KR20150009655A

KR20150009655A - Gcp-2 유전자를 과발현하는 지방 간엽줄기세포를 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20150009655A
Application number: KR1020130083696A
Authority: KR
Inventors: 김성환; 김무현
Original assignee: 학교법인 동아학숙
Priority date: 2013-07-16
Filing date: 2013-07-16
Publication date: 2015-01-27

Abstract

본 발명은 GCP-2(Granulocyte chemotactic protein-2) 유전자를 과발현하는 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ASCs)에 관한 것이다.
본 발명에 따른 지방 간엽줄기세포는 VEGF-A 및 HGF 유전자를 과발현하여 혈관형성을 촉진하고, LVEDD(left ventricular end diastolic diameter) 및 LVESD(Left ventricular end systolic diameter) 값을 감소시키며, LVEF(Left ventricular ejection fraction) 값을 증가시켜 심장기능을 개선시키고, 허혈성 부위(ischemic area)의 혈관 밀집도(vascular density)를 증가시켜, 허혈성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

GCP-2 유전자를 과발현하는 지방 간엽줄기세포를 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물{COMPOSITIONS COMPRISING ADIPOSE-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELL OVEREXPRESSING GCP-2 GENE FOR TREATING ISCHEMIC DISEASE}

본 발명은 지방 간엽줄기세포를 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 GCP-2 유전자를 과발현하는 지방 간엽줄기세포를 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

심장혈관 의학에서 최근에 이루어진 많은 연구 성과에도 불구에도, 허혈성 심장혈관병(ischaemic cardiovascular disease)은 서구화된 사회에서 가장 심각한 건강문제 중 하나이다(Lloyd-Jones D, Adams R, Carnethon M, et al. Heart disease and stroke statistics. 2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation 2009;119:480-486).

최근 줄기세포 생물학 분야의 발전으로 세포를 기반한 치료가 손상된 기관과 조직의 치료를 위한 매력적인 새로운 전략이 되고 있다(Kamihata H, Matsubara H, Nishiue T, et al., Implantation of bone marrow mononuclear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion and regional function via side supply of angioblasts, angiogenic ligands, and cytokines. Circulation 2001;104: 1046-52).

특히, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSCs)는 성체 줄기세포의 중요한 소스이므로, MSCs가 심혈관 병에 대한 잠재적인 치료를 위해 제안되고 있다(Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng 2001;7: 211-228. / Lee RH, Kim B, Choi I, Kim H, Choi HS, Suh K et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem 2004;14:311-324. / Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ, Bovenkerk JE et al. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation 2004;109:1292-1298. / Moon MH, Kim SY, Kim YJ, Kim SJ, Lee JB, Bae YC et al. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells improve postnatal neovascularization in a mouse model of hindlimb ischemia. Cell Physiol Biochem 2006;17:279-290. / Byun KH, Kim SW. Is stem cell-based therapy going on or out for cardiac disease., Korean Circ J 2009;39:87-92.).

지방세포 유래 MSCs(adipose tissue-derived MSCs, ASCs)는 환자로부터의 분리가 용이하여 널리 연구되어 왔다. 그러나, 최근 ASCs와 관련된 연구에서 임상적 치료에 적용하기 어려운 문제점들이 보고되고 있는데, 대표적으로 허혈성 심장(ischaemic heart)에서 증명된 이식 세포의 낮은 생존율에 관한 것이 있다(Shake JG, Gruber PJ, et al. Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model: engraftment and functional effects. Ann Thorac Surg 2002;73:1919-1925. discussion 1926. / Toma C, et al. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation 2002;105:93-98. / Cho HJ, et al. Role of host tissues for sustained humoral effects after endothelial progenitor cell transplantation into the ischemic heart. J Exp Med 2007;204:3257-3269. / Kang HJ, et al. Magnetic bionanoparticle enhances homing of endothelial progenitor cells in mouse hindlimb ischemia. Korean Circ J 2012;42:390-396).

한편, 화학주성 사이토카인(chemotactic cytokine, chemokine)은 면역반응, 항상성 유지, 종양생성, 신혈관생성 등에서 중요한 역할을 하고 있다(Baggiolini M. Chemokines in pathology and medicine. J Intern Med 2001;250:91-104. / Rot A, von Andrian UH. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu Rev Immunol 2004;22:891-928). GCP-2(Granulocyte chemotactic protein-2, GCP-2/CXCL6)는 혈관내피세포와 혈관형성 성질을 보이는 섬유아세포(fibroblast) 그리고 중간엽 줄기세포(mesenchymal cell)에서 발현되는 것으로 보고되었다(Wuyts A, et al. Lab Invest 2003;83:23-34).

본 발명에서는 줄기세포에서 GCP-2의 과다발현이 혈관생성 및 세포 생존 가능성을 높일 수 있는 새로운 방법이 될 수 있을 것이라는 전략을 수립하고 새로운 허혈성 질환 치료제를 발굴하고자 예의 연구노력 하였다. 그 결과, GCP-2 유전자가 과발현된 지방유래 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ASCs)가 VEGF-A 및 HGF 유전자를 과발현하여 혈관형성을 촉진하고, IGF-1 및 Akt-1 유전자를 과발현하여 세포사멸을 억제하며, eNOS, Tie-2, 및 vWF 유전자를 과발현함으로써 혈관내피세포(endothelial cell)로 분화할 수 있고, LVEDD(left ventricular end diastolic diameter) 및 LVESD(Left ventricular end systolic diameter) 값을 감소시키며, LVEF(Left ventricular ejection fraction) 값을 증가시켜 심장기능을 개선시키고, 허혈성 부위(ischemic area)의 혈관 밀집도(vascular density)를 증가시켜, 허혈성 질환에 대한 치료적 효능이 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 GCP-2 유전자를 과발현하여 세포 이동 및 혈관생성과 관련된 유전자와 단백질을 발현분비하고, 심근 경색을 감소시키며, 허혈성 질환에 대한 치료적 효능이 있는 지방 간엽줄기세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 GCP-2 유전자를 과발현하는 지방 간엽줄기세포를 포함하는 허혈성 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 GCP-2 유전자를 과발현하는 지방 간엽줄기세포를 이용한 허혈성 질환의 치료방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 허혈성 질환의 치료용 약물(medicament)을 제조하기 위한 GCP-2 유전자를 과발현하는 지방 간엽줄기세포의 용도를 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 GCP-2(Granulocyte chemotactic protein-2) 유전자를 과발현하는 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ASCs) 또는 그 배양 배지(Conditioned media)의 약제학적 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 GCP-2 유전자는 동물 유래의 모든 GCP-2 유전자를 포함하며, 케모카인(chemokine)으로서 기능을 수행할 수 있도록 GCP-2 단백질이 GCP-2 수용체(receptor)에 결합하는 한, 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합과 관련된 GCP-2 유전자 서열의 변이를 포함한다.

본 발명의 상기 GCP-2 유전자를 줄기세포에 도입시키는데 사용되는 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

상기 GCP-2 유전자는 당 분야의 공지 방법, 예를 들어 벡터 형태의 네이키드 DNA로 직접 주사하거나(Wolff et al., Science, 247:1465-8, 1990: Wolff et al., J Cell Sci. 103:1249-59, 1992), 리포좀(Liposome), 양이온성 고분자(Cationic polymer)등을 이용하여 세포 안으로 전달될 수 있다.

본 발명자들은 GCP-2 유전자를 바이러스 벡터에 삽입하여 지방유래 간엽줄기세포에 형질전환(transfection)시켰고, NOD/SCID 마우스를 이용한 심근경색 모델을 통하여 GCP-2(Granulocyte chemotactic protein-2) 유전자를 과발현하는 지방 간엽줄기세포의 치료 능력을 연구하였다. 또한, 허혈성 부위에 GCP-2(Granulocyte chemotactic protein-2) 유전자를 과발현하는 지방 간엽줄기세포 세포를 이식하여 유전자 발현의 변화, 다중 주변분비 인자(paracrine factor)의 분비, 세포 이동 및 혈관 생성에 미치는 영향, 심근경색의 경감 여부 등을 종합적으로 분석하여 GCP-2(Granulocyte chemotactic protein-2) 유전자를 과발현하는 지방 간엽줄기세포의 주입 또는 이식이 허혈성 질환의 치료를 증진함을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 이용되는 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ASCs)는 GCP-2가 형질전환되지 않은 통상의 ASCs 세포와 비교하여 혈관형성 촉진 인자(pro-angiogenic factor)인 VEGF-A 및 HGF 유전자를 과발현하여 혈관형성을 촉진하는 특징이 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 이용되는 지방 간엽줄기세포는 GCP-2가 형질전환되지 않은 통상의 ASCs 세포와 비교하여 항 세포사멸 인자(anti-apoptotic/cell survival factors)인 IGF-1 및 Akt-1 유전자를 과발현하여 세포사멸을 억제하는 특징이 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 이용되는 지방 간엽줄기세포는 eNOS(endothelial nitric oxide synthase), Tie-2, 및 vWF(Von Willebrand factor) 유전자를 과발현하고, 혈관내피세포(endothelial cell)로 분화할 수 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 이용되는 지방 간엽줄기세포는 LVEDD(left ventricular end diastolic diameter) 및 LVESD(Left ventricular end systolic diameter) 값을 감소시키고, LVEF(Left ventricular ejection fraction) 값을 증가시켜 심장기능의 개선을 촉진시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 이용되는 지방 간엽줄기세포는 허혈성 부위(ischemic area)의 혈관 밀집도(vascular density)를 증가시키는 것을 특징으로 한다..

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 이용되는 지방 간엽줄기세포의 배지(Conditioned media)는 섬유아세포(fibroblasts)의 증식을 촉진하고, 섬유아세포(fibroblasts)의 상처 봉합을 촉진하며, 혈액 순환 속도를 증가시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 허혈성 질환은 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 뇌졸중, 또는 허혈성 하지질환을 포함하며, 바람직하게는 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 또는 허혈성 심부전을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 GCP-2(Granulocyte chemotactic protein-2) 유전자를 과발현하는 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ASCs) 또는 그 배양 배지(Conditioned media)의 약제학적 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 조성물은 1ml 당 1.0 x 10⁴개 내지 1.0 x 10⁸개, 바람직하게는 1.0 x 10⁵개 내지 1.0 x 10⁷개, 더욱 바람직하게는 1.0 x 10⁶개의 세포를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 통상적인 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 치료 효과를 나타낼 수 있는 효과적인 투여량을 포함한다. 적합한 제형의 예로는 비경구 투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제 등을 들 수 있다. 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있다.

상기 약학 제제에는 유효 성분 외에 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체가 추가로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등이, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 약학 제제는 통상적인 투여 방법에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 비경구적 투여방법에 의해 투여될 수 있으며, 예를 들어, 주사에 의해 투여되거나, 질환 부위 또는 그 주변의 진피 또는 피하에 직접 주입되어 이식될 수 있다.

본 발명의 세포의 1일 투여량은 1.0 x 10⁵내지 1.0 x 10⁷, 바람직하게는 1.0 x 10⁵ 내지 1.0 x 10⁶ 세포/kg체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 실제 투여량은 질환, 질환의 중증도, 투여 경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등에 따라 변할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 VEGF-A 및 HGF 유전자를 과발현하여 혈관형성을 촉진하고, IGF-1 및 Akt-1 유전자를 과발현하여 세포사멸을 억제하며, eNOS, Tie-2, 및 vWF 유전자를 과발현함으로써 혈관내피세포(endothelial cell)로 분화할 수 있고, LVEDD(left ventricular end diastolic diameter) 및 LVESD(Left ventricular end systolic diameter) 값을 감소시키며, LVEF(Left ventricular ejection fraction) 값을 증가시켜 심장기능을 개선시키고, 허혈성 부위(ischemic area)의 혈관 밀집도(vascular density)를 증가시켜, 허혈성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 hASCs/GCP-2 세포 처리 후, qRT-PCR 분석을 통해 혈관생성 및 항세포사멸과 관련된 유전자 발현 패턴을 분석한 그래프이다.
도 2a는 배양 배지(conditioned media) 처리 후, 섬유아세포 상처 봉합을 분석한 그림이다.
도 2b는 배양 배지(conditioned media) 처리 후, ex vivo에서 증식된 섬유아세포를 분석한 그림이다.
도 3a는 In vitro에서 혈관형성 능력을 분석한 그림이다.
도 3b는 RT-PCT을 통해 혈관내피세포 특이적 유전자의 발현(EC-specific gene expression changes)을 분석한 사진이다.
도 3c는 혈관내피세포 특이적 유전자의 발현(EC-specific gene expression changes) 결과를 정량화하여 도시한 그래프이다.
도 4는 심장 초음파 검사(echocardiography) 결과를 분석한 그래프이다.
도 5a는 hASCs/GCP-2 세포 이식 후, 심근경색 부위(infarct scar area)를 비교 분석한 그림이다.
도 5b는 hASCs/GCP-2 세포 이식 후, 경색이 일어난 경계 부근에서 혈관 밀도를 비교 분석한 그림이다.
도 5c는 hASCs/GCP-2 세포 이식 후, TUNEL 분석을 통하여 세포 생존을 분석한 그림이다.
도 5d는 qRT-PCR 분석을 통해, VEGF-A 발현을 분석한 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 실험 방법 및 실험 재료의 준비

1-1. 세포 배양

인간 지방유래 간엽줄기세포(hASCs)의 분리는 CHo HH. 등의 방법에 따라 실행하였다(Cho HH, Kim YJ, et al. The role of chemokines in proangiogenic action induced by human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in the murine model of hindlimb ischemia. Cell Physiol Biochem 2009;24:511-518). 인간 샘플을 포함한 모든 프로토콜은 환자의 동의를 얻었고, 동아대와 부산대의 생명윤리위원회(Institutional Review Boards)에 의해 승인되었다. 세포를 배지[a-MEM, 10% foetal bovine serum (FBS), 100 U/mL of penicillin, and 100 mg/mL of streptomycin]에서 배양하고, 37℃, 5% CO₂를 유지시켰다. 모든 실험은 3 내지 5회 계대 배양한 hASCs를 사용하였다. HUVECs(Human umbilical vein endothelial cells )과 HDFs(normal human dermal fibroblasts)는 ATCC(Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다.

1-2. 바이러스 벡터 구축 및 형질도입

형질도입은 hASC/GCP-2 세포 라인을 사용하였다. 바이러스 벡터의 제작(construction)과 세포 내로의 도입(transduction)은 종래 방법에 따라 실시하였다(Cho HH, et al. Cell Physiol Biochem 2009;24:511-518). GCP2 유전자는 pCMVSPORT6-GCP2(21C Frontier human gene bank) 플라스미드(donor plasmid)로부터 획득하였고, BP/LR 클로나아제(clonase, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 목적 벡터(destination vector) pLenti6/V5로 삽입하였다. 바이러스 벡터의 제작을 확인하기 위하여, 전체 플라스미드를 서열분석(sequencing)하였다. 렌티바이러스(replication-defective lentivirus)를 세포 내로 도입하기 위해서, 293T 세포, 리포펙타민 플러스(lipofectamine Plus, Invitrogen), 및 패키징 믹스(packaging mix, Invitrogen)를 사용하였다. 형질 도입 후, 48시간 혹은 72시간 뒤에 바이러스 샘플을 획득하였고, Millex-HV 0.45 mm PVDF 필터(Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 여과하였다. 폴리브렌(polybrene, 5mg/mL)을 사용하여 바이러스가 들어있는 액상을 6시간 동안 hASCs에 반응하여 바이러스의 세포 도입(transduction)을 실행하였고, 블라스티시딘(blasticidin, 10 mg/mL, Invitrogen)을 사용하여 바이러스가 도입된 세포를 선별하였다.

1-3. RT-PCR 및 qRT-PCR 분석

qRT-PCR 분석은 종래 방법을 따라 진행하였다(Kang HJ, et al. Korean Circ J 2012;42:390-396 / Kim SW, et al. J Am Coll Cardiol 2010;56:593-607). 총 RNA는 3 내지 5회 계대 배양된 세포로부터 분리하였다. RNA-stat 시약(Iso-Tex Diagnostics, Friendswood, TX, USA) 및 RNA 추출 키트(iNtRON Biotechnology, Korea)를 사용하였으며, 제조사의 프로토콜에 따라 진행하였다. 분리된 RNA는 Taqman 시약(Taqman Reverse Transcripton Reagents, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 역전사(reverse-transcription)하였다. 이렇게 합성된 cDNA는 인간/마우스 특이적인(human/mouse-specific) 프라이머와 항체를 사용하여 qRTPCR 혹은 RTPCR에 적용하였다. RNA 수준은 검출 시스템(ABI PRISM 7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 정량하였다. GAPDH 발현량을 기준으로 상대적인 mRNA 발현 수준이 계산되었으며, 종래 방식을 따랐다(Kang HJ, Kim JY, et al. Korean Circ J 2012;42:390-396.). 프라이머 및 프로브 세트는 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems)으로부터 구입하였다.

1-4. 세포사멸 분석(Apoptosis assay)

종래 방식에 따라 6시간 동안 혈청 결핍(serum deprivation, SD)에 의해 세포 사멸을 유도하였다(Kim MH, Zhang HZ, Kim SW. J Mol Cell Cardiol 2011;51:702-712). Apoptotic cells은 Annexin V-FITC binding assay kit (Oncogene, San Diego, CA, USA)을 사용하여 검사하였으며,

사멸 세포는 아넥신 V-FITC 결합 분석 키트(Annexin V-FITC binding assay kit, Oncogene, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하였고, FACScan(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)을 사용하여 분석하였다.

1-5. 세포이동 분석(Cell migration assay)

세포이동 분석(cell migration assay)을 실행하기 위하여, 배지(conditioned medium)를 종래 방식에 따라 수득하였다(Zhang C, et al. Clin Cancer Res 2009;15:4017-4027.). 세포(1 × 10⁶)를 T-75 플라스크에 접종하고 일반배지 또는 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(100 mg/mL, Gibco), 및 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 함유된 저당 DMEM(low-glucose Dulbecco modified Eagle medium, Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 세포가 80% 정도 채워질 때까지 48시간동안 배양하였다. 각 샘플로부터의 배양배지를 1000g에서 원심분리한 후, 실험을 위한 배지(conditioned medium)로 사용하였다. HDFs는 타입 I 콜라겐(0.2 mg/mL)을 코팅한 24-웰 배양 플레이트에 1 × 10⁵/웰 밀도로 접종하였다. 그리고, 웰을 다 채울 정도로 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 배양하였다. 멸균한 피펫 팁을 사용하여 세포층을 스크래치(scratching)한 후 조정배지를 넣어 배양하였다. 세포 이동(cell mobility)을 측정하기 위하여, 스크래치 후 72시간 후에, 다섯 곳을 무작위로 정하여 사진을 촬영하였다. 상처부위(wound area)는 상처 가장자리(wound margin)를 이용하여 결정하였고, NIH 이미지 프로그램(http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)을 사용하여 계산하였다.

1-6. 급성심근경색(Acute Myocardial Infarction) 유도 및 세포 이식

실험은 미국 국립보건원에 의해 발행된 실험동물의 보호 및 이용을 위한 가이드(NIH Publication No.85-23, 1996 개정)에 따라 진행하였으며, 인간의 조직과 샘플 사용에 관한 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki)의 원칙을 따라 실행하였다. 급성 심근경색(myocardial infarction, MI)의 마우스 모델은 종래 방법에 따라 준비하였다(Kang HJ, et al. Korean Circ J 2012;42:390-396. / Yu LH, Kim MH, et al. Int J Cardiol 2010;139:166-172). 모든 과정은 동아의대 기관 동물 보호 및 이용 위원회(DIACUC)의 승인 하에 이루어졌다. 통증(Pain and distress)에 관한 부분은 동아대학교 의과학 연구지원센터의 조언을 받아 규칙적인 마취(analgesia)를 실행하였다.

12-13주령의 NOD/SCID 마우스(NOD.CB17-Prkdc^skid/J strain, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA)를 무작위로 다섯 개의 그룹으로 나누었다[ hASCs 그룹, hASCs/GCP-2 처리한 그룹, 항-GCP-2-중화항체(anti-GCP-2-neutralizing antibodies)를 처리한 hASCs/GCP-2 그룹(각각 n=15), PBS 그룹 (n=15), 샴(sham-operation) 그룹(LAD 결찰 없이 수술 진행)].

모든 마우스는 75mg/kg 케타민, 1mg/kg 메테토미딘(medetomidine), 600mg/kg 아트로핀(atropine)을 사용하여 마취하였으며, 0.05mg/kg 부프레노핀(buprenorphine)을 투여하였다. 마취의 깊이는 호흡 수(respiratory rate)와 도피반사(withdrawal reflex)를 측정하여 결정하였다. 분당 130회로 0.25-0.30 ml의 공기를 공급할 수 있는 기기(Inspira-Advanced Safety Ventilator)를 사용하여 산소를 공급하였으며, 이것은 기도에 관을 삽입하여 실행하였다. 마우스를 오른편으로 놓아서, 좌흉개술(left thoracotomy)을 통해 심장이 드러나도록 하였다. 심근을 제거한 후, 입체현미경(stereomicroscope)을 사용하여 좌측 전하행 동맥(left anterior descending artery, LAD)이 보이도록 하였다. 나일론 봉합선(9.0 nylon suture)을 사용하여 심방심실연결부(atrioventricular junction)에서 0.3 mm 떨어진 위치에 혈관이 막히도록 유도하였다. 혈관의 폐색(occlusion)이 제대로 이루어졌는지 확인하기 위하여 결찰(ligation) 후 좌심실의 창백(left ventricular pallor)을 관찰하였다.

이식한 세포를 구별하기 위하여 세포를 용기 당 2 내지 3 × 10⁶ 세포를 사용하여 100mm 배양 용기에서 37℃와 4℃에서 15분간 준비하고, 4μM Dil(chloromethyl - benzamido - 1,1′ - dioctadecyl - 3,3,3′3′ - tetramethylindo - carbocyanine, Molecular Probes, USA)로 표지(labeling) 하였다. GCP-2에 대한 중화항체(Neutralizing antibodies)(R&D Systems)는 세포 이식 1시간 전에 처리하였다. 급성 심근경색(acute myocardial infarction, AMI)후, 50ul PBS 또는 1 × 10⁶ 세포를 포함한 PBS를 심근내로 주사하였다. 주사위치는 경색된 부분의 경계에서 3개의 위치를 선택하였다. hASCs/GCP-2 혹은 PBS를 처리한 후, 4주째에 심장의 기능을 확인하기 위하여, 살아남은 실험동물에 대하여 심장 초음파 검사(echocardiography, ECHO)를 실시하였고, 이후 조직 분석을 위하여 해부하였다.

1-7. 심장 기능(cardiac function) 검사

심장기능은 15-16MHz 소형 선상 배열 트랜스듀서(linear array transducer, hockey stick)를 이용하여 측정하였다. 복장뼈주위(Parasternal) 긴축단면도(long-axis view)와 단축단면도(short-axis view)는 M-모드와 2D(two-dimensional ) 초음파 이미지를 모두 촬영하였다. 좌심실 이완기말 직경(left ventricle end-diastolic diameter, LVEDD), 좌심실 수축기말 직경(left ventricle end-systolic diameter, LVESD), 좌심실 박출계수(left ventricular ejection fraction, LVEF) 등은 종래 방식으로 측정하였다(Yu LH, Kim MH, et al. Int J Cardiol 2010;139:166-172).

1-8. 조직학(Histological) 및 면역조직화학(immunohistochemical) 분석

심장 초음파 검사(echocardiography, ECHO)를 완료한 후, 모든 실험동물은 조직 분석을 위하여 티오펜탈(thiopental-sodium, 40 mg/kg)을 혈관내로 주사하여 안락사 시키고 해부하였다. 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, PFA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 수용액을 처리하고, 심장을 적출하여 파라핀(paraffin)으로 처리하였다(Yu LH, Kim MH, et al. Int J Cardiol 2010;139:166-172). 이 후, 좌심방 전체에 대하여 5μm 가로 섹션을 연속적으로 수득하였고, 절편을 매슨 트리크롬 염색(Masson-Trichrome stain)과 면역조직분석(immunohistochemical analysis)을 위하여 사용하였다. 각각의 적출된 심장으로부터 중간 유두상(mid-papillary)에 가까운 4개의 섹션을 획득하여, 상처 부위(scar area)의 측정과 염색(staining)에 사용하였다. 흉터부분은 매슨 크롬 염색법에 의해 파란색으로 염색되며, 기기(Scan Scope CS system, Aperio Technologies, Inc., Vista, CA, USA)를 사용하여 정량적으로 계산하였다. 면적의 단위는 밀리미터 제곱을 사용하였다.

경색이 일어난 경계 부분의 혈관 조밀도(vascular density)를 측정하기 위하여, 미세혈관(microvessel)의 수를 측정하였다. 측정은 400배의 광학현미경을 사용하였으며, 심장 하나당 다섯 섹션에서 실행하였다. 섹션은 중간유두상에 가까운 부분으로, ILB4(biotinylated ILB4, 1:250; Vector Laboratory, Inc.)로 1차 염색하고, SA(streptavidin) Alexa Fluor 488(1:400; Invitrogen)을 2차로 처리하였다. 각 섹션에서 5개의 고배율시야관찰(high-power field)을 무작위로 선택하였고, 각 부분에서 미세혈관(microvessel)의 수를 측정하였다. 심장에서 세포사멸의 측정은 TUNEL 어세이 키트(Promega)를 이용하여 측정하였다. 근육 액틴(muscle actin)의 1차 염색을 위하여 HHF35(1:400; Dako)를 사용하였고, 2차 염색을 위하여 Cy3 (1:500; Jackson Immunoresearch Laboratories)를 사용하였다. 조직 섹션을 고정하고, 현미경(laser scanning confocal microscope, LSM510, Carl Zeiss)을 사용하여 관찰하였다. 인간 세포(human cell)를 관찰하기 위하여 Cy3-융합(Cambio, Cambridge,UK) 인간 X 염색체 프로브(human X chromosome probe)로 FISH(fluorescence in situ hybridization)를 실행하였다.

1-10. 통계분석(Statistical Analysis)

모든 데이터는 평균 ± 표준오차 또는 표준오차로 요약하였다. 두 그룹사이의 비교를 위해서는 Student’s t-test를 적용하여 분석하였다. 다양한 요소들을 분석하기 위하여 Bonferroni’ 다중 비교 테스트를 적용한 ANOVA를 사용하였다. 통계학적 의미는 p<0.05 의 값에 적용하였다. 모든 통계 분석은 SPSS v 12.0 소프트웨어(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하였다.

실시예 2. 세포 특성 분석

4 내지 6세대의 계대 배양한 세포를 사용한 분석에서 hASCs는 배양시 스핀들 섬유아세포(spindle fibroblast) 유사 형태(morphology)를 나타내었다. FACS 분석을 통하여 hASCs는 중간엽 줄기세포에 특이한 특징을 보여주었는데, CD13, CD29, CD44, CD73, CD105에 대하여 양성이고, CD34, CD45에 대하여 음성이었다.

실시예 2. hASCs/GCP-2 세포의 GCP-2 단백질 발현 분석

hASCs/GCP-2 세포의 GCP-2 단백질 분비를 확인하기 위하여, ELISA 분석을 수행하였다. GCP-2 바이러스 벡터를 처리한 hASC(hASCs/GCP-2) 세포와 대조군 벡터를 처리한 hASCs(hASCs) 세포를 비교했을 때, GCP-2 단백질의 발현 수준은 hASCs/GCP2 세포에서 훨씬 높게 분석되었다(1343 ± 15 vs. 125 ± 12.4pg/mL; P<0.001, n=7 ).

실시예 3. hASCs/GCP-2 세포의 혈관생성 및 항-세포사멸 특성 분석

hASCs/GCP-2 세포의 혈관형성(angiogenic)과 항세포사멸(anti-apoptotic) 특성을 분석하기 위하여, qRT-PCR을 실행하였다. 그 결과, VEGF-A, HGF(hepatocyte growth factor)와 같은 혈관형성 촉진 인자(pro-angiogenic factor)가 hASCs 세포와 비교하여 hASCs/GCP-2 세포에서 높게 발현되었다(각 29.9 및 2.1 배)(도 1A). 또한, 신혈관생성(neovascularization)에 중요한 역할을 하는 IL-8, GCP-2와 같은 케모카인(chemokine)도 크게 상향 조절(up-regulation) 되었다(각 12.5 및 9.0배). 또한, IGF-1, Akt-1 같은 항 세포사멸 인자(anti-apoptotic/cell survival factors)가 대조군과 비교하여 높게 발현되었다(각 254.0 및 3.1 배).

hASCs/GCP-2 세포의 세포보호효과(cytoprotective effect)를 검사하기 위하여, in vitro 세포사멸 분석(apoptosis assay)을 실행하였다. 그 결과, hASCs 세포군과 HUVECs 세포군과 비교하여 hASCs/GCP-2 세포군에서 사멸 세포(apoptotic cell)의 수가 크게 줄어들었다(도 1B).

이러한 결과를 바탕으로 hASCs/GCP-2 세포가 혈관형성(angiogenic) 및 항-세포사멸(anti-apoptotic)과 관련된 유전자를 높은 레벨로 발현함을 확인할 수 있었다.

실시예 4. hASCs/GCP-2 배양 배지의 세포 이동, 증식, 및 혈류 개선 특성 분석

hASCs/GCP-2 세포로부터 분비된 단백질이 신혈관생성(neovasculogenesis) 과정에서 세포 이동(cell migration)을 촉진시킬 수 있는지 확인하기 위하여, in vitro 상처 분석(scratch assay)를 수행하였다. 실험은 HUVECs, 및 hASCs와 비교하여 수행하였으며, 72시간 후 측정하였다. 분석 결과, hASCs/GCP-2 배지(conditioned media)가 HDF(Human dermal fibroblasts)의 상처 봉합 속도를 크게 증가시킴을 알 수 있었다(20.2 ± 2.1 vs. 37.9 ± 4.9, 50.9 ± 4.6, 각; n=4)(도 2A). 또한 hASCs/GCP-2 배지에서 배양한 섬유아세포(fibroblast)의 증식속도(proliferation rate)가 크게 증가하였다(도 2B).

다음으로, in vivo 주변분비(paracrine) 메카니즘과 관련되어 있는지를 명확히 하기 위하여, 분비된 단백질의 효과를 IH 마우스 모델(ischaemic hindlimb mouse model)을 사용하여 조사하였다. LDPI 분석 결과, 21일후 hASCs/GCP-2 조정배지를 주사한 다리에서 혈액 순환 속도가 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. hASCs/GCP-2 세포의 in virto. 혈관내피세포 분화능 분석

hASCs/GCP-2 세포와 대조군 hASCs 세포의 혈관내피세포 분화 가능성(EC differentiation potential)을 조사하기 위하여, 각각의 세포 타입을 EGM-2 배지에서 배양하였다.

hASCs/GCP-2 세포와 hASCs 세포를 혈관내피세포로 분화시키는 10일째, 상당히 흥미로운 현상을 발견하였다. hASCs/GCP-2 세포와 hASC 세포 모두 긴 튜브 모양의 구조(linear tubular structures)를 형성하였으며, 이것은 이들 세포가 신혈관형성(vasculogenesis)에 기여한다는 사실과 일치한다.

특히, hASCs/GCP-2 세포 투여군에서는 독특한 가지 모양의 구조를 형성하여, 충분히 성숙한 혈관으로 분화되는 것을 관찰할 수 있었다(도 3A).

이러한 튜브 모양의 세포를 확인하기 위하여, 혈관내피세포에 특이적 마커(EC-specific markers)로 쓰이는 UEA-1 렉틴(lectin)과 KDR(kinase insert domain receptor)를 염색하였다.

면역조직화학(immunocytochemistry) 분석 결과, hASCs/GCP-2 세포 처리군에서 훨씬 많은 수의 혈관내피세포 마커를 확인하였으며, 이러한 결과를 통하여 hASCs/GCP-2 세포가 hASCs 세포와 비교하여 높은 혈관내피세포 분화 능력이 있음을 확인할 수 있었다.

다음으로 혈관내피세로의 분화시 나타나는 혈관내피세포 특이적 유전자 발현(EC-specific gene expression)을 측정하기 위하여, RT-PCR을 수행하였다. 분화하지 않은 상태에서의 hASCs/GCP-2와 hASCs는 eNOS(endothelial nitric oxide synthase)와 Tie-2를 발현하였다. 특히 분화하지 않은 상태에서의 hASCs/GCP-2에서 Tie-2가 높은 레벨로 발현되었다(도 3B 및 3C). hASCs/GCP-2를 혈관내피세포로 분화를 시작한 지 10일 후, vWF(Von Willebrand factor)의 발현이 점차적으로 증가하였다.

유전자 발현정도를 정량화 했을 때, 5 내지 15일에 걸쳐 hASCs/GCP-2에서는 eNOS, Tie-2, 및 vWF 발현정도가 아주 높게 측정되었다(도 3C). 이러한 결과를 통하여 hASCs/GCP-2가 혈관내피세포로의 분화에 큰 잠재력을 갖고 있음을 확인할 수 있다.

실시예 6. MI 모델에서 hASCs/GCP-2 세포의 치료 효과 분석

허혈성 심장(ischaemic heart)에 대한 hASCs/GCP-2 세포의 치료 능력(therapeutic potential)을 조사하기 위하여 우리는 NOD/SCID mice에서 관상동맥 결찰(coronary ligation)을 통하여 심근경색(MI)을 유도하였다. 그리고 심실벽의 경색이 일어난 부위(peri-infarct zone)로 1 × 10⁶의 세포를 주입하였다. 비교를 위하여 대조군(n=15, 각 군별)으로 PBS를 주사하였다. 세포를 이식한 후 4주째에 심장 초음파 검사(echocardiography, ECHO)를 실시하였다.

그 결과, PBS 투여군과 비교하여 hASCs/GCP-2 세포를 주입한 군에서는 좌심실 이완기말 직경(LVEDD)(3.36 ± 0.47 vs. 3.94 ± 0.46mm; P=0.009)과 좌심실 수축기말 직경(LVESD)(2.02 ± 0.47 vs. 2.96 ± 0.41mm; P< 0.001) 값이 감소하는 것으로 나타났다.

또한, hASCs/GCP-2 세포를 주입한 군에서는 각각 hASCs, PBS, 및 GCP-2 중성화 항체 처리 hASCs/GCP-2 세포를 사용한 군 보다 좌심실 박출계수(LVEF) 값이 높게 측정되었다(72.2 ± 7.5 vs. 65.7 ± 3.5%; P=0.022, vs. 48.1 ± 5.0%; P<0.001, vs. 63.1 ± 8.3%; P=0.018). hASCs/GCP-2를 주입한 군은 상처부위가 아물어 면적이 감소되는 것을 측정하는 실험에서도 hASCs 혹은 PBS 주입 군과 비교하여 감소정도가 크게 측정되었다(도 5A).

또한, 경색부위의 경계면에서 혈관 조밀도(vascular density)는 hASCs/GCP-2세포를 주입했을 때, hASCs 혹은 PBS를 주입한 그룹보다 높은 값을 보였다(도 5B).

hASCs/GCP-2 세포를 주입했을 때 심장 회복에 대한 치료 기작을 분석하기 위하여, 우리는 저산소증으로 경색이 일어난 부위에서 세포 괴사 정도를 측정하였다. 사멸 세포(apoptotic cell)는 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTPbiotin nick end labelling) 분석을 이용하여 검출하였으며, 대조군과 hASCs/GCP-2 주입군을 3일에 걸쳐 측정하였다.

근육 액틴 단백질(muscle actin)을 염색(triple staining)해서, 사멸세포가 근세포(myocyte)임을 확인하였고, 대조군과 비교하여 hASCs/GCP-2 세포를 주입한 심장에 큰 차이가 있음을 관찰하였다(도 5C).

이러한 결과를 바탕으로, hASCs/GCP-2 세포가 심근경색으로 손상된 심근에 를 이식되어 사용되는 경우, 심장 보호효과(protective effect)가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 7. hASCs/GCP-2 세포 이식 후 혈관형성 인자 발현 분석

허혈성 심장에 hASCs/GCP-2를 이식한 후에 나타나는 cytokine 발현 변화를 관찰하기 위하여, 마우스에 심근경색을 일으켰다. 그 후 안락사를 실행하고 심장조직을 분리하였다. 그 결과, VEGF-A와 Ang(angiopoietin)-1의 발현 수준이 hASCs/GCP-2 세포를 주입한 군에서 hASCs 세포와 PBS를 주입한 군에 비해 크게 증가함을 확인할 수 있었다(도 5D).

실시예 8. hASCs/GCP-2 세포의 생착(engraftment) 및 혈관내피세포 전환분화(EC trans-differentiation) 분석

hASCs/GCP-2를 주사하였을 때, 생착(engraftment) 및 생존능(survival potentiai)을 평가하기 위하여, NOD/SCID 마우스를 사용하여 심근경색 모델(MI model)을 만들었다. 1 × 10⁶개의 Dil-표지 세포를 허혈성 심장의 가장자리로 주사하였다. 조직면역분석(immunohistochemistry)으로 확인 결과. hASCs 세포(84.1 ± 54.2)를 처리한 군과 비교하였을 때, hASCs/GCP-2 세포 처리군은 높은 생착율(152.3 ± 52.5)을 보였다(도 6A). 또한 이식된 세포의 생존율을 정량하기 위하여, 허혈성 심장을 효소 처리한 후 유세포 분석(flow cytometric analysis)을 실시하였다. 분석은 세포 이식 후 4주째에 실행하였다. 분석결과 hASCs/GCP-2(0.47±0.28)를 주입한 군에서 hASCs(0.12±0.19) 세포를 처리한 군보다 높은 이식률을 나타내었다.

다음으로 in vivo에서 hASCs/GCP-2 세포가 혈관내피세포로 분화하는 능력을 평가하기 위하여, 혈관내피세포 단백질 ILB4(isolectin B4)에 대하여 면역염색(immunostaining)을 실시하였다. Dil-표지 세포를 이식한 후 4주째에 Dil과 ILB4에 모두 양성인(double-positive) 세포를 관찰하였다. hASCs 세포를 처리한 군과 비교하여 hASCs/GCP-2 세포를 처리한 허혈성 심장에서 더 많은 수의 세포를 관찰할 수 있었다(4.8 ± 2.1 vs. 1.3 ± 1.2; P= 0.006, n=7)(도 6B).

또한, 삼차원 이미지(Three-dimensional z-stacked images)를 통하여 hASCs/GCP-2 세포가 혈관 구조에 들어가 있음을 확인하였고, 혈관내피세포 마커의 발현도 확인하였다. 이러한 결과는 hASCs/GCP-2 세포가 혈관내피세포로 분화했음을 보여준다(도 6C).

ILB4를 발현하는 세포가 실제로 이식된 hASCs/GCP-2 세포인지 확인하기 위하여, 인간 X 염색체(human X chromosome)를 이용한 FISH 분석을 실행하였다.

FISH 결과 ILB4 양성 세포가 기증자(human donor)의 것임을 확인함으로써, hASCs/GCP-2 세포가 혈관내피세포로 분화되었음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들을 통하여 hASCs/GCP-2 세포주(cell line)가 높은 생존율과 혈관내피세포로 분화하는 능력이 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

GCP-2(Granulocyte chemotactic protein-2) 유전자를 과발현하는 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ASCs) 또는 그 배양 배지(Conditioned media)의 약제학적 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ASCs)는 VEGF-A 및 HGF 유전자를 과발현하여 혈관형성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ASCs)는 IGF-1 및 Akt-1 유전자를 과발현하여 세포사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ASCs)는 eNOS, Tie-2, 및 vWF 유전자를 과발현하고, 혈관내피세포(endothelial cell)로 분화할 수 있는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ASCs)는 LVEDD(left ventricular end diastolic diameter) 및 LVESD(Left ventricular end systolic diameter) 값을 감소시키고, LVEF(Left ventricular ejection fraction) 값을 증가시키는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ASCs)는 허혈성 부위(ischemic area)의 혈관 밀집도(vascular density)를 증가시키는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 배지(Conditioned media)는 섬유아세포(fibroblasts)의 증식을 촉진하고, 섬유아세포(fibroblasts)의 상처 봉합을 촉진하며, 혈액 순환 속도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 허혈성 질환은 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 하지질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
GCP-2(Granulocyte chemotactic protein-2) 유전자를 과발현하는 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ASCs) 또는 그 배양 배지(Conditioned media)의 약제학적 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환의 치료방법.