CN110769861A

CN110769861A - 治疗缺血性组织的方法

Info

Publication number: CN110769861A
Application number: CN201880040949.0A
Authority: CN
Inventors: O·韦拉斯克斯; Z-J·刘
Original assignee: University of Miami
Current assignee: University of Miami
Priority date: 2017-05-02
Filing date: 2018-05-02
Publication date: 2020-02-07
Also published as: JP2020518644A; JP7450244B2; WO2018204475A1; EP3618852A4; IL270388A; IL270388B1; US20200062820A1; KR20200013674A; EP3618852A1; IL270388B2; CA3097135A1; AU2018261420A1

Abstract

本发明提供一种增加缺血性组织中的血流或灌注；诱导血管生成、新血管形成或血管再形成；增加骨骼肌活力；促进缺血性皮肤伤口愈合；治疗或预防坏疽；和/或治疗CLI的方法。在各种方面，所述方法包含向个体给药杂交腺相关病毒(AAV)，其包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV血清型2(AAV2)反向末端重复序列(ITR)和来自除血清型2之外的AAV的衣壳。在各种方面，所述方法包含向所述个体给药包含AAV的细胞，所述AAV包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV2 ITR和AAV2衣壳。

Description

治疗缺血性组织的方法

资助资金披露

本发明是在政府支持下、由美国国家卫生研究院/国立心肺血研究所授予的授权号HHSN268201700008C完成的。政府对本发明享有一定权利。

通过引用并入电子递交的材料

以全文引用的方式并入本文中与本申请同时提交的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表且标识如下：命名为“51600A_SeqListing.txt”的38,503字节ACII(Text)档案；创建于2018年5月1日。

技术领域

本公开涉及用于治疗缺血性组织的材料和方法。

背景技术

严重肢体缺血(CLI)为一种供应肢体的动脉的严重堵塞，且表示由全身性动脉粥样硬化引起的外周动脉疾病(PAD)的晚期。在动脉粥样硬化中，脂肪沉积物(斑块)积聚在动脉壁中并且使得血液难以流过动脉。与动脉粥样硬化相关的动脉堵塞大大降低了到肢体(腿、脚和手)的血流，且可能导致严重的疼痛、皮肤溃疡、疮、坏疽和/或组织损失。许多患者大面积截肢的风险很高，身体机能差，生活质量严重下降。特别地，糖尿病患者的CLI具有高发病率和死亡率。

在美国，每年有大约160,000患有CLI的新患者。当疾病进展到CLI状态时，药物治疗对PAD的结果作用有限。当前旨在改善流向患肢血液的CLI标准疗法是通过外科手术绕过堵塞的血管或进行血管内血管再形成(重新开放堵塞的血管)，其包括经皮腔内血管成形术(PTA)和置入支架。但是，由于手术风险高，血管阻塞复发率高，移植失败率高或血管内解剖结构不利(尤其是在膝盖以下区域)，约20％到40％的患者不适合这种干预。这些患者通常除了截肢外没有其他选择。

需要新的有效策略为罹患缺血的患者提供一种可行的治疗方案。

发明内容

本公开提供一种增加个体的缺血性组织中的血流或灌注的方法。方法包含向个体给药增加缺血性组织中的血流或灌注的有效量的杂交腺相关病毒(AAV)，其包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV血清型2(AAV2)反向末端重复序列(ITR)和来自除血清型2之外的AAV的衣壳。

还提供一种诱导个体的缺血性组织中的血管生成、新血管形成或血管再形成的方法，方法包含向个体给药诱导缺血性组织中的血管生成、新血管形成或血管再形成的有效量的杂交AAV，其包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV2 ITR和来自除血清型2之外的AAV的衣壳。

本公开进一步提供一种增加个体的骨骼肌活力的方法。方法包含向个体给药增加骨骼肌活力的有效量的杂交AAV，其包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV2 ITR和来自除血清型2之外的AAV的衣壳。

另外，提供一种促进个体的缺血性皮肤伤口愈合的方法。方法包含向个体给药促进缺血性皮肤伤口愈合的有效量的杂交AAV，其包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV2ITR和来自除血清型2之外的AAV的衣壳。

本公开还涉及一种治疗或预防个体的坏疽的方法，方法包含向个体给药治疗或预防个体的坏疽的有效量的杂交AAV，其包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV2 ITR和来自除血清型2之外的AAV的衣壳。还提供一种治疗个体的严重肢体缺血(CLI)的方法。方法包含向个体给药治疗CLI的有效量的杂交AAV，其包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV2 ITR和来自除血清型2之外的AAV的衣壳。

本公开另外提供一种增加个体的缺血性组织中的血流或灌注的方法，方法包含向个体给药增加缺血性组织中的血流或灌注的有效量的包含AAV的细胞，所述AAV包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV2 ITR和AAV2衣壳。

还提供一种诱导个体的缺血性组织中的血管生成、新血管形成或血管再形成的方法。方法包含向个体给药诱导缺血性组织中的血管生成、新血管形成或血管再形成的有效量的包含AAV的细胞，所述AAV包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV2 ITR和AAV2衣壳。

提供一种促进个体的缺血性皮肤伤口愈合的方法，其中方法包含向个体给药促进缺血性皮肤伤口愈合的有效量的包含AAV的细胞，所述AAV包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV2 ITR和AAV2衣壳。本公开还涉及一种治疗或预防个体的坏疽的方法，方法包含向个体给药治疗或预防个体的坏疽的有效量的包含AAV的细胞，所述AAV包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV2 ITR和AAV2衣壳。还提供一种治疗个体的严重肢体缺血的方法，其中方法包含向个体给药治疗个体的CLI的有效量的包含AAV的细胞，所述AAV包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV2 ITR和AAV2衣壳。

前述发明内容并非旨在限定本发明的每个方面，并且在其它部分如具体实施方式中描述了另外的方面。整个文档旨在作为统一的公开内容相关联，并且应理解，设想了本文所描述的特征的所有组合，即便特征的组合未在本文档的同一个句子或段落或部分中找到。此外，作为附加方面，本发明包括本发明的所有实施例在范围上以任何方式比上述具体提及的变型更窄。应理解，相对于以“一个/一种”所描述或所要求保护的本发明的方面，除非上下文明确地要求更为受限的含义，否则这些术语意指“一种或多种”。应理解，相对于描述为集合内的一或多种元件，预期在集合内的所有组合。如果将本发明的方面描述为“包含”特征，则还预期实施例“由所述特征组成”或“主要由所述特征组成”。

虽然一或多个申请人发明随附在此的要求的全部范围，但是随附在此的要求并不意图在其范围内涵盖其他人的现有技术的工作。因此，在通过专利局或其它实体或个人使申请人关注到权利要求的范围内的法定或司法上认可的现有技术的情况下，一或多个申请人保留在可适用的专利法律下实行修改权利的权力，以重新界定这类权利要求的主题以从这类权利要求的范围中特别排除这类现有技术或法定现有技术的明显变型。由这类修改的权利要求界定的本发明的变型也旨在为本发明的方面。根据本申请的全部内容，本发明的附加特征和变型将对于所属领域的技术人员是显而易见的，并且所有这类特征旨在为本发明的方面。

附图说明

图1：各种杂交AAV在小鼠缺血性肢体组织中的组织细胞的感染中的功效。将1×10⁹vg的GFP/AAV2/2、GFP/AAV2/5、GFP/AAV2/8和GFP/AAV2/9肌肉内注射到接受股动脉结扎的FVB小鼠(n＝3)的内壁半膜绳肌中。在AAV注射后7天内收集肢体组织并且进行免疫荧光染色。计算每个高倍视野(HPF，40倍；y轴)的GFP+细胞数量。AAV2/8和AAV2/9在感染组织细胞中展现出较高功效。

图2：E选择蛋白/AAV基因疗法改善了缺血性肢体中的骨骼肌活力。LacZ/AAV(左柱；x轴)与E选择蛋白/AAV(右柱；x轴)术后Faber缺血评分(y轴)。LacZ/AAV n＝7；E选择蛋白/AAV n＝10。术后(POD)第1天(LacZ/AAV＝2.57，E选择蛋白/AAV＝1.1)：p＝0.213；POD 2(LacZ/AAV＝2.71，E选择蛋白/AAV＝1.4)：p＝0.253；POD 3(LacZ/AAV＝3，E选择蛋白/AAV＝1.5)：p＝0.168；POD 7(LacZ/AAV＝3.86，E选择蛋白/AAV＝1.9)：*p＝0.041；POD 14(LacZ/AAV＝5.29，E选择蛋白/AAV＝2.4)：**p＝0.009。

图3：E选择蛋白/AAV基因疗法改善了缺血性肢体灌注。LacZ/AAV与E选择蛋白/AAV激光多普勒成像(LDI)灌注比。LacZ/AAV n＝7；E选择蛋白/AAV n＝10。术前：p＝0.659；术后(POD)第7天：p＝0.066；POD 14：*p＝0.008。

图4：E选择蛋白/AAV基因疗法改善了坏疽足中的新血管形成和足灌注。结扎和未结扎肢体(x轴)的LacZ/AAV与E选择蛋白/AAV活体动物Dil灌注平均强度评分(y轴)。LacZ/AAV：n＝5；E选择蛋白/AAV：n＝5；结扎肢体(LacZ/AAV＝22.1，E选择蛋白/AAV＝43.86)：*p<0.027；未结扎肢体(LacZ/AAV＝26.7，E选择蛋白/AAV＝49.48)：**p<0.005。

图5：相较于E选择蛋白结扎肢体(x轴)，LacZ/AAV结扎肢体中肌原纤维/hpf(y轴)数量更高；*p<0.0001。每个高倍视野(HPF)的肌原纤维平均数的定量数据表明，相较于LacZ结扎肢体，E选择蛋白/AAV结扎肢体中肌原纤维数量高得多。

图6：表示0到10(x轴)的伤口愈合面积百分比(y轴)的定量数据。LacZ/AAV(底线)：n＝10；E选择蛋白/AAV(顶线)：n＝11。POD 0：p<0.000127；POD1：0.000441；POD2：p<0.000189；POD3到10：p<0.0001。

图7：包含AAV2复制酶和AAV9衣壳的杂交AAV的示意性说明。

图8：用于转导本公开细胞的AAV的示意性说明。

图9：经L-NAME处理的FVB小鼠中的高肢坏疽的代表性成像。具有坏疽的缺血性肢体为方形且将POD1和POD3时发育出的坏疽由红色箭头指出。

图10：在指定时间点(术前和术后，POD 7和POD14)用E选择蛋白/AAV2(顶行)或LacZ/AAV2(底行)处理的小鼠的激光多普勒成像。

图11：LacZ/AAV处理或E选择蛋白/AAV处理的未结扎和结扎肢体的小鼠成像。

图12A和图12B：在10倍放大倍数下，E选择蛋白/AAV结扎与LacZ结扎肢体的苏木精和曙红染色的显微成像。

图13：用E选择蛋白/AAV或LacZ/AAV处理的小鼠的指定时间点的伤口成像。

具体实施方式

在各种方面，本公开涉及用于增加个体的缺血性组织中的血流或灌注；诱导血管生成、新血管形成或血管再形成；增加个体(任选地罹患缺血(如严重肢体缺血(CLI))或处于罹患其风险下的个体)的骨骼肌活力；促进个体的缺血性皮肤伤口愈合；治疗或预防个体的坏疽；和/或治疗个体的CLI的材料和方法。在各种方面，方法包含向个体给药有效量的杂交腺相关病毒(AAV)，其包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV血清型2(AAV2)反向末端重复序列(ITR)和来自除血清型2之外的AAV的衣壳。在各种方面，方法包含向个体给药达成所期望的生物反应(即，诱导缺血性组织中的血管生成、新血管形成或血管再形成等)的有效量的包含AAV的细胞，所述AAV包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV2 ITR和AAV2衣壳。本公开首先显示由病毒介导的E选择蛋白的生成改善了活体内坏疽症状。

下文进一步描述本发明的各方面。章节标题的使用仅是为了阅读的方便，并不旨在对其本身进行限制。整个文档旨在被视为统一的公开，并且应当理解，可以预期本文所述特征的所有组合。

E选择蛋白

选择蛋白为一种通常在内皮细胞上表达的细胞粘附分子。E选择蛋白也被称为CD62抗原类家庭成员E(CD62E)、内皮细胞白细胞粘附分子1(ELAM-1)和白细胞内皮细胞粘附分子2(LECAM2)。在各种方面，E选择蛋白为原生人类E选择蛋白。在这点上，编码E选择蛋白的核酸序列任选地是编码人类E选择蛋白(即，SEQ ID NO:1的E选择蛋白，其对应于登录号AAQ67702,NP_000441.2)的核酸序列。在例示性方面，核酸序列对人类E选择蛋白的成熟形式进行编码，并且不含信号肽MIASQFLSALTLVLLIKESGA(SEQ ID NO:7)。在例示性方面，核酸序列对SEQ ID NO:8的人类E选择蛋白的成熟形式进行编码。在各种实施例中，核酸序列编码一种与SEQ ID NO:1具有至少65％(例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或99％)氨基酸序列一致性的蛋白，并且表明至少一种与原生E选择蛋白相关的活性，如介导EC-EPC粘附或促进发炎部位处的血液白细胞积聚。在各种方面，编码E选择蛋白的核酸序列阐述于SEQ ID NO:2中，其对应于登录号NM_000450。应了解，还涵盖了一种编码人类E选择蛋白的等位基因变异型和同系物的核酸。在各种实施例中，核酸序列与SEQ ID NO:2具有至少65％(例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或99％)一致性。必要时也可使用非人类、哺乳动物E选择蛋白；小鼠E选择蛋白(GenBank登录号AAA37577.1)、大鼠E选择蛋白(GenBank登录号AAA41113.1)、犬类E选择蛋白(GenBank登录号AAA30843.1)和羊类E选择蛋白(GenBank登录号NP_001009749.1)的氨基酸序列分别以SEQ ID NO:3至6提供。

如本文所用，“至少90％一致性”和类似术语涵盖例如90％到100％的任何整数，诸如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等。并且，术语“至少[百分比]一致性”涵盖大于或等于相同核苷酸或氨基酸的数目除以核苷酸或氨基酸的总数的任何百分比([至少百分比一致性]×[相同核苷酸或氨基酸的数目]/[核苷酸或氨基酸的总数])。两种或更多种序列的比对氨基酸(或核苷酸)的一致性百分比计算是所属领域中众所周知的并且常规地使用已知计算机程序来确定。举例来说，使用Altschul等人所述的算法任选地进行两种或更多种序列的比对，以确定序列一致性百分比。(核酸研究，25:3389-402(1997))并入BLAST(基本局部比对搜索工具)程序中，所述程序可在美国国家生物技术信息中心网站上获得。

可以通过产生引起编码多肽变化的核苷酸取代来产生不同于SEQ IDNO：1的变异型E选择蛋白。取代的实例为引起(a)多肽骨干结构；(b)多肽的电荷或疏水性；或(c)氨基酸侧链主体变化的取代。在各种方面，变异型E选择蛋白包含一或多种保守性取代，即蛋白的至少一种氨基酸经另一种具有类似特征的氨基酸取代。

腺相关病毒

在各种实施例中，方法包含向个体给药有效量的杂交腺相关病毒(AAV)，其包含编码E选择蛋白的核苷酸序列。“杂交AAV”意指包含至少两种AAV血清型部分的AAV。在例示性方面，杂交AAV不是天然情况下发生的且其经工程化以组成来自两种不同AAV血清型的AAV部分。“杂交AAV”与Choi等人，《当代基因疗法(Current Gene Ther)》5(3):299-310(2005)和Wu等人，《分子治疗学(Mol Ther.)》14(3):316-27(2006)中所述的AAV杂交血清型同义。在例示性方面，杂交AAV包含病毒基因组中的AAV2ITR，病毒基因组封装于来自除血清型2之外的AAV的衣壳中。AAV介导了目标细胞中E选择蛋白的生成。在各种方面，方法包含向个体给药包含AAV的细胞，所述AAV包含封装于AAV2衣壳的病毒基因组，其包含编码E选择蛋白的核苷酸序列和AAV2 ITR。

AAV为一种已知不会引起人类疾病的DNA病毒，使得其成为所期望的基因疗法选择。AAV基因组由两种基因(rep和cap)组成，两种基因通过含有用于DNA复制和病毒封装的识别信号的反向末端重复序列(ITR)侧接。为了有效复制，AAV需要与辅助病毒(即腺病毒或疱疹病毒)共感染或表达辅助基因。用于给药治疗性核酸的AAV载体通常具有大部分缺失的亲本基因组，使得仅保留ITR，而这并非所需的。必要时，递送AAV rep蛋白使得包含AAV ITR的AAV载体能够整合到基因组的特定区域中。包含整合AAV基因组的宿主细胞未展现出细胞生长或形态变化。因此，AAV载体治疗因素的延长表达可适用于治疗持续性和慢性疾病。本公开情形中所用的AAV是基于AAV型2，并且递送到个体或细胞的病毒基因组包含AAV2 ITR。其它AAV血清型包括AAV型1、AAV型3(包含型3A和3B)、AAV型4、AAV型5、AAV型6、AAV型7、AAV型8、AAV型9、AAV型10或AAV型11。AAV基因组序列以及ITR、Rep蛋白的序列和衣壳亚单位为所属领域中已知的。参见例如国际专利公开案第WO 00/28061号、第WO 99/61601号、第WO98/11244号；以及美国专利第6,156,303号，Srivistava等人(1983)《病毒学杂志(JVirol.)》45:555；Chiorini等人(1998)《病毒学杂志》71:6823；Xiao等人(1999)《病毒学杂志》73:3994；Shade等人(1986)《病毒学杂志》58:921及Gao等人(2002)美国国家科学院院刊99:11854。

在各种方面，AAV包含一种缺乏全部或部分原生AAV基因组的病毒基因组。举例来说，AAV基因组缺乏所有原生AAV蛋白编码序列，但保留AAV ITR(例如，AAV2 ITR)，且进一步包含编码E选择蛋白的核酸序列。

可将包含核酸序列和AAV2 ITR的病毒基因组并入到病毒粒子中(即，封装于病毒衣壳中)，以促进基因组引入细胞中。AAV衣壳蛋白构成了病毒粒子的外部非核酸部分并且由AAV cap基因编码。Cap基因对病毒粒子组装所需的三种病毒外壳蛋白VP1、VP2和VP3进行编码。美国专利第5,173,414号；第5,139,941号；第5,863,541号；第5,869,305号；第6,057,152号和第6,376,237号；Rabinowitz等人《病毒学杂志》76:791-801,2002和Bowles等人《病毒学杂志》77:423-432,2003中描述了对AAV病毒粒子的建构。

在各种实施例中，将包含AAV2 ITR的AAV基因组封装于来源于血清型其它AAV2的衣壳中。这种AAV载体被称为“假型”AAV或“杂交”AAV。将AAV2病毒基因组(包含编码E选择蛋白的核酸序列和AAV2 ITR)任选地封装于来自AAV型1、AAV型3(包含型3A和3B)、AAV型4、AAV型5、AAV型6、AAV型7、AAV型8、AAV型9、AAV型10或AAV型11的衣壳中。在各种方面，将AAV2病毒基因组封装于AAV8衣壳(AAV2/8)或AAV9衣壳(AAV2/9)中。涉及构造和使用假型AAV的技术进一步描述于例如杜安Duan等人,《病毒学杂志》,75:7662-7671,2001；Halbert等人,《病毒学杂志》,74:1524-1532,2000；Zolotukhin等人,方法,28:158-167,2002；和Auricchio等人,《人类分子遗传学(Hum.Molec.Genet.Genet.)》10:3075-3081,2001。在例示性方面，本公开的杂交AAV包含图7中所示的元件。在例示性方面，本公开的杂交AAV包含图7中所示的结构。

任选地，病毒衣壳(即，粒子表面)经修饰以调节病毒向性。举例来说，衣壳的组件可经修饰以例如扩展由所得载体转导的细胞类型，避免(完全或部分)非所期望细胞类型的转导，或改善所期望细胞类型的转导效率(例如通过在所期望细胞类型上并入细胞表面受体的配体)。转导效率一般通过参考对照(即，未经修饰的匹配病毒载体)来确定。改善转导效率可致使例如改善给定细胞类型的转导速率至少约25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、100％。必要时，衣壳可经修饰以使得其不会有效地转导非目标组织，如肝细胞或生殖细胞(例如，所期望目标组织转导水平的50％或更低、30％或更低、20％或更低、10％或更低、5％或更低)。构造和表征包括插入突变体、丙氨酸筛选突变体和表位标签突变体的AAV衣壳突变体描述于Wu等人，《病毒学杂志》74:8635-45,2000。可用于本文所述方法的其它AAV包括由病毒的分子育种以及外显子改组产生的衣壳杂交物。参见Soong等人,《自然遗传学(Nat.Genet.)》25:436-439,2000；以及Kolman和Stemmer《自然生物技术(Nat.Biotechnol)》19:423-428,2001。

构造和使用不同血清型AAV载体和AAV蛋白表述于Chao等人，《分子治疗(Mol.Ther.)》2:619-623,2000；Davidson等人，PNAS 97:3428-3432,2000；Xiao等人，《病毒学杂志》72:2224-2232,1998；Halbert等人，《病毒学杂志》74:1524-1532,2000；Halbert等人，《病毒学杂志》75:6615-6624,2001和Auricchio等人，《病毒学杂志》《人类分子遗传学(Hum.Molec.Genet.Genet.)》10:3075-3081,2001，其全部特此以引用的方式并入，尤其关于AAV生成的论述。还论述了使用AAV载体的方法，例如在Tal,J.《生物医学(J.Biomed.Sci.)》科学7:279-291,2000以及Monahan和Samulski,《基因递送(Genedelivery)》7:24-30,2000。

表达载体(如AAV载体)通常含有转录和翻译可操作地连接的编码序列所必需的多种核酸序列。举例来说，表达载体可包含复制来源、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子、增强子等。本公开的AAV载体优选地包含一种可操作地连接到E选择蛋白编码序列的启动子。“可操作地连接”是指一种控制序列(如启动子)相对于另一种核酸序列处于正确位置和方向，以对核酸序列发挥其作用(例如转录起始)。启动子对于与其可操作地连接的核酸序列可为原生或非原生的，并且对于特定目标细胞类型可为原生或非原生的，并且在各种方面，启动子可为组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子。组成型启动子的实例包括单纯疱疹病毒(HSV)、胸苷激酶(TK)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、猴病毒40(SV40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、Ad E1A和巨细胞病毒(CMV)启动子。组成型哺乳动物启动子的实例包括多种持家基因启动子，如由β-肌动蛋白启动子例示。还涵盖诱导型启动子和/或调控元件以用于本文所述方法中。诱导型启动子的实例包括(但不限于)来自基因的启动子，如细胞色素P450基因、热冲击蛋白基因、金属硫蛋白基因和激素诱导型基因，如雌激素基因启动子。诱导型启动子的另一实例为对四环素具有反应性的tet启动子。组织特异性启动子和/或调节元件适用于本文所述方法的某些实施例。这种启动子的实例包括(但不限于)Tie-2或KDR启动子。

给药生成E选择蛋白的细胞

在一些实施例中，方法包含向个体给药包含AAV的细胞，所述AAV包含编码E选择蛋白的核苷酸序列和AAV2 ITR。AAV在细胞中产生E选择蛋白。在各种方面，AAV2基因组封装于AAV2衣壳中，尽管在各种实施例中，包含AAV2 ITR的AAV基因组可封装于非AAV2衣壳中，如本文进一步所述。在各种实施例中，细胞为干细胞，如间充质干细胞(MSC)、源于骨髓(BM)的祖细胞或内皮祖细胞(EPC)。细胞可从个体中分离(即，自体)或从不同供体中收集(即，同种异体)。“源于骨髓的祖细胞”和“源于BM的祖细胞”是指来自骨髓干细胞谱系的祖细胞。细胞还可以是间充质干细胞(MSC)，其为在骨髓中发现的类胚胎细胞，能够进行成骨、成肌、成脂肪和成软骨分化。

在各种方面，细胞为内皮祖细胞(EPC)。“祖细胞”或“内皮祖细胞”或“EPC”意指具有通过分化和增殖产生完全分化的功能性后代的能力的任何体细胞。在另一实施例中，祖细胞包括来自任何组织或器官系统的祖细胞，组织或器官系统包括(但不限于)血液、神经、肌肉、皮肤、肠道、骨骼、肾脏、肝脏、胰脏、胸腺等。祖细胞与“分化细胞”不同，分化细胞为可能具有或不具有增殖能力(即，自身复制)的细胞，但在正常生理条件下无法进一步分化成不同细胞类型。祖细胞进一步与异常细胞(如癌细胞，尤其白血病细胞)不同，异常细胞增殖(自身复制)但通常不进一步分化，尽管呈现为不成熟或未分化的。

“全能”细胞为未定型的祖细胞，如胚胎干细胞，即，产生所有类型的成熟细胞所必需和足够的。保留产生所有胰腺细胞谱系的能力但无法自我更新的祖细胞被称为“多能”。在另一实施例中，可产生一些但并非所有内皮谱系且无法自我更新的细胞被称为“多能”。

用于分离供体干细胞和移植这种分离细胞的技术为所属领域中已知的。举例来说，在促进感染的条件下从宿主收集目标组织或细胞(例如源于BM的EPC)并且将其暴露于本文所述AAV病毒粒子，从而将编码E选择蛋白的核酸引入到细胞中。然后将这些经遗传修饰的细胞移植到个体中。可使用多种方法将细胞引入到个体中，包含静脉内注射、腹膜内注射或原位注射到目标组织中。还涵盖了用AAV转导或感染的细胞的微囊化。在本公开方法的情形下涵盖自体和同种异体细胞移植两者。

治疗方法；用途

在各种方面，本公开涉及用于增加个体的缺血性组织中的血流或灌注的材料和方法。“缺血性”是指通常由于动脉血供应受阻或血流不足而缺氧(即，缺乏足够氧)的组织。在各种方面，缺血性组织为肌肉组织(骨骼肌或心肌)，但也涵盖其它组织，如视网膜、脂肪、肝、肾脏、肺、胃肠、胰脏、胆囊、膀胱、中枢神经组织和皮肤。

将AAV或细胞以增加缺血性组织中的血流或灌注的有效量给药。应了解，灌注或血流的任何增加都对个体有益。可以使用例如多普勒成像、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、磁共振成像(MRI)或对比度增强型计算机断层扫描(CT)来检查组织中的血流或灌注。举例来说，可使用⁹⁹mTc-sestamibi SPECT来确定应力总分，其为通过对由应力后成像获得的20个低灌注片段的严重程度评分进行求和得到的灌注的半定量量度。严重程度评分经定义为：0＝正常，1＝轻度降低或含糊不清，2＝中度降低，3＝严重降低和4＝无摄取。或者，灌注可表征为平均速度与所测量组织体积内的红细胞浓度的乘积。

如本文所用，术语“增加”和其衍生词可能不是100％或完全增加。确切地说，存在所属领域的一般技术人员认为具有潜在益处或治疗效果的不同程度的增加。就此而言，本公开的杂交AAV或细胞可将血流或灌注增加到任何量或水平。在例示性实施例中，本公开方法提供的增加为至少或约10％增加(例如，至少或约20％增加、至少或约30％增加、至少或约40％增加、至少或约50％增加、至少或约60％增加、至少或约70％增加、至少或约80％增加、至少或约90％增加、至少或约95％增加、至少或约98％增加)。

测量血流或灌注的方法为所属领域中已知的。可以通过例如激光多普勒成像(LDI)(例如，在实例中本文所述的LDI)来测量缺血性肢体灌注。测量血流或灌注的其它分析包括：光体积变化描记图法(plethysmogrpahy)、染料或热扩散、对比度超声波、PET成像、电磁流探针、视频显微法、近红外光谱法、标记微米球、微透析、扩散相关性光谱法(DCS)、动脉旋标记的MRI、氙-CT和多普勒超声波，其描述于Mesquita等人,《Philos Trans A MathPhys Eng Sci.》369(1955):4390-4406(2011)以及Barrett和Rattigan，《糖尿病(Diabetes.)》61(11):2661-2668(2012)中。

在各种方面，本公开涉及用于诱导缺血性组织中的血管生成、新血管形成或血管再形成的材料和方法。新血管形成是新血管的形成。“血管再形成”是对已患有缺血的身体部位或器官的灌注恢复。血管生成是源于现有血管的新血管的生长(即，来自预先存在的血管的毛细管生长)。在至少一个实施例中，血管生成是指使伤口的邻近成熟血管网的驻留内皮细胞增殖，和在其它实施例中迁移且重塑成新血管的过程，新血管生长成最初的无血管伤口组织。“诱导”血管生成、新血管形成或血管再形成包括帮助新血管的形成和/或质量。如果未发生血管生成、新血管形成或血管再形成，那么可起始血管生成、新血管形成或血管再形成；如果已发生血管生成、新血管形成或血管再形成，那么可增强或加强血管生成、新血管形成或血管再形成。在此方面，将AAV或细胞以诱导血管生成、新血管形成或血管再形成的有效量给药。可通过测量非分支血管片段的数目(每单位面积片段的数量)、功能性血管密度(每单位面积灌注血管的总长度)和/或血管体积密度(基于每单位面积的每个片段长度和直径计算的血管体积的总和)对血管生成或新血管形成进行检测和/或表征。

可使用方法的各种方面将E选择蛋白递送到多种组织，包含例如骨骼肌和心肌组织。方法可用于研究或治疗大量疾病和病痛。举例来说，可使用促进缺血性组织中的新血管形成或血管生成的方法来研究或治疗(治疗性或预防性)外周血管疾病、肠系膜缺血、脑血管缺血、因缺血所致的肌肉萎缩，或与外科手术相关的并发症(例如皮肤和/或肌瓣的愈合或再结合)。

在各种方面，本公开涉及用于增加个体(任选地罹患缺血(如严重肢体缺血(CLI))或处于罹患其风险下的个体)的骨骼肌活力的材料和方法。本公开的杂交AAV或细胞可将骨骼肌活力增加到任何量或水平。在例示性实施例中，本公开方法提供的增加为至少或约10％增加(例如，至少或约20％增加、至少或约30％增加、至少或约40％增加、至少或约50％增加、至少或约60％增加、至少或约70％增加、至少或约80％增加、至少或约90％增加、至少或约95％增加、至少或约98％增加)。测量骨骼肌活力的方法为所属领域中已知的，并且包括计算经苏木精和曙红(H&E)染色切片(每个高倍视野)的肌肉细胞的数量。参见以下实例。

在各种方面，本公开涉及用于促进个体的缺血性皮肤伤口愈合的材料和方法。在本公开的各种方面，“促进缺血皮肤伤口愈合”涵盖减小伤口大小、消退炎症、抑制坏死组织形成、修复底层皮肤基质和再上皮化。创伤和伤口愈合的进展可通过显微法和检查一段时间拍摄的相片来确定。LDI为一种测量缺血性伤口愈合的例示性方法。可获得用于研究伤口的成像分析仪(例如，AlphaEase FC版本4.1.0，Alpha Innotech公司)。在各种方面，方法促进伤口再上皮化。

在各种方面，本公开涉及用于治疗或预防个体的坏疽的材料和方法。坏疽为一类由血液供应不足引起的坏死。坏疽可能由于损伤、感染或对血液循环造成不利影响的慢性病况引起。处于坏疽风险下的个体包括(但不限于)罹患感染、糖尿病、循环/血管疾病或严重损伤的个体。根据症状对不同类型坏疽进行分类，并且包括例如干性坏疽(表征为干燥、皱缩、脱色皮肤)、湿性坏疽(与细菌感染相关，并且通常伴有肿胀或水疱)、气性坏疽(通常影响深肌组织并且产生气泡)、内部坏疽(影响一或多种器官)和坏死性筋膜炎(由肉食性微生物引起的)。在各种方面，坏疽存在于肢体(例如，脚趾、脚、腿、手指或臂)中。可通过目视检查、摄影、X射线、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、动脉波(或其它用于观测血管的成像分析)和/或组织培养或活体检查对坏疽的出现和进展进行评估。坏疽还可使用经修饰的Tarlov缺血标度来表征，其中任选地采用激光多普勒成像(LDI)。

在各种方面，本公开涉及用于治疗个体的CLI的材料和方法。严重肢体缺血起因于例如动脉无法将足够的血流传输到小腿、脚踝和脚趾。CLI可引起持续的反复发作的静息痛(例如，脚掌和脚趾灼痛)、溃疡和坏疽。CLI表征为例如脚的脉搏低或无脉搏、低踝肱指数(ABI，踝血压<0.4)、脚趾血压降低(<30mm Hg)、经皮氧降低和/或肌肉萎缩。使用多种方式中的任一种对CLI进行评估，方式包括(但不限于)多普勒成像、血压袖带、荧光素血管造影、TCOM(经皮氧测量)和/或功能性评估(肌肉强度、行走测试、疼痛评估)。在各种实施例中，方法改善了本文所述CLI参数中的任一种或多种。

使用任何适合的方法(包含上文所述方法)来确定治疗(即，降低、减缓、抑制或缓解)或预防有需要个体的病症或病况的功效。“治疗”不需要100％消除个体的病症。症状的任何减轻构成个体的有益生物作用。在各种方面，方法降低了疼痛的严重程度(其可包括降低通常用于这些病况的其它药物和/或疗法(例如暴露于药物和/或疗法)的需要和/或量)、持续时间和/或频率。“预防”不需要完全预防病症或病况的发作；涵盖任何抑制或延迟病症或相关症状的发作。

对于本文所述参数中的任一种，可通过例如将基线值与后续值进行比较，以确定由方法产生的治疗效果。“基线值”意指根据方法在治疗前所记录的基线研究中针对每种参数确定的值。“后续值”意指对于与在治疗后的适当时间(例如治疗后1周、6周、12周、26周、36周、48周或52周)所记录的基线研究中针对相同的参数确定的值。通常，进行多次后续评估，且因此，在治疗后的不同时间点确定相同参数的多个后续值。

本公开进一步提供一种包含AAV2 ITR和编码E选择蛋白的核酸序列的AAV载体在增加个体的缺血性组织中的血流或灌注；诱导血管生成、新血管形成或血管再形成；增加个体(任选地罹患缺血(如严重肢体缺血(CLI))或处于罹患其风险下的个体)的骨骼肌活力；促进个体的缺血性皮肤伤口愈合；治疗或预防个体的坏疽；和/或治疗个体的CLI的用途。还提供一种包含AAV2 ITR和编码E选择蛋白的核酸序列的AAV载体在制备用于增加个体的缺血性组织中的血流或灌注；诱导血管生成、新血管形成或血管再形成；增加个体(任选地罹患缺血(如严重肢体缺血(CLI))或处于罹患其风险下的个体)的骨骼肌活力；促进个体的缺血性皮肤伤口愈合；治疗或预防个体的坏疽；和/或治疗个体的CLI的药剂中的用途。

还提供一种包含AAV(包含AAV2 ITR和编码E选择蛋白的核酸序列)的细胞(封装于AAV2衣壳(或假型))在增加个体的缺血性组织中的血流或灌注；诱导血管生成、新血管形成或血管再形成；增加个体(任选地罹患缺血(如严重肢体缺血(CLI))或处于罹患其风险下的个体)的骨骼肌活力；促进个体的缺血性皮肤伤口愈合；治疗或预防个体的坏疽；和/或治疗个体的CLI的药剂中的用途。还提供一种包含AAV(包含AAV2 ITR和编码E选择蛋白的核酸序列)的细胞(封装于AAV2衣壳(或假型))在制备用于增加个体的缺血性组织中的血流或灌注；诱导血管生成、新血管形成或血管再形成；增加个体(任选地罹患缺血(如严重肢体缺血(CLI))或处于罹患其风险下的个体)的骨骼肌活力；促进个体的缺血性皮肤伤口愈合；治疗或预防个体的坏疽；和/或治疗个体的CLI的药剂中的用途。

本公开方法的个体可为哺乳动物，例如人类、大鼠、小鼠、猫、犬、山羊、绵羊、马、猴、公牛、兔、牛等。个体(例如哺乳动物)可处于任何发育阶段，包含成年或未成年。优选地，个体为人类。本文所述方法一般包括向有需要个体(例如动物、人类)给药治疗有效量的本文所述的组合物。这种治疗将适当地向罹患疾病、病症或其症状，患有疾病、病症或其症状，易受疾病、病症或其症状影响，或处于疾病、病症或其症状风险下的个体(尤其人类)给药。可通过任何由诊断测试的客观或主观性判定或个体或健康护理提供者的意见来确定“处于风险下”的个体。在各种方面，个体患有严重肢体缺血(CLI)(或处于其风险下)。在各种方面，个体患有外周动脉疾病(PAD)(或处于其风险下)。PAD表征为腿、胃、臂和头部的外周动脉变窄，通常由例如脂肪、胆固醇、纤维组织、钙和其它血液组分构成的斑块引起。PAD的常见症状包括(但不限于)跛行(行走时腿疼)、四肢无力、四肢发冷和脱色。使用例如多普勒超声波和血管造影来评估PAD。

调配物、剂量、给药方案

在各种方面，将AAV或细胞以一种包含生理学上可接受的(即，药理学上可接受的)载剂、缓冲剂、赋形剂或稀释剂的组合物(例如，医药组合物)提供。可在本公开情形中使用任何适合的生理学上可接受的(例如药学上可接受的)载剂，并且这种载剂为所属领域中众所周知的。载剂的选择将部分地由待给药组合物的特定部位和用于给药所述组合物的特定方法来确定。组合物还可包含例如促进AAV被摄取入宿主细胞的药剂。适合的组合物调配物包括水性和非水性溶液；等张无菌溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与血液等张的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。

可将组合物调配进行局部给药(例如以气雾剂、乳膏、泡沫、凝胶、液体、软膏、糊剂、粉末、洗发剂、喷雾、贴片、圆盘或敷料形式)。“贴片”通常至少包括本文所提供的组合物和覆盖层，使得可将贴片置于待治疗的皮肤区域上。可将贴片设计以使本文所提供的组合物通过角质层进入表皮或真皮的递送最大化，减少滞后时间，促进均匀吸收，和降低机械磨损。

组合物可存在于单剂量或多剂量密封容器中，诸如安瓿和小瓶，并且可储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在即将使用之前添加无菌液体载剂，例如水。在一个方面，将一种包含AAV或包含AAV的细胞的组合物与封装材料一起放置于容器内，封装材料提供了关于组合物用途的说明(即，在试剂盒中)。通常，这种说明包括描述试剂浓度的有形表达，以及在某些实施例中，重建组合物可能需要的赋形剂成分或稀释剂(例如，水、盐水或PBS)的相对量。

可将AAV或细胞以足以向个体提供一些改善或益处的量和位置给药，例如增加缺血性组织中的血流或灌注；诱导血管生成、新血管形成或血管再形成；增加骨骼肌活力；促进缺血性皮肤伤口愈合；治疗或预防坏疽；和/或治疗CLI。取决于情形，将一种包含AAV或细胞的组合物施用或滴注到体腔中，直接施用到目标组织和/或引入循环中。举例来说，在各种情形中，将需要通过静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉内、病灶内、髓内、鞘内、心室内、皮内、关节内、神经细胞内、神经节内、副神经节瘤、经皮、皮下、鼻内、吸入(例如上呼吸道和/或下呼吸道)、经肠、硬膜外、尿道、阴道或直肠方式递送组合物。必要时，将AAV或细胞经由肌肉内、经皮或皮下给药或供给所关注区域的动脉内或静脉内给药来区域性给药。在一个优选实施例中，将AAV或细胞向骨骼肌中的缺血性组织肌肉内给药。

或者，组合物经由植入膜、海绵、胶囊或将组合物吸收或囊封于其上的另一种适当材料局部给药。在使用植入装置的情况下，一方面将装置植入到适合的组织中，并且例如经由扩散、定时释放丸剂或连续给药递送由工程化细胞产生的AAV或E选择蛋白。

特定个体的特定给药方案将部分地取决于给药的治疗量、给药途径和任何副作用的原因和程度。根据本公开向个体(例如哺乳动物，如人类)给药的量应足以在合理的时间范围内影响所期望的反应。

10⁴到10¹⁵转导单位(例如，10⁷到10¹²转导单位)或至少约10⁵、至少约10⁶、至少约10⁷、至少约10⁸、至少约10⁹、至少约10¹⁰、至少约10¹¹、至少约10¹²、至少约10¹³、至少约10¹⁴、或至少约10¹⁵转导单位(例如，至少约10⁷、至少约10⁸、至少约10⁹、至少约10¹⁰、至少约10¹¹、至少约10¹²、至少约10¹³或至少约10¹⁴转导单位，诸如约10¹⁰或10¹²转导单位)的基因组等效滴度中的病毒粒子的例示性剂量。在例示性方面，每活体外转导细胞的病毒粒子(VP)剂量在约10³到约10¹²内。在一些方面，每活体外转导细胞的病毒粒子剂量在约10⁴到约10⁸或约10⁴到约10⁶内。举例来说，每活体外转导细胞的病毒粒子剂量为10⁵VP/细胞。一些病况需要延长治疗，经过一段时间，其可能需要或可能不需要多次给药。

在例示性方面，向个体给药(例如经由肌肉内注射)的杂交AAV的剂量为约50到约5000μl杂交AAV，其中杂交AAV的浓度在约10⁸或10¹⁶VP/ml内。在例示性方面，向个体给药(例如经由肌肉内注射)的杂交AAV的剂量为约50到约500μl杂交AAV，其中杂交AAV的浓度在约10¹⁰或10¹⁴VP/ml内。在例示性方面，向个体给药(例如经由肌肉内注射)的杂交AAV的剂量为约75到约200μl杂交AAV，其中杂交AAV的浓度在约10¹²VP/ml。

适当时，将AAV或细胞与其它物质(例如治疗剂)和/或其它治疗方法组合给药,以达成额外(或扩增)生物作用。这一方面包括将AAV或细胞与一或多种额外适合的药剂同时给药(即，大体上同时给药)和非同时给药(即，在不同时间以任何次序给药，无论是否重叠)。应了解，在某些方面，将不同组分以相同或不同组合物以及通过相同或不同给药途径给药。

根据本公开的另一方面，将AAV或细胞任选地与适用于治疗缺血的症状或原因的一或多种药剂的组合分开、依序或同时给药。代表性药剂包括(但不限于)骨关节炎、硝酸盐、β阻断剂、钙离子通道阻断剂、降低胆固醇的药剂、血管紧张素-转化酶(ACE)抑制剂、雷诺嗪、抗凝血剂、溶血素(组织纤维蛋白溶酶原活化剂(tPA)、链激酶或尿激酶)、抗生素。

根据本公开的另一方面，将AAV或细胞任选地与适用于疼痛治疗的一或多种药剂的组合分开、依序或同时给药。其它药剂的实例包括(但不限于)类鸦片镇痛剂(例如吗啡、氢吗啡酮、羟吗啡酮、芬太尼、可待因、二氢可待因、羟考酮或氢可酮)；非类固醇消炎药(NSAID)(例如阿司匹林、双氯芬酸、布洛芬、萘普生、奥沙普嗪或环加氧酶-2(COX-2)抑制剂)；镇静剂(例如巴比妥类镇静剂)；麻醉剂和皮质类固醇(例如地塞米松)。

在需要促进将源于BM干细胞从BM募集到非BM隔室(例如目标组织)的情况下，还向个体提供一种能够促进源于BM的祖细胞募集的药剂，作为组合物的一部分或作为治疗方案的一部分。多类药剂为已知的并且包括例如整合蛋白、粘附分子的选择家族、VCAM-I和集落刺激因素。适合的药剂进一步描述于例如国际专利公开案WO 00/50048中。

本公开方法任选地为治疗方案的一部分，治疗方案包括高氧疗法(HBO₂)，一种用于在减弱微脉管的情况下刺激伤口愈合的辅助疗法。涉及HBO₂的治疗方法描述于例如国际专利申请案第PCT/US2008/003760号，其关于高氧疗法的论述以引用的方式并入本文中。任选地，使患者接受20次或更多次治疗，患者每天一次或两次地在加压腔室中以约2.0到约3.2的绝对大气压(ATA)呼吸100O2。治疗时间范围通常为约10分钟到约240分钟(例如，约10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟等)。

治疗方案还可包括血管内治疗(例如血管成形术或支架术)、旁路或动脉手术或清创术。

通过参考以下实例将更容易理解本发明，实例是借助于说明而提供且并不意图限制本发明。

实例

实例1

通常通过大血管(动脉)和微血管(毛细管)过程流向肢体和软组织的血液的减弱是患有PAD和CLI患者的主要常见病因。恢复流向缺血性组织的足够血液允许成功的修复反应。治疗性血管生成是指使用药物、基因、细胞或机械装置来诱导缺血性组织中的血管形成。主要益处是诱导新血管的生长并且促进侧支血管形成以增加流向缺血性组织的血液。血管生成可能最终降低不良心血管事件的风险、缓解缺血性疼痛、愈合溃疡、预防大截肢并且改善CLI患者的生活质量和延长存活期，尤其是不符合手术治疗条件的患者。

细胞表面上的粘附分子介导了细胞间相互作用和归巢。由损伤组织中的干细胞/祖细胞与EC之间的粘附受体/配体对(尤其是E选择蛋白/配体)介导的细胞间相互作用是干细胞诱导的血管生成中的基本事件。通过创建支持性组织微环境来测试处理PAD/CLI的新颖策略，其使用基因疗法(E选择蛋白/AAV)用E选择蛋白引发伤口脉管和组织细胞中的EC。E选择蛋白可充当用于锚定的源于骨髓(BM)具有修复能力的干组织修复细胞/祖组织修复细胞(TRC)(表达E选择蛋白的配体)的内源性或外源性对接位点，借此增大TRC与缺血性组织的精确相互作用/归巢。测试小鼠肢体缺血和坏疽模型中基于粘附分子的细胞外和细胞组分的可行性和功效，并且证实E选择蛋白/AAV基因疗法为小鼠模型中PAD/CLI的有效方法。本文所述的方法改善了组织微环境的适宜性，以增强源于骨髓(BM)的具有修复能力的干细胞/祖细胞(TRC)的精确靶向。

坏疽为一类特定的组织坏死，但支柱分子机制在很大程度上仍是未知的。缺乏可靠且可再现的坏疽动物模型使得难以研究这种疾病过程。已知氮氧化物(NO)(其为缺血的标志)充当了氧化条件中细胞反应的调节剂，所以对NO/NOS路径可能参与坏疽的发展和进展进行研究，并且研发出坏疽肢体的鼠类模型来划定缺血诱导的肢体坏疽的病理生理学过程中涉及的分子机制。将八到12周龄的雄性FVB小鼠分别用N-硝基-L-精胺酸甲酯(L-NAME)，非选择性NOS抑制剂和媒剂(n＝18/组)处理。后肢缺血是由结扎腹股沟韧带和腘窝的股动脉，接着切除右肢中的动脉和所有分支产生。使小鼠接受术前1到2小时的单次剂量L-NAME(40mg/kg ip)和术后第1天、第2天和3天的每日一次剂量(40mg/kg ip)。使对照小鼠接受单独药剂媒剂。每日通过目视检查和摄影对坏疽的出现和进展进行评估。使用经修饰的Tarlov缺血标度对坏疽进行评估。术后第1天(POD)到第3天使用激光多普勒成像(LDI)每日监测缺血。L-NAME处理的小鼠POD 3时均匀发育出肢体远端坏疽。相比而言，对照组中的小鼠都未发育出坏疽(图9)。这是首个可靠且高度可再现的鼠类缺血诱导的后肢坏疽模型。

重组AAV(rAAV)载体源于非病原性野生型病毒AAV。尽管大部分人类已暴露于这种病毒，但无明显的不良作用与AAV相关。任选地，本文所述方法中使用的重组载体不含所有AAV基因，也就是说，已去除野生型病毒的rep和cap基因。反向末端重复序列(ITR)是保留在重组载体基因组中唯一的病毒DNA序列。除其安全性概况(缺乏病理性和毒性)之外，重组AAV载体还具有以下显著特征；感染各种组织来源的分裂和非分裂细胞的能力，极低的宿主免疫反应和长期表达。

AAV生命周期通过复杂的系统来调节，系统涉及宿主因素、辅助病毒、编码于AAV基因组中的基因和顺式元件ITR。ITR为可采用T形发夹结构的回文序列。这种特定的配置充当病毒DNA复制的来源。另外，ITR对于病毒的成功封装、整合和救援至关重要。重组rAAV基因组通常由单链DNA组成野生型AAV的基因组。原病毒质粒的ITR之一的DNA区中的缺失使得双链rAAV有效封装，其通常被称作“自身互补”rAAV。可将rAAV的自身互补基因组封装于某些衣壳中，以确定其向性。可将AAV封装于许多不同血清型的衣壳中，以“假型”AAV载体，由此将基于AAV基因组(即，ITR的来源)的表达盒封装于具有源于另一血清型的AAV的衣壳的重组病毒粒子中。假型重组AAV载体通常称为rAAV2/1或rAAV2/9等，指代其杂交来源(基于封装于AAV1或AAV9衣壳中的AAV2的基因组)。假型AAV载体介导了转基因表达的不同模式和动力学，转基因表达显著扩增了AAV载体的可获得的组成成分。

测试了肢体缺血小鼠模型中编码GFP的不同AAV载体的功效，包括AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9。AAV2/9展现出较高转导效率(图1)。基本AAV2顺式质粒是基于pZac的。pZac在两端含有两个AAV ITR、CMV启动子、多克隆位点(MCS)和SV40聚A，用于易于克隆所关注基因。使用鼠类E选择蛋白/AAV2/9(LacZ/AAV2/9为对照)来转导缺血性肢体组织，以在小鼠后肢坏疽模型中引发缺血性组织微环境。将E选择蛋白/AAV2/9和LacZ/AAV2/9肌肉内注射(分别为1.8×10¹²vg和1.2×10¹³vg)。沿着大腿的半膜绳肌，分别向坏疽小鼠的缺血肢体的五个部位注射20μL。通过免疫组织化学检查转基因(E选择蛋白)的组织细胞表达。通过使用激光多普勒成像(LDI)监测后肢血流和使用血管成像技术测量新血管形成和血管再形成对处理坏疽中E选择蛋白/AAV2/9基因疗法的处理效果进行评估。

使用八到十二周龄的FVB/NJ雄性小鼠，以利用5倍增量的20μL的肌肉内E选择蛋白/AAV 1.8×10¹²vg(处理组)或LacZ/AAV2/9 1.2×10¹³vg(对照组)沿着内壁半膜绳肌引发双侧后肢组织微环境。在后肢手术之前4天、2天和0天引发。术前30分钟和术后第1天、第2天和第3天，使FVB小鼠经历股动脉结扎与切除的组合并且给药NG-硝基-L-精胺酸甲酯(L-NAME)(氮氧化物合成酶抑制剂)，其进一步降低了后肢灌注。术后第1天、第2天、第3天、第7天及第14天，记录基于坏疽严重程度Faber标度的缺血评分，而术后第7天及第14天进行激光多普勒成像。术后第14天使用激光扫描共焦显微法来定量新血管形成的活体动物dil灌注，将动物处死并且收集大腿组织进行免疫荧光，以验证E选择蛋白转基因表达。

除L-NAME给药之外，使所有小鼠经历股动脉结扎。基于Faber缺血评分系统对组织进行评分(从0(无坏疽)到11(前足严重坏疽))。Faber缺血评分描述于Faber等人，《动脉硬化(Arteriosclerosis)》《血栓(thrombosis)》和《脉管生物学(vascular biology)》31(8):1748-1756(2011)。基于Faber缺血的评分标度为0(无坏疽)到11(前足严重坏疽)，在术后第7天发现所有小鼠出现坏疽。相较于已接受E选择蛋白/AAV的处理组，术后第7天接受LacZ/AAV的对照组的坏疽明显更严重。术后14天时情况更为严重，前述组中的任一者缺血评分分别为5.3和2.4(图2，p<0.05)。这些数据表明，相较于LacZ/AAV给药，E选择蛋白/AAV可以减弱坏疽。

使所有小鼠在术后第7天和第14天进行激光多普勒成像。术后第14天，计算结扎与未结扎肢体的比率，两组间缺血指数存在显著差异。当比率为1表示正常灌注时，第14天对照组和处理组的缺血指数分别为0.28与0.52(p<0.05)(图3和图10)。这些数据证实，经过一段时间，E选择蛋白/AAV组恢复到良好的灌注，且因此在总体检查中坏疽的严重程度降低。参见图11。

此外，使所有小鼠在术后第14天经历全身Dil灌注，随后处死。通过扫描共焦显微镜对足灌注进行检测。截至术后第14天，计算结扎与未结扎肢体的坏疽足的Dil染色血管强度，两组间结扎足的血管密度存在显著差异。E选择蛋白/AAV基因疗法改善了坏疽足中的新血管形成和足灌注。(图4)。这些数据证实，E选择蛋白/AAV基因疗法改善了坏疽足中的新血管形成和足灌注。

术后第14天，收集内壁大腿肌肉，并且在脱蜡和包埋之前用福尔马林固定。基于苏木精和曙红染色，E选择蛋白组中的结扎肢体肌细胞缺血性似乎降低，中央核收缩减少，而LacZ结扎肢体的此类特征更明显。图12A和12B分别展示了10倍放大倍数下E选择蛋白/AAV结扎肢体和LacZ结扎肢体的苏木精和曙红染色的显微成像。相较于E选择蛋白结扎肢体，LacZ/AAV结扎肢体的肌原纤维/hpf数量更高，*p<0.0001。类似地，在LacZ/AAV组中，结扎肢体中的肌细胞汇合，其中中央核中有大量炎性细胞。最后，LacZ/AAV结扎组表明，基于定量数据，相较于E选择蛋白/AAV组，肌原纤维/hpf的数量最高(图5)。这些数据表示，E选择蛋白/AAV基因疗法改善了缺血诱导的骨骼肌萎缩。

确定E选择蛋白/AAV基因疗法，以促进缺血伤口愈合。图6说明E选择蛋白/AAV与LacZ/AAV组之间POD 0到10的愈合进展。图13展示了术后第0天(POD)、第1天、第3天、第5天、第6天、第7天、第10天左后肢大腿的伤口愈合总体成像。成像顶行表示用E选择蛋白/AAV处理的小鼠成像，且成像底部行表示用LacZ/AAV处理的小鼠成像。在E选择蛋白/AAV组中，术后24小时内伤口收缩似乎最明显，POD1时愈合率从0进展到54％。比较地，LacZ/AAV小鼠POD1时愈合率达到20％(p<0001)。当小鼠从POD 0进展到10，基于总体成像，E选择蛋白/AAV小鼠伤口内的发炎和收缩明显增加，其在LacZ/AAV组中延迟更久。两组中伤口愈合率之间的差异百分比每天均降低，但在统计学上仍然不同。相较于LacZ/AAV组为84％，E选择蛋白/AAV小鼠POD 10时愈合率达到97％(p<0.0001)。

实例2

这一实例在所述方法情形下描述了新颖干细胞疗法的递送。在一个方面中，给药源于BM工程化组织修复细胞(TRC)，其中将E选择蛋白预安装在细胞表面上。在缺血性肢体组织中给药的这些工程化TRC可选择性地粘附缺血性组织脉管中的活化内皮细胞(EC)(其表达吸引E选择蛋白且与其相互作用的升高的对应配体)并且与EC相互作用以促进新血管形成，所述EC尤其是在发芽血管生成中改组的出芽尖端上的细胞。或者，通过使用病毒载体用E选择蛋白引发伤口脉管和组织细胞中的EC，以产生支持性组织微环境。E选择蛋白充当用于锚定的内源性或外源性TRC(其表达E选择蛋白的配体)对接位点，借此增大TRC与缺血性组织的精确相互作用/归巢。

将用Adh/VV预转导的自体组织修复细胞(TRC)肌肉内注射，以逆转小鼠模型中的肢体缺血。目前，在PAD/CLI患者中给药非工程化TRC的最广泛使用途径为动脉内和肌肉内注射，其具有明显的局限性。肌肉内注射的TRC与组织细胞经历“盲性测年”。TRC的性能主要依赖于旁分泌机制，因为TRC几乎不与缺血性组织中的活化EC相互作用且很少与其相互作用，所述活化EC尤其是在发芽血管生成中改组的出芽尖端上的细胞。动脉内注射方法尚未显示出优越性，并伴有出血风险。缺血诱导的低氧传感器HIF-1α触发对某些化学疗法细胞因子(包括VEGF和SDF-1α)的表达增加，其不仅诱导血管生成，而且上调缺血性组织内皮中一组粘附分子的表达。尖端细胞的迁移和出芽为血管生成的第一步骤。在发芽血管生成中改组的动态尖端细胞是为了治疗性血管生成而将要被靶向的“热点”。虽然不希望受任何特定理论束缚，但TRC与多细胞出芽尖端的特异性相互作用将促进血管生成。E选择蛋白/配体为在活化内皮上升高的一对粘附分子，并且负责干细胞/祖细胞(例如内皮祖细胞(EPC))相互作用且将其募集到新血管形成发生部位。已确定E选择蛋白配体的表达在伤口组织内皮中升高，可能由SDF-1α和其它细胞因子(即IL-1和TNF-α)上调。为了增大TRC与出芽尖端中EC的特异性相互作用，用Adh/VV预转导以在细胞表面上表达高水平‘Adh’的源于BM的自体LacZ+TRC将会给药(肌肉内)到已经经历股动脉结扎的受体C57BL6小鼠的缺血性肢体中，以诱导肢体缺血。利用LacZ+源于BM的TRC的目的是在植入后的缺血性组织中易于追踪这些细胞。观察到，经工程化以在细胞表面上携带E选择蛋白的自体TRC的伤口组织注射使得伤口血管生成增大了五倍。除其旁分泌作用之外，移植TRC将与出芽尖端中EC更主动和特异性地相互作用，以促进血管生成(由于TRC与目标细胞的精确结合(靠近)，可能的旁分泌作用可能更为有效)。

用E选择蛋白/AAV“引发”缺血性肢体组织微环境，以促进小鼠后肢坏疽模型中的新血管形成/血管再形成。肢体坏疽为腿/脚趾组织死亡并且为PAD最严重的表现之一。上文描述了新颖、可靠且高度可再现的小鼠后肢坏疽模型。在小鼠缺血性后肢坏疽模型中，通过病毒载体介导的基因疗法用E选择蛋白引发缺血性组织脉管和组织细胞，以创建高度易接近组织微环境，进行内源性TRC的相互作用/归巢。初步研究显示，E选择蛋白/AAV伤口组织注射显著增加了小鼠模型中伤口脉管和组织细胞中E选择蛋白的表达。在脉管和组织细胞上表达的E选择蛋白将充当用于锚定和相互作用的内源性TRC(其表达E选择蛋白的对应配体)的“对接”位点，其又将产生更稳固的血管再形成和/或新血管形成反应。

方法

构建E选择蛋白/VV和对照载体(质粒)：病毒载体(VV)为一种高效且安全的基因转移系统。裸露的pDNA方法已展现出转基因表达水平和持续时间的局限性。构建E选择蛋白/VV和EGFP/VV质粒并且产生重组病毒。选择标记包括于病毒载体中。为此目的，将通过插入IRES2-EGFP(约1.4kb)到多克隆位点中，以修饰基本病毒载体。可将这些载体本身用作对照。将使用多克隆位点中的剩余位点插入鼠类E选择蛋白基因到IRES2-EGFP的上游。由于IRES(内部核糖体进入位点)，E选择蛋白和标记和对照基因(EGFP)均可同时在TRC中表达。因此，有可能选择和扩增过度表达E选择蛋白的TRC的纯种群(E选择蛋白/TRC)。

重组VV(病毒)生成：利用标准方法产生重组VV。重组VV通过梯度离心来纯化。将收集含有重组VV的馏分，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析，并且储存。

生成源于BM的鼠类TRC：鼠类TRC将由从ROSA26(LacZ+)小鼠收集的源于BM的单核细胞生成。

创建FVB小鼠的缺血诱导的肢体坏疽：使用FVB小鼠来创建由缺血诱导的坏疽。使小鼠经历单侧股动脉结扎并且用抑制氧化还原途径的化合物处理。每日通过目视检查和摄影对坏疽的出现和进展进行评估。使用经修饰的Tarlov缺血标度来度量坏疽。术后第1天(POD)到第3天使用LDI每日监测缺血。通常，小鼠术后第3天时均匀发育出肢体远端坏疽。

创建C57 BL6小鼠的缺血肢体小鼠模型：为了创建常见缺血性肢体，使C57 BL6小鼠经历单侧股动脉和静脉结扎。后肢缺血是由结扎腹股沟韧带和腘窝的股动脉，接着切除右肢中的动脉和所有分支产生。术后第1天到第7天(预期实验结束)使用LDI每日监测缺血和再灌注。LDI将在具有基于重量的镇静作用的温度控制设备中进行，以最大程度地降低因温度波动和镇静水平导致的伪影。相对灌注数据将表示为缺血性(右)与正常(左)肢体血流的比率。

用重组VV来转导经培养的TRC：为了产生活体外E选择蛋白/TRC，用E选择蛋白/VV或EGFP/VV(作为对照)来转导从ROSA26(LacZ+)小鼠分离的源于BM的TRC。为了检测转基因(E选择蛋白)表达，转导后3天将TRC由胰蛋白酶-EDTA剥离，洗涤且经历FACS分拣，其使用FACScan流式细胞仪(加拿大，圣何塞，百克顿-迪金森公司)，以分离EGFP+细胞(E选择蛋白/TRC和对照/表达EGFP的TRC两者)。将经分离的EGFP+细胞再培养进行细胞扩增。另外，可通过蛋白印迹来验证E选择蛋白表达。将TRC用低温磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，并且再悬浮于裂解缓冲液(1％Nonidit P-40，50mmol/l Tris-HCl，pH为7.4，150mmol/l NaCl，200U/ml抑肽酶，1mmol/l PMSF)中。将细胞溶解物(10μg蛋白)通过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并且印迹到聚偏二氟乙烯膜上。将用抗鼠类E选择蛋白抗体进行免疫印迹法，并且用ECL检测系统观测。

将E选择蛋白/TRC肌肉内注射到受体C57BL6小鼠的缺血性肢体中。收集并洗涤从供体ROSA26(LacZ+)小鼠制备的工程化TRC，将其再悬浮于PBS中。将100μl细胞悬浮液(AAV/TRC与对照/TRC：8只小鼠/组)肌肉内注射到缺血性肢体中。

用重组VV转导缺血性肢体组织：将FVB小鼠用乙醚麻醉。将E选择蛋白/VV和EGFP/VV稀释于生理盐水中。病毒悬浮液将注射到同侧半膜肌中。将通过免疫荧光(IF)对转基因(E选择蛋白)表达进行检查。

监测后肢缺血或坏疽：术后第1天直到第7天使用LDI在温度控制设备上每日监测肢体缺血和缺血性后肢的血流恢复。相对灌注数据将表示为缺血性(右)与正常(左)肢体血流的比率。

评估新血管形成和血管再形成：将通过Dil灌注和激光扫描共焦显微镜来测量肢体组织血管密度。小鼠血管(新血管形成)将在麻醉小鼠中活体内直接标记，其通过使用含有Dil(D-282，茵维特罗根/分子探针公司)的专门调配的水性溶液进行活体灌注。肢体组织中的血管网将通过使用激光扫描共焦显微镜扫描缺血性肢体达到200μm的厚度或深度来观测。使用成像软件对容器密度进行定量，以评估标准化至整个扫描区域的Dil红色标记的容器的总数。此外，使用收集的肢体组织，用抗KDR或抗CD31抗体对内皮细胞标记KDR或CD31进行免疫染色，通过定量毛细管密度来评估血管生成。Dil灌注后，血管再形成通过LDI(每日)和通过激光扫描共焦显微法(聚焦于结扎股骨区域附近的大血管上)观测横向股动脉的形成两者来测量。

显微CT：也可以通过显微CT探索血管形成。显微计算的断层扫描(显微CT)提供了适合于分析、定量、验证和观测血管成像的高分辨率3D体积数据。其提供了实验小鼠的血管探索的替代性方法。

检测并入到组织内皮中的自体E选择蛋白/TRC：因为给药TRC来自ROSA26(LacZ+)供体小鼠，因此可以通过X-gal染色来检测E选择蛋白/TRC和对照EGFP/TRC，借此可对LacZ+TRC的数量和组织位置进行检查(细胞追踪)。或者，由于TRC为EGFP+，并且可通过IF(抗EGFP染色)进行检测。可使用X-gal，因为相较于免疫荧光(IF)，其具有更稳定的结果且背景更少。

用于源于BM的TRC和其归宿的组织水平检测的β-半乳糖苷酶分析(X-gal)和IF：将收集的肢体组织分成两部分，一部分冷冻且一部分固定(4％多聚甲醛)。随后在室温下将冷冻的组织切片与X-gal(法门塔斯，加拿大)一起培育2小时。将切片用核固红进行复染(载体实验室)。术后第7天，通过在至少3个连续切片的每切片5个随机高倍视野(HPF，40倍)中计数肢体组织连续切片中的β-半乳糖苷酶+细胞来定量TRC的数量。还可使用标准协议通过IF检测移植TRC，以对EGFP进行染色。为了检测细胞宿命，当冷冻切片与X-gal一起培育时，针对分化标记添加HRP结合抗体，例如针对EC谱系添加KDR和针对成纤维细胞添加FSP1。使用HRP/DAB或AEC检测IHC试剂盒(ab93702，阿布凯姆)来检测阳性染色。对于固定组织切片，可使用针对GFP、KDR或FSP-1的荧光染料结合Ab。不清晰的用DAPI染色。

调查缺血肢体中并入的E选择蛋白/TRC的位置和宿命：为了检测注射的TRC的位置和宿命，使用IHC与X-gal对细胞谱系标记进行共染色，例如使用EC共染色KDR和使用成纤维细胞共染色FSP-1。

描述恢复的缺血肢体中细胞因子/趋化因子：为了探索注射的E选择蛋白/TRC对治疗性血管生成的潜在旁分泌作用，对测试细胞和组织溶解物进行测试，其使用MILLIPLEXMAP小鼠血管生成/成长因子磁珠板(密理博)，其检测了27-细胞因子：血管生成素-2、G-CSF、sFasL、sAlk-1、双调蛋白、瘦素、IL-1β、β细胞调节素、EGF、IL-6、内皮糖蛋白、内皮素-1、FGF-2、卵泡抑素、HGF、PECAM-1、IL-17、PLGF-2、KC、MCP-1、促乳素、MIP-1α、SDF-1α、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-A和TNFα。

数据分析：使用双尾斯图登氏t检验进行两组比较和双向ANOVA测试进行多组比较，以进行差异统计分析。当P<0.05时，P值具有统计学意义。统计分析将用SPSS 22.0软件包(SPSS公司，芝加哥，IL，美国)进行。

实例3

缺乏可靠的动物后肢坏疽模型限制了严重肢体缺血的分子研究和临床前处理。这一实例描述了小鼠后肢坏疽模型的研发和使用，以评估基因疗法的功效。

假设用E选择蛋白/腺病毒相关病毒(AAV)引发缺血性后肢组织将增强治疗性血管生成且减弱坏疽。

对诱导后肢坏疽的两种方法进行测试。在第一种方法中，使FVB小鼠经历股动脉结扎(FAL)，以达成严重肢体缺血。在第二种方法中，使FVB小鼠经历FAL组合并且给药NG-硝基-L-精胺酸甲酯(L-NAME)(氮氧化物合成酶抑制剂)，其进一步降低后肢灌注。在使用FAL和L-NAME之前，向坏疽诱导的小鼠的后肢肌肉内给药E选择蛋白/AAV(处理)或LacZ/AAV(对照)。使用术后(POD)第2天、第7天、第14天记录的标准化缺血评分(0(无坏疽)到11(前足坏疽))对坏疽进行评估。使用激光多普勒成像的后肢再灌注通过同一POD上的结扎与非结扎肢体的平均灌注来定量。使用活体动物Dil灌注加激光扫描共焦显微镜来定量肢体新血管形成。

用仅FAL方法，大多数FVB未发育出坏疽(n＝2/8，坏疽发病率为25％)。FAL与L-NAME的组合方法一致地诱导了后肢坏疽(n＝14/14，坏疽发病率为100％)。POD 7时，E选择蛋白/AAV(n＝7)的激光多普勒成像评分为0.41，且LacZ/AAV(n＝7)为0.27(P＝0.071)，并且POD 14时，激光多普勒成像评分为0.54与0.29(P＝0.017)。E选择蛋白/AAV与LacZ/AAV的Dil灌注结扎后肢展现出截然不同的新血管形成平均强度评分，分别为44与21(P＝0.037)。对应小鼠的Dil灌注未结扎肢体的平均强度评分分别为50与25(P＝0.006)。POD第2天、第7天、第14天时，E选择蛋白/AAV的平均缺血评分分别为1.9、2.9和3.7与2.7、3.9和5.3(P＝0.104)。

成功地研发出高度可靠的小鼠后肢坏疽模型，并且显示其适用于翻译研究。使用这种模型，基于E选择蛋白的新颖基因疗法改善了肢体再灌注和增加了严重肢体缺血中新血管形成。可以利用这种新颖后肢坏疽模型进一步理解有助于坏疽的氧化还原路径，促进未来的翻译研究。

本说明书中所引用的所有公开、专利和专利申请案都以引用的方式并入本文中，其引用的程度如同每个个别公开、专利申请或授权专利经特定并且独立地指示以引用的方式并入一般。尽管已出于清楚理解的目的通过说明和实例相当详细地描述前述发明，但根据本发明的教示，所属领域的技术人员能容易地显而易见，可在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下对其作出某些改变和修改。

序列表

<110> 迈阿密大学

<120> 治疗缺血性组织的方法

<130> 32286/51600A

<150> US 62/500,470

<151> 2017-05-02

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 610

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<300>

<308> Genbank / NP_000441.2

<309> 2017-04-09

<313> (1)..(610)

<400> 1

Met Ile Ala Ser Gln Phe Leu Ser Ala Leu Thr Leu Val Leu Leu Ile

1 5 10 15

Lys Glu Ser Gly Ala Trp Ser Tyr Asn Thr Ser Thr Glu Ala Met Thr

20 25 30

Tyr Asp Glu Ala Ser Ala Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Thr His Leu Val

35 40 45

Ala Ile Gln Asn Lys Glu Glu Ile Glu Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Ser

50 55 60

Tyr Ser Pro Ser Tyr Tyr Trp Ile Gly Ile Arg Lys Val Asn Asn Val

65 70 75 80

Trp Val Trp Val Gly Thr Gln Lys Pro Leu Thr Glu Glu Ala Lys Asn

85 90 95

Trp Ala Pro Gly Glu Pro Asn Asn Arg Gln Lys Asp Glu Asp Cys Val

100 105 110

Glu Ile Tyr Ile Lys Arg Glu Lys Asp Val Gly Met Trp Asn Asp Glu

115 120 125

Arg Cys Ser Lys Lys Lys Leu Ala Leu Cys Tyr Thr Ala Ala Cys Thr

130 135 140

Asn Thr Ser Cys Ser Gly His Gly Glu Cys Val Glu Thr Ile Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Thr Cys Lys Cys Asp Pro Gly Phe Ser Gly Leu Lys Cys Glu Gln

165 170 175

Ile Val Asn Cys Thr Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Gly Ser Leu Val

180 185 190

Cys Ser His Pro Leu Gly Asn Phe Ser Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Ile

195 200 205

Ser Cys Asp Arg Gly Tyr Leu Pro Ser Ser Met Glu Thr Met Gln Cys

210 215 220

Met Ser Ser Gly Glu Trp Ser Ala Pro Ile Pro Ala Cys Asn Val Val

225 230 235 240

Glu Cys Asp Ala Val Thr Asn Pro Ala Asn Gly Phe Val Glu Cys Phe

245 250 255

Gln Asn Pro Gly Ser Phe Pro Trp Asn Thr Thr Cys Thr Phe Asp Cys

260 265 270

Glu Glu Gly Phe Glu Leu Met Gly Ala Gln Ser Leu Gln Cys Thr Ser

275 280 285

Ser Gly Asn Trp Asp Asn Glu Lys Pro Thr Cys Lys Ala Val Thr Cys

290 295 300

Arg Ala Val Arg Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Arg Cys Ser His Ser

305 310 315 320

Pro Ala Gly Glu Phe Thr Phe Lys Ser Ser Cys Asn Phe Thr Cys Glu

325 330 335

Glu Gly Phe Met Leu Gln Gly Pro Ala Gln Val Glu Cys Thr Thr Gln

340 345 350

Gly Gln Trp Thr Gln Gln Ile Pro Val Cys Glu Ala Phe Gln Cys Thr

355 360 365

Ala Leu Ser Asn Pro Glu Arg Gly Tyr Met Asn Cys Leu Pro Ser Ala

370 375 380

Ser Gly Ser Phe Arg Tyr Gly Ser Ser Cys Glu Phe Ser Cys Glu Gln

385 390 395 400

Gly Phe Val Leu Lys Gly Ser Lys Arg Leu Gln Cys Gly Pro Thr Gly

405 410 415

Glu Trp Asp Asn Glu Lys Pro Thr Cys Glu Ala Val Arg Cys Asp Ala

420 425 430

Val His Gln Pro Pro Lys Gly Leu Val Arg Cys Ala His Ser Pro Ile

435 440 445

Gly Glu Phe Thr Tyr Lys Ser Ser Cys Ala Phe Ser Cys Glu Glu Gly

450 455 460

Phe Glu Leu His Gly Ser Thr Gln Leu Glu Cys Thr Ser Gln Gly Gln

465 470 475 480

Trp Thr Glu Glu Val Pro Ser Cys Gln Val Val Lys Cys Ser Ser Leu

485 490 495

Ala Val Pro Gly Lys Ile Asn Met Ser Cys Ser Gly Glu Pro Val Phe

500 505 510

Gly Thr Val Cys Lys Phe Ala Cys Pro Glu Gly Trp Thr Leu Asn Gly

515 520 525

Ser Ala Ala Arg Thr Cys Gly Ala Thr Gly His Trp Ser Gly Leu Leu

530 535 540

Pro Thr Cys Glu Ala Pro Thr Glu Ser Asn Ile Pro Leu Val Ala Gly

545 550 555 560

Leu Ser Ala Ala Gly Leu Ser Leu Leu Thr Leu Ala Pro Phe Leu Leu

565 570 575

Trp Leu Arg Lys Cys Leu Arg Lys Ala Lys Lys Phe Val Pro Ala Ser

580 585 590

Ser Cys Gln Ser Leu Glu Ser Asp Gly Ser Tyr Gln Lys Pro Ser Tyr

595 600 605

Ile Leu

610

<210> 2

<211> 3875

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<300>

<308> Genbank / NM_000450.2

<309> 2017-04-09

<313> (1)..(3875)

<400> 2

agctgttctt ggctgacttc acatcaaaac tcctatactg acctgagaca gaggcagcag 60

tgatacccac ctgagagatc ctgtgtttga acaactgctt cccaaaacgg aaagtatttc 120

aagcctaaac ctttgggtga aaagaactct tgaagtcatg attgcttcac agtttctctc 180

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ccgttatggg tccagctgtg agttctcctg tgagcagggt tttgtgttga agggatccaa 1380

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tggagaattc acctacaagt cctcttgtgc cttcagctgt gaggagggat ttgaattaca 1560

tggatcaact caacttgagt gcacatctca gggacaatgg acagaagagg ttccttcctg 1620

ccaagtggta aaatgttcaa gcctggcagt tccgggaaag atcaacatga gctgcagtgg 1680

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ctctgcagct cggacatgtg gagccacagg acactggtct ggcctgctac ctacctgtga 1800

agctcccact gagtccaaca ttcccttggt agctggactt tctgctgctg gactctccct 1860

cctgacatta gcaccatttc tcctctggct tcggaaatgc ttacggaaag caaagaaatt 1920

tgttcctgcc agcagctgcc aaagccttga atcagatgga agctaccaaa agccttctta 1980

catcctttaa gttcaaaaga atcagaaaca ggtgcatctg gggaactaga gggatacact 2040

gaagttaaca gagacagata actctcctcg ggtctctggc ccttcttgcc tactatgcca 2100

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tagggactta aaaaacttgt aaatgctgtc aactatgata tggtaaaagt tacttattct 2760

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gtttgtatat tgtcagatat tttttcagaa atatgtggtt tccacgatga aaaacttcca 3000

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acaatagaaa ctcaccatgt aaaagagtca tctggtagat ttttaacgaa tgaagatgtc 3240

taatagttat tccctatttg ttttcttctg tatgttaggg tgctctggaa gagaggaatg 3300

cctgtgtgag caagcattta tgtttattta taagcagatt taacaattcc aaaggaatct 3360

ccagttttca gttgatcact ggcaatgaaa aattctcagt cagtaattgc caaagctgct 3420

ctagccttga ggagtgtgag aatcaaaact ctcctacact tccattaact tagcatgtgt 3480

tgaaaaaaaa gtttcagaga agttctggct gaacactggc aacaacaaag ccaacagtca 3540

aaacagagat gtgataagga tcagaacagc agaggttctt ttaaaggggc agaaaaactc 3600

tgggaaataa gagagaacaa ctactgtgat caggctatgt atggaataca gtgttatttt 3660

ctttgaaatt gtttaagtgt tgtaaatatt tatgtaaact gcattagaaa ttagctgtgt 3720

gaaataccag tgtggtttgt gtttgagttt tattgagaat tttaaattat aacttaaaat 3780

attttataat ttttaaagta tatatttatt taagcttatg tcagacctat ttgacataac 3840

actataaagg ttgacaataa atgtgcttat gttta 3875

<210> 3

<211> 619

<212> PRT

<213> Mus musculus

<300>

<308> Genbank / AAA37577.1

<309> 2005-10-07

<313> (1)..(619)

<400> 3

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1 5 10 15

Leu Val Phe Val Leu Leu Ala Gly Glu Ser Thr Ala Trp Tyr Tyr Asn

20 25 30

Ala Ser Ser Glu Leu Met Thr Tyr Asp Glu Ala Ser Ala Tyr Cys Gln

35 40 45

Arg Asp Tyr Thr His Leu Val Ala Ile Gln Asn Lys Glu Glu Ile Asn

50 55 60

Tyr Leu Asn Ser Asn Leu Lys His Ser Pro Ser Tyr Tyr Trp Ile Gly

65 70 75 80

Ile Arg Lys Val Asn Asn Val Trp Ile Trp Val Gly Thr Gly Lys Pro

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Gln Arg Asn Glu Asp Cys Val Glu Ile Tyr Ile Gln Arg Thr Lys Asp

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Ser Gly Met Trp Asn Asp Glu Arg Cys Asn Lys Lys Lys Leu Ala Leu

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Cys Ile Glu Thr Ile Asn Ser Tyr Thr Cys Lys Cys His Pro Gly Phe

165 170 175

Leu Gly Pro Asn Cys Glu Gln Ala Val Thr Cys Lys Pro Gln Glu His

180 185 190

Pro Asp Tyr Gly Ser Leu Asn Cys Ser His Pro Phe Gly Pro Phe Ser

195 200 205

Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Phe Gly Cys Lys Arg Gly Tyr Leu Pro Ser

210 215 220

Ser Met Glu Thr Thr Val Arg Cys Thr Ser Ser Gly Glu Trp Ser Ala

225 230 235 240

Pro Ala Pro Ala Cys His Val Val Glu Cys Glu Ala Leu Thr His Pro

245 250 255

Ala His Gly Ile Arg Lys Cys Ser Ser Asn Pro Gly Ser Tyr Pro Trp

260 265 270

Asn Thr Thr Cys Thr Phe Asp Cys Val Glu Gly Tyr Arg Arg Val Gly

275 280 285

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Pro Ser Cys Lys Ala Val Thr Cys Asp Ala Ile Pro Gln Pro Gln Asn

305 310 315 320

Gly Phe Val Ser Cys Ser His Ser Thr Ala Gly Glu Leu Ala Phe Lys

325 330 335

Ser Ser Cys Asn Phe Thr Cys Glu Gln Ser Phe Thr Leu Gln Gly Pro

340 345 350

Ala Gln Val Glu Cys Ser Ala Gln Gly Gln Trp Thr Pro Gln Ile Pro

355 360 365

Val Cys Lys Ala Val Gln Cys Glu Ala Leu Ser Ala Pro Gln Gln Gly

370 375 380

Asn Met Lys Cys Leu Pro Ser Ala Ser Gly Pro Phe Gln Asn Gly Ser

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Ser Cys Glu Phe Ser Cys Glu Glu Gly Phe Glu Leu Lys Gly Ser Arg

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Arg Leu Gln Cys Gly Pro Arg Gly Glu Trp Asp Ser Lys Lys Pro Thr

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Cys Ser Ala Val Lys Cys Asp Asp Val Pro Arg Pro Gln Asn Gly Val

435 440 445

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Leu Glu Cys Thr Ser Gln Gly Lys Trp Thr Gln Glu Val Pro Ser Cys

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Gln Val Val Gln Cys Pro Ser Leu Asp Val Pro Gly Lys Met Asn Met

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Ser Cys Ser Gly Thr Ala Val Phe Gly Thr Val Cys Glu Phe Thr Cys

515 520 525

Pro Asp Asp Trp Thr Leu Asn Gly Ser Ala Val Leu Thr Cys Gly Ala

530 535 540

Thr Gly Arg Trp Ser Gly Met Pro Pro Thr Cys Glu Ala Pro Val Ser

545 550 555 560

Pro Thr Arg Pro Leu Val Val Ala Leu Ser Ala Ala Gly Thr Ser Leu

565 570 575

Leu Thr Ser Ser Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Met Arg Tyr Phe Arg Lys

580 585 590

Lys Ala Lys Lys Phe Val Pro Ala Ser Ser Cys Gln Ser Leu Gln Ser

595 600 605

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<210> 4

<211> 549

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<300>

<308> Genbank / AAA41113

<309> 1993-10-21

<313> (1)..(549)

<400> 4

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Gly Lys Ser Ile Ala Trp Tyr Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Leu Met Thr

20 25 30

Tyr Asp Glu Ala Ser Ala Tyr Cys Gln Arg Asp Tyr Thr His Leu Val

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Ala Ile Gln Asn Lys Glu Glu Ile Asn Tyr Leu Asn Ser Thr Leu Arg

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Trp Ile Trp Val Gly Thr Gln Lys Pro Leu Thr Glu Glu Ala Lys Asn

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Arg Cys Asp Lys Lys Lys Leu Ala Leu Cys Tyr Thr Ala Ser Cys Thr

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Ser Ser Asn Pro Gly Ser Tyr Pro Trp Asn Thr Thr Cys Thr Phe Asp

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275 280 285

Ser Ser Gly Val Trp Asp Asn Glu Lys Pro Ser Cys Lys Ala Val Thr

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Cys Asp Ala Ile Pro Arg Pro Gln Asn Gly Ser Val Ser Cys Ser Asn

305 310 315 320

Ser Thr Ala Gly Ala Leu Ala Phe Lys Ser Ser Cys Asn Phe Thr Cys

325 330 335

Glu His Ser Phe Thr Leu Gln Gly Pro Ala Gln Val Glu Cys Ser Ala

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Gln Gly Gln Trp Thr Pro Gln Ile Pro Val Cys Lys Ala Ser Gln Cys

355 360 365

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Glu Gly Phe Glu Leu Lys Gly Ser Arg Arg Leu Gln Cys Gly Pro Arg

405 410 415

Gly Glu Trp Asp Ser Glu Lys Pro Thr Cys Ala Gly Val Gln Cys Ser

420 425 430

Ser Leu Asp Leu Pro Gly Lys Met Asn Met Ser Cys Ser Gly Pro Ala

435 440 445

Val Phe Gly Thr Val Cys Glu Phe Thr Cys Pro Glu Gly Trp Thr Leu

450 455 460

Asn Gly Ser Ser Ile Leu Thr Cys Gly Ala Thr Gly Arg Trp Ser Ala

465 470 475 480

Met Leu Pro Thr Cys Glu Ala Pro Ala Asn Pro Pro Arg Pro Leu Val

485 490 495

Val Ala Leu Ser Val Ala Ala Thr Ser Leu Leu Thr Leu Ser Ser Leu

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Pro Ala Ser Ser Cys Gln Ser Leu Gln Ser Phe Glu Asn Tyr Gln Gly

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Pro Ser Tyr Ile Ile

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<210> 5

<211> 611

<212> PRT

<213> Canis lupus

<300>

<308> Genbank / AAA30843

<309> 1993-08-13

<313> (1)..(611)

<400> 5

Met Ile Thr Ser Gln Leu Leu Pro Ala Leu Thr Leu Val Leu Leu Leu

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Phe Lys Glu Gly Gly Ala Trp Ser Tyr Asn Ala Ser Thr Glu Ala Met

20 25 30

Thr Phe Asp Glu Ala Ser Thr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Thr His Leu

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Val Ala Ile Gln Asn Gln Glu Glu Ile Lys Tyr Leu Asn Ser Met Phe

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Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Asn Asn Lys Gln Asn Asp Glu Asp Cys

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195 200 205

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275 280 285

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Ser Pro Ala Gly Glu Phe Ser Val Arg Ser Ser Cys Asn Phe Thr Cys

325 330 335

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340 345 350

Gln Gly Gln Trp Ser Gln Gln Val Pro Val Cys Lys Ala Ser Gln Cys

355 360 365

Lys Ala Leu Ser Ser Pro Glu Arg Gly Tyr Met Ser Cys Leu Pro Gly

370 375 380

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385 390 395 400

Lys Gly Phe Val Leu Lys Gly Ser Lys Thr Leu Gln Cys Gly Leu Thr

405 410 415

Gly Lys Trp Asp Ser Glu Glu Pro Thr Cys Glu Ala Val Lys Cys Asp

420 425 430

Ala Val Gln Gln Pro Gln Asp Gly Leu Val Arg Cys Ala His Ser Ser

435 440 445

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450 455 460

Gly Phe Glu Leu His Gly Ser Ala Gln Leu Glu Cys Thr Ser Gln Gly

465 470 475 480

Gln Gly Val Thr Gly Gly Pro Ser Cys Gln Val Val Gln Cys Phe Lys

485 490 495

Ser Gly Ser Phe Arg Lys Asp Glu His Lys Leu Gln Gly Glu Pro Val

500 505 510

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515 520 525

Gly Ser Ala Ala Leu Met Cys Asp Ala Thr Gly His Trp Ser Gly Met

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545 550 555 560

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565 570 575

Leu Trp Leu Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg Ala Lys Lys Phe Val Pro

580 585 590

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Cys Ser Ile

610

<210> 6

<211> 484

<212> PRT

<213> Ovis aries

<300>

<308> Genbank / NP_001009749

<309> 2013-04-18

<313> (1)..(484)

<400> 6

Met Ile Ala Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Thr Phe Val Leu Leu Phe

1 5 10 15

Lys Glu Ser Arg Thr Trp Ser Tyr His Ala Ser Thr Glu Ile Met Thr

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Phe Glu Ala Ala Arg Asp Tyr Cys Gln Lys Thr Tyr Thr Ala Leu Val

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Trp Ala Pro Gly Glu Pro Asn Asn Lys Gln Thr Asp Glu Asp Cys Val

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Glu Ile Tyr Ile Lys Arg Glu Lys Asp Ser Gly Lys Trp Asn Asp Glu

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Val Val Thr Cys Gln Ala Gln Lys His Pro Glu His Gly His Leu Val

180 185 190

Cys Asn Pro Leu Gly Lys Phe Thr Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Ile Ser

195 200 205

Cys Ala Glu Gly Tyr Leu Pro Ser Ser Thr Glu Ala Ala Arg Cys Met

210 215 220

Ser Ser Gly Glu Trp Ser Thr Pro Leu Pro Lys Cys Asn Val Val Lys

225 230 235 240

Cys Asp Ala Leu Ser Asn Pro Asp Asn Gly Val Val Asn Cys Ser Gln

245 250 255

Asn His Gly Ser Leu Pro Trp Asn Thr Thr Cys Met Phe Glu Cys Gln

260 265 270

Glu Gly Tyr Lys Leu Thr Gly Pro Gln His Leu Gln Cys Thr Ser Ser

275 280 285

Gly Ile Trp Asp Asn Lys Gln Pro Thr Cys Lys Ala Val Thr Cys Ala

290 295 300

Ala Ile Ser His Pro Gln Asn Gly Thr Val Lys Cys Ser His Ser Leu

305 310 315 320

Val Gly Asp Phe Ala Phe Lys Ser Ser Cys His Phe Thr Cys Ala Glu

325 330 335

Gly Phe Ala Leu Gln Gly Pro Ala Gln Val Glu Cys Thr Ala Gln Gly

340 345 350

Arg Trp Thr Gln Gln Val Pro Val Cys Glu Val Val Arg Cys Ser Arg

355 360 365

Leu Asp Val Ser Gly Lys Leu Asn Met Asp Cys Asn Gly Glu Pro Val

370 375 380

Leu Gly Thr Glu Cys Met Phe Ala Cys Pro Glu Gly Trp Thr Leu Asn

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Gly Ser Val Ala Leu Thr Cys Gly Ala Thr Gly His Trp Ser Gly Met

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Leu Pro Thr Cys Glu Ala Pro Thr Val Ser Gln Thr Pro Leu Ala Val

420 425 430

Gly Leu Ser Thr Ala Gly Val Ser Leu Val Thr Ile Pro Ser Phe Leu

435 440 445

Phe Trp Leu Leu Lys Arg Leu Gln Met Lys Ala Glu Lys Leu Ser Asp

450 455 460

Asp Ser Ser Cys Ser Ser Leu Lys Ser Asn Gly Cys Tyr Ser Thr Pro

465 470 475 480

Ser Glu Leu Val

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Met Ile Ala Ser Gln Phe Leu Ser Ala Leu Thr Leu Val Leu Leu Ile

1 5 10 15

Lys Glu Ser Gly Ala

20

<210> 8

<211> 589

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Mature E-selectin

<400> 8

Trp Ser Tyr Asn Thr Ser Thr Glu Ala Met Thr Tyr Asp Glu Ala Ser

1 5 10 15

Ala Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Thr His Leu Val Ala Ile Gln Asn Lys

20 25 30

Glu Glu Ile Glu Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Ser Tyr Ser Pro Ser Tyr

35 40 45

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Lys Leu Ala Leu Cys Tyr Thr Ala Ala Cys Thr Asn Thr Ser Cys Ser

115 120 125

Gly His Gly Glu Cys Val Glu Thr Ile Asn Asn Tyr Thr Cys Lys Cys

130 135 140

Asp Pro Gly Phe Ser Gly Leu Lys Cys Glu Gln Ile Val Asn Cys Thr

145 150 155 160

Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Gly Ser Leu Val Cys Ser His Pro Leu

165 170 175

Gly Asn Phe Ser Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Ile Ser Cys Asp Arg Gly

180 185 190

Tyr Leu Pro Ser Ser Met Glu Thr Met Gln Cys Met Ser Ser Gly Glu

195 200 205

Trp Ser Ala Pro Ile Pro Ala Cys Asn Val Val Glu Cys Asp Ala Val

210 215 220

Thr Asn Pro Ala Asn Gly Phe Val Glu Cys Phe Gln Asn Pro Gly Ser

225 230 235 240

Phe Pro Trp Asn Thr Thr Cys Thr Phe Asp Cys Glu Glu Gly Phe Glu

245 250 255

Leu Met Gly Ala Gln Ser Leu Gln Cys Thr Ser Ser Gly Asn Trp Asp

260 265 270

Asn Glu Lys Pro Thr Cys Lys Ala Val Thr Cys Arg Ala Val Arg Gln

275 280 285

Pro Gln Asn Gly Ser Val Arg Cys Ser His Ser Pro Ala Gly Glu Phe

290 295 300

Thr Phe Lys Ser Ser Cys Asn Phe Thr Cys Glu Glu Gly Phe Met Leu

305 310 315 320

Gln Gly Pro Ala Gln Val Glu Cys Thr Thr Gln Gly Gln Trp Thr Gln

325 330 335

Gln Ile Pro Val Cys Glu Ala Phe Gln Cys Thr Ala Leu Ser Asn Pro

340 345 350

Glu Arg Gly Tyr Met Asn Cys Leu Pro Ser Ala Ser Gly Ser Phe Arg

355 360 365

Tyr Gly Ser Ser Cys Glu Phe Ser Cys Glu Gln Gly Phe Val Leu Lys

370 375 380

Gly Ser Lys Arg Leu Gln Cys Gly Pro Thr Gly Glu Trp Asp Asn Glu

385 390 395 400

Lys Pro Thr Cys Glu Ala Val Arg Cys Asp Ala Val His Gln Pro Pro

405 410 415

Lys Gly Leu Val Arg Cys Ala His Ser Pro Ile Gly Glu Phe Thr Tyr

420 425 430

Lys Ser Ser Cys Ala Phe Ser Cys Glu Glu Gly Phe Glu Leu His Gly

435 440 445

Ser Thr Gln Leu Glu Cys Thr Ser Gln Gly Gln Trp Thr Glu Glu Val

450 455 460

Pro Ser Cys Gln Val Val Lys Cys Ser Ser Leu Ala Val Pro Gly Lys

465 470 475 480

Ile Asn Met Ser Cys Ser Gly Glu Pro Val Phe Gly Thr Val Cys Lys

485 490 495

Phe Ala Cys Pro Glu Gly Trp Thr Leu Asn Gly Ser Ala Ala Arg Thr

500 505 510

Cys Gly Ala Thr Gly His Trp Ser Gly Leu Leu Pro Thr Cys Glu Ala

515 520 525

Pro Thr Glu Ser Asn Ile Pro Leu Val Ala Gly Leu Ser Ala Ala Gly

530 535 540

Leu Ser Leu Leu Thr Leu Ala Pro Phe Leu Leu Trp Leu Arg Lys Cys

545 550 555 560

Leu Arg Lys Ala Lys Lys Phe Val Pro Ala Ser Ser Cys Gln Ser Leu

565 570 575

Glu Ser Asp Gly Ser Tyr Gln Lys Pro Ser Tyr Ile Leu

580 585

<210> 9

<211> 1860

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 9

atgaaagcaa ctgctggagt catgaatgcc tcgcgctttc tctctgctct tgtttttgtt 60

ctcctcgctg gagagagcac agcttggtac tacaatgcct ccagtgagct catgacgtat 120

gatgaagcca gtgcatactg tcagcgggac tacacacatc tggtggcgat tcagaacaag 180

gaagagatca actaccttaa ctccaatctg aaacattcac cgagttacta ctggattgga 240

atcagaaaag tcaataacgt atggatctgg gtggggacgg ggaagcctct gacagaggaa 300

gctcagaact gggctccagg tgaaccaaac aacaaacaaa gaaatgagga ctgtgtagag 360

atttacatcc aacgaaccaa agactcgggc atgtggaatg acgagagatg taacaaaaag 420

aagctggctc tgtgctacac agcttcgtgt accaatgcat cctgcagtgg tcatggtgaa 480

tgcatagaga ccatcaatag ttacacctgc aagtgccacc ctggcttcct gggacccaac 540

tgtgagcaag ctgtgacttg caaaccacag gaacaccctg actatggaag cctgaactgc 600

tcccacccgt tcggcccctt cagctataat tcctcctgct cctttggctg taaaaggggc 660

tacctgccca gcagcatgga gaccaccgtg cggtgtacgt cctctggaga gtggagtgcg 720

cctgctccag cctgccatgt ggttgaatgt gaagctttga cccaccctgc ccacggtatc 780

aggaaatgtt cctcaaatcc tgggagctac ccatggaaca cgacatgcac gtttgactgt 840

gtggaagggt acaggcgagt tggagctcag aatctacagt gtacctcatc tggcatctgg 900

gataacgaga cgccatcatg caaagctgtg acctgtgacg ccatccctca gcctcagaat 960

ggctttgtga gctgcagcca ctcaacagct ggagaacttg cgtttaagtc atcctgtaac 1020

ttcacctgtg agcagagttt cacgttgcag gggccagcgc aggttgaatg cagcgcacaa 1080

gggcagtgga caccacaaat cccagtctgc aaagctgtcc agtgtgaagc cttatctgcg 1140

ccacagcagg gcaacatgaa atgtcttccc agtgcttctg gacctttcca aaatgggtcc 1200

agttgtgagt tctcctgcga agaaggattt gaactgaagg gatcaagaag acttcagtgt 1260

ggtccaagag gggaatggga tagcaagaag cccacgtgtt cagctgtgaa atgtgatgat 1320

gtccctcggc cccagaatgg cgtcatggag tgtgctcatg ctactactgg agaattcacc 1380

tacaagtcct catgtgcctt tcaatgcaat gagggcttta gcttgcatgg ctcagctcaa 1440

cttgagtgca catctcaggg aaagtggacc caggaagtcc cctcctgcca agtggtacaa 1500

tgtccaagcc ttgacgtccc gggaaagatg aacatgagct gcagcggaac agcagttttc 1560

ggcacagtgt gtgagtttac atgtcctgat gattggacac tcaatggatc tgcagttctg 1620

acgtgtggtg ccacgggacg ctggtctggg atgccgccta cctgtgaagc cccagtcagc 1680

cccacccgtc ccttggtagt tgcactttct gcggcaggaa cctcactcct gacatcgtcc 1740

tcattgctct acttgttgat gagatacttt cggaagaaag caaagaaatt tgttcctgct 1800

agcagctgcc aaagccttca atcatttgaa aactaccatg tgccttctta caacgtctag 1860

Claims

1.一种增加个体的缺血性组织中的血流或灌注的方法，其包含向所述个体给药增加所述缺血性组织中的所述血流或灌注的有效量的杂交腺相关病毒(AAV)，其包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV血清型2(AAV2)反向末端重复序列(ITR)和来自除血清型2之外的AAV的衣壳。

2.一种诱导个体的缺血性组织中的血管生成、新血管形成或血管再形成的方法，其包含向所述个体给药诱导所述缺血性组织中的血管生成、新血管形成或血管再形成的有效量的杂交腺相关病毒(AAV)，其包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV血清型2(AAV2)反向末端重复序列(ITR)和来自除血清型2之外的AAV的衣壳。

3.一种增加个体的骨骼肌活力的方法，其包含向所述个体给药增加所述骨骼肌活力的有效量的杂交腺相关病毒(AAV)，其包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV血清型2(AAV2)反向末端重复序列(ITR)和来自除血清型2之外的AAV的衣壳。

4.一种促进个体的缺血性皮肤伤口愈合的方法，其包含向所述个体给药促进缺血性皮肤伤口愈合的有效量的杂交腺相关病毒(AAV)，其包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV血清型2(AAV2)反向末端重复序列(ITR)和来自除血清型2之外的AAV的衣壳。

5.一种治疗或预防个体的坏疽的方法，其包含向所述个体给药治疗或预防所述个体的坏疽的有效量的杂交腺相关病毒(AAV)，其包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV血清型2(AAV2)反向末端重复序列(ITR)和来自除血清型2之外的AAV的衣壳。

6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述个体患有严重肢体缺血(CLI)。

7.一种治疗个体的严重肢体缺血(CLI)的方法，其包含向所述个体给药治疗CLI的有效量的杂交腺相关病毒(AAV)，其包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV血清型2(AAV2)反向末端重复序列(ITR)和来自除血清型2之外的AAV的衣壳。

8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述个体患有外周动脉疾病(PAD)。

9.根据权利要求1到8中任一项所述的方法，其中所述衣壳为AAV血清型8衣壳且所述杂交AAV为AAV2/8。

10.根据权利要求1到8中任一项所述的方法，其中所述衣壳为AAV血清型9衣壳且所述杂交AAV为AAV2/9。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述AAV向骨骼肌的缺血性组织肌肉内给药。

12.一种增加个体的缺血性组织中的血流或灌注的方法，其包含向所述个体给药增加所述缺血性组织中的所述血流或灌注的有效量的包含腺相关病毒(AAV)的细胞，所述腺相关病毒包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV血清型2(AAV2)反向末端重复序列(ITR)和AAV2衣壳。

13.一种诱导个体的缺血性组织中的血管生成、新血管形成或血管再形成的方法，其包含向所述个体给药诱导所述缺血性组织中的血管生成、新血管形成或血管再形成的有效量的包含腺相关病毒(AAV)的细胞，所述腺相关病毒包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV血清型2(AAV2)反向末端重复序列(ITR)和AAV2衣壳。

14.一种促进个体的缺血性皮肤伤口愈合的方法，其包含向所述个体给药促进缺血性皮肤伤口愈合的有效量的包含腺相关病毒(AAV)的细胞，所述腺相关病毒包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV血清型2(AAV2)反向末端重复序列(ITR)和AAV2衣壳。

15.一种治疗或预防个体的坏疽的方法，其包含向所述个体给药治疗或预防所述个体的坏疽的有效量的包含腺相关病毒(AAV)的细胞，所述腺相关病毒包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV血清型2(AAV2)反向末端重复序列(ITR)和AAV2衣壳。

16.根据权利要求12到15中任一项所述的方法，其中所述个体患有严重肢体缺血(CLI)。

17.一种治疗个体的严重肢体缺血(CLI)的方法，其包含向所述个体给药治疗所述个体的所述CLI的有效量的包含腺相关病毒(AAV)的细胞，所述腺相关病毒包含编码E选择蛋白的核苷酸序列、AAV血清型2(AAV2)反向末端重复序列(ITR)和AAV2衣壳。

18.根据权利要求12到17中任一项所述的方法，其中所述个体患有外周动脉疾病(PAD)。

19.根据权利要求12到18中任一项所述的方法，其中所述细胞为干细胞。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞为间充质干细胞(MSC)、源于骨髓(BM)的祖细胞或内皮祖细胞(EPC)。

21.根据权利要求12到20中任一项所述的方法，其中所述细胞为所述个体自体的。