KR20200013674A - 허혈 조직을 치료하는 방법 - Google Patents

허혈 조직을 치료하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200013674A
KR20200013674A KR1020197035559A KR20197035559A KR20200013674A KR 20200013674 A KR20200013674 A KR 20200013674A KR 1020197035559 A KR1020197035559 A KR 1020197035559A KR 20197035559 A KR20197035559 A KR 20197035559A KR 20200013674 A KR20200013674 A KR 20200013674A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
aav
subject
ser
selectin
cys
Prior art date
Application number
KR1020197035559A
Other languages
English (en)
Inventor
오마이다 벨라스케스
자오-준 리우
Original Assignee
유니버시티 오브 마이애미
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 오브 마이애미 filed Critical 유니버시티 오브 마이애미
Publication of KR20200013674A publication Critical patent/KR20200013674A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/7056—Lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C07K14/70564—Selectins, e.g. CD62
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/178—Lectin superfamily, e.g. selectins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
    • C12N15/8645—Adeno-associated virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/20—Animals treated with compounds which are neither proteins nor nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0375—Animal model for cardiovascular diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

본 발명은 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키며; 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 유도하며; 골격근 생존력을 증가시키며; 허혈성 피부 상처 치유를 촉진하며; 괴저를 치료하거나 예방하며; 및/또는 CLI를 치료하는 방법을 제공한다. 다양한 양태에서, 이러한 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV 혈청형 2(AAV2) 역방위 말단 반복부(ITR; inverted terminal repeat), 및 혈청형 2 이외의 AAV로부터의 캡시드를 포함하는 하이브리드 아데노연관 바이러스(AAV; adenoassociated virus)를 이러한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 이러한 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV2 ITR, 및 AAV2 캡시드를 포함하는 AAV를 포함하는 세포를 이러한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

Description

허혈 조직의 치료 방법
보조금 개시내용
본 발명은 미국 국립보건원/미국 국립 심장, 폐 및 혈액 연구원에 의해 수여받아 수여 번호 HHSN268201700008C 하에 정부 지원 하에 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 소정의 권리를 가진다.
전자 제출된 자료의 참조에 의한 통합
본 출원과 함께 동시에 제출되고 하기와 같이 식별되고, 2018년 5월 1일에 생성된 컴퓨터-판독 가능한 뉴클레오타이드/아미노산 서열 목록이 그 전문이 참조에 의해 통합되어 있다: 38,503 바이트 ACII(텍스트) 파일명 "51600A_SeqListing.txt".
기술분야
본 개시내용은 허혈 조직을 치료하기 위한 물질 및 방법에 관한 것이다.
중증 하지 허혈(CLI; critical limb ischemia)은 사지에 공급하는 동맥의 심각한 차단이고, 전신 아테롬성 동맥경화증에 의해 유발되는 진행 단계의 말초 동맥 질병(PAD; peripheral arterial disease)을 나타낸다. 아테롬성 동맥경화증에서, 지방 침착물(플라크(plaque))이 동맥벽에 축적되고, 혈액이 동맥을 통해 흐르는 것을 어렵게 만든다. 동맥의 아테롬성 동맥경화증-연관 폐색은 사지(다리, 발 및 손)로의 혈류를 두드러지게 감소시키고, 심한 통증, 피부 궤양, 상처(sore), 괴저 및/또는 조직 손실을 유발할 수 있다. 많은 환자들이 대절단의 매우 높은 위험에 있으며, 불량한 신체적 기능 및 심각하게 저하된 삶의 질을 경험한다. 특히, 당뇨병 환자에서 CLI는 이환율(morbidity) 및 사망률(mortality)의 높은 비율과 연관이 있다.
매년 미국에서 CLI를 갖는 대략 160,000명의 새로운 환자가 존재한다. PAD가 CLI 상태로 진전될 때 약리학적 치료는 상기 PAD의 결과에 대해 제한된 영향을 가졌다. 영향을 받는 사지로의 혈류를 향상시키는 데 목적을 둔 현재의 표준 CLI 치료법은 경피 경관 혈관성형술(PTA; percutaneous transluminal angioplasty) 및 스텐트 설치를 포함하여 막힌 혈관의 수술적 우회술(surgical bypass) 또는 혈관내 혈관재생(endovascular revascularization)(막힌 혈관의 재개방)이다. 그러나, 대략 20% 내지 40%의 환자가 특히 무릎 아래의 영역에서, 높은 수술적 위험, 혈관 차단의 높은 재발율 및 이식 실패율 또는 바람직하지 못한 혈관내 해부학적 상황으로 인해 이러한 개입에 적합하지 않다. 이들 환자는 종종 절단 이외의 '선택-없음(no-option)'을 가진다.
허혈을 앓고 있는 환자에게 실행 가능한 치료 대안을 제공하기 위해 새로운 효과적인 전략이 필요하다.
본 개시내용은 대상체의 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV 혈청형 2(AAV2) 역방위 말단 반복부(ITR; inverted terminal repeat), 및 혈청형 2 이외의 AAV로부터의 캡시드를 포함하는 하이브리드 아데노연관 바이러스(AAV; adenoassociated virus)를, 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 대상체의 허혈 조직에서 혈관신생(angiogeneis), 신혈관형성(neovascularization) 또는 혈관재생을 유도하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV2 ITR, 및 혈청형 2 이외의 AAV로부터의 캡시드를 포함하는 하이브리드 AAV를, 허혈 조직에서 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 유도하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 추가로, 대상체에서 골격근 생존력(viability)을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV2 ITR, 및 혈청형 2 이외의 AAV로부터의 캡시드를 포함하는 하이브리드 AAV를, 골격근 생존력을 증가시키기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 대상체에서 허혈성 피부 상처 치유를 촉진하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV2 ITR, 및 혈청형 2 이외의 AAV로부터의 캡시드를 포함하는 하이브리드 AAV를, 허혈성 피부 상처 치유를 촉진하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한, 대상체에서 괴저를 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV2 ITR, 및 혈청형 2 이외의 AAV로부터의 캡시드를 포함하는 하이브리드 AAV를, 대상체에서 괴저를 치료하거나 예방하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 대상체에서 중증 하지 허혈(CLI)을 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV2 ITR, 및 혈청형 2 이외의 AAV로부터의 캡시드를 포함하는 하이브리드 AAV를, CLI를 치료하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 부가적으로, 대상체의 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV2 ITR, 및 AAV2 캡시드를 포함하는 AAV를 포함하는 세포를, 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 대상체의 허혈 조직에서 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 유도하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV2 ITR, 및 AAV2 캡시드를 포함하는 AAV를 포함하는 세포를, 허혈 조직에서 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 유도하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
대상체에서 허혈성 피부 상처 치유를 촉진하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV2 ITR, 및 AAV2 캡시드를 포함하는 AAV를 포함하는 세포를, 허혈성 피부 상처 치유를 촉진하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 대상체에서 괴저를 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV2 ITR, 및 AAV2 캡시드를 포함하는 AAV를 포함하는 세포를, 대상체에서 괴저를 치료하거나 예방하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 대상체에서 중증 하지 허혈(CLI)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV2 ITR, 및 AAV2 캡시드를 포함하는 AAV를 포함하는 세포를, 대상체에서 CLI를 치료하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 요약은 본 발명의 모든 양태를 정의하고자 하는 것이 아니며, 부가적인 양태가 다른 섹션, 예컨대 상세한 설명에 기재되어 있다. 전체 문헌은 통합된 개시내용으로서 관련되고자 하고, 본원에 기재된 특징의 모든 조합은, 이러한 특징의 조합이 이 문헌의 동일한 문장, 단락 또는 섹션에서 함께 확인되지 않더라도, 고려되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명은 부가적인 양태로서, 상기에서 구체적으로 언급된 변화 이외의 임의의 방식으로 본 범위 내에서 더 좁은 본 발명의 모든 구현예를 포함한다. 단수형("a" 또는 "an")과 함께 기재되거나 청구된 본 발명의 양태와 관련하여, 문맥이 보다 제약된 의미를 분명하게 필요로 하지 않는 한, 이들 용어는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 세트 내에서 하나 이상으로서 기재된 요소와 관련하여, 상기 세트 내의 모든 조합이 고려되는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 양태가 특징을 "포함하는" 것으로 기재된다면, 구현예는 또한, 상기 특징"으로 구성되거나" 또는 상기 특징"으로 본질적으로 구성되는" 것으로 고려된다.
출원인(들)이 본원에 첨부된 청구항의 모든 범위를 발명하긴 하였지만, 이에 첨부된 청구항은 다른 이들의 선행 연구를 이들의 범위 내에 포괄하지 않는다. 따라서, 청구항의 범위 내에서 명시적인(statutory) 선행 기술이 특허청 또는 다른 엔터티나 개체에 의해 출원인의 관심을 받는 경우, 출원인(들)은, 이러한 명시적인 선행 기술 또는 명시적인 선행 기술의 명백한 변화를 이러한 청구항의 범위로부터 구체적으로 배제하기 위해 이러한 청구항의 주제를 재정의하고자 적용 가능한 특허법 하에 보정 권리를 실시할 권리를 보존한다. 이러한 보정된 청구항에 의해 정의된 본 발명의 변화 또한, 본 발명의 양태로서 의도된다. 본 발명의 부가적인 특징 및 변화는 본 출원의 전체로부터 당업자에게 명백해질 것이고, 이러한 모든 특징은 본 발명의 양태로서 의도된다.
도 1: 마우스 허혈성 사지 조직에서 조직 세포의 감염에서 다양한 하이브리드 AAV의 효율이다. 대퇴동맥 결찰술을 받은 FVB 마우스(n=3)에서 1 x 109 vg의 GFP/AAV2/2, GFP/AAV2/5, GFP/AAV2/8 및 GFP/AAV2/9를 내측 반막 슬괵근(medial semimembranous hamstring muscle) 내로 근육내 주사하였다. AAV 주사 후 7일째에 사지 조직을 수합하고, 면역형광 염색하였다. 1개 고출력 장(HPF; high power field, X 40; y-축) 당 GFP+ 세포의 수를 계수하였다. AAV2/8 및 AAV2/9는 조직 세포를 감염시키는 데 있어서 높은 효율을 나타내었다.
도 2: E-셀렉틴/AAV 유전자 치료법은 허혈성 사지에서 골격근 생존력을 향상시킨다. LacZ/AAV(좌측 상의 막대; x-축) 대(vs) E-셀렉틴/AAV(우측 상의 막대; x-축) 수술후 파버 허혈 점수(Postoperative Faber Ischemia Score)(y-축). LacZ/AAV n=7; E-셀렉틴/AAV n=10. 수술후(POD) 제1일(LacZ/AAV=2.57, E-셀렉틴/AAV=1.1): p=0.213; POD 2(LacZ/AAV=2.71, E-셀렉틴/AAV=1.4): p=0.253; POD 3(LacZ/AAV=3, E-셀렉틴/AAV=1.5): p=0.168; POD 7(LacZ/AAV=3.86, E-셀렉틴/AAV=1.9): *p=0.041; POD 14 (LacZ/AAV=5.29, E-셀렉틴/AAV=2.4): **p=0.009.
도 3: E-셀렉틴/AAV 유전자 치료법은 허혈성 사지 관류를 향상시킨다. LacZ/AAV 대 E-셀렉틴/AAV 레이저 도플러 이미징(LDI; Laser Doppler Imaging) 관류비. LacZ/AAV n=7; E-셀렉틴/AAV n=10. 수술전: p= 0.659; 수술후(POD) 제7일: p=0.066; POD 14: *p=0.008.
도 4: E-셀렉틴/AAV 유전자 치료법은 괴저 발(foot)에서 신혈관형성 및 발 관류를 향상시킨다. 결찰된 사지 및 비-결찰된 사지(x-축)에 대한 LacZ/AAV 대 E-셀렉틴/AAV 살아 있는 동물 Dil 관류 평균 강도 점수(y-축). LacZ/AAV: n=5; E-셀렉틴/AAV: n=5; 결찰된 사지(LacZ/AAV=22.1, E-셀렉틴/AAV=43.86): *p<0.027; 비-결찰된 사지(LacZ/AAV=26.7, E-셀렉틴/AAV=49.48): **p<0.005.
도 5: LacZ/AAV 결찰된 사지 대 E-셀렉틴 결찰된 사지(x-축)에서 더 높은 수의 근원섬유/hpf(y-축)이다; *p<0.0001. 1개 고출력 장(HPF) 당 근원섬유의 평균 수의 정량적 데이터는 LacZ 결찰된 사지와 비교하여 E-셀렉틴/AAV 결찰된 사지에서 유의하게 더 높은 수의 근원섬유를 실증한다.
도 6: POD 0-10(x-축)으로부터 상처 치유된 영역 퍼센트(y-축)를 실증하는 정량적 데이터이다. LacZ/AAV(하부 선): n=10; E-셀렉틴/AAV(상부 선): n=11. POD 0: p<0.000127; POD1: 0.000441; POD2: p<0.000189; POD3-10: p<0.0001.
도 7: AAV2 레플리카제(replicase) 및 AAV9 캡시드를 포함하는 하이브리드 AAV의 도식도이다.
도 8: 본 개시내용의 세포를 형질도입하는 데 사용된 AAV의 도식도이다.
도 9: L-NAME 치료받은 FVB 마우스에서 상지(high-limb) 괴저의 대표 이미지이다. 괴저를 갖는 허혈성 사지에 상자 표시하고, POD1 and POD3에서 괴저가 발병한 발가락을 적색 화살표로 표시한다.
도 10: 지시된 시점(수술전 및 수술후, POD 7 및 POD14)에서 E-셀렉틴/AAV2(상부 열(row)) 또는 LacZ/AAV2(하부 열)로 치료받은 마우스의 레이저 도플러 이미지이다.
도 11: 비결찰된 사지 또는 결찰된 사지를 갖는 LacZ/AAV-치료받은 마우스 또는 E-셀렉틴/AAV-치료받은 마우스의 이미지이다.
도 12a 및 도 12b: 10x 배율에서 E-셀렉틴/AAV 결찰된 사지 대 LacZ 결찰된 사지의 헤마톡실린 및 에오신 염색의 현미경 이미지이다.
도 13: E-셀렉틴/AAV 또는 LacZ/AAV로 치료받은 마우스의 지시된 시점에서의 상처의 이미지이다.
다양한 양태에서, 본 개시내용은 대상체의 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키며; 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 유도하며; 대상체(선택적으로 중증 하지 허혈(CLI)과 같은 허혈을 앓고 있거나 앓을 위험에 있는 대상체)에서 골격근 생존력을 증가시키며; 대상체에서 허혈성 피부 상처 치유를 촉진하며; 대상체에서 괴저를 치료하거나 예방하며; 및/또는 대상체에서 CLI를 치료하는 물질 및 방법에 관한 것이다. 다양한 양태에서, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV 혈청형 2(AAV2) 역방위 말단 반복부(ITR), 및 혈청형 2 이외의 AAV로부터의 캡시드를 포함하는 하이브리드 아데노연관 바이러스(AAV)를 유효량으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV2 ITR, 및 AAV2 캡시드를 포함하는 AAV를 포함하는 세포를, 요망되는 생물학적 반응을 달성하기에(즉, 허혈 조직에서 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 유도하는 등) 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 E-셀렉틴의 바이러스-매개 생성이 생체내에서 괴저의 증상을 개선함을 보여주는 최초의 개시내용이다.
본 발명의 양태는 하기에서 더 기재된다. 섹션 문두의 사용은 단지 읽기의 편의성을 위한 것이고, 그 자체로 제한하려는 것이 아니다. 전체 문헌은 통합된 개시내용으로서 여겨지고자 하고, 본원에 기재된 특징의 모든 조합이 고려되는 것으로 이해되어야 한다.
E-셀렉틴
E-셀렉틴은 내피 세포 상에서 전형적으로 발현되는 세포 접착 분자이다. E-셀렉션(selection)은 또한, CD62 항원-유사 과(family) 구성원 E(CD62E), 내피-백혈구 접착 분자 1(ELAM-1) 및 백혈구-내피 세포 접착 분자 2(LECAM2)로 공지되어 있다. 다양한 양태에서, E-셀렉틴은 네이티브(native) 인간 E-셀렉션이다. 이러한 측면에서, E-셀렉틴을 인코딩하는 핵산 서열은 선택적으로, 인간 E-셀렉틴 단백질을 인코딩하는 핵산 서열(즉, 기탁 번호 AAQ67702, NP_000441.2에 상응하는 서열 번호: 1의 E-셀렉틴 단백질)이다. 예시적인 양태에서, 핵산 서열은 성숙한 형태의 인간 E-셀렉틴을 인코딩하고, 신호 펩타이드 MIASQFLSALTLVLLIKESGA(서열 번호: 7)를 함유하지 않는다. 예시적인 양태에서, 핵산 서열은 서열 번호: 8의 성숙한 형태의 인간 E-셀렉틴을 인코딩한다. 다양한 구현예에서, 핵산 서열은 서열 번호: 1과 적어도 65%(예를 들어 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 99%)의 아미노산 서열 동일성을 공유하고, 네이티브 E-셀렉틴과 연관된 적어도 하나의 활성, 예컨대 EC-EPC 접착의 매개 또는 염증 부위에서 혈중 백혈구의 축적의 촉진을 실증하는 단백질을 인코딩한다. 다양한 양태에서, E-셀렉틴을 인코딩하는 핵산 서열은 기탁 번호 NM_000450에 상응하는 서열 번호: 2에 제시되어 있다. 인간 E-셀렉틴의 대립유전자 변이체 및 상동체(homolog)를 인코딩하는 핵산이 또한 고려되는 것으로 이해될 것이다. 다양한 구현예에서, 핵산 서열은 서열 번호: 2와 적어도 65%(예를 들어 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 99%) 동일하다. 요망된다면, 비-인간, 포유류 E-셀렉틴이 또한 사용될 수 있으며; 마우스 E-셀렉틴(GenBank 기탁 번호 AAA37577.1), 래트 E-셀렉틴(GenBank 기탁 번호 AAA41113.1), 개(canine) E-셀렉틴(GenBank 기탁 번호 AAA30843.1) 및 양 E-셀렉틴(GenBank 기탁 번호 NP_001009749.1)의 아미노산 서열은 각각 서열 번호: 3~6으로서 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, "적어도 90% 동일성" 및 유사한 용어는 예를 들어 90% 내지 100%, 예컨대 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 등으로부터의 임의의 정수를 포괄한다. 또한, 용어 "적어도 동일성 [퍼센트]"는, 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 수를 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 총 수로 나눈 값([적어도 퍼센트 동일성] x [동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 수] / [뉴클레오타이드 또는 아미노산의 총 수])보다 크거나 동일한 임의의 퍼센트를 포괄한다. 2개 이상의 서열의 정렬된 아미노산(또는 뉴클레오타이드)의 동일성 퍼센트의 계산은 당업계에서 잘 이해되고, 통상적으로, 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정된다. 예를 들어, 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 2개 이상의 서열의 정렬은 선택적으로, 미국 국립 생물공학 정보 센터 웹사이트 상에서 입수 가능한 BLAST(기본 국소 정렬 검색 툴(basic local alignment search tool)) 프로그램 내에 통합된 바와 같이 Altschul 등(문헌[Nucleic Acids Res., 25:3389-402 (1997)])에 의해 기재된 알고리즘을 사용하여 수행된다.
서열 번호: 1과 상이한 변이체 E-셀렉틴 단백질은 인코딩된 폴리펩타이드에서 변화를 유발하는 뉴클레오타이드 치환을 만듦으로써 발생될 수 있다. 치환의 예는 (a) 폴리펩타이드 백본의 구조; (b) 폴리펩타이드의 전하 또는 소수성; 또는 (c) 아미노산 측쇄의 벌크(bulk)에서 변화를 유발하는 것들이다. 다양한 양태에서, 변이체 E-셀렉틴은 하나 이상의 보존적 치환을 포함하며, 즉, 단백질의 적어도 하나의 아미노산은 유사한 특징을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환된다.
아데노-연관 바이러스
다양한 구현예에서, 본 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하이브리드 아데노연관 바이러스(AAV)를 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. "하이브리드 AAV"는 적어도 2개의 AAV 혈청형의 일부를 포함하는 AAV를 의미한다. 예시적인 양태에서, 하이브리드 AAV는 천연-발생이 아니고, 2개의 상이한 AAV 혈청형으로부터의 AAV의 일부를 포함하도록 조작된다. "하이브리드 AAV"는 문헌[Choi et al., Current Gene Ther 5(3): 299-310 (2005) 및 Wu et al., Mol Ther.14(3):316-27 (2006)]에 기재된 바와 같은 AAV 하이브리드 혈청형과 동의어이다. 예시적인 양태에서, 하이브리드 AAV는, 혈청형 2 이외의 AAV로부터의 캡시드에서 포장되는 바이러스 게놈에서 AAV2 ITR을 포함한다. AAV는 표적 세포에서 E-셀렉틴 생성을 매개한다. 다양한 양태에서, 본 방법은 AAV2 캡시드 내에 포장된, E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈 및 AAV2 ITR을 포함하는 AAV를 포함하는 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
AAV는 인간 질병을 유발하는 것으로 공지되지 않은 DNA 바이러스이며, 바람직한 유전자 치료법 옵션으로 되게 한다. AAV 게놈은 DNA 복제 및 바이러스 포장을 위한 인지 신호를 함유하는 2개의 유전자, rep 및 cap로 이루어지며, 이들 유전자의 측면에 역방위 말단 반복부(ITR)가 존재한다. AAV는 효율적인 복제를 위해 헬퍼 바이러스(즉, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스)에 의한 공동-감염 또는 헬퍼 유전자의 발현을 필요로 한다. 치료 핵산의 투여에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로, 결실된 대부분의 부모 게놈을 가지며, 따라서 ITR이 필요하지 않더라도 이것만 남아 있다. AAV rep 단백질의 전달은 요망된다면, AAV ITR을 포함하는 AAV 벡터가 게놈의 특이적인 영역 내로 통합되는 것을 가능하게 한다. 통합된 AAV 게놈을 포함하는 숙주 세포는 세포 성장 또는 형태에서 변화를 보여주지 않는다. 이와 같이, AAV 벡터로부터의 치료 인자의 연장된 발현은 지속적(persistent) 및 만성 질병을 치료하는 데 유용할 수 있다. 본 개시내용의 맥락에서 사용하기 위한 AAV는 AAV 유형 2를 기반으로 하고, 대상체 또는 세포에 전달되는 바이러스 게놈은 AAV2 ITR을 포함한다. 다른 AAV 혈청형은 AAV 유형 1, AAV 유형 3(유형 3A 및 3B 포함), AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10 또는 AAV 유형 11을 포함한다. AAV의 게놈 서열, 뿐만 아니라 ITR, Rep 단백질 및 캡시드 하위단위의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 국제 특허 공개 WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; 뿐만 아니라 미국 특허 6,156,303, 문헌[Srivistava et al. (1983) J Virol. 45:555; Chiorini et al (1998) J Virol. 71:6823; Xiao et al (1999) J Virol. 73:3994; Shade et al (1986) J Virol. 58:921; 및 Gao et al (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854]을 참조한다.
다양한 양태에서, AAV는 네이티브 AAV 게놈의 전부 또는 일부가 결여된 바이러스 게놈을 포함한다. 예를 들어, AAV 게놈은 모든 네이티브 AAV 단백질 코딩 서열이 결여되어 있으나, AAV ITR(예를 들어 AAV2 ITR)을 보유하고, E-셀렉틴을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
핵산 서열 및 AAV2 ITR을 포함하는 바이러스 게놈은 비리온 내에 혼입되어(즉, 바이러스 캡시드 내로 포장되어), 세포 내로의 게놈의 도입을 용이하게 할 수 있다. AAV 캡시드 단백질은 비리온의 외부, 비-핵산 부분으로 구성되고, AAV cap 유전자에 의해 인코딩된다. cap 유전자는, 비리온 조립에 필요한 3개의 바이러스 외피(coat) 단백질, VP1, VP2 및 VP3을 인코딩한다. AAV 비리온의 구축은 예를 들어 미국 특허 5,173,414; 5,139,941; 5,863,541; 5,869,305; 6,057,152; 및 6,376,237; 문헌[Rabinowitz et al., J. Virol. 76:791-801, 2002; 및 Bowles et al., J. Virol. 77:423-432, 2003]에 기재되어 있다.
다양한 구현예에서, AAV2 ITR을 포함하는 AAV 게놈은 혈청형 다른 AAV2로부터 유래된 캡시드 내로 포장된다. 이러한 AAV 벡터는 "위형(pseudotyped)" AAV 또는 "하이브리드" AAV로 지칭된다. AAV2 바이러스 게놈(E-셀렉틴을 인코딩하는 핵산 서열 및 AAV2 ITR을 포함함)은 선택적으로, AAV 유형 1, AAV 유형 3(유형 3A 및 3B 포함), AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10 또는 AAV 유형 11로부터의 캡시드 내로 포장된다. 다양한 양태에서, AAV2 바이러스 게놈은 AAV8 캡시드(AAV2/8) 또는 AAV9 캡시드(AAV2/9) 내로 포장된다. 위형 AAV의 구축 및 사용을 수반하는 기술은 예를 들어 문헌[Duan et al., J. Virol, 75:7662-7671, 2001; Halbert et al., J. Virol, 74:1524-1532, 2000; Zolotukhin et al, Methods, 28: 158-167, 2002; 및 Auricchio et al, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, 2001]에 더 기재되어 있다. 예시적인 양태에서, 본 개시내용의 하이브리드 AAV는 도 7에 제시된 요소를 포함한다. 예시적인 양태에서, 본 개시내용의 하이브리드 AAV는 도 7에 제시된 구조를 포함한다.
선택적으로, 바이러스 캡시드(즉, 입자 표면)는 바이러스 향성(tropism)을 조정하기 위해 변형된다. 예를 들어, 캡시드의 구성성분은 예를 들어, 생성된 벡터에 의해 형질도입된 세포의 유형을 팽창(expand)시키거나, 요망되지 않는 세포 유형의 (전체적인 또는 부분적인) 형질도입을 피하거나, 요망되는 세포 유형의 형질도입 효율을 (예를 들어 요망되는 세포 유형 상의 세포 표면 수용체에 대한 리간드를 혼입시킴으로써) 향상시키기 위해 변형될 수 있다. 형질도입 효율은 일반적으로, 대조군(즉, 비변형된, 매칭된 바이러스 벡터)을 참조로 결정된다. 형질도입 효율에서의 향상은 예를 들어, 주어진 세포 유형의 형질도입율에서 예를 들어 적어도 약 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 향상을 초래할 수 있다. 요망된다면, 캡시드는, 이러한 캡시드가 간 또는 생식 세포와 같은 비-표적 조직에 효율적으로 형질도입하지 않도록 변형될 수 있다(예를 들어 요망되는 표적 조직(들)의 형질도입 수준의 50% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하). 삽입 돌연변이체, 알라닌 스크리닝 돌연변이체 및 에피토프 태그 돌연변이체를 포함하여 AAV 캡시드 돌연변이체의 구축 및 특징화는 문헌[Wu et al, J. Virol. 74:8635-45, 2000]에 기재되어 있다. 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있는 다른 AAV는, 바이러스의 분자 육종(molecular breeding)에 의해서, 뿐만 아니라 엑손 셔플링에 의해서 발생되는 캡시드 하이브리드를 포함한다. 문헌[Soong et al, Nat. Genet. 25:436-439, 2000; 및 Kolman and Stemmer Nat. Biotechnol 19:423-428, 2001]을 참조한다.
상이한 혈청형의 AAV 벡터 및 AAV 단백질의 구축 및 용도는 문헌[Chao et al., Mol. Ther. 2:619-623, 2000; Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000; Xiao et al., J. Virol. 72:2224-2232, 1998; Halbert et al., J. Virol. 74:1524-1532, 2000; Halbert et al., J. Virol. 75:6615-6624, 2001; 및 Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, 2001]에서 고찰되고, 이들은 모두 특히 AAV 생성의 고찰에 관하여 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. AAV 벡터를 사용하는 방법은 또한, 예를 들어, 문헌[Tal, J., J. Biomed. Sci. 7:279-291, 2000 및 Monahan and Samulski, Gene delivery 7:24-30, 2000]에서 고찰된다.
발현 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 전형적으로, 작동적으로 연결된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 여러 가지 핵산 서열을 함유한다. 예를 들어, 발현 벡터는 복제 기원, 폴리아데닐화 신호, 내부 리보좀 진입 부위(IRES; internal ribosome entry site), 프로모터, 인핸서 등을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 AAV 벡터는 바람직하게는, E-셀렉틴 코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함한다. "작동적으로 연결된"은, 프로모터와 같은 조절 서열이 핵산 서열 상에서 이의 효과(예를 들어 전사의 개시)를 발휘하기 위해 또 다른 핵산 서열과 관련되어 올바른 위치 및 배향에 존재함을 의미한다. 프로모터는, 이러한 프로모터가 작동적으로 연결된 핵산 서열에 대해 네이티브 또는 비-네이티브이고, 특정 표적 세포 유형에 대해 네이티브 또는 비-네이티브일 수 있고, 다양한 양태에서 프로모터는 구성적(constitutive) 프로모터, 조직-특이적 프로모터 또는 유도적(inducible) 프로모터일 수 있다. 구성적 프로모터의 예는 단순 포진 바이러스 (HSV), 티미딘 키나제 (TK), 라우스 육종 바이러스(RSV), 시미안 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), Ad E1A 및 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 포함한다. 구성적 포유류 프로모터의 예는 β-액틴 프로모터에 의해 예시된 바와 같이 다양한 하우스키핑 유전자 프로모터를 포함한다. 유도적 프로모터 및/또는 제어 요소 또한, 본원에 기재된 방법에 사용하는 것으로 고려된다. 유도적 프로모터의 예는 시토크롬 P450 유전자, 열 충격 단백질 유전자, 메탈로티오네인(metallothionein) 유전자 및 호르몬-유도적 유전자와 같은 유전자로부터의 것들, 예컨대 에스트로겐 유전자 프로모터를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 유도적 프로모터의 또 다른 예는 테트라사이클린에 반응성인 tet 프로모터이다. 조직-특이적 프로모터 및/또는 제어 요소는 본원에 기재된 방법의 소정의 구현예에서 유용하다. 이러한 프로모터의 예는 Tie-2 또는 KDR 프로모터를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
E-셀렉틴을 생성하는 세포의 투여
일부 구현예에서, 본 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 AAV2 ITR을 포함하는 AAV를 포함하는 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. AAV는 세포에서 E-셀렉틴을 생성한다. 다양한 양태에서, AAV2 게놈은 AAV2 캡시드 내로 포장되지만, AAV2 ITR을 포함하는 AAV 게놈은 본원에서 추가로 기재된 바와 같이 다양한 구현예에서 비-AAV2 캡시드 내로 포장될 수 있다. 다양한 구현예에서, 세포는 줄기세포, 예컨대 간엽 줄기세포(MSC), 골수(BM)-유래 전구 세포, 또는 내피 전구 세포(EPC)이다. 세포는 대상체로부터 단리될 수 있거나(예를 들어 자가(자가)) 또는 상이한 공여자로부터 수합될 수 있다(즉, 동종이계(allogeneic)). "골수-유래 전구 세포" 및 "BM-유래 전구 세포"는, 골수 줄기세포 계통(lineage)으로부터 기원하는 전구 세포를 의미한다. 세포는 또한, 골원성(osteogenic), 근원성(myogenic), 지방생성(adipogenic) 및 연골발생성(chondrogenic) 분화를 할 수 있는, 골수에서 확인되는 간엽 줄기세포(MSC), 배아-유사 세포일 수 있다.
다양한 양태에서, 세포는 내피 전구 세포(EPC)이다. "전구 세포", "내피 전구 세포" 또는 "EPC"란, 분화 및 증식에 의해 완전히 분화된, 기능적 자손을 발생시키는 능력을 가진 임의의 체세포를 의미한다. 또 다른 구현예에서, 전구 세포는 비제한적으로 혈액, 신경, 근육, 피부, 소화관, 뼈, 신장, 간, 췌장, 흉선 등을 포함하여 임의의 조직 또는 기관계로부터의 전구체를 포함한다. 전구 세포는, 증식하는, 즉, 자가-복제하는 능력을 갖고 있을 수 있거나 갖고 있지 않을 수 있지만 정상적인 생리학적 조건 하에 상이한 세포 유형으로 추가의 분화를 받을 수 없는 세포인 "분화된 세포"로부터 구별된다. 전구 세포는 추가로, 증식하지만(자가-복제하지만) 일반적으로 미성숙하거나 미분화된 것으로 보임에도 불구하고 추가로 분화하지 않는 비정상적인 세포, 예컨대 암세포, 특히 백혈병 세포로부터 구별된다.
"전능성(totipotent)" 세포는 미결정(uncommitted) 전구 세포, 예컨대 배아 줄기세포이며, 즉, 모든 유형의 성숙한 세포를 발생시키는 데 필요하기도 하고 충분하기도 하다. 모든 췌장 세포 계통을 발생시키는 능력을 보유하지만 자가-재생(self-renew)할 수 없는 전구 세포는 "만능성(pluripotent)"으로 지칭된다. 또 다른 구현예에서, 모두는 아니지만 일부 내피 계통을 생성할 수 있고 자가-재생할 수 없는 세포는 "다능성(multipotent)"으로 지칭된다.
공여자 줄기세포를 단리하고 이러한 단리된 세포를 이식하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 표적 조직 또는 세포(예를 들어 BM-유래 EPC)는 숙주로부터 수합되고, 감염을 촉진하는 조건 하에 본원에 기재된 AAV 비리온에 노출되어, 이로써 E-셀렉틴-인코딩 핵산을 세포 내로 도입한다. 그 후에, 이들 유전적으로 변형된 세포를 대상체 내로 이식한다. 정맥내 주사, 복강내 주사, 또는 표적 조직 내로의 인 시추(in situ) 주사를 포함하여 몇몇 접근법이 세포를 대상체 내로 도입하는 데 사용될 수 있다. AAV에 의해 형질도입되거나 감염된 세포의 마이크로캡슐화(microencapsulation)가 또한, 고려된다. 자기 세포 이식과 동종이계 세포 이식 둘 모두가 본 개시내용의 방법의 맥락에서 고려된다.
치료 방법; 용도
다양한 양태에서, 본 개시내용은 대상체의 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키는 물질 및 방법에 관한 것이다. "허혈"은 전형적으로 동맥혈 공급의 폐색 또는 부적절한 혈류의 결과 저산소성으로 된(즉, 충분한 산소가 결여된) 조직을 지칭한다. 다양한 양태에서, 허혈 조직은 근육 조직(골격근 또는 심장근)이지만, 망막, 지방(adipose), 간, 신장, 폐, 위장관, 췌장, 담낭, 방광, 중추신경 조직 및 피부와 같은 다른 조직이 또한 고려된다.
AAV 또는 세포는 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키기에 효과적인 양으로 투여된다. 관류 또는 혈류에서 임의의 증가는 대상체에게 이득을 제공하는 것으로 이해될 것이다. 조직에서 혈류 또는 관류는 예를 들어, 도플러 이미징, 양전자 방출 단층촬영(PET; positron emission tomography), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT; single photon emission computed tomography), 자기 영상 이미징(MRI; magnetic resonance imaging) 또는 조영-증강 컴퓨터 단층촬영(CT; contrast-enhanced computed tomography)을 사용하여 검사될 수 있다. 예를 들어, 99mTc-세스타미비(sestamibi) SPECT는 부하기 총 점수(summed stress score)를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 상기 점수는 부하-후 이미지(post-stress image)에 의해 수득된 20개 분절의 저관류의 중증도 점수(severity score)의 합계를 냄으로써 수득된 관류의 반정량적 측정값이다. 중증도 채점은 하기와 같이 정의된다: 0=정상적인 흡수, 1=경미하게 감소되거나 모호한 흡수, 2=중간 정도로 감소된 흡수, 3=심각하게 감소된 흡수, 및 4=흡수 부재. 대안적으로, 관류는 측정되는 조직의 체적 내에서 적혈구의 평균 속도 및 농도의 생성물로서 특징화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증가" 및 이로부터 나온 단어는 100% 또는 완전한 증가가 아닐 수 있다. 그보다는, 당업자가 잠재적인 이득 또는 치료 효과를 갖는 것으로 인지하는 증가의 정도는 다양하게 존재한다. 이러한 측면에서, 본 개시내용의 하이브리드 AAV 또는 세포는 혈류 또는 관류를 임의의 양 또는 수준까지 증가시킬 수 있다. 예시적인 구현예에서, 본 개시내용의 방법에 의해 제공되는 증가는 적어도 또는 약 10% 증가(예를 들어 적어도 또는 약 20% 증가, 적어도 또는 약 30% 증가, 적어도 또는 약 40% 증가, 적어도 또는 약 50% 증가, 적어도 또는 약 60% 증가, 적어도 또는 약 70% 증가, 적어도 또는 약 80% 증가, 적어도 또는 약 90% 증가, 적어도 또는 약 95% 증가, 적어도 또는 약 98% 증가)이다.
혈류 또는 관류를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 허혈성 사지 관류는 예를 들어, 레이저 도플러 이미징(LDI), 예컨대 본원의 실시예에 기재된 LDI에 의해 측정될 수 있다. 혈류 또는 관류를 측정하는 다른 검정법은 체적 변동 기록법(plethysmogrpahy), 염료 또는 열 확산, 조영 초음파, PET 이미징, 전자기 유동 프로브(electromagnetic flow probe), 비디오 현미경, 근적외선 분광법, 표지된 미소구체, 미소투석법(microdialysis), 확산 상관 분광법(DCS; diffuse correlation spectroscopy), 동맥 스핀-표지 MRI, 제논-CT 및 도플러 초음파를 포함하며, 이는 문헌[Mesquita et al., Philos Trans A Math Phys Eng Sci. 369(1955): 4390-4406 (2011) 및 Barrett and Rattigan, Diabetes.61(11): 2661-2668 (2012)]에 기재되어 있다.
다양한 양태에서, 본 개시내용은 허혈 조직에서 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 유도하는 물질 및 방법에 관한 것이다. 신혈관형성은 새로운 혈관의 형성이다. "혈관재생"은 허혈을 앓은 신체 부분 또는 기관으로의 관류의 복구이다. 혈관신생은 기존의 혈관으로부터 기원하는 새로운 혈관의 성장(즉, 기존의 혈관으로부터의 모세혈관 버드(capillary bud)의 성장)이다. 혈관신생은 적어도 하나의 구현예에서, 상처의 인접한 성숙 혈관 네트워크의 거주 내피 세포가 증식하는 과정을 지칭하고, 다른 구현예에서, 초기에 무혈관(avascular) 상처 조직 내로 성장하는 신혈관 내로 이동하고 재건되는 과정을 지칭한다. 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 "유도하는" 것은, 새로운 혈관의 형성 및/또는 품질을 돕는 것을 포함한다. 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생이 발생하지 않고 있다면, 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생이 개시될 수 있으며; 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생이 이미 발생하고 있다면, 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생은 증강되거나 고조될 수 있다. 이러한 양태에서, AAV 또는 세포는 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 유도하기에 효과적인 양으로 투여된다. 혈관신생 또는 신혈관형성은 비-분지형 혈관 분절의 수(1 단위 면적 당 분절의 수), 기능적 혈관 밀도(1 단위 면적 당 관류된 혈관의 총 길이), 및/또는 혈관 체적 밀도(1 단위 면적 당 각각의 분절의 길이 및 직경을 기준으로 하여 계산된 총 혈관 체적)를 측정함으로써 검출되고/되거나 특징화될 수 있다.
본 방법의 다양한 양태는 E-셀렉틴을 예를 들어 골격근 및 심장 조직을 포함하여 여러 가지 조직에 전달하는 데 사용될 수 있다. 상기 방법은 많은 질병 및 병의 검색 또는 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 허혈 조직에서 신혈관형성 또는 혈관신생을 촉진하는 방법은 말초 혈관 질병, 장간막 허혈, 뇌혈관 허혈, 허혈로 인한 근육 소모(muscle wasting), 또는 수술적 시술과 연관된 합병증(예를 들어 피부 및/또는 근육판(muscle flap)의 치유 또는 재부착)을 연구하거나 (치료적으로 또는 예방적으로) 치료하는 데 사용될 수 있다.
다양한 양태에서, 본 개시내용은 대상체(예를 들어 선택적으로 허혈, 예컨대 중증 하지 허혈(CLI)을 앓고 있거나 앓을 위험에 있는 대상체)에서 골격근 생존력을 증가시키는 물질 및 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 하이브리드 AAV 또는 세포는 골격근 생존력을 임의의 양 또는 수준까지 증가시킬 수 있다. 예시적인 구현예에서, 본 개시내용의 방법에 의해 제공되는 증가는 적어도 또는 약 10% 증가(예를 들어 적어도 또는 약 20% 증가, 적어도 또는 약 30% 증가, 적어도 또는 약 40% 증가, 적어도 또는 약 50% 증가, 적어도 또는 약 60% 증가, 적어도 또는 약 70% 증가, 적어도 또는 약 80% 증가, 적어도 또는 약 90% 증가, 적어도 또는 약 95% 증가, 적어도 또는 약 98% 증가)이다. 골격근 생존력을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색된 슬라이드에서 (1개 고출력 장 당) 근육 세포의 수를 계수하는 단계를 포함한다. 하기 실시예를 참조한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 허혈성 피부 상처 치유를 촉진하는 물질 및 방법에 관한 것이다. "허혈성 피부 상처 치유를 촉진하는 것"은 본 개시내용의 다양한 양태에서, 상처 크기의 축소, 염증의 해소(resolution), 괴사 조직 형성의 저해, 기저 피부 매트릭스의 수선(repair), 및 재-상피화(re-epithelialization)를 포괄한다. 상처 및 상처 치유의 진전은 현미경 및 소정의 기간에 걸쳐 촬영된 사진의 검사에 의해 결정될 수 있다. LDI는 허혈성 상처 치유를 측정하는 예시적인 방법이다. 상처를 연구하는 데 유용한 이미지 분석기가 입수 가능하다(예를 들어 AlphaEase FC 버전 4.1.0, Alpha Innotech Corporation). 다양한 양태에서, 상기 방법은 상처 재-상피화를 촉진한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 괴저를 치료하거나 예방하는 물질 및 방법에 관한 것이다. 괴저는 불충분한 혈액 공급에 의해 유발되는 괴사의 유형이다. 괴저는 혈액 순환에 악영향을 주는 손상, 감염 또는 만성 질환의 결과로서 발생할 수 있다. 괴저의 위험에 있는 대상체는 감염, 당뇨병, 순환/혈관 질병 또는 심각한 손상을 앓고 있는 대상체를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 상이한 유형의 괴저는 증상을 기반으로 분류되고, 예를 들어 건성 괴저(건조하며, 쪼글쪼글하고 탈색된 피부를 특징으로 함), 습식 괴저(박테리아 감염과 연관있고, 종종 부기(swelling) 또는 물집과 연관있음), 가스 괴저(전형적으로 심부 근육 조직에 영향을 주고 가스 물집을 초래함), 내부 괴저(internal gangrene)(하나 이상의 기관에 영향을 줌), 및 괴사 근막염(necrotizing fasciitis)(살을 파먹는 미생물에 의해 유발됨)을 포함한다. 다양한 양태에서, 괴저는 사지(extremity)(예를 들어 발가락, 발, 다리, 손가락 또는 팔)에 존재한다. 괴저의 발생 및 진전은 시각적 조사, 사진 촬영, X-선, 컴퓨터 단층촬영(CT), 자기 영상 이미징(MRI), 동맥 조영도(arteriogram)(또는 혈관을 시각화하는 데 사용되는 다른 이미징 검정법), 및/또는 조직 배양 또는 생검에 의해 평가될 수 있다. 괴저는 또한, 변형된 타를로브 허혈 척도(modified Tarlov ischemia scale)를 사용하여 특징화될 수 있으며, 여기서, 레이저 도플러 이미징(LDI)이 선택적으로 이용된다.
다양한 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 CLI를 치료하는 물질 및 방법에 관한 것이다. 중증 하지 허혈은 예를 들어, 동맥이 하지(lower leg), 발목 및 발가락에 충분한 혈류를 전달하지 못해서 발생한다. CLI는 지속적인, 재발성 휴식통(rest pain)(예를 들어 발 볼 및 발가락에서 타는 듯한 통증), 궤양, 및 괴저를 유발할 수 있다. CLI는 예를 들어, 발에서 낮은 맥박(pulse) 또는 맥박의 결여, 낮은 발목 상완 지수(ABI(ankle brachial index), 발목에서의 혈압 <0.4), 발가락에서 감소된 혈압(<30 mm Hg), 감소된 경피 산소, 및/또는 근육 소모에 의해 두드러진다. CLI는 (비제한적으로) 도플러 이미징, 혈압측정띠(blood pressure cuff), 플로우레세인 혈관조영술(flourescein angiography), TCOM(경피 산소 측정), 및/또는 기능성 평가(근육 강도, 보행 시험, 통증 평가)를 포함하여 많은 방식 중 임의의 방식을 사용하여 평가된다. 다양한 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기재된 CLI 매개변수 중 임의의 하나 이상을 향상시킨다.
치료나 예방이 필요한 대상체에서 장애 또는 질환을 치료하거나(즉, 감소시키거나, 덜어주거나, 억제하거나 경감시키거나) 예방하는 데 있어서의 효능은 상기 기재된 방법을 포함하여 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정된다. "치료"는 대상체에서 장애의 100% 소멸(abolition)을 필요로 하지 않는다. 증상에서의 임의의 저하는 대상체에서 유익한 생물학적 효과를 이룬다. 다양한 양태에서, 본 방법은 통증의 중증도(이들 질환에 일반적으로 사용되는 다른 약물 및/또는 치료법에 대한 필요성 및/또는 이들의 양(예를 들어 이것들에의 노출)을 감소시키는 것을 포함할 수 있음), 기간 및/또는 빈도를 감소시킨다. "예방"은 장애 또는 질환의 시작의 완전한 배제를 필요로 하지 않으며; 장애 또는 연관된 증상의 시작의 임의의 약화(dampening) 또는 지연이 고려된다.
본원에 기재된 임의의 매개변수에 대해, 본 방법으로 인한 치료 효과는 예를 들어 기준선 값을 추적조사 값과 비교함으로써 확정될 수 있다. "기준선 값"이란, 본 방법에 따른 치료 이전에 기록된, 기준선 연구에서 수행된 각각의 매개변수에 대해 결정된 값을 의미한다. "추적조사 값"이란, 치료 후 적절한 시간(예를 들어 치료-후 1주, 6주, 12주, 26주, 36주, 48주 또는 52주째)에 기록된, 기준선 연구에서와 동일한 매개변수(들)에 대해 결정된 값을 의미한다. 전형적으로, 다수의 추적조사 평가가 수행되고, 따라서 동일한 매개변수에 대해 다수의 추적조사 값이 치료-후 상이한 시점에서 확정된다.
나아가, 본 개시내용은 대상체의 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키며; 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 유도하며; 대상체(선택적으로 허혈, 예컨대 중증 하지 허혈(CLI)을 앓고 있거나 앓을 위험에 있는 대상체)에서 골격근 생존력을 증가시키며; 대상체에서 허혈성 피부 상처 치유를 촉진하며; 대상체에서 괴저를 치료하거나 예방하며; 및/또는 대상체에서 CLI를 치료하는 데 있어서, AAV2 ITR 및 E-셀렉틴을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터의 용도를 제공한다. 또한, 대상체의 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키며; 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 유도하며; 대상체(선택적으로 허혈, 예컨대 중증 하지 허혈(CLI)을 앓고 있거나 앓을 위험에 있는 대상체)에서 골격근 생존력을 증가시키며; 대상체에서 허혈성 피부 상처 치유를 촉진하며; 대상체에서 괴저를 치료하거나 예방하며; 및/또는 대상체에서 CLI를 치료하기 위한 약제의 제조에서, AAV2 ITR 및 E-셀렉틴을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터의 용도가 제공된다.
또한, 대상체의 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키며; 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 유도하며; 대상체(선택적으로 허혈, 예컨대 중증 하지 허혈(CLI)을 앓고 있거나 앓을 위험에 있는 대상체)에서 골격근 생존력을 증가시키며; 대상체에서 허혈성 피부 상처 치유를 촉진하며; 대상체에서 괴저를 치료하거나 예방하며; 및/또는 대상체에서 CLI를 치료하는 데 있어서, AAV2 캡시드(또는 위형) 내로 포장된, AAV2 ITR 및 E-셀렉틴을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 AAV를 포함하는 세포의 용도가 제공된다. 또한, 대상체의 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키며; 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 유도하며; 대상체(선택적으로 허혈, 예컨대 중증 하지 허혈(CLI)을 앓고 있거나 앓을 위험에 있는 대상체)에서 골격근 생존력을 증가시키며; 대상체에서 허혈성 피부 상처 치유를 촉진하며; 대상체에서 괴저를 치료하거나 예방하며; 및/또는 대상체에서 CLI를 치료하기 위한 약제의 제조에서, AAV2 캡시드(또는 위형) 내로 포장된, AAV2 ITR 및 E-셀렉틴을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 AAV를 포함하는 세포의 용도가 제공된다.
본 개시내용의 방법의 대상체는 포유류, 예컨대 인간, 래트, 마우스, 고양이, 개, 염소, 양, 말, 원숭이, 유인원, 토끼, 소 등일 수 있다. 대상체(예를 들어 포유류)는 성인 또는 청소년을 포함하여 임의의 발달 단계에 있을 수 있다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다. 본원에 기재된 방법은 일반적으로, 치료적 유효량의 본원에 기재된 조성물을 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어 동물, 인간)에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 치료는 질병, 장애 또는 이의 증상을 앓고 있거나, 갖고 있거나, 이에 취약하거나, 이에 대한 위험에 있는 대상체, 특히 인간에게 적합하게 투여될 것이다. "위험에 있는" 대상체의 결정은 진단 시험 또는 대상체나 의료인의 의견에 의한 임의의 객관적인 또는 주관적인 결정에 의해 이루어질 수 있다. 다양한 양태에서, 대상체는 중증 하지 허혈(CLI)을 가진다(또는 이의 위험에 있음). 다양한 양태에서, 대상체는 말초 동맥 질병(PAD)을 가진다(또는 이의 위험에 있음). PAD는 예를 들어 지방, 콜레스테롤, 섬유성 조직, 칼슘 및 다른 혈액 구성성분으로 이루어진 플라크에 의해 종종 유발되는, 다리, 위, 팔 및 머리로 가는 말초 동맥의 협소화를 특징으로 한다. PAD의 보편적인 증상은 파행(claudication)(걸을 때의 다리 통증), 사지 약화(extremity weakness), 사지에서의 냉감(cold sensation), 및 변색을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. PAD는 예를 들어 도플러 초음파 및 혈관조영술을 사용하여 평가된다.
제제, 용량, 투여 요법
다양한 양태에서, AAV 또는 세포는 생리학적으로-허용 가능한(즉, 약리학적으로-허용 가능한) 담체, 완충제, 부형제 또는 희석제를 포함하는 조성물(예를 들어 약제학적 조성물)에 제공된다. 임의의 적합한 생리학적으로-허용 가능한(예를 들어 약제학적으로 허용 가능한) 담체는 본 개시내용의 맥락 내에서 사용될 수 있고, 이러한 담체는 당업계에 잘 공지되어 있다. 담체의 선택은 부분적으로는, 조성물이 투여되는 특정 부위 및 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 것이다. 상기 조성물은 또한, 예를 들어 숙주 세포 내로의 AAV의 흡수를 용이하게 하는 작용제를 포함할 수 있다. 적합한 조성물 제제는 수성 및 비-수성 용액, 항산화제, 완충제, 세균 발육 저지제, 및 제제를 혈액과 등장성으로 만들어주는 용질을 함유할 수 있는 등장성 멸균액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다.
조성물은 국소 투여용으로(예를 들어 에어로졸, 크림, 폼, 젤, 액체, 연고, 페이스트, 분말, 샴푸, 스프레이, 패치, 디스크 또는 드레싱의 형태로) 제제화될 수 있다. "패치"는 전형적으로, 본원에 제공된 조성물 및 피복층(covering layer)을 적어도 포함하고, 따라서 상기 패치는 치료받는 피부의 영역에 걸쳐 놓일 수 있다. 패치는 각질층을 통하여 표피(epidermis) 또는 진피(dermis) 내로의 본원에 제공된 조성물의 전달을 최대화하며, 지체 시간을 감소시키고, 균일한 흡수를 촉진하며, 기계적 럽-오프(rub-off)를 감소시키도록 설계될 수 있다.
상기 조성물은 단위-용량 또는 다중-용량 밀봉된 용기, 예컨대 앰플 및 바이얼에 존재할 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 물의 첨가만을 필요로 하는 냉동-건조된(동결건조된) 조건에서 저장될 수 있다. 일 양태에서, AAV 또는 AAV를 포함하는 세포를 포함하는 조성물은 상기 조성물의 사용에 관한 설명서를 제공하는 포장 물질과 함께 용기 내에(즉, 키트 내에) 놓인다. 일반적으로, 이러한 설명서는 시약 농도, 뿐만 아니라 소정의 구현예에서 조성물을 재구성하는 데 필요할 수 있는 부형제 성분 또는 희석제(예를 들어 물, 식염수 또는 PBS)의 상대량을 설명하는 실체적인 표현을 포함한다.
AAV 또는 세포는 대상체에게 어느 정도의 향상 또는 이득을 제공하기에, 예를 들어 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키기에; 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 유도하기에; 골격근 생존력을 증가시키기에; 허혈성 피부 상처 치유를 촉진하기에; 괴저를 치료하거나 예방하기에; 및/또는 CLI를 치료하기에 충분한 양 및 위치에서 투여된다. 상황에 따라, AAV 또는 세포를 포함하는 조성물은 체강 내로 적용되거나 주입되며, 표적 조직에 직접적으로 적용되며, 및/또는 순환 내로 도입된다. 예를 들어, 다양한 상황에서, 조성물을 정맥내, 복강내, 뇌내(뇌실질내), 근육내, 안내(intra-ocular), 동맥내, 간문맥내(intraportal), 병변내, 수내(intramedullary), 경막내(intrathecal), 뇌실내(intraventricular), 피내(intradermal), 관절내, 신경세포내(intraneuronal), 신경절내(intraganglion), 신경절주위(periganglion), 경피, 피하, 비내, 흡입(예를 들어 상기도(upper airway) 및/또는 하기도(lower airway)), 경관(enteral), 경막외(epidural), 요도(urethral), 질(vaginal) 또는 직장(rectal) 수단에 의해 전달하는 것이 바람직할 것이다. 요망된다면, AAV 또는 세포는 관심 영역에 공급하는 근육내, 경피 또는 피하 투여, 또는 동맥내 또는 정맥내 투여를 통해 국지적으로 투여된다. 바람직한 구현예에서, AAV 또는 세포는 골격근에서 허혈 조직에 근육내 투여된다.
대안적으로, 조성물은 막, 스펀지, 캡슐 또는 또 다른 적절한 물질의 이식을 통해 국소적으로 투여되며, 상기 물질 상으로 상기 조성물이 흡수되거나 캡슐화되었다. 이식 장치가 사용되는 경우, 상기 장치는 일 양태에서 적합한 조직 내로 이식되고, 조작된 세포에 의해 생성된 AAV 또는 E-셀렉틴의 전달은 예를 들어 확산, 시간-방출 볼루스(timed-release bolus) 또는 연속 투여를 통한 것이다.
특정 대상체에 대한 특정 투여 요법은 부분적으로는, 투여되는 치료제의 양, 투여 경로, 및 임의의 부작용의 유발 및 정도에 의존할 것이다. 본 개시내용에 따라 대상체(예를 들어 포유류, 예컨대 인간)에게 투여되는 양은 합리적인 기간에 걸쳐 요망되는 반응에 영향을 주기에 충분해야 한다.
게놈에서 바이러스 입자의 예시적인 용량은 104 내지 1015 형질도입 단위(transducing unit)(예를 들어 107 내지 1012 형질도입 단위), 또는 적어도 약 105, 적어도 약 106, 적어도 약 107, 적어도 약 108, 적어도 약 109, 적어도 약 1010, 적어도 약 1011, 적어도 약 1012, 적어도 약 1013, 적어도 약 1014, 또는 적어도 약 1015 형질도입 단위(예를 들어 적어도 약 107, 적어도 약 108, 적어도 약 109, 적어도 약 1010, 적어도 약 1011, 적어도 약 1012, 적어도 약 1013 또는 적어도 약 1014 형질도입 단위, 예컨대 약 1010 또는 1012 형질도입 단위)의 역가(titer)와 맞먹는다. 예시적인 양태에서, 시험관내에서 형질도입된 세포 1개 당 바이러스 입자(VP)의 용량은 약 103 내지 약 1012 내에 있다. 일부 양태에서, 시험관내에서 형질도입된 세포 1개 당 바이러스 입자의 용량은 약 104 내지 약 108, 또는 약 104 내지 약 106 내에 있다. 예를 들어, 시험관내에서 형질도입된 세포 1개 당 바이러스 입자의 용량은 105 VP/세포이다. 일부 질환은 연장된 치료를 필요로 하며, 이러한 치료는 시간에 걸쳐 다수의 투여를 수반할 수 있거나 수반하지 않을 수 있다.
예시적인 양태에서, 대상체에게 (예를 들어 근육내 주사를 통해) 투여되는 하이브리드 AAV의 용량은 약 50 내지 약 5000 μl 하이브리드 AAV이며, 여기서, 하이브리드 AAV의 농도는 약 108 또는 1016 VP/ml 내에 있다. 예시적인 양태에서, 대상체에게 (예를 들어 근육내 주사를 통해) 투여되는 하이브리드 AAV의 용량은 약 50 내지 약 500 μl 하이브리드 AAV이며, 여기서, 하이브리드 AAV의 농도는 약 1010 또는 1014 VP/ml 내에 있다. 예시적인 양태에서, 대상체에게 (예를 들어 근육내 주사를 통해) 투여되는 하이브리드 AAV의 용량은 약 75 내지 약 200 μl 하이브리드 AAV이며, 여기서, 하이브리드 AAV의 농도는 약 1012 VP/ml이다.
적절하다면, AAV 또는 세포는 부가적인(또는 증가된) 생물학적 효과를 달성하기 위해 다른 성분(예를 들어 치료제) 및/또는 다른 치료 양식(modality)과 조합되어 투여된다. 이러한 양태는 AAV 또는 세포 및 하나 이상의 부가적으로 적합한 작용제(들)의 공존(concurrent) 투여(즉, 실질적으로 동시적인 투여) 및 비-공존(non-concurrent) 투여(즉, 중복되거나 중복되지 않든지 간에 임의의 순서로 상이한 시기에서의 투여)를 포함한다. 소정의 양태에서, 상이한 구성성분은 동일한 조성물에서 또는 별개의 조성물에서, 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여되는 것으로 이해될 것이다.
본 개시내용의 추가의 양태에 따르면, AAV 또는 세포는 선택적으로, 허혈의 증상 또는 원인을 치료하는 데 유용한 하나 이상의 작용제와 조합되어 별개로, 순차적으로 또는 동시적으로 투여된다. 대표적인 작용제는 아스피린, 니트레이트, 베타 차단제, 칼슘 채널 차단제, 콜레스테롤-저하 의약, 안지오텐신-전환 효소(ACE) 저해제, 라놀라진(ranolazine), 항응고제, 혈전용해제(조직 플라스미노겐 활성제(tPA), 스트렙토키나제 또는 유로키나제), 항생제를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 개시내용의 추가의 양태에 따르면, AAV 또는 세포는 선택적으로, 통증 관리에 유용한 하나 이상의 작용제와 조합되어 별도로, 순차적으로 또는 동시적으로 투여된다. 추가의 작용제의 예는 오피오이드 진통제(예를 들어 모르핀, 하이드로모르폰, 옥시모르폰, 펜타닐, 코데인, 디하이드로코데인, 옥시코돈 또는 하이드로코돈); 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID)(예를 들어 아스피린, 디클로페낙(diclofenac), 이부프로펜, 나프록센, 옥사프로진(oxaprozin) 또는 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 저해제); 진정제(예를 들어 바르비투레이트 진정제); 마취제; 및 코티코스테로이드(예를 들어 덱사메타손)를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
BM 구획으로부터 비-BM 구획(예를 들어 표적 조직)으로의 BM-유래 줄기세포의 동원을 촉진하는 것이 바람직한 경우에, BM-유래 전구 세포의 동원을 촉진할 수 있는 작용제가 또한 대상체에게 조성물의 일부로서 또는 치료 요법의 일부로서 별도로 제공된다. 많은 이러한 작용제가 공지되어 있고, 예를 들어 인테그린, 접착 분자의 셀렉틴 과(family), VCAM-I, 및 콜로니 자극 인자를 포함한다. 적합한 작용제는 예를 들어 국제 특허 공개 WO 00/50048에 더 기재되어 있다.
본 개시내용의 방법은 선택적으로, 미세혈관계가 약화되고 있는 상황에서 상처 치유를 자극하는 데 사용되는 보조(adjunctive) 치료법, 고압 산소 치료법(HBO2)을 포함하는 치료 요법의 일부이다. HBO2를 수반하는 치료 방법은 예를 들어 국제 특허 출원 PCT/US2008/003760에 기재되어 있고, 상기 출원은 고압 산소 치료법의 이의 고찰에 대해 참조에 의해 본원에 포함된다. 선택적으로, 환자는 가압 챔버에서 100% O2를 약 2.0 내지 약 3.2의 절대 기압(ATA; atmospheres absolute)으로 1일 1회 또는 2회로 불어넣는 20 이상의 치료를 받는다. 치료 시간 범위는 일반적으로 약 10분 내지 약 240분(예를 들어 약 10, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240분 등)이다.
치료 요법은 또한, 혈관내 치료(예를 들어 혈관성형술 또는 스텐트 삽입술), 우회술 또는 동맥 수술, 또는 괴사 조직 제거술을 포함할 수 있다.
따라서, 일반적으로 기재된 본 발명은 하기 실시예를 참조로 더욱 쉽게 이해될 것이며, 이러한 실시예는 예시에 의해 제공되고 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1
정상적으로 대혈관(동맥)과 미세혈관(모세혈관) 과정 둘 모두를 통한 것인 사지 및 연조직으로의 손상된 혈류는 PAD 및 CLI를 앓고 있는 환자에서 중추적이며 보편적인 병인(etiology)이다. 허혈 조직으로의 충분한 혈류의 복구는 성공적인 수선 반응을 허용한다. 치료적 혈관신생은 허혈 조직에서 혈관 형성을 유도하기 위해 약물, 유전자, 세포 또는 기계적 장치의 사용을 지칭한다. 일차적인 이득은 새로운 혈관의 성장을 유도하고 측부혈관(collateral vessel) 형성을 촉진하여 혈액 부족(blood starved) 조직으로의 혈류를 증가시키는 것이다. 혈관신생은 궁극적으로, CLI 환자, 특히 수술적 개입의 자격이 없는 환자에서 부정적 심혈관 사건(adverse cardiovascular event)의 위험에서 감소를 초래하며, 허혈 통증을 경감시키고, 궤양을 치유하며, 대절단을 예방하고, 삶의 질 및 생존율을 향상시킬 수 있다.
세포 표면 상의 접착 분자는 세포-세포 상호작용 및 귀소(homing)를 매개한다. 손상 조직에서 줄기/전구 세포와 EC 사이의 접착 수용체/리간드 쌍(pair)(구체적으로 E-셀렉틴/리간드)-매개 세포-세포 상호작용은 줄기세포-유도 혈관 생성에서 필수적인 사건이다. PAD/CLI를 치료하기 위한 신규 전략은, 손상된 혈관 구조 및 조직 세포에서 유전자-치료법(E-셀렉틴/AAV)을 사용하여 E-셀렉틴을 이용하여 EC를 프라이밍(priming)함으로써 지지 조직 미세환경을 만듦으로써 시험되었다. E-셀렉틴은 내인성 또는 외인성 골수(BM)-유래, 수선-적격 줄기/전구 조직 수선 세포(TRC)(E-셀렉틴의 리간드를 발현함)가 앵커(anchor)하기 위한 도킹 부위(docking site)로서 역할을 할 수 있으며, 이에 의해 허혈 조직으로의 TRC의 정확한 상호작용/귀소를 증가시킨다. 마우스 사지 허혈 및 괴저 모델에서 접착 분자-기반 세포외 및 세포 구성성분의 실행 가능성(feasibility) 및 효능이 시험되었고, E-셀렉틴/AAV 유전자 치료법이 마우스 모델에서 PAD/CLI에 효과적인 양상인 것으로 실증되었다. 본원에 기재된 방법은 골수(BM)-유래, 수선-적격 줄기/전구 세포(TRC)의 정확한 표적화를 증강시키기 위해 조직 미세환경의 환대성(hospitability)을 향상시킨다.
괴저는 조직 괴사의 특정 유형이지만, 기저의(underpinning) 분자 기전은 대체로 알려져 있지 않다. 괴저의 신뢰할 만하고 재현 가능한 동물 모델의 결여는 이 질병 과정을 연구하는 것을 어렵게 하였다. 산화질소(NO)가 허혈의 특징인 산화적 조건에서 세포 반응의 제어자로서 작용하는 것으로 공지되어 있기 때문에, 괴저의 발병 및 진전에서 NO/NOS 경로의 잠재적인 관여가 조사되었고, 사지 괴저의 뮤린 모델은 허혈-유도 사지 괴저의 병리생리학적 과정에 관여된 분자 기전을 설명하기 위해 개별되었다. 8 내지 12-주령의 수컷 FVB 마우스를 N-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르(L-NAME) 비-선택적 NOS 저해제 및 비히클(n=18/그룹)로 각각 치료하였다. 서혜 인대(inguinal ligament) 및 슬와(popliteal fossa)에서 대퇴동맥의 결찰술, 뒤이어 우측 사지에서 동맥 및 모든 분지(branch)의 절개(excision)에 의해 뒷다리 허혈(hindlimb ischemia)을 발생시켰다. 마우스는 수술-전 1 내지 2시간째에 단일 용량의 L-NAME(40 mg/kg ip), 및 그 후에 수술-후 제1일, 제2일 및 제3일에 일일 용량(40 mg/kg ip)을 받았다. 대조군 마우스는 의약 비히클만 받았다. 괴저의 발생 및 진전을 매일 시각적 조사 및 사진촬영에 의해 평가하였다. 괴저를 변형된 타를로브 허혈 척도를 사용하여 평가하였다. 허혈을 수술-후 일(POD) 1 내지 3일째에 레이저 도플러 이미징(LDI)을 사용하여 매일 모니터링하였다. L-NAME 치료받은 마우스는 POD 3까지 원위부 사지 괴저를 균일하게 발병시켰다. 비교에서, 대조군 중 어떤 마우스도 괴저를 발병시키지 않았다(도 9). 이는, 최초의 신뢰할 만하고 고-재현 가능한 뮤린 허혈-유도 뒷다리 괴저 모델이다.
재조합 AAV(rAAV) 벡터는 비-병원성인 야생형 바이러스, AAV로부터 유래된다. 대다수의 인간이 이 바이러스에 노출되긴 하였지만, 어떠한 분명한 병 효과도 AAV와 연관되지 않았다. 선택적으로, 본원에 기재된 방법에 사용된 재조합 벡터는 모든 AAV 유전자가 없으며, 즉, 야생형 바이러스의 rep 및 cap 유전자가 제거되었다. 역방위 말단 반복부(ITR)는 재조합 벡터 게놈에서 보유된 유일한 바이러스 DNA 서열이다. 재조합 AAV 벡터는 이의 안전성 프로파일(병원성 및 독성의 결여) 외에도, 하기 주요한 특징을 가진다; 다양한 조직 기원의 분열중인 세포 및 비-분열중인 세포를 감염시키는 능력, 매우 낮은 숙주 면역 반응 및 장기간 발현.
AAV 생활 주기는 숙주 인자, 헬퍼 바이러스, AAV 게놈에서 인코딩된 유전자, 및 cis 요소 ITR을 수반하는 복잡한 시스템을 통해 제어된다. ITR은 T-형상 헤어핀 구조를 취할 수 있는 회문형(palindromic) 서열이다. 이러한 특수한 배열은 바이러스 DNA 복제를 위한 기원으로서 역할을 한다. 또한, ITR은 성공적인 바이러스 포장, 통합 및 구제에 필수적이다. 재조합 rAAV 게놈은 통상, 야생형 AAV의 게놈으로서 단일 가닥 DNA로 구성된다. 프로바이러스 플라스미드의 ITR 중 하나의 D-영역에서의 결실은, 통상 '자가-상보적' rAAV로서 지칭되는 이중 가닥 rAAV의 효율적인 포장을 초래한다. rAAV의 자가-상보적 게놈은 이들의 향성을 결정하기 위해 소정의 캡시드에 포장될 수 있다. AAV는 많은 상이한 혈청형의 캡시드에 '포장'되어 AAV 벡터를 "위형화(pseudotype)"할 수 있고, 이로써 AAV의 게놈을 기반으로 한 발현 카세트(즉, ITR의 기원)가 AAV의 또 다른 혈청형으로부터 기원하는 캡시드와 함께 재조합 바이러스 입자 내로 포장된다. 위형 재조합 AAV 벡터는 종종, 이들의 하이브리드 기원(AAV1 또는 AAV9 캡시드에 포장된 AAV2를 기반으로 하는 게놈)을 지칭하는 rAAV2/1 또는 rAAV2/9 등으로 지정된다. 위형 AAV 벡터는 이식유전자 발현의 상이한 패턴 및 동역학(kinetics)을 매개하며, 이는 AAV 벡터의 입수 가능한 레퍼토리를 상당히 확장시킨다.
AAV2/2, AAV2/5, AAV2/8 및 AAV2/9를 포함하여, GFP를 인코딩하는 상이한 AAV 벡터의 효율이 마우스 모델에서 사지 허혈에 대해 시험되었다. AAV2/9는 더 높은 형질도입 효율을 나타내었다(도 1). 기본적인(basic) AAV2 cis-플라스미드는 pZac를 기반으로 한다. pZac는 관심 유전자에서 용이한 클로닝을 위해 2개의 말단에 2개의 AAV ITR, CMV 프로모터, 다중 클로닝 부위(MCS) 및 SV40 polyA를 함유한다. 뮤린 E-셀렉틴/AAV2/9(대조군으로서 LacZ/AAV2/9)를 사용하여, 허혈성 사지 조직을 형질도입시켜, 마우스 뒷다리 괴저 모델에서 허혈 조직 미세환경을 프라이밍하였다. E-셀렉틴/AAV2/9 및 LacZ/AAV2/9 바이러스를 각각 괴저 마우스의 허혈성 사지 내로 근육내 주사하였다(각각 1.8x1012 vg 및 1.2x1013 vg. 각각 20 μL의 주사의 5개 부위를 대퇴부에서 반막 슬괵근을 따라 수행하였음). 이식유전자(E-셀렉틴)의 조직 세포 발현을 면역조직화학에 의해 검사하였다. 뒷다리 혈류를 레이저 도플러 이미징(LDI)을 사용하여 모니터링하고 신혈관형성 및 혈관재생을 혈관 이미징 기술을 사용하여 측정함으로써, 괴저의 치료에서 E-셀렉틴/AAV2/9 유전자 치료법의 치료 효과를 평가하였다.
8 내지 12주령의 FVB/NJ 수컷 마우스를, 내측 반막 슬괵근을 따라 20 μL 증분(increment) 5x에서 근육내 E-셀렉틴/AAV 1.8x1012 vg(치료군) 또는 LacZ/AAV2/9 1.2x1013 vg(대조군)를 이용하여 양측 뒷다리 조직 미세환경을 프라이밍하는 데 사용하였다. 프라이밍을 뒷다리 수술 전 4, 2 및 0일째에 수행하였다. FVB 마우스는 조합된 대퇴동맥 결찰술/절개, 및 NG-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르(L-NAME), 산화질소 신타제 저해제의 투여를 받았으며, 이는 수술전 30분째 및 수술후 1, 2 및 3일째에 뒷다리 관류를 추가로 감소시킨다. 괴저 중증도에 대한 파버 척도를 기반으로 하는 허혈 점수를 수술후 1, 2, 3, 7 및 14일째에 기록한 반면, 레이저 도플러 이미징을 수술후 7 및 14일째에 수행하였다. 신혈관형성을 정량화하기 위해 레이저 주사 공초점 현미경을 이용한 살아 있는 동물 dil 관류를 수술후 14일째에 수행하였으며, 이 시점에서 동물을 안락사시키고, 대퇴 조직을 면역형광을 위해 수합하여 E-셀렉틴 이식유전자 발현을 입증하였다.
모든 마우스는 L-NAME 투여 외에도 대퇴동맥 결찰술을 받았다. 조직에 파버 허혈 채점 시스템(0의 척도(괴저 없음) 내지 11(심각한 앞발 괴저))을 기반으로 점수를 지정하였다. 파버 허혈 채점은 문헌 [Faber et al., Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 31(8):1748-1756 (2011)]에 기재되어 있다. 0(괴저 없음) 내지 11(심각한 앞발 괴저)의 파버 허혈 채점 척도를 기반으로, 수술후 7일까지 모든 마우스는 괴저의 존재를 갖는 것으로 확인되었다. 괴저의 중증도는, E-셀렉틴/AAV를 받은 치료군과 비교하여 수술후 7일째까지 LacZ/AAV를 받은 대조군에서 유의하게 더 불량하였다. 이러한 유의성은, 상기 언급된 그룹이 각각 5.3 및 2.4의 허혈 점수를 갖는 수술후 14일째까지 훨씬 더 두드러졌다(p<0.05, 도 2). 이들 데이터는, 괴저를 약화시키는 E-셀렉틴/AAV의 가능성을 LacZ/AAV 투여와 비교하여 시사한다.
수술후, 모든 마우스는 제7일 및 제14일에 레이저 도플러 이미징을 받았다. 수술후 제14일까지, 그룹들 사이에서 비결찰된 사지에 대한 결찰된 사지의 비로서 계산되는 허혈 지수에서 유의한 차이가 존재하였다. 1의 비가 정상적인 관류를 가리키는 경우, 대조군 및 치료군에서 허혈 지수는 제14일까지 각각 0.28 및 0.52였다(p<0.05)(도 3 및 도 10). 이들 데이터는, E-셀렉틴/AAV 그룹이 시간이 경과함에 따라 우수한 관류, 및 따라서 총체적인 조사에서 덜 심각한 괴저와 함께 회복됨을 확증한다. 도 11을 참조한다.
또한, 마우스는 안락사되기 전 수술후 제14일에 전신 Dil 관류를 받았다. 발 관류를 주사 공초점 현미경에 의해 검출하였다. 수술후 제14일까지, 그룹들 사이에 결찰된 사지 대 비-결찰된 사지에서 괴저 발에서 Dil-염색된 혈관의 강도로서 계산된, 결찰된 발의 혈관 밀도에서 유의한 차이가 있었다. E-셀렉틴/AAV 유전자 치료법은 괴저 발에서 신혈관형성 및 발 관류를 향상시킨다(도 4). 이들 데이터는, E-셀렉틴/AAV 유전자 치료법이 괴저 발에서 신혈관형성 및 발 관류를 향상시킴을 확증한다.
수술후 제14일에, 내대퇴(medial thigh) 근육을 수합하고, 포르말린으로 고정한 후, 파라핀화 및 포매하였다. 헤마톡실린 및 에오신 염색을 기반으로, E-셀렉틴 그룹에서 결찰된 사지 근세포는 덜 허혈인 것으로 보였고, 더 적은 집중화된 핵과 함께 수축한 반면, LacZ 결찰된 사지에서는 이러한 특징이 더 만연하게 관찰되었다. 10x 배율에서 E-셀렉틴/AAV 결찰된 사지 및 LacZ 결찰된 사지의 헤마톡실린 및 에오신 염색의 현미경 이미지가 각각 도 12a 및 12b에 제시되어 있다. LacZ/AAV 결찰된 사지 대 e-셀렉틴 결찰된 사지에서 더 높은 수의 근원섬유/hpf, *p<0.0001. 유사하게는, LacZ/AAV 그룹에서 근세포는 집중된 핵 중에서 풍부한 염증 세포와 함께 결찰된 사지에서 풍부하였다. 마지막으로, LacZ/AAV 결찰된 그룹은 E-셀렉틴/AAV 그룹과 비교한 정량적 데이터를 기반으로 가장 많은 수의 근원섬유s/hpf를 실증하였다(도 5). 이들 데이터는 E-셀렉틴/AAV 유전자 치료법이 허혈-유도 골격근 위축을 향상시킴을 가리킨다.
E-셀렉틴/AAV 유전자 치료법은 또한, 허혈 상처 치유를 촉진하는 것으로 결정되었다. 도 6은 E-셀렉틴/AAV 그룹과 LacZ/AAV 그룹 사이에서 POD 0 내지 10으로부터 치유 진전을 예시한다. 수술후 일자(POD) 0, 1, 3, 5, 6, 7, 10에서 내부 좌측 뒷다리 대퇴에 대한 상처 치유의 총체적인 이미지가 도 13에 제시되어 있다. 이미지의 상부 열은 E-셀렉틴/AAV로 치료받은 마우스로부터의 이미지를 나타내고, 이미지의 하부 열은 LacZ/AAV로 치료받은 마우스로부터의 이미지를 나타낸다. E-셀렉틴/AAV 그룹에서, 상처는 수술 후 처음 24시간 이내에 POD1까지 0% 내지 54%의 치유율로 진전되는 가장 유의한 수축을 겪는 것으로 나타났다. 비교적, LacZ/AAV 마우스는 POD1까지 20% 치유율을 겪었다(p<0001). 마우스가 POD 0 내지 10으로부터 진전함에 따라, E-셀렉틴/AAV 마우스는 상처 내에서 유의하게 더 많은 염증 및 수축을 맞닥뜨렸고, 이는 총괄적인 이미지를 기반으로 LacZ/AAV 그룹에서 더 지연된다. 각각의 일에서, 어떤 그룹에서든 상처 치유율 사이의 격차 퍼센트는 저하되지만, 여전히 통계학적으로 상이한 채로 남았다. POD 10까지, E-셀렉틴/AAV 마우스는 LacZ/AAV 그룹에서의 84%와 비교하여 97% 치유율에 도달한다(p<0.0001).
실시예 2
이 실시예는 본 방법의 맥락에서 신규 줄기세포-치료법의 전달을 기재한다. 일 양태에서, 조작된 BM-유래 조직 수선 세포(TRC)가 투여되며, 여기서, E-셀렉틴은 세포 표면 상에 미리-설치된다. 허혈성 사지 조직에 투여된 이들 조작된 TRC는 선택적으로 허혈 조직 혈관 구조에서 부착되고, 활성화된 내피 세포(EC)(E-셀렉틴을 끌어들여 이와 상호작용하는 상승된 대응(counterpart) 리간드를 발현함), 특히 발아하는(sprouting) 혈관신생에서 버딩 팁 셔플링(budding tip shuffling)에 있는 세포와 상호작용하여, 새로운 혈관 형성을 촉진할 수 있다. 대안적으로, 지지 조직 미세환경은, 바이러스 벡터를 사용하여 E-셀렉틴과 함께 손상된 혈관 구조 및 조직 세포에서 EC를 프라이밍함으로써 발생된다. E-셀렉틴은 내인성 또는 외인성 TRC(E-셀렉틴의 리간드를 발현함)가 앵커하기 위한 도킹 부위로서 역할을 하며, 이에 의해 허혈 조직으로의 TRC의 정확한 상호작용/귀소를 증가시킨다.
마우스 모델에서 사지 허혈의 반전을 위해 Adh/VV로 예비-형질도입된 자가 조직 수선 세포(TRC)의 근육내 주사. 현재, PAD/CLI 환자에서 비-조작된 TRC의 투여를 위해 가장 광범위하게 사용되는 경로는 동맥내(i.a.) 및 근육내(i.m.) 주사이고, 이들은 유의한 한계를 드러낸다. 근육내 주사된 TRC는 조직 세포와 '블라인드 데이팅(blind dating)'을 겪는다. TRC의 성능은 주로, 측분비 기전에 의존하는데, 왜냐하면 TRC가 허혈 조직에서, 특히 발아하는 혈관신생에서 버딩 팁 셔플링에서 활성화된 EC와 특이적으로 상호작용하지 않고 드물기 때문이다. 동맥내 주사 접근법은 우수한 것으로 제시되지 않았고, 출혈 위험이 동반된다. 허혈 유도 저(low) 산소 센서 HIF-1α는 VEGF 및 SDF-1α를 포함하는 소정의 케모-사이토카인의 증가된 발현을 도출하고, 이러한 사이토카인은 혈관신생을 유도할 뿐만 아니라 허혈 조직의 내피에서 접착 분자의 패널의 발현을 상향조절한다. 팁 세포의 이동 및 버딩은 혈관신생의 제1 단계이다. 발아하는 혈관신생에서 동적 팁 세포 셔플링은 치료 혈관신생을 위해 표적화되는 "핫 스팟(hot spot)"이다. 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, TRC와 다세포 버딩 팁의 특이적인 상호작용은 혈관신생을 촉진할 것이다. E-셀렉틴/리간드는 활성화된 내피 상에서 상승되고, 줄기/전구 세포, 예를 들어 내피 전구 세포(EPC)의 상호작용 및 신혈관형성이 발생하는 부위로의 상기 세포의 동원을 책임지는 접착 분자의 쌍이다. E-셀렉틴 리간드의 발현이 상처 조직의 내피에서 상승되는 것으로, 예컨대 SDF-1α 및 다른 사이토카인(즉, IL-1 및 TNF-α)에 의해 상향조절되는 것으로 결정되었다. 버딩 팁에서 EC와 TRC의 특이적인 상호작용을 증가시키기 위해, 세포 표면 상에서 높은 수준의 'Adh'를 발현하도록 Adh/VV로 예비-형질도입된 자가 LacZ+ BM-유래 TRC를, 사지 허혈을 유도하기 위해 대퇴동맥 결찰술을 겪은 수여자(recipient) C57BL6 마우스의 허혈성 사지 내로(i.m.) 투여할 것이다. LacZ+ BM-유래 TRC를 이용하기 위한 목적은 접목-후(post-engraftment) 허혈 조직에서 이들 세포를 용이하게 추적하기 위한 것이다. 세포 표면 상에서 E-셀렉틴을 운반하도록 조작된 자가 TRC의 상처 조직 주사가 5-배 더 많이 증가된 상처 혈관신생을 초래한 것으로 관찰되었다. 접목된 TRC는 버딩 팁에서 EC와 보다 활성적으로 그리고 특이적으로 상호작용하여, 이들의 측분비 효과 외에도 혈관신생을 촉진할 것이다(및 측분비 효과는 표적 세포와 TRC의 정확한 부착(근접화)으로 인해 더 효과적일 수 있음).
마우스 뒷다리 괴저 모델에서 신생-재-혈관형성을 촉진하기 위한 E-셀렉틴/AAV를 이용한 허혈성 사지 조직 미세환경의 '프라이밍'. 사지 괴저는 다리/발가락 조직의 사멸이고, PAD의 가장 심각한 징후 중 하나를 나타낸다. 마우스에서 뒷다리 괴저의 신규, 신뢰할 만하고 고도로 재현 가능한 모델은 상기 기재되어 있다. 허혈 조직 혈관 구조 및 조직 세포는 마우스 허혈 뒷다리 괴저 모델에서 바이러스 벡터-매개 유전자 치료법에 의해 E-셀렉틴을 이용하여 프라이밍되어, 내인성 TRC의 상호작용/귀소를 위해 고도로 접근 가능한 조직 미세환경을 만들 것이다. 파일럿 연구는, E-셀렉틴/AAV의 상처 조직 주사가 마우스 모델에서 상처 혈관 구조 및 조직 세포에서 E-셀렉틴의 유의하게 증가된 발현을 초래하였음을 보여주었다. 혈관 구조 및 조직 세포 상에서 발현된 E-셀렉틴은, E-셀렉틴의 대응 리간드를 발현하는 내인성 TRC가 앵커하고 상호작용하기 위한 '도킹' 부위로서 역할을 할 것이고, 이는 다시 보다 강력한 혈관재생 및/또는 신혈관형성 반응을 유발할 것이다.
방법
E-셀렉틴/VV 및 대조군 벡터(플라스미드)의 구축: 바이러스 벡터(VV)는 효율적이고 안전한 유전자 전달 시스템이다. 네이키드 pDNA 접근법은 이식유전자 발현의 수준 및 기간에 대해 한계를 보여주었다. E-셀렉틴/VV 및 EGFP/VV 플라스미드를 구축하고, 재조합 바이러스를 생성하였다. 셀렉션 마커를 바이러스 벡터에 포함시킨다. 이를 위해, IRES2-EGFP(약 1.4 kb)를 다중 클로닝 부위 내로 삽입함으로써 기본적인 바이러스 벡터를 변형시킬 것이다. 이들 벡터 자체가 대조군으로서 사용될 수 있다. 뮤린 E-셀렉틴 유전자를 다중 클로닝 부위에서 잔여 부위를 사용하여 IRES2-EGFP의 업스트림 내로 삽입할 것이다. IRES(내부 리보좀 진입 부위)때문에, E-셀렉틴 및 마커와 대조군 유전자(EGFP) 둘 모두가 TRC에서 동시적으로 발현될 수 있다. 따라서, E-셀렉틴-과발현 TRC(E-셀렉틴/TRC)의 순수한 집단을 선택하고 증폭시키는 것이 가능할 것이다.
재조합 VV(바이러스) 생성: 표준 방법을 이용하여, 재조합 VV를 발생시킨다. 재조합 VV를 구배 원심분리에 의해 정제한다. 재조합 VV를 함유하는 분획을 수합하고, 포스페이트-완충 식염수(PBS)에 대해 투석하고, 저장한다.
뮤린 BM-유래 TRC의 발생: 뮤린 TRC를 ROSA26(LacZ+) 마우스로부터 수합된 BM-유래 단핵 세포로부터 발생시킬 것이다.
FVB 마우스에서 허혈-유도 사지 괴저의 형성: FVB 마우스를 사용하여, 허혈-유도 사지 괴저를 형성한다. 마우스를 일측(unilateral) 대퇴동맥 결찰술을 받게 하고, 산화환원 경로를 저해하는 화합물로 치료한다. 괴저의 발생 및 진전을 매일 시각적 조사 및 사진촬영에 의해 평가한다. 괴저를 변형된 타를로브 허혈 척도를 사용하여 채점한다. 수술후 일자(POD) 1 내지 3으로부터 LDI를 사용하여 허혈을 매일 모니터링한다. 통상, 마우스는 수술후 제3일까지 원위부 사지 괴저를 균일하게 발병시킨다.
C57 BL6 마우스에서 허혈 사지 마우스 모델의 형성: 보편적인 허혈성 사지를 형성하기 위해, C57 BL6 마우스를 일측 대퇴동맥 및 정맥 결찰술을 받게 한다. 서혜 인대 및 슬와에서 대퇴동맥 및 정맥 다발의 결찰술, 뒤이어 동맥/정맥 및 모든 분지의 절개에 의해 뒷다리 허혈을 발생시킨다. 허혈 및 재관류를, 수술후 제1일 내지 제7일(실험의 예상되는 종료 시점)까지 LDI를 사용하여 매일 모니터링한다. LDI를 체중-기반 진정제 투여를 이용하여 온도-조절된 설비에서 수행하여, 온도 변동 및 진정제 투여 수준으로 인한 인공물(artifact)을 최소화할 것이다. 상대 관류 데이터는 정상적인(좌측) 사지 혈류에 대한 허혈(우측)의 비로서 표현될 것이다.
재조합 VV를 이용한, 배양된 TRC의 형질도입: 시험관내에서 E-셀렉틴/TRC를 발생시키기 위해, ROSA26(LacZ+) 마우스로부터 단리된 BM-유래 TRC를, E-셀렉틴/VV 또는 EGFP/VV(대조군으로서)를 이용하여 형질도입시킨다. 이식유전자(E-셀렉틴) 발현을 검출하기 위해, 형질도입-후 3일째에, TRC를 트립신-EDTA에 의해 탈착시키고, 세척하고, FACScan 유세포분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 FACS 소팅을 받게 하여, EGFP+ 세포(E-셀렉틴/TRC와 대조군/EGFP를 발현하는 TRC 둘 모두)를 단리한다. 단리된 EGFP+ 세포를 세포 확장을 위해 재-배양한다. 또한, E-셀렉틴 발현을 웨스턴 블롯에 의해 확증할 수 있다. TRC를 얼음-냉각된 포스페이트-완충 식염수(PBS)로 헹구고, 용해 완충제(1% Nonidit P-40, 50 mmol/l Tris-HCl, pH 7.4, 150 mmol/l NaCl, 200 U/ml 아프로티닌(aprotinine), 1 mmol/l PMSF)에 재현탁시킨다. 세포 용해물(10 μg의 단백질)을 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 상으로 블로팅한다. 항-뮤린 E-셀렉틴 항체를 이용하여 면역블로팅을 수행하고, ECL 검출 시스템을 이용하여 시각화할 것이다.
수여자 C57BL6 마우스의 허혈성 사지 내로의 E-셀렉틴/TRC의 근육내 주사. 공여자 ROSA26(LacZ+) 마우스로부터 제조된 조작된 TRC를 수합하고, 세척하고, PBS에 재현탁시킨다. 100 μl의 세포 현탁액(AAV/TRC 대 대조군/TRC: 8 마우스/그룹)을 허혈성 사지 내로(i.m.) 주사할 것이다.
재조합 VV를 이용한, 허혈성 사지 조직의 형질도입: FVB 마우스를 디에틸 에테르를 이용하여 마취시킨다. E-셀렉틴/VV 및 EGFP/VV를 식염수 현탁액에서 희석시킨다. 바이러스 현탁액을 동측(ipsilateral) 반막 근육 내로 주사할 것이다. 이식유전자(E-셀렉틴) 발현을 면역형광(IF)에 의해 검사할 것이다.
뒷다리 허혈 또는 괴저를 모니터링한다: 사지 허혈 및 허혈 뒷다리 내로의 혈류의 복구를 실온-조절된 설비에서 수술후 제1일부터 제7일까지 LDI를 사용하여 매일 모니터링한다. 상대 관류 데이터는 정상적인(좌측) 사지 혈류에 대한 허혈(우측)의 비로서 표현될 것이다.
신혈관형성 및 혈관재생의 평가: 사지 조직 혈관 밀도를 Dil 관류 및 레이저 주사 공초점 현미경에 의해 측정할 것이다. 마우스 혈관(신혈관형성)을 생체내에서 마취된 마우스에서, Dil(D-282, Invitrogen/Molecular Probes)을 함유하는 특수 제제화된 수용액을 사용하여 생(live) 관류에 의해 직접적으로 표지할 것이다. 사지 조직에서 혈관 네트워크를, 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하여 200 μm의 두께 또는 깊이까지 허혈성 사지를 주사함으로써 시각화할 것이다. 혈관 밀도를, 전체 주사된 영역으로 정규화된 적색 Dil-표지된 혈관의 총 수를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 평가하여 정량화한다. 이 외에도, 혈관신생을, 수합된 사지 조직을 사용하여 항-KDR 또는 항-CD31 항체를 이용하여 내피 세포 마커 KDR 또는 CD31에 대해 면역염색하는 모세혈관 밀도의 정량화에 의해 평가할 것이다. 혈관재생을, LDI(매일)와 Dil 관류 후 레이저 주사 공초점 현미경(결찰된 대퇴 영역 근처의 대혈관에 초점을 둠)에 의한 측방향 대퇴동맥 형성의 시각화 둘 모두에 의해 측정한다.
MicroCT: 혈관화(vascularization)를 또한, microCT에 의해 조사할 수 있다. 마이크로-컴퓨터 단층촬영(micro-CT)은 혈관 이미지의 분석, 정량화, 확증 및 시각화에 적합한 고해상 3D 체적 데이터를 제공한다. 상기 micro-CT는 실험 마우스에서 혈관 조사를 위한 대안적인 방법으로서 제공된다.
조직 내피 내로의 자가 E-셀렉틴/TRC 혼입의 검출: 투여된 TRC가 ROSA26(LacZ+) 공여자 마우스로부터 유래되기 때문에, E-셀렉틴/TRC 및 대조군 EGFP/TRC를 X-gal 염색에 의해 검출할 수 있으며, 상기 염색에 의해 LacZ+ TRC의 수 및 조직 위치를 검사할 수 있다(세포 추적). 대안적으로, TRC가 EGFP+이고, IF(항-EGFP 염색)에 의해 검출 가능하기 때문이다. X-gal은 면역형광(IF)보다 덜 배경을 갖는 보다 안정한 결과를 유발하므로 사용될 수 있다.
BM-유래 TRC 및 이들의 운명의 조직-수준 검출을 위한 β-갈락토시다제 검정법(X-gal) 및 IF: 수합된 사지 조직을 2개의 부분, 냉동을 위한 1개 부분 및 고정(4% 파라포름알데하이드)을 위한 1개 부분으로 나눈다. 그 후에, 냉동된 조직 절편(section)을 실온에서 2시간 동안 X-gal(Fermentas, Canada)과 함께 인큐베이션한다. 절편을 뉴클리어 패스트 레드(nuclear fast red)(Vector Labs)로 대조염색하였다. 적어도 3개의 일련의 절편에서 1개 절편 당 5개의 무작위 고출력 장(HPF, 40X)에서 수술후 제7일에 사지 조직의 일련의 절편에서 β-갈락토시다제+ 세포를 계수함으로써 TRC의 수를 정량화한다. 접목된 TRC를 또한, 표준 프로토콜을 사용하여 EGFP를 염색시키기 위해 IF에 의해 검출할 수 있다. 세포 운명을 검출하기 위해, 냉동된 절편을 X-gal과 함께 인큐베이션할 때, 분화 마커를 위한 HRP-공액 항체, 예를 들어 EC 계통을 위한 KDR 및 섬유아세포를 위한 FSP-1을 첨가한다. HRP/DAB 또는 AEC 검출 IHC 키트(ab93702, Abcam)를 사용하여 양성 염색을 검출한다. 고정된 조직 절편에 대해, GFP, KDR 또는 FSP-1에 대한 형광 염료-공액 Ab를 사용할 수 있다. DAPI를 이용한 대조염색은 불분명하다.
허혈 사지에서 혼입된 E-셀렉틴/TRC의 위치 및 운명의 조사: 주사된 TRC의 위치 및 운명을 검출하기 위해, IHC를 사용하여 세포 계통 마커, 예를 들어 EC에 대해 KDR 및 섬유아세포에 대해 FSP-1을 X-gal과 함께 공동-염색한다.
회복된 허혈 사지에서 사이토카인/케모카인의 프로파일링: 치료적 혈관신생에 미치는 주사된 E-셀렉틴/TRC의 잠재적인 측분비 효과를 조사하기 위해, 시험 세포 및 조직 용해물을 MILLIPLEX MAP 마우스 혈관신생/성장 인자 자기 비드 패널(Millipore)을 사용하여 시험하며, 상기 패널은 27-사이토카인을 검출한다: 안지오포이에틴-2, G-CSF, sFasL, sAlk-1, 암피레굴린(Amphiregulin), 렙틴, IL-1β, 베타셀룰린(Betacellulin), EGF, IL-6, 엔도글린(Endoglin), 엔도텔린(Endothelin)-1, FGF-2, 폴리스타틴(Follistatin), HGF, PECAM-1, IL-17, PLGF-2, KC, MCP-1, 프롤락틴(Prolactin), MIP-1α, SDF-1α, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-A 및 TNFα.
데이터 분석: 차이의 통계학적 분석을 2-그룹 비교를 위해 양측 스튜던츠 t-검정(2-tailed Student's t-test) 및 다수의 비교를 위해 이원 ANOVA 검정(two-way ANOVA test)을 사용하여 수행한다. P-값은 P<0.05에서 통계학적으로 유의한 것으로 간주된다. 통계학적 분석을 SPSS 22.0 소프트웨어 패키지(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 수행할 것이다.
실시예 3
신뢰할 만한 동물 뒷다리 괴저 모델의 결여는 중증 하지 허혈의 분자적 조사 및 예비-임상 치료를 제한한다. 이 실시예는 유전자 치료법의 효능을 평가하기 위한 마우스 뒷다리 괴저 모델의 개발 및 용도를 기재한다.
E-셀렉틴/아데노-연관 바이러스(AAV)를 이용한 허혈 뒷다리 조직의 프라이밍이 치료적 혈관신생을 증강시키고 괴저를 약화시킬 것으로 가정되었다.
뒷다리 괴저를 유도하기 위한 2가지 방법을 시험하였다. 제1 방법에서, FVB 마우스는 대퇴동맥 결찰술(FAL)을 받아 중증 하지 허혈을 달성하였다. 제2 방법에서, FVB 마우스는 조합된 FAL과 NG-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르(L-NAME), 산화질소 신타제 저해제의 투여를 받았으며, 이는 뒷다리 관류를 추가로 감소시킨다. FAL 및 L-NAME 사용 전에, 괴저-유도 마우스에게 E-셀렉틴/AAV(치료군) 또는 LacZ/AAV(대조군)를 뒷다리에 근육내 투여하였다. 수술후 일자(POD) 2, 7, 14에 기록된, 0(괴저 없음)으로부터 11(앞발 괴저)까지의 범위에서 표준화된 허혈 점수를 사용하여 괴저를 평가하였다. 레이저 도플러 이미징을 사용한 뒷다리 재관류를, 일부 POD 상에서 결찰된 사지:비-결찰된 사지의 평균 관류에 의해 정량화하였다. 살아 있는 동물 Dil 관류 + 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하여, 사지 신혈관형성을 정량화하였다.
대부분의 FVB는 FAL-단독 방법을 이용해서는 괴저를 발병시키지 않았다(n=2/8, 25% 괴저 발생). 조합된 FAL과 L-NAME 방법은 뒷다리 괴저를 일관되게 유도하였다(n=14/14, 100% 괴저 발생). E-셀렉틴/AAV(n=7) 및 LacZ/AAV(n=7)에 대한 레이저 도플러 이미징 점수는 POD 7에서 0.41 대 0.27(P=0.071)이었고, POD 14에서 0.54 대 0.29(P=0.017)이었다. E-셀렉틴/AAV 및 LacZ/AAV에서 Dil 관류된 결찰된 뒷다리는 44 대 21의 유의하게 상이한 평균 신혈관형성 강도 점수를 드러내었다(P=0.037). 각각의 마우스에서 Dil 관류된 비-결찰된 사지는 50 대 25의 평균 강도 점수를 실증하였다(P=0.006). POD 2, 7, 14에서 E-셀렉틴/AAV 및 LacZ/AAV에 대한 평균 사지 허혈 점수는 1.9, 2.9 및 3.7 대 2.7, 3.9 및 5.3(P=0.104)이었다.
고도로 신뢰할 만한 마우스 뒷다리 괴저 모델이 성공적으로 개발되었고, 번역 연구에 유용한 것으로 제시되었다. 이 모델을 사용하여, E-셀렉틴-기반 신규 유전자 치료법은 중증 하지 허혈에서 사지 재관류를 향상시켰고 신생혈관화를 증가시켰다. 이러한 신규 뒷다리 괴저 모델을 이용하여, 괴저에 기여하는 산화환원 경로를 더 이해하여, 추가의 번역 연구를 용이하게 할 수 있다.
본 명세서에서 인용된 모든 공개, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공개 또는 특허 출원이 참조에 의해 구체적으로 그리고 개별적으로 혼입되는 것으로 가리켜진 바와 같이, 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 상기 발명이 이해의 명료성을 위해 예시 및 실시예에 의해 어느 정도 상세하게 기재되어 있긴 하지만, 본 발명의 교시의 측면에서 당업자는 소정의 변화 및 변형이 첨부된 청구항의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 이에 대해 이루어질 수 있음을 쉽게 명백해질 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Miami <120> METHOD FOR TREATING ISCHEMIC TISSUE <130> PIPB194362US <150> US 62/500,470 <151> 2017-05-02 <160> 9 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 610 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <308> Genbank / NP_000441.2 <309> 2017-04-09 <313> (1)..(610) <400> 1 Met Ile Ala Ser Gln Phe Leu Ser Ala Leu Thr Leu Val Leu Leu Ile 1 5 10 15 Lys Glu Ser Gly Ala Trp Ser Tyr Asn Thr Ser Thr Glu Ala Met Thr 20 25 30 Tyr Asp Glu Ala Ser Ala Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Thr His Leu Val 35 40 45 Ala Ile Gln Asn Lys Glu Glu Ile Glu Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Ser 50 55 60 Tyr Ser Pro Ser Tyr Tyr Trp Ile Gly Ile Arg Lys Val Asn Asn Val 65 70 75 80 Trp Val Trp Val Gly Thr Gln Lys Pro Leu Thr Glu Glu Ala Lys Asn 85 90 95 Trp Ala Pro Gly Glu Pro Asn Asn Arg Gln Lys Asp Glu Asp Cys Val 100 105 110 Glu Ile Tyr Ile Lys Arg Glu Lys Asp Val Gly Met Trp Asn Asp Glu 115 120 125 Arg Cys Ser Lys Lys Lys Leu Ala Leu Cys Tyr Thr Ala Ala Cys Thr 130 135 140 Asn Thr Ser Cys Ser Gly His Gly Glu Cys Val Glu Thr Ile Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Thr Cys Lys Cys Asp Pro Gly Phe Ser Gly Leu Lys Cys Glu Gln 165 170 175 Ile Val Asn Cys Thr Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Gly Ser Leu Val 180 185 190 Cys Ser His Pro Leu Gly Asn Phe Ser Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Ile 195 200 205 Ser Cys Asp Arg Gly Tyr Leu Pro Ser Ser Met Glu Thr Met Gln Cys 210 215 220 Met Ser Ser Gly Glu Trp Ser Ala Pro Ile Pro Ala Cys Asn Val Val 225 230 235 240 Glu Cys Asp Ala Val Thr Asn Pro Ala Asn Gly Phe Val Glu Cys Phe 245 250 255 Gln Asn Pro Gly Ser Phe Pro Trp Asn Thr Thr Cys Thr Phe Asp Cys 260 265 270 Glu Glu Gly Phe Glu Leu Met Gly Ala Gln Ser Leu Gln Cys Thr Ser 275 280 285 Ser Gly Asn Trp Asp Asn Glu Lys Pro Thr Cys Lys Ala Val Thr Cys 290 295 300 Arg Ala Val Arg Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Arg Cys Ser His Ser 305 310 315 320 Pro Ala Gly Glu Phe Thr Phe Lys Ser Ser Cys Asn Phe Thr Cys Glu 325 330 335 Glu Gly Phe Met Leu Gln Gly Pro Ala Gln Val Glu Cys Thr Thr Gln 340 345 350 Gly Gln Trp Thr Gln Gln Ile Pro Val Cys Glu Ala Phe Gln Cys Thr 355 360 365 Ala Leu Ser Asn Pro Glu Arg Gly Tyr Met Asn Cys Leu Pro Ser Ala 370 375 380 Ser Gly Ser Phe Arg Tyr Gly Ser Ser Cys Glu Phe Ser Cys Glu Gln 385 390 395 400 Gly Phe Val Leu Lys Gly Ser Lys Arg Leu Gln Cys Gly Pro Thr Gly 405 410 415 Glu Trp Asp Asn Glu Lys Pro Thr Cys Glu Ala Val Arg Cys Asp Ala 420 425 430 Val His Gln Pro Pro Lys Gly Leu Val Arg Cys Ala His Ser Pro Ile 435 440 445 Gly Glu Phe Thr Tyr Lys Ser Ser Cys Ala Phe Ser Cys Glu Glu Gly 450 455 460 Phe Glu Leu His Gly Ser Thr Gln Leu Glu Cys Thr Ser Gln Gly Gln 465 470 475 480 Trp Thr Glu Glu Val Pro Ser Cys Gln Val Val Lys Cys Ser Ser Leu 485 490 495 Ala Val Pro Gly Lys Ile Asn Met Ser Cys Ser Gly Glu Pro Val Phe 500 505 510 Gly Thr Val Cys Lys Phe Ala Cys Pro Glu Gly Trp Thr Leu Asn Gly 515 520 525 Ser Ala Ala Arg Thr Cys Gly Ala Thr Gly His Trp Ser Gly Leu Leu 530 535 540 Pro Thr Cys Glu Ala Pro Thr Glu Ser Asn Ile Pro Leu Val Ala Gly 545 550 555 560 Leu Ser Ala Ala Gly Leu Ser Leu Leu Thr Leu Ala Pro Phe Leu Leu 565 570 575 Trp Leu Arg Lys Cys Leu Arg Lys Ala Lys Lys Phe Val Pro Ala Ser 580 585 590 Ser Cys Gln Ser Leu Glu Ser Asp Gly Ser Tyr Gln Lys Pro Ser Tyr 595 600 605 Ile Leu 610 <210> 2 <211> 3875 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> Genbank / NM_000450.2 <309> 2017-04-09 <313> (1)..(3875) <400> 2 agctgttctt ggctgacttc acatcaaaac tcctatactg acctgagaca gaggcagcag 60 tgatacccac ctgagagatc ctgtgtttga acaactgctt cccaaaacgg aaagtatttc 120 aagcctaaac ctttgggtga aaagaactct tgaagtcatg attgcttcac agtttctctc 180 agctctcact ttggtgcttc tcattaaaga gagtggagcc tggtcttaca acacctccac 240 ggaagctatg acttatgatg aggccagtgc ttattgtcag caaaggtaca cacacctggt 300 tgcaattcaa aacaaagaag agattgagta cctaaactcc atattgagct attcaccaag 360 ttattactgg attggaatca gaaaagtcaa caatgtgtgg gtctgggtag gaacccagaa 420 acctctgaca gaagaagcca agaactgggc tccaggtgaa cccaacaata ggcaaaaaga 480 tgaggactgc gtggagatct acatcaagag agaaaaagat gtgggcatgt ggaatgatga 540 gaggtgcagc aagaagaagc ttgccctatg ctacacagct gcctgtacca atacatcctg 600 cagtggccac ggtgaatgtg tagagaccat caataattac acttgcaagt gtgaccctgg 660 cttcagtgga ctcaagtgtg agcaaattgt gaactgtaca gccctggaat cccctgagca 720 tggaagcctg gtttgcagtc acccactggg aaacttcagc tacaattctt cctgctctat 780 cagctgtgat aggggttacc tgccaagcag catggagacc atgcagtgta tgtcctctgg 840 agaatggagt gctcctattc cagcctgcaa tgtggttgag tgtgatgctg tgacaaatcc 900 agccaatggg ttcgtggaat gtttccaaaa ccctggaagc ttcccatgga acacaacctg 960 tacatttgac tgtgaagaag gatttgaact aatgggagcc cagagccttc agtgtacctc 1020 atctgggaat tgggacaacg agaagccaac gtgtaaagct gtgacatgca gggccgtccg 1080 ccagcctcag aatggctctg tgaggtgcag ccattcccct gctggagagt tcaccttcaa 1140 atcatcctgc aacttcacct gtgaggaagg cttcatgttg cagggaccag cccaggttga 1200 atgcaccact caagggcagt ggacacagca aatcccagtt tgtgaagctt tccagtgcac 1260 agccttgtcc aaccccgagc gaggctacat gaattgtctt cctagtgctt ctggcagttt 1320 ccgttatggg tccagctgtg agttctcctg tgagcagggt tttgtgttga agggatccaa 1380 aaggctccaa tgtggcccca caggggagtg ggacaacgag aagcccacat gtgaagctgt 1440 gagatgcgat gctgtccacc agcccccgaa gggtttggtg aggtgtgctc attcccctat 1500 tggagaattc acctacaagt cctcttgtgc cttcagctgt gaggagggat ttgaattaca 1560 tggatcaact caacttgagt gcacatctca gggacaatgg acagaagagg ttccttcctg 1620 ccaagtggta aaatgttcaa gcctggcagt tccgggaaag atcaacatga gctgcagtgg 1680 ggagcccgtg tttggcactg tgtgcaagtt cgcctgtcct gaaggatgga cgctcaatgg 1740 ctctgcagct cggacatgtg gagccacagg acactggtct ggcctgctac ctacctgtga 1800 agctcccact gagtccaaca ttcccttggt agctggactt tctgctgctg gactctccct 1860 cctgacatta gcaccatttc tcctctggct tcggaaatgc ttacggaaag caaagaaatt 1920 tgttcctgcc agcagctgcc aaagccttga atcagatgga agctaccaaa agccttctta 1980 catcctttaa gttcaaaaga atcagaaaca ggtgcatctg gggaactaga gggatacact 2040 gaagttaaca gagacagata actctcctcg ggtctctggc ccttcttgcc tactatgcca 2100 gatgccttta tggctgaaac cgcaacaccc atcaccactt caatagatca aagtccagca 2160 ggcaaggacg gccttcaact gaaaagactc agtgttccct ttcctactct caggatcaag 2220 aaagtgttgg ctaatgaagg gaaaggatat tttcttccaa gcaaaggtga agagaccaag 2280 actctgaaat ctcagaattc cttttctaac tctcccttgc tcgctgtaaa atcttggcac 2340 agaaacacaa tattttgtgg ctttctttct tttgcccttc acagtgtttc gacagctgat 2400 tacacagttg ctgtcataag aatgaataat aattatccag agtttagagg aaaaaaatga 2460 ctaaaaatat tataacttaa aaaaatgaca gatgttgaat gcccacaggc aaatgcatgg 2520 agggttgtta atggtgcaaa tcctactgaa tgctctgtgc gagggttact atgcacaatt 2580 taatcacttt catccctatg ggattcagtg cttcttaaag agttcttaag gattgtgata 2640 tttttacttg cattgaatat attataatct tccatacttc ttcattcaat acaagtgtgg 2700 tagggactta aaaaacttgt aaatgctgtc aactatgata tggtaaaagt tacttattct 2760 agattacccc ctcattgttt attaacaaat tatgttacat ctgttttaaa tttatttcaa 2820 aaagggaaac tattgtcccc tagcaaggca tgatgttaac cagaataaag ttctgagtgt 2880 ttttactaca gttgtttttt gaaaacatgg tagaattgga gagtaaaaac tgaatggaag 2940 gtttgtatat tgtcagatat tttttcagaa atatgtggtt tccacgatga aaaacttcca 3000 tgaggccaaa cgttttgaac taataaaagc ataaatgcaa acacacaaag gtataatttt 3060 atgaatgtct ttgttggaaa agaatacaga aagatggatg tgctttgcat tcctacaaag 3120 atgtttgtca gatatgatat gtaaacataa ttcttgtata ttatggaaga ttttaaattc 3180 acaatagaaa ctcaccatgt aaaagagtca tctggtagat ttttaacgaa tgaagatgtc 3240 taatagttat tccctatttg ttttcttctg tatgttaggg tgctctggaa gagaggaatg 3300 cctgtgtgag caagcattta tgtttattta taagcagatt taacaattcc aaaggaatct 3360 ccagttttca gttgatcact ggcaatgaaa aattctcagt cagtaattgc caaagctgct 3420 ctagccttga ggagtgtgag aatcaaaact ctcctacact tccattaact tagcatgtgt 3480 tgaaaaaaaa gtttcagaga agttctggct gaacactggc aacaacaaag ccaacagtca 3540 aaacagagat gtgataagga tcagaacagc agaggttctt ttaaaggggc agaaaaactc 3600 tgggaaataa gagagaacaa ctactgtgat caggctatgt atggaataca gtgttatttt 3660 ctttgaaatt gtttaagtgt tgtaaatatt tatgtaaact gcattagaaa ttagctgtgt 3720 gaaataccag tgtggtttgt gtttgagttt tattgagaat tttaaattat aacttaaaat 3780 attttataat ttttaaagta tatatttatt taagcttatg tcagacctat ttgacataac 3840 actataaagg ttgacaataa atgtgcttat gttta 3875 <210> 3 <211> 619 <212> PRT <213> Mus musculus <300> <308> Genbank / AAA37577.1 <309> 2005-10-07 <313> (1)..(619) <400> 3 Met Lys Ala Thr Ala Gly Val Met Asn Ala Ser Arg Phe Leu Ser Ala 1 5 10 15 Leu Val Phe Val Leu Leu Ala Gly Glu Ser Thr Ala Trp Tyr Tyr Asn 20 25 30 Ala Ser Ser Glu Leu Met Thr Tyr Asp Glu Ala Ser Ala Tyr Cys Gln 35 40 45 Arg Asp Tyr Thr His Leu Val Ala Ile Gln Asn Lys Glu Glu Ile Asn 50 55 60 Tyr Leu Asn Ser Asn Leu Lys His Ser Pro Ser Tyr Tyr Trp Ile Gly 65 70 75 80 Ile Arg Lys Val Asn Asn Val Trp Ile Trp Val Gly Thr Gly Lys Pro 85 90 95 Leu Thr Glu Glu Ala Gln Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Asn Asn Lys 100 105 110 Gln Arg Asn Glu Asp Cys Val Glu Ile Tyr Ile Gln Arg Thr Lys Asp 115 120 125 Ser Gly Met Trp Asn Asp Glu Arg Cys Asn Lys Lys Lys Leu Ala Leu 130 135 140 Cys Tyr Thr Ala Ser Cys Thr Asn Ala Ser Cys Ser Gly His Gly Glu 145 150 155 160 Cys Ile Glu Thr Ile Asn Ser Tyr Thr Cys Lys Cys His Pro Gly Phe 165 170 175 Leu Gly Pro Asn Cys Glu Gln Ala Val Thr Cys Lys Pro Gln Glu His 180 185 190 Pro Asp Tyr Gly Ser Leu Asn Cys Ser His Pro Phe Gly Pro Phe Ser 195 200 205 Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Phe Gly Cys Lys Arg Gly Tyr Leu Pro Ser 210 215 220 Ser Met Glu Thr Thr Val Arg Cys Thr Ser Ser Gly Glu Trp Ser Ala 225 230 235 240 Pro Ala Pro Ala Cys His Val Val Glu Cys Glu Ala Leu Thr His Pro 245 250 255 Ala His Gly Ile Arg Lys Cys Ser Ser Asn Pro Gly Ser Tyr Pro Trp 260 265 270 Asn Thr Thr Cys Thr Phe Asp Cys Val Glu Gly Tyr Arg Arg Val Gly 275 280 285 Ala Gln Asn Leu Gln Cys Thr Ser Ser Gly Ile Trp Asp Asn Glu Thr 290 295 300 Pro Ser Cys Lys Ala Val Thr Cys Asp Ala Ile Pro Gln Pro Gln Asn 305 310 315 320 Gly Phe Val Ser Cys Ser His Ser Thr Ala Gly Glu Leu Ala Phe Lys 325 330 335 Ser Ser Cys Asn Phe Thr Cys Glu Gln Ser Phe Thr Leu Gln Gly Pro 340 345 350 Ala Gln Val Glu Cys Ser Ala Gln Gly Gln Trp Thr Pro Gln Ile Pro 355 360 365 Val Cys Lys Ala Val Gln Cys Glu Ala Leu Ser Ala Pro Gln Gln Gly 370 375 380 Asn Met Lys Cys Leu Pro Ser Ala Ser Gly Pro Phe Gln Asn Gly Ser 385 390 395 400 Ser Cys Glu Phe Ser Cys Glu Glu Gly Phe Glu Leu Lys Gly Ser Arg 405 410 415 Arg Leu Gln Cys Gly Pro Arg Gly Glu Trp Asp Ser Lys Lys Pro Thr 420 425 430 Cys Ser Ala Val Lys Cys Asp Asp Val Pro Arg Pro Gln Asn Gly Val 435 440 445 Met Glu Cys Ala His Ala Thr Thr Gly Glu Phe Thr Tyr Lys Ser Ser 450 455 460 Cys Ala Phe Gln Cys Asn Glu Gly Phe Ser Leu His Gly Ser Ala Gln 465 470 475 480 Leu Glu Cys Thr Ser Gln Gly Lys Trp Thr Gln Glu Val Pro Ser Cys 485 490 495 Gln Val Val Gln Cys Pro Ser Leu Asp Val Pro Gly Lys Met Asn Met 500 505 510 Ser Cys Ser Gly Thr Ala Val Phe Gly Thr Val Cys Glu Phe Thr Cys 515 520 525 Pro Asp Asp Trp Thr Leu Asn Gly Ser Ala Val Leu Thr Cys Gly Ala 530 535 540 Thr Gly Arg Trp Ser Gly Met Pro Pro Thr Cys Glu Ala Pro Val Ser 545 550 555 560 Pro Thr Arg Pro Leu Val Val Ala Leu Ser Ala Ala Gly Thr Ser Leu 565 570 575 Leu Thr Ser Ser Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Met Arg Tyr Phe Arg Lys 580 585 590 Lys Ala Lys Lys Phe Val Pro Ala Ser Ser Cys Gln Ser Leu Gln Ser 595 600 605 Phe Glu Asn Tyr His Val Pro Ser Tyr Asn Val 610 615 <210> 4 <211> 549 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <300> <308> Genbank / AAA41113 <309> 1993-10-21 <313> (1)..(549) <400> 4 Met Asn Ala Ser Cys Phe Leu Ser Ala Leu Thr Phe Val Leu Leu Ile 1 5 10 15 Gly Lys Ser Ile Ala Trp Tyr Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Leu Met Thr 20 25 30 Tyr Asp Glu Ala Ser Ala Tyr Cys Gln Arg Asp Tyr Thr His Leu Val 35 40 45 Ala Ile Gln Asn Lys Glu Glu Ile Asn Tyr Leu Asn Ser Thr Leu Arg 50 55 60 Tyr Ser Pro Ser Tyr Tyr Trp Ile Gly Ile Arg Lys Val Asn Asn Val 65 70 75 80 Trp Ile Trp Val Gly Thr Gln Lys Pro Leu Thr Glu Glu Ala Lys Asn 85 90 95 Trp Ala Pro Gly Glu Pro Asn Asn Lys Gln Arg Asn Glu Asp Cys Val 100 105 110 Glu Ile Tyr Ile Gln Arg Pro Lys Asp Ser Gly Met Trp Asn Asp Glu 115 120 125 Arg Cys Asp Lys Lys Lys Leu Ala Leu Cys Tyr Thr Ala Ser Cys Thr 130 135 140 Asn Thr Ser Cys Ser Gly His Gly Glu Cys Val Glu Thr Ile Asn Ser 145 150 155 160 Tyr Thr Cys Lys Cys His Pro Gly Phe Leu Gly Pro Lys Cys Asp Gln 165 170 175 Val Val Thr Cys Gln Glu Gln Glu Tyr Pro Asp His Gly Ser Leu Asn 180 185 190 Cys Thr His Pro Phe Gly Leu Phe Ser Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Phe 195 200 205 Ser Cys Glu Arg Gly Tyr Val Pro Ser Ser Met Glu Thr Thr Val Arg 210 215 220 Cys Thr Ser Ser Gly Glu Trp Ser Ala Pro Ala Pro Ala Cys His Val 225 230 235 240 Val Glu Cys Lys Ala Leu Thr Gln Pro Ala His Gly Val Arg Lys Cys 245 250 255 Ser Ser Asn Pro Gly Ser Tyr Pro Trp Asn Thr Thr Cys Thr Phe Asp 260 265 270 Cys Glu Glu Gly Tyr Arg Arg Val Gly Ala Gln Asn Leu Gln Cys Thr 275 280 285 Ser Ser Gly Val Trp Asp Asn Glu Lys Pro Ser Cys Lys Ala Val Thr 290 295 300 Cys Asp Ala Ile Pro Arg Pro Gln Asn Gly Ser Val Ser Cys Ser Asn 305 310 315 320 Ser Thr Ala Gly Ala Leu Ala Phe Lys Ser Ser Cys Asn Phe Thr Cys 325 330 335 Glu His Ser Phe Thr Leu Gln Gly Pro Ala Gln Val Glu Cys Ser Ala 340 345 350 Gln Gly Gln Trp Thr Pro Gln Ile Pro Val Cys Lys Ala Ser Gln Cys 355 360 365 Glu Ala Leu Ser Ala Pro Gln Arg Gly His Met Lys Cys Leu Pro Ser 370 375 380 Ala Ser Ala Pro Phe Gln Ser Gly Ser Ser Cys Lys Phe Ser Cys Asp 385 390 395 400 Glu Gly Phe Glu Leu Lys Gly Ser Arg Arg Leu Gln Cys Gly Pro Arg 405 410 415 Gly Glu Trp Asp Ser Glu Lys Pro Thr Cys Ala Gly Val Gln Cys Ser 420 425 430 Ser Leu Asp Leu Pro Gly Lys Met Asn Met Ser Cys Ser Gly Pro Ala 435 440 445 Val Phe Gly Thr Val Cys Glu Phe Thr Cys Pro Glu Gly Trp Thr Leu 450 455 460 Asn Gly Ser Ser Ile Leu Thr Cys Gly Ala Thr Gly Arg Trp Ser Ala 465 470 475 480 Met Leu Pro Thr Cys Glu Ala Pro Ala Asn Pro Pro Arg Pro Leu Val 485 490 495 Val Ala Leu Ser Val Ala Ala Thr Ser Leu Leu Thr Leu Ser Ser Leu 500 505 510 Ile Tyr Val Leu Lys Arg Phe Phe Trp Lys Lys Ala Lys Lys Phe Val 515 520 525 Pro Ala Ser Ser Cys Gln Ser Leu Gln Ser Phe Glu Asn Tyr Gln Gly 530 535 540 Pro Ser Tyr Ile Ile 545 <210> 5 <211> 611 <212> PRT <213> Canis lupus <300> <308> Genbank / AAA30843 <309> 1993-08-13 <313> (1)..(611) <400> 5 Met Ile Thr Ser Gln Leu Leu Pro Ala Leu Thr Leu Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Phe Lys Glu Gly Gly Ala Trp Ser Tyr Asn Ala Ser Thr Glu Ala Met 20 25 30 Thr Phe Asp Glu Ala Ser Thr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Thr His Leu 35 40 45 Val Ala Ile Gln Asn Gln Glu Glu Ile Lys Tyr Leu Asn Ser Met Phe 50 55 60 Thr Tyr Thr Pro Thr Tyr Tyr Trp Ile Gly Ile Arg Lys Val Asn Lys 65 70 75 80 Lys Trp Thr Trp Ile Gly Thr Gln Lys Leu Leu Thr Glu Glu Ala Lys 85 90 95 Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Asn Asn Lys Gln Asn Asp Glu Asp Cys 100 105 110 Val Glu Ile Tyr Ile Lys Arg Asp Lys Asp Ser Gly Lys Trp Asn Asp 115 120 125 Glu Arg Cys Asp Lys Lys Lys Leu Ala Leu Cys Tyr Thr Ala Ala Cys 130 135 140 Thr Pro Thr Ser Cys Ser Gly His Gly Glu Cys Val Glu Thr Val Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Thr Cys Lys Cys His Pro Gly Phe Arg Gly Leu Arg Cys Glu 165 170 175 Gln Val Val Thr Cys Gln Ala Gln Glu Ala Pro Glu His Gly Ser Leu 180 185 190 Val Cys Thr His Pro Leu Gly Thr Phe Ser Tyr Asn Ser Ser Cys Phe 195 200 205 Val Ser Cys Asp Lys Gly Tyr Leu Pro Ser Ser Thr Glu Ala Thr Gln 210 215 220 Cys Thr Ser Thr Gly Glu Trp Ser Ala Ser Pro Pro Ala Cys Asn Val 225 230 235 240 Val Glu Cys Ser Ala Leu Thr Asn Pro Cys His Gly Val Met Asp Cys 245 250 255 Leu Gln Ser Ser Gly Asn Phe Pro Trp Asn Met Thr Cys Thr Phe Glu 260 265 270 Cys Glu Glu Gly Phe Glu Leu Met Gly Pro Lys Arg Leu Gln Cys Thr 275 280 285 Ser Ser Gly Asn Trp Asp Asn Arg Lys Pro Thr Cys Lys Ala Val Thr 290 295 300 Cys Gly Ala Ile Gly His Pro Gln Asn Gly Ser Val Ser Cys Ser His 305 310 315 320 Ser Pro Ala Gly Glu Phe Ser Val Arg Ser Ser Cys Asn Phe Thr Cys 325 330 335 Asn Glu Gly Phe Leu Met Gln Gly Pro Ala Gln Ile Glu Cys Thr Ala 340 345 350 Gln Gly Gln Trp Ser Gln Gln Val Pro Val Cys Lys Ala Ser Gln Cys 355 360 365 Lys Ala Leu Ser Ser Pro Glu Arg Gly Tyr Met Ser Cys Leu Pro Gly 370 375 380 Ala Ser Gly Ser Phe Gln Ser Gly Ser Ser Cys Glu Phe Phe Cys Glu 385 390 395 400 Lys Gly Phe Val Leu Lys Gly Ser Lys Thr Leu Gln Cys Gly Leu Thr 405 410 415 Gly Lys Trp Asp Ser Glu Glu Pro Thr Cys Glu Ala Val Lys Cys Asp 420 425 430 Ala Val Gln Gln Pro Gln Asp Gly Leu Val Arg Cys Ala His Ser Ser 435 440 445 Thr Gly Glu Phe Thr Tyr Lys Ser Ser Cys Ala Phe Ser Cys Glu Glu 450 455 460 Gly Phe Glu Leu His Gly Ser Ala Gln Leu Glu Cys Thr Ser Gln Gly 465 470 475 480 Gln Gly Val Thr Gly Gly Pro Ser Cys Gln Val Val Gln Cys Phe Lys 485 490 495 Ser Gly Ser Phe Arg Lys Asp Glu His Lys Leu Gln Gly Glu Pro Val 500 505 510 Phe Gly Ala Val Cys Ala Phe Ala Cys Pro Glu Gly Trp Thr Leu Asn 515 520 525 Gly Ser Ala Ala Leu Met Cys Asp Ala Thr Gly His Trp Ser Gly Met 530 535 540 Leu Pro Thr Cys Glu Ala Pro Thr Glu Ser Ser Ile Pro Leu Ala Val 545 550 555 560 Gly Leu Thr Ala Gly Gly Thr Ser Leu Leu Thr Val Ala Ser Phe Leu 565 570 575 Leu Trp Leu Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg Ala Lys Lys Phe Val Pro 580 585 590 Ala Ser Ser Cys Gln Ser Leu Gln Ser Asp Gly Ser Tyr His Met Pro 595 600 605 Cys Ser Ile 610 <210> 6 <211> 484 <212> PRT <213> Ovis aries <300> <308> Genbank / NP_001009749 <309> 2013-04-18 <313> (1)..(484) <400> 6 Met Ile Ala Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Thr Phe Val Leu Leu Phe 1 5 10 15 Lys Glu Ser Arg Thr Trp Ser Tyr His Ala Ser Thr Glu Ile Met Thr 20 25 30 Phe Glu Ala Ala Arg Asp Tyr Cys Gln Lys Thr Tyr Thr Ala Leu Val 35 40 45 Ala Ile Gln Asn Gln Glu Glu Ile Glu Tyr Leu Asn Ser Thr Phe Ser 50 55 60 His Ser Pro Ser Tyr Tyr Trp Ile Gly Ile Arg Lys Ile Asn Gly Thr 65 70 75 80 Trp Thr Trp Ile Gly Thr Asn Lys Ser Leu Thr Glu Glu Ala Thr Asn 85 90 95 Trp Ala Pro Gly Glu Pro Asn Asn Lys Gln Thr Asp Glu Asp Cys Val 100 105 110 Glu Ile Tyr Ile Lys Arg Glu Lys Asp Ser Gly Lys Trp Asn Asp Glu 115 120 125 Asn Cys Thr Lys Lys Lys Phe Ala Leu Cys Tyr Lys Ala Ala Cys Thr 130 135 140 Pro Thr Ser Cys Ser Ser His Gly Glu Cys Val Glu Thr Ile Asn Ser 145 150 155 160 His Thr Cys Gln Cys His Pro Gly Phe Lys Gly Leu Arg Cys Glu Gln 165 170 175 Val Val Thr Cys Gln Ala Gln Lys His Pro Glu His Gly His Leu Val 180 185 190 Cys Asn Pro Leu Gly Lys Phe Thr Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Ile Ser 195 200 205 Cys Ala Glu Gly Tyr Leu Pro Ser Ser Thr Glu Ala Ala Arg Cys Met 210 215 220 Ser Ser Gly Glu Trp Ser Thr Pro Leu Pro Lys Cys Asn Val Val Lys 225 230 235 240 Cys Asp Ala Leu Ser Asn Pro Asp Asn Gly Val Val Asn Cys Ser Gln 245 250 255 Asn His Gly Ser Leu Pro Trp Asn Thr Thr Cys Met Phe Glu Cys Gln 260 265 270 Glu Gly Tyr Lys Leu Thr Gly Pro Gln His Leu Gln Cys Thr Ser Ser 275 280 285 Gly Ile Trp Asp Asn Lys Gln Pro Thr Cys Lys Ala Val Thr Cys Ala 290 295 300 Ala Ile Ser His Pro Gln Asn Gly Thr Val Lys Cys Ser His Ser Leu 305 310 315 320 Val Gly Asp Phe Ala Phe Lys Ser Ser Cys His Phe Thr Cys Ala Glu 325 330 335 Gly Phe Ala Leu Gln Gly Pro Ala Gln Val Glu Cys Thr Ala Gln Gly 340 345 350 Arg Trp Thr Gln Gln Val Pro Val Cys Glu Val Val Arg Cys Ser Arg 355 360 365 Leu Asp Val Ser Gly Lys Leu Asn Met Asp Cys Asn Gly Glu Pro Val 370 375 380 Leu Gly Thr Glu Cys Met Phe Ala Cys Pro Glu Gly Trp Thr Leu Asn 385 390 395 400 Gly Ser Val Ala Leu Thr Cys Gly Ala Thr Gly His Trp Ser Gly Met 405 410 415 Leu Pro Thr Cys Glu Ala Pro Thr Val Ser Gln Thr Pro Leu Ala Val 420 425 430 Gly Leu Ser Thr Ala Gly Val Ser Leu Val Thr Ile Pro Ser Phe Leu 435 440 445 Phe Trp Leu Leu Lys Arg Leu Gln Met Lys Ala Glu Lys Leu Ser Asp 450 455 460 Asp Ser Ser Cys Ser Ser Leu Lys Ser Asn Gly Cys Tyr Ser Thr Pro 465 470 475 480 Ser Glu Leu Val <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ile Ala Ser Gln Phe Leu Ser Ala Leu Thr Leu Val Leu Leu Ile 1 5 10 15 Lys Glu Ser Gly Ala 20 <210> 8 <211> 589 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Mature E-selectin <400> 8 Trp Ser Tyr Asn Thr Ser Thr Glu Ala Met Thr Tyr Asp Glu Ala Ser 1 5 10 15 Ala Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Thr His Leu Val Ala Ile Gln Asn Lys 20 25 30 Glu Glu Ile Glu Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Ser Tyr Ser Pro Ser Tyr 35 40 45 Tyr Trp Ile Gly Ile Arg Lys Val Asn Asn Val Trp Val Trp Val Gly 50 55 60 Thr Gln Lys Pro Leu Thr Glu Glu Ala Lys Asn Trp Ala Pro Gly Glu 65 70 75 80 Pro Asn Asn Arg Gln Lys Asp Glu Asp Cys Val Glu Ile Tyr Ile Lys 85 90 95 Arg Glu Lys Asp Val Gly Met Trp Asn Asp Glu Arg Cys Ser Lys Lys 100 105 110 Lys Leu Ala Leu Cys Tyr Thr Ala Ala Cys Thr Asn Thr Ser Cys Ser 115 120 125 Gly His Gly Glu Cys Val Glu Thr Ile Asn Asn Tyr Thr Cys Lys Cys 130 135 140 Asp Pro Gly Phe Ser Gly Leu Lys Cys Glu Gln Ile Val Asn Cys Thr 145 150 155 160 Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Gly Ser Leu Val Cys Ser His Pro Leu 165 170 175 Gly Asn Phe Ser Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Ile Ser Cys Asp Arg Gly 180 185 190 Tyr Leu Pro Ser Ser Met Glu Thr Met Gln Cys Met Ser Ser Gly Glu 195 200 205 Trp Ser Ala Pro Ile Pro Ala Cys Asn Val Val Glu Cys Asp Ala Val 210 215 220 Thr Asn Pro Ala Asn Gly Phe Val Glu Cys Phe Gln Asn Pro Gly Ser 225 230 235 240 Phe Pro Trp Asn Thr Thr Cys Thr Phe Asp Cys Glu Glu Gly Phe Glu 245 250 255 Leu Met Gly Ala Gln Ser Leu Gln Cys Thr Ser Ser Gly Asn Trp Asp 260 265 270 Asn Glu Lys Pro Thr Cys Lys Ala Val Thr Cys Arg Ala Val Arg Gln 275 280 285 Pro Gln Asn Gly Ser Val Arg Cys Ser His Ser Pro Ala Gly Glu Phe 290 295 300 Thr Phe Lys Ser Ser Cys Asn Phe Thr Cys Glu Glu Gly Phe Met Leu 305 310 315 320 Gln Gly Pro Ala Gln Val Glu Cys Thr Thr Gln Gly Gln Trp Thr Gln 325 330 335 Gln Ile Pro Val Cys Glu Ala Phe Gln Cys Thr Ala Leu Ser Asn Pro 340 345 350 Glu Arg Gly Tyr Met Asn Cys Leu Pro Ser Ala Ser Gly Ser Phe Arg 355 360 365 Tyr Gly Ser Ser Cys Glu Phe Ser Cys Glu Gln Gly Phe Val Leu Lys 370 375 380 Gly Ser Lys Arg Leu Gln Cys Gly Pro Thr Gly Glu Trp Asp Asn Glu 385 390 395 400 Lys Pro Thr Cys Glu Ala Val Arg Cys Asp Ala Val His Gln Pro Pro 405 410 415 Lys Gly Leu Val Arg Cys Ala His Ser Pro Ile Gly Glu Phe Thr Tyr 420 425 430 Lys Ser Ser Cys Ala Phe Ser Cys Glu Glu Gly Phe Glu Leu His Gly 435 440 445 Ser Thr Gln Leu Glu Cys Thr Ser Gln Gly Gln Trp Thr Glu Glu Val 450 455 460 Pro Ser Cys Gln Val Val Lys Cys Ser Ser Leu Ala Val Pro Gly Lys 465 470 475 480 Ile Asn Met Ser Cys Ser Gly Glu Pro Val Phe Gly Thr Val Cys Lys 485 490 495 Phe Ala Cys Pro Glu Gly Trp Thr Leu Asn Gly Ser Ala Ala Arg Thr 500 505 510 Cys Gly Ala Thr Gly His Trp Ser Gly Leu Leu Pro Thr Cys Glu Ala 515 520 525 Pro Thr Glu Ser Asn Ile Pro Leu Val Ala Gly Leu Ser Ala Ala Gly 530 535 540 Leu Ser Leu Leu Thr Leu Ala Pro Phe Leu Leu Trp Leu Arg Lys Cys 545 550 555 560 Leu Arg Lys Ala Lys Lys Phe Val Pro Ala Ser Ser Cys Gln Ser Leu 565 570 575 Glu Ser Asp Gly Ser Tyr Gln Lys Pro Ser Tyr Ile Leu 580 585 <210> 9 <211> 1860 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 atgaaagcaa ctgctggagt catgaatgcc tcgcgctttc tctctgctct tgtttttgtt 60 ctcctcgctg gagagagcac agcttggtac tacaatgcct ccagtgagct catgacgtat 120 gatgaagcca gtgcatactg tcagcgggac tacacacatc tggtggcgat tcagaacaag 180 gaagagatca actaccttaa ctccaatctg aaacattcac cgagttacta ctggattgga 240 atcagaaaag tcaataacgt atggatctgg gtggggacgg ggaagcctct gacagaggaa 300 gctcagaact gggctccagg tgaaccaaac aacaaacaaa gaaatgagga ctgtgtagag 360 atttacatcc aacgaaccaa agactcgggc atgtggaatg acgagagatg taacaaaaag 420 aagctggctc tgtgctacac agcttcgtgt accaatgcat cctgcagtgg tcatggtgaa 480 tgcatagaga ccatcaatag ttacacctgc aagtgccacc ctggcttcct gggacccaac 540 tgtgagcaag ctgtgacttg caaaccacag gaacaccctg actatggaag cctgaactgc 600 tcccacccgt tcggcccctt cagctataat tcctcctgct cctttggctg taaaaggggc 660 tacctgccca gcagcatgga gaccaccgtg cggtgtacgt cctctggaga gtggagtgcg 720 cctgctccag cctgccatgt ggttgaatgt gaagctttga cccaccctgc ccacggtatc 780 aggaaatgtt cctcaaatcc tgggagctac ccatggaaca cgacatgcac gtttgactgt 840 gtggaagggt acaggcgagt tggagctcag aatctacagt gtacctcatc tggcatctgg 900 gataacgaga cgccatcatg caaagctgtg acctgtgacg ccatccctca gcctcagaat 960 ggctttgtga gctgcagcca ctcaacagct ggagaacttg cgtttaagtc atcctgtaac 1020 ttcacctgtg agcagagttt cacgttgcag gggccagcgc aggttgaatg cagcgcacaa 1080 gggcagtgga caccacaaat cccagtctgc aaagctgtcc agtgtgaagc cttatctgcg 1140 ccacagcagg gcaacatgaa atgtcttccc agtgcttctg gacctttcca aaatgggtcc 1200 agttgtgagt tctcctgcga agaaggattt gaactgaagg gatcaagaag acttcagtgt 1260 ggtccaagag gggaatggga tagcaagaag cccacgtgtt cagctgtgaa atgtgatgat 1320 gtccctcggc cccagaatgg cgtcatggag tgtgctcatg ctactactgg agaattcacc 1380 tacaagtcct catgtgcctt tcaatgcaat gagggcttta gcttgcatgg ctcagctcaa 1440 cttgagtgca catctcaggg aaagtggacc caggaagtcc cctcctgcca agtggtacaa 1500 tgtccaagcc ttgacgtccc gggaaagatg aacatgagct gcagcggaac agcagttttc 1560 ggcacagtgt gtgagtttac atgtcctgat gattggacac tcaatggatc tgcagttctg 1620 acgtgtggtg ccacgggacg ctggtctggg atgccgccta cctgtgaagc cccagtcagc 1680 cccacccgtc ccttggtagt tgcactttct gcggcaggaa cctcactcct gacatcgtcc 1740 tcattgctct acttgttgat gagatacttt cggaagaaag caaagaaatt tgttcctgct 1800 agcagctgcc aaagccttca atcatttgaa aactaccatg tgccttctta caacgtctag 1860

Claims (21)

  1. 대상체의 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV 혈청형 2(AAV2) 역방위 말단 반복부(ITR; inverted terminal repeat), 및 혈청형 2 이외의 AAV로부터의 캡시드를 포함하는 하이브리드 아데노연관 바이러스(AAV; adenoassociated virus)를, 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 대상체의 허혈 조직에서 혈관신생(angiogeneis), 신혈관형성(neovascularization) 또는 혈관재생(revascularization)을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV 혈청형 2(AAV2) 역방위 말단 반복부(ITR), 및 혈청형 2 이외의 AAV로부터의 캡시드를 포함하는 하이브리드 아데노연관 바이러스(AAV)를, 허혈 조직에서 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 유도하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 대상체에서 골격근 생존력(viability)을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV 혈청형 2(AAV2) 역방위 말단 반복부(ITR), 및 혈청형 2 이외의 AAV로부터의 캡시드를 포함하는 하이브리드 아데노연관 바이러스(AAV)를, 골격근 생존력을 증가시키기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 대상체에서 허혈성 피부 상처 치유를 촉진하는 방법으로서, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV 혈청형 2(AAV2) 역방위 말단 반복부(ITR), 및 혈청형 2 이외의 AAV로부터의 캡시드를 포함하는 하이브리드 아데노연관 바이러스(AAV)를, 허혈성 피부 상처 치유를 촉진하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 대상체에서 괴저를 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV 혈청형 2(AAV2) 역방위 말단 반복부(ITR), 및 혈청형 2 이외의 AAV로부터의 캡시드를 포함하는 하이브리드 아데노연관 바이러스(AAV)를, 대상체에서 괴저를 치료하거나 예방하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 중증 하지 허혈(CLI; critical limb ischemia)을 갖고 있는, 방법.
  7. 대상체에서 중증 하지 허혈(CLI)을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV 혈청형 2(AAV2) 역방위 말단 반복부(ITR), 및 혈청형 2 이외의 AAV로부터의 캡시드를 포함하는 하이브리드 아데노연관 바이러스(AAV)를, CLI를 치료하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 말초 동맥 질병(PAD; peripheral artery disease)을 갖고 있는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캡시드가 AAV 혈청형 8 캡시드이고, 상기 하이브리드 AAV가 AAV2/8인, 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캡시드가 AAV 혈청형 9 캡시드이고, 상기 하이브리드 AAV가 AAV2/9인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV를 골격근의 허혈 조직에 근육내 투여하는, 방법.
  12. 대상체의 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV 혈청형 2(AAV2) 역방위 말단 반복부(ITR), 및 AAV2 캡시드를 포함하는 아데노연관 바이러스(AAV)를 포함하는 세포를, 허혈 조직에서 혈류 또는 관류를 증가시키기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 대상체의 허혈 조직에서 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV 혈청형 2(AAV2) 역방위 말단 반복부(ITR), 및 AAV2 캡시드를 포함하는 아데노연관 바이러스(AAV)를 포함하는 세포를, 허혈 조직에서 혈관신생, 신혈관형성 또는 혈관재생을 유도하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 대상체에서 허혈성 피부 상처 치유를 촉진하는 방법으로서, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV 혈청형 2(AAV2) 역방위 말단 반복부(ITR), 및 AAV2 캡시드를 포함하는 아데노연관 바이러스(AAV)를 포함하는 세포를, 허혈성 피부 상처 치유를 촉진하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 대상체에서 괴저를 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV 혈청형 2(AAV2) 역방위 말단 반복부(ITR), 및 AAV2 캡시드를 포함하는 아데노연관 바이러스(AAV)를 포함하는 세포를, 대상체에서 괴저를 치료하거나 예방하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 중증 하지 허혈(CLI)을 갖고 있는, 방법.
  17. 대상체에서 중증 하지 허혈(CLI)을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 E-셀렉틴을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV 혈청형 2(AAV2) 역방위 말단 반복부(ITR), 및 AAV2 캡시드를 포함하는 아데노연관 바이러스(AAV)를 포함하는 세포를, 대상체에서 CLI를 치료하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 말초 동맥 질병(PAD)을 갖고 있는, 방법.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 줄기세포인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 세포가 간엽 줄기세포(MSC), 골수(BM)-유래 전구 세포, 또는 내피 전구 세포(EPC)인, 방법.
  21. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 대상체에게 자기(자가)인, 방법.
KR1020197035559A 2017-05-02 2018-05-02 허혈 조직을 치료하는 방법 KR20200013674A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762500470P 2017-05-02 2017-05-02
US62/500,470 2017-05-02
PCT/US2018/030615 WO2018204475A1 (en) 2017-05-02 2018-05-02 Method for treating ischemic tissue

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200013674A true KR20200013674A (ko) 2020-02-07

Family

ID=64016314

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197035559A KR20200013674A (ko) 2017-05-02 2018-05-02 허혈 조직을 치료하는 방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20200062820A1 (ko)
EP (1) EP3618852A4 (ko)
JP (1) JP7450244B2 (ko)
KR (1) KR20200013674A (ko)
CN (1) CN110769861A (ko)
AU (1) AU2018261420A1 (ko)
CA (1) CA3097135A1 (ko)
IL (1) IL270388B2 (ko)
WO (1) WO2018204475A1 (ko)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010123699A2 (en) * 2009-04-21 2010-10-28 University Of Miami Compositions, kits and methods for promoting ischemic and diabetic wound healing

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020518644A (ja) 2020-06-25
AU2018261420A1 (en) 2019-12-12
IL270388B2 (en) 2024-03-01
US20200062820A1 (en) 2020-02-27
IL270388B1 (en) 2023-11-01
EP3618852A4 (en) 2021-01-06
CN110769861A (zh) 2020-02-07
IL270388A (ko) 2019-12-31
WO2018204475A1 (en) 2018-11-08
JP7450244B2 (ja) 2024-03-15
CA3097135A1 (en) 2018-11-08
EP3618852A1 (en) 2020-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2967616T3 (es) Tratamiento de AMD mediante el uso de AAV sFLT-1
US20150139952A1 (en) Methods, compositions, cells, and kits for treating ischemic injury
CA2505213A1 (en) Cell-based vegf delivery
US20150322410A1 (en) Hypoxia regulated conditionally silenced aav expressing angiogenic inducers
JP2002514899A (ja) 組換えａａｖベクターを用いて血管中の細胞を形質導入するための方法
JP2015503924A (ja) 遺伝子導入のための方法及び組成物
Quiroz et al. E-selectin-overexpressing mesenchymal stem cell therapy confers improved reperfusion, repair, and regeneration in a murine critical limb ischemia model
US20210130429A1 (en) Recombinant adeno-associated virus-mediated expression of fractalkine for treatment of neuroinflammatory and neurodegenerative diseases
JP2012524781A (ja) 虚血性及び糖尿病性創傷の治癒を促進する組成物、キット及び方法
US20170252462A1 (en) Extended antegrade epicardial coronary infusion of adeno-associated viral vectors for gene therapy
KR20190050277A (ko) 허혈성 심혈관 질환의 치료용 또는 예방용 약학 조성물
JP7450244B2 (ja) 虚血組織を治療するための方法
Korpela et al. Therapeutic angiogenesis: Translational and clinical experience
WO2024216156A1 (en) Method for promoting myogenesis and skeletal muscle recovery
Puligadda In vivo evaluation of the cardioprotective activity of VEGF-B
Lostal et al. 944. Efficient Recovery of Dysferlin Deficiency by Dual Adeno-Associated Vectors Mediated Gene Transfer

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application