacos recogidos de un corazón humano, se llevó a cabo la clasificación celular de fibroblastos CD106+ humanos mediante autoMACS. Se evaluaron las propiedades celulares de los fibroblastos CD106+ humanos obtenidos mediante la clasificación por autoMACS. Los resultados se muestran en la figura 9. Se descubrió que los fibroblastos CD106+ humanos recogidos contenían el 95,98 % de células positivas para CD106, el 92,28 % de células positivas para CD90 y el 89,15 % de células doblemente positivas. De este modo, quedó claro que casi todas las células son positivas para CD106 y/o CD90, que son proteínas marcadoras que indican una población de fibroblastos CD106+ humanos. Todas las proporciones de células positivas descritas anteriormente son valores en términos del número de células. Para evaluar si los fibroblastos CD106+ humanos son positivos para marcadores de tumorigenicidad y células madre pluripotentes, los fibroblastos CD106+ humanos se sometieron a tinción por inmunofluorescencia con Oct3/4, Nanog
y Sox2, y se evaluaron las proporciones de células positivas (%, en términos del número de células). Los resultados se muestran en la figura 10. Los fibroblastos CD106+ humanos fueron negativos para los marcadores anteriores y no tenían las propiedades de tumorigenicidad o de células madre pluripotentes.
<Propiedades celulares de los fibroblastos CD106+ humanos>
Como resultado de la tinción por inmunofluorescencia de los fibroblastos CD106+ humanos para vimentina, que es un marcador del citoesqueleto de fibroblastos y células madre mesenquimales, para citoqueratina, que es un marcador de células epiteliales, y para conexina 43, que es un marcador de uniones gap de los cardiomiocitos, se descubrió que todos los fibroblastos CD106+ humanos mostraban expresión de vimentina y conexina 43. Los resultados se muestran en la figura 11.
Además, como resultado de la evaluación de la tasa de expresión de STRO-1 de los fibroblastos CD106+ humanos por citometría de flujo, se descubrió que el 0,29 % de los fibroblastos CD106+ humanos son positivos para STRO-1 y, por lo tanto, casi ninguno de los fibroblastos CD106+ humanos muestra expresión de STRO-1. Los resultados se muestran en la figura 12. “STRO-1, uno de los marcadores moleculares más conocidos de células madre mesenquimales (MSC), es una proteína transmembrana unipaso cuya localización cambia desde el retículo endoplásmico a la membrana celular en respuesta a la pérdida de calcio intracelular (Barkhordarian A, Sison J, Cayabyab R, et al. Epigenetic regulation of osteogenesis: human embryonic palatal mesenchymal cells. Bioinformation 2011; 5: 278-281.). Se sabe que se puede obtener una población celular que tiene alta capacidad de formación de colonias y pluripotencia mediante el aislamiento de una fracción de células STRO-1-positiva, glicoforina A-negativa a partir de células estromales de la médula ósea (Simmons PJ, Torok-Storb B. Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody, STRO-1. Blood 1991; 78: 55-62., Tomohiko Kazama. Basic Research and Clinical Application in Mesenchymal Stem Cells. Journal of Nihon University Medical Association 2016; 75(2): 61-66.).”
<Efecto terapéutico de los fibroblastos CD106+ humanos en el modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas> Los fibroblastos CD106+ humanos recogidos después de la clasificación se administraron por vía intramiocárdica al modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas, y se evaluó el efecto sobre la recuperación de la insuficiencia cardíaca durante 18 semanas después de la administración de las células. Los resultados se muestran en la figura 12. Se descubrió que el grupo en el que se administraron los fibroblastos CD106+ humanos mostró una mejora del 32,60 % de la e F y del 17,85 % del FS en comparación con el control, en la semana 18 después de la administración. No se descubrió ni un aumento/disminución extremos de LVEDV ni un aumento de LVESV durante las 18 semanas posteriores a la administración. Los resultados de los elementos principales (LVEF, LVFS, LVEDV y LVESV) y los subelementos (LVIDd, LVIDs, IVSTd, LVPWTd y FC) se muestran en las tablas 10 a 18. En cuanto a los resultados para el control, se utilizaron los resultados obtenidos por el experimento sobre el efecto terapéutico de los fibroblastos CD106+ de rata en el modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas.
[Tabla 10]
Tabla 10: Tendencia de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LEVF) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas mediante la administración de los fibroblastos CD106+ humanos re resentados como “VCF” en la tabla ^
[Tabla 11]
Tabla 11: Tendencia del acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (LVFS) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas mediante la administración de los fibroblastos CD106+ humanos re resentados como "VCF" en la tabla ^
[Tabla 12]
[Tabla 13]
[Tabla 14]
Tabla 14: Tendencia del diámetro telediastólico del ventrículo izquierdo (LVIDd) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas mediante la administración de los fibroblastos CD106+ humanos re resentados como “VCF” en la tabla
[Tabla 15]
Tabla 15: Tendencia del diámetro telesistólico del ventrículo izquierdo (LVIDs) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas mediante la administración de los fibroblastos CD106+ humanos re resentados como "VCF" en la tabla
[Tabla 16]
Tabla 16: Tendencia del espesor telediastólico de la pared anterior del ventrículo izquierdo (LVAWd = IVSTd) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas mediante la administración de los fibroblastos CD106+ humanos re resentados como “VCF” en la tabla
[Tabla 17]
Tabla 17: Tendencia del espesor telediastólico de la pared posterior del ventrículo izquierdo (LVPWTd) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas mediante la administración de los fibroblastos CD106+ humanos (representados como "VCF" en la tabla
[Tabla 18]
<Estudio de dosis de fibroblastos CD106+ humanos>
Los fibroblastos CD106+ humanos recogidos después de la clasificación se administraron por vía intramiocárdica a dos tipos de concentraciones (2,0 x 106 células/50 |j.l y 5,0 x 105 células/50 |j.l) al modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas, y se evaluó el efecto sobre la recuperación de la insuficiencia cardíaca durante 8 semanas después de la administración de las células. Los resultados se muestran en la figura 14. Se descubrió que el grupo en el que se administraron los fibroblastos CD106+ humanos (2,0 x 106 células/50 |j.l) mostró una mejora del 30,18 % de la EF y del 15,65 % del FS en comparación con el control, en la semana 8 después de la administración. No se descubrió ni un aumento/disminución extremos de LVEDV ni un aumento de LVESV durante las 8 semanas posteriores a la administración. Se descubrió que el grupo en el que se administraron los fibroblastos CD106+ humanos (5,0 x 105 células/50 |j.l) mostró una mejora del 26,90 % de la EF y del 13,63 % del FS en comparación con el control, en la semana 8 después de la administración. En la semana 8 después de la administración, no se descubrieron diferencias significativas en EF o FS entre el grupo en el que se administraron los fibroblastos CD106+ humanos (2,0 x 106 células/50 |j.l) y el grupo en el que se administraron los fibroblastos CD106+ humanos (5,0 x 105 células/50 |j.l). Sin embargo, resultó evidente que, a medida que aumenta la dosis, el efecto terapéutico sobre la insuficiencia cardíaca se puede descubrir antes. En cuanto a los resultados para el control, se utilizaron los resultados obtenidos por el experimento sobre el efecto terapéutico de los fibroblastos CD106+ de rata en el modelo de insuficiencia cardíaca crónica en ratas. En cuanto a los resultados para el grupo en el que se administraron los fibroblastos CD106+ humanos (2,0 x 106 células/50 |j.l), se utilizaron los resultados obtenidos en la tabla 2.
Los resultados para los elementos principales (LVEF, LVFS, LVEDV y LVESV) y los resultados para los subelementos (LVlDd, LVIDs, IVSTd, LVpWTd y FC) se muestran en las tablas 19 a 27.
[Tabla 19]
Tabla 19: Tendencia del acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (LVFS) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas debido a la diferencia en la dosis de los fibroblastos CD106+ humanos (representados como "VCF" en la tabla
[Tabla 20]
Tabla 20: Tendencia del acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (LVFS) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas debido a la diferencia en la dosis de los fibroblastos CD106+ humanos (representados como “VCF2” en la tabla
[Tabla 21]
Tabla 21: Tendencia del volumen telediastólico del ventrículo izquierdo (LVEDV) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas debido a la diferencia en la dosis de los fibroblastos CD106+ humanos (representados como “VCF” en la tabla
[Tabla 22]
Tabla 22: Tendencia del volumen telesistólico del ventrículo izquierdo (LVESV) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas debido a la diferencia en la dosis de los fibroblastos CD106+ humanos re resentados como “VCF” en la tabla
[Tabla 23]
Tabla 23: Tendencia del diámetro telediastólico del ventrículo izquierdo (LVIDd) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas debido a la diferencia en la dosis de los fibroblastos CD106+ humanos re resentados como “VCF” en la tabla
[Tabla 24]
Tabla 24: Tendencia del diámetro telesistólico del ventrículo izquierdo (LVIDs) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas debido a la diferencia en la dosis de los fibroblastos CD106+ humanos re resentados como “VCF” en la tabla
[Tabla 25]
Tabla 25: Tendencia del espesor telediastólico de la pared anterior del ventrículo izquierdo (LVAWd = IVSTd) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas debido a la diferencia en la dosis de los fibroblastos CD106+ humanos re resentados como “VCF” en la tabla
[Tabla 26]
Tabla 26: Tendencia del espesor telediastólico de la pared posterior del ventrículo izquierdo (LVPWTd) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas debido a la diferencia en la dosis de los fibroblastos CD106+ humanos re resentados como “VCF” en la tabla
[Tabla 27]
Tabla 27: Tendencia de la frecuencia cardíaca (FC) del modelo de insuficiencia cardíaca en ratas debido a la diferencia en la dosis de los fibroblastos CD106+ humanos re resentados como “VCF” en la tabla
<Efecto terapéutico de los fibroblastos humanos CD 106+ en el modelo de insuficiencia cardíaca crónica porcina> Posteriormente, se preparó un modelo de insuficiencia cardíaca crónica utilizando cerdo, cuyo corazón se informa que es anatómica y fisiológicamente similar al corazón de un ser humano, y se evaluó el efecto terapéutico de los fibroblastos CD106+ humanos sobre la insuficiencia cardíaca. Los resultados se muestran en las figuras 15, 16 y 17. El día antes de la administración de los fibroblastos CD106+ humanos, LVEF fue del 43 %; SV fue de 30,4 ml; EDV fue de 70,5 ml; ESV fue de 40,0 ml; FC fue de 100 lpm; PFR fue de 231 ml/s; y PER fue de 161 ml/s. Dado que el peso del infarto (peso del área fibrótica) calculado mediante el análisis de ROI fue de 10,2 g y el peso del músculo cardíaco del ventrículo izquierdo fue de 78,1 g, se descubrió que la región del infarto (área fibrótica) (%) era del 13,1 %.
Por otra parte, en la semana 4 después de la administración de los fibroblastos CD106+ humanos, LVEF fue del 58 %; SV fue de 38,6 ml; EDV fue de 66,9 ml; ESV fue de 28,2 ml; FC fue de 98 lpm; PFR fue de 232 ml/s; y PER fue de 215 ml/s. Resultó evidente que se puede conseguir una mejora de la LVEF en un 15 % y una mejora del SV en 8,2 ml en la semana 4 después de la administración de los fibroblastos CD106+ humanos. Además, dado que el ESV disminuyó en 11,8 ml y la PER aumentó en 54 ml/s, se hizo evidente la mejora de las funciones cardíacas. Además, dado que el peso del infarto (peso del área fibrótica) calculado mediante el análisis de ROI fue de 8,23 g y el peso del músculo cardíaco del ventrículo izquierdo fue de 89,2 g, la región del infarto (área fibrótica) (%) resultó ser del 9,23 %. A partir de este resultado, resultó evidente que la administración de fibroblastos CD106+ humanos provoca una reducción del peso del infarto (peso del área fibrótica) en 1,97 g.
En la semana 8 después de la administración de los fibroblastos CD106+ humanos, LVEF fue del 52 %; SV fue de 35,9 ml; EDV fue de 69,2 ml; ESV fue de 33,3 ml; FC fue de 92 lpm; PFR fue de 263 ml/s; y PER fue de 156 ml/s. Resultó evidente que se puede conseguir una mejora de la LVEF en un 8 % en la semana 8 después de la administración de los fibroblastos CD106+ humanos. Además, dado que el peso del infarto (peso del área fibrótica) calculado mediante el análisis de ROI fue de 8,51 g y el peso del músculo cardíaco del ventrículo izquierdo fue de 91,6 g, la región del infarto (área fibrótica) (%) resultó ser del 9,29 %. A partir de este resultado, resultó evidente que la administración de fibroblastos CD106+ humanos provoca una reducción del peso del infarto (peso del área fibrótica) en 1,69 g en las ocho semanas posteriores a la administración. El área de infarto/fibrótica (%) apenas cambió con respecto a la semana 4 después del trasplante. A partir de este resultado, resultó evidente que los fibroblastos CD106+ humanos son altamente efectivos para la recuperación de las funciones cardíacas también en la insuficiencia cardíaca del cerdo, que se informa que es anatómica y fisiológicamente similar a la humana.
Claims (4)
1. Composición inyectable que comprende fibroblastos para su utilización en el tratamiento de insuficiencia cardíaca, cardiopatía isquémica o infarto de miocardio, en la que los fibroblastos contienen fibroblastos positivos para CD106 y en la que la composición inyectable se debe inyectar en una región de tejido cardíaco necrótico o sus inmediaciones, y/o infundir en una arteria coronaria.
2. Composición inyectable para su utilización, según la reivindicación 1, en la que los fibroblastos contienen fibroblastos positivos para CD90.
3. Composición inyectable para su utilización, según la reivindicación 1 o 2, en la que los fibroblastos contienen fibroblastos positivos para conexina 43.
4. Composición inyectable para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proporción (en términos del número de células) de los fibroblastos positivos para CD106 respecto a la cantidad total de fibroblastos contenidos en la composición inyectable no es inferior al 0,03 %.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017033624 | 2017-02-24 | ||
| PCT/JP2018/006795 WO2018155651A1 (ja) | 2017-02-24 | 2018-02-23 | 線維芽細胞を含む心臓疾患を治療するための注射用組成物、及び治療用線維芽細胞の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2885080T3 true ES2885080T3 (es) | 2021-12-13 |
Family
ID=63253929
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES18758465T Active ES2885080T3 (es) | 2017-02-24 | 2018-02-23 | Composición inyectable que comprende fibroblastos para su utilización en el tratamiento de cardiopatías |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11096969B2 (es) |
| EP (1) | EP3476395B1 (es) |
| JP (2) | JP6618066B2 (es) |
| KR (1) | KR102407387B1 (es) |
| CN (1) | CN109890398B (es) |
| AU (1) | AU2018223739B2 (es) |
| CA (1) | CA3032654A1 (es) |
| DK (1) | DK3476395T3 (es) |
| ES (1) | ES2885080T3 (es) |
| IL (1) | IL267958B2 (es) |
| SG (1) | SG11201900810WA (es) |
| WO (1) | WO2018155651A1 (es) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020045547A1 (ja) | 2018-08-29 | 2020-03-05 | 株式会社メトセラ | 線維芽細胞の製造方法及びｇ－ｃｓｆ陽性線維芽細胞集団 |
| CN109589337B (zh) * | 2018-12-29 | 2022-04-26 | 南京艾尔普再生医学科技有限公司 | 心肌细胞制剂及其制备方法和应用 |
| CA3174551A1 (en) | 2020-03-04 | 2021-09-10 | Metcela Inc. | Fibroblast having enhanced erythropoietin production ability |
| EP4249585A1 (en) * | 2022-03-25 | 2023-09-27 | Technische Universität München - TUM | Heart tissue models, method of producing heart tissue models and uses of heart tissue models |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003901668A0 (en) * | 2003-03-28 | 2003-05-01 | Medvet Science Pty. Ltd. | Non-haemopoietic precursor cells |
| EP1503819A4 (en) * | 2002-05-08 | 2007-07-25 | Univ California | SYSTEM AND METHOD FOR PRODUCING A NON-ABSORBENT HEADLINE BLOCK |
| WO2003094855A1 (en) * | 2002-05-08 | 2003-11-20 | The Regents Of The University Of California | System and method for treating cardiac arrhythmias with fibroblast cells |
| US20040161412A1 (en) * | 2002-08-22 | 2004-08-19 | The Cleveland Clinic Foundation | Cell-based VEGF delivery |
| US7470538B2 (en) * | 2002-12-05 | 2008-12-30 | Case Western Reserve University | Cell-based therapies for ischemia |
| US20070219487A1 (en) * | 2003-11-10 | 2007-09-20 | The Cleveland Clinic Foundation | Method to Control Ventricular Rate in Atrial Fibrillation Patients |
| US8513011B2 (en) * | 2004-08-26 | 2013-08-20 | Biotech Research Ventures Pte Limited | Methods and compositions for culturing cardiomyocyte-like cells |
| ES2325715B1 (es) * | 2007-08-03 | 2010-06-17 | Genetrix, S.L. | Poblacion de celulas madre adultas derivadas de tejido adiposo cardiaco y su uso en regeneracion cardiaca. |
| JP5378743B2 (ja) | 2008-09-30 | 2013-12-25 | テルモ株式会社 | 医療用細胞シートの製造方法 |
| US8802144B2 (en) * | 2011-08-25 | 2014-08-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation | 3-dimensional cardiac fibroblast derived extracellular matrix |
| JP5920741B2 (ja) | 2012-03-15 | 2016-05-18 | ｉＨｅａｒｔ Ｊａｐａｎ株式会社 | 人工多能性幹細胞から心筋および血管系混合細胞群を製造する方法 |
| US20140072611A1 (en) * | 2012-09-07 | 2014-03-13 | Fibrocell Technologies, Inc. | Methods and Compositions for Treating Post-Cardial Infarction Damage |
| GB201309057D0 (en) | 2013-05-20 | 2013-07-03 | Cell Therapy Ltd | Method |
| KR20150009655A (ko) * | 2013-07-16 | 2015-01-27 | 학교법인 동아학숙 | Gcp-2 유전자를 과발현하는 지방 간엽줄기세포를 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물 |
| WO2016006262A1 (ja) * | 2014-07-11 | 2016-01-14 | 貴紘 岩宮 | 心臓細胞培養材料 |
-
2018
- 2018-02-23 ES ES18758465T patent/ES2885080T3/es active Active
- 2018-02-23 SG SG11201900810WA patent/SG11201900810WA/en unknown
- 2018-02-23 KR KR1020197003364A patent/KR102407387B1/ko active IP Right Grant
- 2018-02-23 AU AU2018223739A patent/AU2018223739B2/en active Active
- 2018-02-23 DK DK18758465.1T patent/DK3476395T3/da active
- 2018-02-23 JP JP2019501845A patent/JP6618066B2/ja active Active
- 2018-02-23 CN CN201880003050.1A patent/CN109890398B/zh active Active
- 2018-02-23 CA CA3032654A patent/CA3032654A1/en active Pending
- 2018-02-23 EP EP18758465.1A patent/EP3476395B1/en active Active
- 2018-02-23 WO PCT/JP2018/006795 patent/WO2018155651A1/ja unknown
-
2019
- 2019-01-31 US US16/263,321 patent/US11096969B2/en active Active
- 2019-07-09 IL IL267958A patent/IL267958B2/en unknown
- 2019-10-03 JP JP2019182761A patent/JP7072135B2/ja active Active
-
2021
- 2021-07-19 US US17/379,671 patent/US20210346436A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20210346436A1 (en) | 2021-11-11 |
| IL267958B2 (en) | 2023-08-01 |
| EP3476395B1 (en) | 2021-07-21 |
| EP3476395A1 (en) | 2019-05-01 |
| EP3476395A4 (en) | 2020-02-26 |
| US11096969B2 (en) | 2021-08-24 |
| KR20190117468A (ko) | 2019-10-16 |
| JPWO2018155651A1 (ja) | 2019-11-07 |
| WO2018155651A1 (ja) | 2018-08-30 |
| CN109890398A (zh) | 2019-06-14 |
| AU2018223739A1 (en) | 2019-02-14 |
| JP7072135B2 (ja) | 2022-05-20 |
| JP6618066B2 (ja) | 2019-12-11 |
| CA3032654A1 (en) | 2018-08-30 |
| JP2019218408A (ja) | 2019-12-26 |
| SG11201900810WA (en) | 2019-02-27 |
| CN109890398B (zh) | 2024-01-16 |
| IL267958B1 (en) | 2023-04-01 |
| AU2018223739B2 (en) | 2023-06-22 |
| US20190224250A1 (en) | 2019-07-25 |
| KR102407387B1 (ko) | 2022-06-10 |
| IL267958A (en) | 2019-09-26 |
| DK3476395T3 (da) | 2021-08-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2885080T3 (es) | Composición inyectable que comprende fibroblastos para su utilización en el tratamiento de cardiopatías | |
| Bao et al. | C-Kit Positive cardiac stem cells and bone marrow–derived mesenchymal stem cells synergistically enhance angiogenesis and improve cardiac function after myocardial infarction in a paracrine manner | |
| US10639335B2 (en) | Pluripotent stem cell that induces repair and regeneration after myocardial infarction | |
| Zhang et al. | Enhancing efficacy of stem cell transplantation to the heart with a PEGylated fibrin biomatrix | |
| JP6796143B2 (ja) | トロンビン処理幹細胞に由来するエキソソームを含む慢性肺疾患治療用組成物 | |
| Huang et al. | A translational approach in using cell sheet fragments of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells for cellular cardiomyoplasty in a porcine model | |
| JP6883904B2 (ja) | 線維芽細胞の製造方法及びｇ−ｃｓｆ陽性線維芽細胞集団 | |
| US20200085875A1 (en) | Platelet vesicle-engineered cells for targeted tissue repair | |
| JP7091427B2 (ja) | 心不全の治療方法 | |
| JPWO2014051154A1 (ja) | 虚血性疾患治療に適した細胞を含む細胞群の生体外増幅方法 | |
| BR112015008745B1 (pt) | Uso de um peptídeo de fragmento de hmgb1 para a fabricação de um medicamento para o tratamento de lesão do cordão espinhal | |
| EP3494979A1 (en) | Alleviation and treatment of ischemia reperfusion-induced lung injury using pluripotent stem cells | |
| Fatkhudinov et al. | Bone Marrow‐Derived Multipotent Stromal Cells Promote Myocardial Fibrosis and Reverse Remodeling of the Left Ventricle | |
| JP5894071B2 (ja) | 心臓組織由来細胞 | |
| US20220347346A1 (en) | Mesenchymal stem cell sheet and use thereof | |
| WO2017012226A1 (zh) | 间质干细胞、其克隆源性扩增的方法、其分离方法及其应用 | |
| JPWO2004100972A1 (ja) | 組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤 | |
| ES2623142T3 (es) | Un método para amplificar las células madre cardíacas in vitro e in vivo | |
| Guo et al. | Young human PRP promotes the rejuvenation of aged bone marrow mesenchymal stem cells and the therapeutic effect on ischemic heart disease | |
| KR20230137808A (ko) | 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포 및 인간 기질 혈관 분획을 포함하는 혈관신생 촉진용 조성물 | |
| Kinugawa et al. | Safety and Efficacy of Autologous Skeletal Myoblast Sheets (TCD-5 1073) for the Treatment of Severe Chronic Heart |