CN115551554A - 基因工程间充质干细胞及其应用 - Google Patents

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CN115551554A CN202080067799.XA CN202080067799A CN115551554A CN 115551554 A CN115551554 A CN 115551554A CN 202080067799 A CN202080067799 A CN 202080067799A CN 115551554 A CN115551554 A CN 115551554A
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Abstract

因此，本揭示提供了一种基因工程间充质干细胞(MSCs)群，包括一包含Akt或HGF基因和PD‑L1基因的表达载体。还提供了一种协同提高间充质干细胞的生存状态和免疫调节能力或增强间充质干细胞增殖的方法，包括用Akt或HGF基因和PD‑L1基因转染间充质干细胞，以及一种预防、改善和/或治疗缺血状况、增强神经再生或减少神经元死亡的方法，包括向有需要的个体施用有效量的本揭示之基因工程间充质干细胞群。

Description

基因工程间充质干细胞及其应用
技术领域
本发明涉及一种工程化干细胞及其应用之领域。特别是，该工程化干细胞至少包含一生存基因和一免疫检查点基因，并可用于治疗或改善缺血状况，增强神经再生，或减少神经元死亡。
背景技术
卒中和急性心肌缺血(AMI)皆是世界上导致死亡和残疾的主要原因之一。尽管重组组织纤溶酶原启动剂(rt-PA)是一种公认且广泛应用于急性缺血性卒中及急性心肌缺血的治疗方法，但其狭窄的适用时间窗使溶栓治疗的获益有限。需要一种疗效或效益大幅改善的新颖治疗方法。
间充质干细胞具有广泛的免疫抑制潜能，可以调节固有免疫系统和适应性免疫系统细胞的活性，因此被认为具有治疗多种疾病的潜力。然而，对间充质干细胞行为的理解，在利用它们的能力来帮助治疗和相关应用方面，仍然是难以捉摸的。许多涉及间充质干细胞的治疗方法已被测试，但疗效甚微。
因此，提高其存活率的方法是间充质干细胞的治疗应用所亟需的。
发明内容
本揭示基于升高表达水平的Akt或肝细胞生长因子(HGF)和PD-L1的基因工程间充质干细胞(MSCs)以及使用此MSCs治疗和改善缺血状况、增强神经再生或减少神经元死亡的方法。本揭示的间充质干细胞和方法使需要治疗的个体的损伤恢复和修复得到显著和意想不到的改善。
在一个方面，本揭示提供了一种于一个体中预防、改善和/或治疗的缺血状况、增强神经再生或减少神经元死亡的方法，包括向该个体施用有效量的包含生存基因(如Akt或HGF)和免疫检查点基因(如PD-L1)的间充质干细胞群。还提供了包含生存基因(如Akt或HGF)和免疫检查点基因(ex.PD-L1)的间充质干细胞群，在制造于一个体中治疗或改善缺血状况的药剂的用途。在一个实施态样中，该间质干细胞是基因工程化的。
缺血状况的实例包括但不限于卒中和心肌梗塞(myocardial infarction，MI)。在一个实施态样中，该MI是急性心肌梗塞(acute myocardial infarction，AMI)。在一个实施态样中，本揭示的施用减轻了MI-诱导的纤维化。在另一个实施态样中，本揭示的施用还可减少缺血组织上的炎症。在另一个实施态样中，本揭示的施用可减轻MI后的左心室功能障碍，并减少MI后的梗塞大小。在另一个实施态样中，本揭示的施用可增加卒中后脾脏中T细胞上调节分子的表达，减少卒中脑损伤引起的神经元死亡和/或减少炎症反应，但增强缺血脑中CD8+CD122+Tregs的积累。
在一个实施态样中，该施用降低了炎症反应，但增强了缺血组织中CD8+CD122+Tregs的积累。优选地，该缺血组织是缺血的脑组织。
在一个实施态样中，该施用增加了个体T细胞中调节分子的表达。
在一个实施态样中，本揭示的有效量基因工程MSCs群升高了Akt或HGF和PD-L1的表达。
本揭示的基因工程MSCs群的有效量的某些实施态样为从约1×105个细胞到约1×108个细胞的范围。在某些实施态样中，该基因工程MSCs群的有效量范围为约3×105个细胞至约3×108个细胞、约5×105细胞至约5×108细胞、约7×105细胞至约7×108细胞、约1×106细胞至约1×108细胞、约3×106细胞至约3×108细胞、约5×106细胞至约5×108细胞、约7×106细胞至约7×108细胞、约1×107细胞至约1×108细胞、约3×107细胞至约3×108细胞、约5×107细胞至约5×108细胞、约7×107细胞至约7×108细胞、约1×105细胞至约1×106细胞、约3×105细胞至约3×106细胞、约5×105细胞至约5×106细胞或约7×105细胞至约7×106细胞。
在某些实施态样中，施用包括但不限于静脉注射、颈动脉内注射、动脉内注射或其组合。施用的某一实施态样是颈动脉内注射组合静脉注射。另一实施态样的施用方式是动脉内注射结合静脉注射。优选地，静脉注射在动脉内注射之前进行。在一个特定的实施态样中，在患有卒中或AMI的个体中，施用是颈动脉内注射结合静脉注射相或动脉内注射结合静脉注射。在另一个特定的实施态样中，施用的有效量范围为颈内注射约1×104细胞至约1×106细胞，优选约5×104细胞至约5×105细胞，静脉注射有效量范围为约3×104细胞至约1×107细胞，优选约1×105细胞至约5×106细胞。
另一方面，本揭示提供了一种协同增加MSC的生存状态和免疫调节能力或增强MSC增殖的方法，包括用Akt或HGF基因和PD-L1基因转染间充质干细胞。
在一方面，本揭示提供了一种基因工程间充质干细胞(MSCs)群，其中该MSCs包含生存基因(例如Akt或HGF)和免疫检查点基因(例如PD-L1)。在一实施态样中，该间充质干细胞是经基因工程化。
在一实施态样中，本文该的间充质干细胞选自由脐带间充质干细胞(umbilicalcord mesenchymal stem cells，UMSCs)、脂肪衍生间充质干细胞(adipose derivedmesenchymal stem cells，ADSCs)和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)组成的组。
在一实施态样中，本文所述的程序性死亡配体1(PD-1)或Akt或HGF是用转座子或载体转导。在一些实施例中，该生存基因(例如Akt或HGF)和免疫检查点基因(例如PD-L1)包含在一表达载体中。在一实施态样中，该表达载体是病毒载体。在某个实施态样中，该病毒载体是慢病毒载体。
在另一方面，本揭示提供了一种包含本揭示的基因工程MSCs群的医药组合物。
图式简单说明
图1A展示本揭示脐带间充质干细胞(UMSCs)原代培养物细胞形态观察结果图。
图1B展示本揭示脐带间充质干细胞原代培养物经流式细胞术分析生物学特性结果图。
图1C展示用流式细胞仪检测UMSC-PD-L1-Akt的RFP荧光和PD-L1的表达水平。
图1D展示用西方墨点法检测UMSC-PD-L1-Akt的Akt的表达水平。
图1E为UMSC-Akt-PD-L1和普通UMSC的脂肪发生、软骨发生、成骨和血管管形成的显微观察结果。
图2A展示UMSC-PD-L1-Akt及普通UMSCs经CFSE染色检测增殖结果图。
图2B展示H2O2对UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-Luc和UMSCs处理的细胞存活率结果。
图2C展示H2O2对UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-Luc和UMSCs处理，TUNEL+的细胞比例结果图。
图2D展示H2O2对UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-Luc和UMSCs处理，DCF荧光分析的细胞内活性氧水平结果图。
图2E展示H2O2对UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-Luc和UMSCs处理，在西方墨点分析Akt磷酸化结果图。
图3A展示静脉内注射IgG、UMSCs、UMSC-Akt、UMSC-HGF、UMSC-PD-L1、UMSC-PD-L1-Akt或UMSC-PD-L1-HSF在卒中后梗塞区域结果图。
图3B展示颈动脉内注射IgG、UMSCs、UMSC-Akt、UMSC-HGF、UMSC-PD-L1、UMSC-PD-L1-Akt或UMSC-PD-L1-HSF在卒中后梗塞区域结果图。
图3C展示合并静脉及颈动脉内注射IgG、UMSCs、UMSC-Akt、UMSC-PD-L1或UMSC-PD-L1-Akt卒中后梗塞区域结果图。
图3D展示静脉内(IV)、颈动脉内(IA)及合并静脉与颈动脉内(IV+IA)注射UMSC-PD-L1-Akt或UMSC-PD-L1-Akt和对照组，卒中后梗塞区域结果图。
图3E展示静脉内(IV)、颈动脉内(IA)及合并静脉与颈动脉内(IV+IA)注射ADSC-PD-L1-Akt和对照组，卒中后梗塞区域结果图。
图3F展示静脉内(IV)、颈动脉内(IA)及合并静脉与颈动脉内(IV+IA)注射BMSC-PD-L1-Akt和对照组，卒中后梗塞区域结果图。
图4A展示在身体摆动试验中，以IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-Akt和对照组处理大鼠的结果图。
图4B展示在垂直运动试验中，以IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-Akt和对照组处理大鼠的结果图。
图4C展示在垂直运动试验中，以IA-IV-ADSC-PD-L1-Akt、IA-ADSC-PD-L1-Akt、IV-ADSC-PD-L1-Akt和对照组处理大鼠的结果图。
图4D展示在垂直运动试验中，以IA-IV-BMSC-PD-L1-Akt、IA-BMSC-PD-L1-Akt、IV-BMSC-PD-L1-Akt和对照组处理大鼠的结果图。
图4E展示以IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt、IA-IV-UMSCAkt、IA-IV-UMSC-PD-L1和对照组处理大鼠的神经细胞死亡结果图。
图5A展示静脉、颈动脉内及合并静脉与颈动脉内注射UMSC-PD-L1-Akt-Luc的生物分布IVIS结果图。
图5B展示颈动脉内及合并静脉与颈动脉内注射UMSC-PD-L1-Akt-Luc后不同时间的生物分布IVIS结果图。
图5C展示合并静脉与颈动脉内注射UMSC-PD-L1-Akt-Luc的共聚焦显微镜免疫荧光结果图。
图6A-1及6A-2展示经IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治疗，经流式细胞术分析大脑半球炎性细胞的选通策略图。
图6B展示经IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治疗，经流式细胞术分析大脑半球的CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD11b+PD-L1+巨噬细胞和F4/80+PD-L1+小胶质细胞结果图。
图6C展示经IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治疗，经流式细胞术分析大脑半球的CD11b+TNF-α+、CD3+TNF-α+和CD3+INF-γ+细胞结果图。
图6D-1展示经IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治疗，经流式细胞术分析大脑半球炎性细胞的选通策略图。
图6D-2展示经IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治疗，经流式细胞术分析大脑半球的CD8+、CD8+CD122+、CD8+CD122+IL-10+和CD19+IL-10+细胞结果图。
图7A-1至7A-3展示经UMSC-PD-L1-Akt治疗，经流式细胞术分析脾脏细胞的选通策略图。
图7A-4展示经UMSC-PD-L1-Akt治疗，经流式细胞术分析脾脏细胞的CD11b+PD-L1+、CD11c+PD-L1+、CD19+PD-L1+、CD4+PD-L1+和CD8+PD-L1+细胞结果图。
图7B展示经UMSC-PD-L1-Akt治疗，经流式细胞术分析脾脏细胞的CD3+TNF-α+、CD3+INF-γ+细胞结果图。
图7C展示经UMSC-PD-L1-Akt治疗，经流式细胞术分析脾脏细胞的CD8+CD122+和CD19+IL-10+细胞结果图。
图8A展示经静脉注射(IV)或动脉内(IA)或合并静脉与动脉内(IV+IA)注射UMSC-PD-L1-Akt细胞在AMI模型中的梗塞面积的结果图。
图8B展示经静脉注射(IV)或动脉内(IA)或合并静脉与动脉内(IV+IA)注射UMSC-PD-L1-Akt或UMSC-PD-L1-HGF细胞在AMI模型中的梗塞壁厚度结果图。
图8C展示经静脉注射(IV)或动脉内(IA)或合并静脉与动脉内(IV+IA)注射ADSC-PD-L1-Akt或UMSC-PD-L1-HGF细胞在AMI模型中的梗塞面积及死壁厚度结果图。
图8D展示经静脉注射(IV)或动脉内(IA)或合并静脉与动脉内(IV+IA)注射BMSC-PD-L1-Akt细胞在AMI模型中的梗塞面积及死壁厚度结果图。
图9A展示经静脉注射(IV)或动脉内(IA)或合并静脉与动脉内(IV+IA)注射UMSC-Akt-PD-L1，对MI后3天的发炎指数结果图。
图9B展示经静脉注射(IV)或动脉内(IA)或合并静脉与动脉内(IV+IA)注射UMSC-Akt-PD-L1，对MI后3天的CD68+细胞浸润结果图。
图9C展示经静脉注射(IV)或动脉内(IA)或合并静脉与动脉内(IV+IA)注射UMSC-Akt-PD-L1，心肌梗塞后28天，三色染色切片的左室纤维结果图。
图10展示颈动脉及静脉注射UMSC-PD-L1-Akt-Luc后不同时间的生物分布IVIS结果图。
具体实施方式
除非另有定义，本文中使用的所有科学或技术术语与本发明所属技术领域的通常知识者所理解的含义相同。任何与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料都可以被本领域通常知识者理解并用于实践本发明。
除非另有说明，说明书和权利要求书中使用的所有表示成分数量、反应条件等的数字都应被理解为在所有情况下为术语“约”所修饰。因此，除非有相反的指示，本发明的说明书和权利要求书中规定的数字参数是近似的，并且可以根据本发明所寻求的所需特性而变化。为使本发明更容易理解，首先在下文定义某些术语。以下术语之另外定义及其他术语可贯穿本说明书阐述。若以下阐述之术语的定义与以引用之方式并入之申请案或专利中的定义不一致，则应使用本申请案中所阐述的定义来理解该术语之含义。
术语“一”应指本发明该对象中的一个或多个。术语“和/或”是指候选方案中的一个或两个。术语“一个细胞”或“该细胞”可包括多个细胞。
术语“和/或”用于指两种事物或该两种事物中的任一种。
“体内”一词一般是指在生物体内。术语“体外”一般是指在生物体外，例如在生物体外创造的人工环境中进行的实验。
术语“基因工程”或“基因工程细胞”是指使用遗传材料操纵基因，以改变细胞中的基因拷贝和/或基因表达水平。遗传材料可以是DNA或RNA的形式。遗传材料可以通过各种方式转移到细胞中，包括病毒转导和非病毒转染。在经过基因工程化后，细胞中某些基因的表达水平可被永久或暂时改变。
术语“转导”是指使用病毒将遗传物质输送到细胞中，其中病毒可以是整合病毒或非整合病毒。本发明中使用的整合病毒可以是慢病毒或逆转录病毒。整合病毒允许其编码基因整合到被病毒颗粒感染的转导细胞中。非整合病毒可以是腺病毒或仙台病毒。非病毒方法也可用于本揭示中，例如通过将DNA或RNA材料转染到细胞中。DNA材料可以是PiggyBac、minicircle载体或外显子质体的形式。RNA材料可以是mRNA或miRNA的形式。
术语“表达载体”是指携带外来基因进入细胞进行表达而不降解的媒介。本发明中的表达载体可以是质体、病毒载体和人工染色体。
此处的术语“升高表达”是指与非工程细胞对应的这些基因的表达水平相比，基因工程细胞中感兴趣的基因的RNA或蛋白质的表达增加。
此处的细胞“纯化”是指利用感兴趣的特定细胞所特有的特性来分离并获得感兴趣的细胞。在一些实施例中，独特的特性是指细胞表面的蛋白质的存在或不存在，在此称为“表面标记”。在一些实施例中，“阳性标记物”是指在感兴趣的细胞上存在或表达的表面标记物。在一些实施例中，“阴性标记物”是指在感兴趣的细胞上不存在的表面标记物。
术语“治疗”一般指获得所需的药理和/或生理效果。该效果可能是预防性的，即完全或部分预防疾病、失调或其症状，并且可能是治疗性的，即部分或完全治愈疾病、失调和/或归因于此的症状。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物(优选人类)疾病的任何治疗，并包括(1)抑制个体的疾病、失调或其症状的发展或(2)缓解或改善个体的疾病、失调或其症状。
本文中的术语“个体”、“受试者”和“患者”可互换使用，并指需要对其进行诊断、治疗或治疗的任何哺乳动物个体。
术语“有效量”是指当给需要治疗疾病或失调的患者或个体施用时，足以对该疾病或失调产生有益效果的细胞或其衍生后代的量。治疗有效量将根据疾病或失调的条件及其严重程度而变化。它不限于说明书中该的范围。确定给定细胞或其衍生后代的治疗有效量在本技术领域的通常知识范围内，并且不需要更多的常规实验。
本发明的术语“医药组合物”包括有效量的活细胞以治疗退化性疾病。细胞成分可以是培养细胞的混合物或分离的细胞群，如分化的组织细胞、祖细胞和/或干细胞。本发明的医药组合物为液体形式或细胞悬浮液缓冲液，它可以含有稳定液体悬浮液并帮助细胞存活的药学上可接受的赋形剂。
本发明中的术语“缺血状况”是指由缺血性疾病导致或伴随的条件，其通常特征是由于不良的血管条件，如血管狭窄或动脉瘤破裂，导致组织或器官的血流量减少。心肌梗塞(MI)、缺血性卒中和重症肢体缺血是三种最常见的缺血性疾病。在一些实施例中，缺血状况包括急性心肌梗塞(AMI)和缺血性卒中。在一个实施例中，缺血状况是由AMI引起的。在另一个实施例中，缺血状况是由缺血性卒中引起的。
术语“PD-L1”指程序性死亡配体1(programmed death-ligand 1)，由CD274基因编码的40kDa 1型跨膜蛋白。PD-L1与其受体PD-1结合，PD-1存在于活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞上。PD-L1也被称为“CD274”、“B7同源1”和“B7-H1”。
程序性死亡配体1(PD-L1)，又称分化簇274(CD274)或B7同源1(B7-H1)，是一种在人类中由CD274基因编码的蛋白质。PD-L1与其受体PD-1结合后，可抑制T细胞活化，降低增殖和细胞毒性，并诱导细胞凋亡。PD-1表达在活化的T细胞和B细胞的细胞表面，MSCs上表达的PD-L1与PD-1相互作用，提供抑制信号，调节细胞活化和增殖(J Exp Med2009；206：3015-3029)。此外，发现MSCs通过直接接触活化的T细胞和间接分泌可溶性PD-L1来抑制效应T细胞的增殖和功能(Stem Cells 2017；35：766-776)。然而，当MSCs被移植到治疗梗塞的心脏时，已经观察到间充质干细胞的移植效果不佳，心脏功能几乎没有改善(Ann Thorac Surg2003；73:1919-1926)。在梗塞的心脏中也被发现移植的MSCs存活率低，植入后4天只有1％的活力细胞(Circulation 2002；105:93-98)。
蛋白激酶B(PKB)，又称Akt，是一种丝胺酸/苏胺酸特异性蛋白激酶，在葡萄糖代谢、细胞凋亡、细胞增殖、转录和细胞迁移等多种细胞过程中具关键作用。Akt通过结合和调节许多下游效应激素，如核激素κB、Bcl-2家族蛋白、主溶酶体调节激素TFEB和鼠双分2(MDM2)等，调节细胞的生存和代谢。Akt可以直接和间接地促进生长激素介导的细胞生存。研究发现，经将移植细胞的低氧预调，即在移植前对细胞进行短暂的培养，可藉由启动Akt依赖性途径以保护人脑内皮细胞免受缺血性凋亡的影响(Am J Transl Res.2017；9：664-673)。然而，Akt-MSCs在修复和更好地从缺血性损伤中恢复方面仍有改进空间。
本揭示惊人地发现，对MSCs中的Akt或HGF和PD-L1进行遗传修饰，不仅能提供存活信号，还能发挥抗炎作用，有力地促进缺血状况的改善。本揭示的基因修饰可以维持和延长植入的MSCs的生存状态和免疫调节能力，以克服缺血组织的缺氧环境和脾细胞启动的免疫系统。
因此，本揭示提供了一种基因工程间充质干细胞群，其包括包含生存基因(如Akt或HGF)和免疫检查点基因(如PD-L1)的表达载体。还提供了一种协同增加MSCs的生存状态和免疫调节能力或增强MSCs增殖的方法，包括用Akt或HGF基因和PD-L1基因转染MSCs，以及一种预防、改善和/或治疗缺血状况、增强神经再生或减少神经元死亡的方法，包括向有需要的个体施用有效量的本揭示的基因工程间充质干细胞群。
根据本揭示的间充质干细胞可从不同来源获得，优选从脐带、脂肪组织或骨髓获得。根据不同来源，间充质干细胞是脐带间充质干细胞(UMSCs)、脂肪衍生间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)。在本揭示的一些实施态样中，从脐带中分离和纯化MSCs，并称为“脐带MSC”或“UMSC”。在一些实施例中，确定本揭示中的UMSC与从其他机构分离的MSC表达相同的表面标记，并显示出相符的活性。
根据本揭示的间充质干细胞被修饰为表达程序性死亡配体1和Akt或HGF。如本文所使用的，本揭示中的术语“修饰以表达”是指将外源基因或基因片段转移到间质干细胞中，使其能够表达外源基因或基因片段。优选地，这种修饰不改变间质干细胞的分化潜能，也不改变间质干细胞的免疫调节特性。在另一个方面，这种修饰优选为稳定的修饰，并且表达可以是持久的或可诱导的。根据揭示的间质干细胞经过修饰，表达程序性死亡配体1和Akt或HGF，并且仍然具有多能分化潜能，例如但不限于脂肪生成、软骨生成、成骨和血管化，这与没有PD-L1和Akt或HGF转导的普通间质干细胞相似。
用程序性细胞死亡蛋白-1和Akt或HGF修饰间充质干细胞的方式不受限制。优选地，程序性死亡配体1或Akt或HGF用转座子或慢病毒转导；更优选地，转座子为piggyBac转座子。通过应用piggyBac转座子，PD-L1和Akt或HGF在100-150天内保持其表达。结果表明，piggyBac转座子能高效、稳定地转染骨髓间充质干细胞，且piggyBac的基因修饰不会改变间充质干细胞的DNA拷贝数和排列。
本揭示的基因工程间充质干细胞(MSCs)，包含具有Akt或HGF基因和PD-L1基因的表达载体。除了Akt或HGF和PD-L1的序列外，本揭示的载体还包括一个或多个控制序列以调节本揭示的多核苷酸的表达。根据所利用的表达载体，在将分离的多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是可取的或必要的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸和核酸序列的技术是本领域众所周知的。在一些实施态样中，控制序列包括启动子、领导序列、多腺苷酸化序列、多肽序列、信号肽序列和转录终止子等。在一些实施例中，根据宿主细胞的选择选择合适的启动子。
揭示了本揭示的重组表达载体以及一个或多个表达调节区域，如启动子和终止子、复制原点等，这取决于它们将被引入宿主的类型。构成性启动子的非限制性例子包括SFFV、CMV、PKG、MDNU3、SV40、Ef1a、UBC和CAGG。
在一些实施态样中，将本文该的各种核酸和控制序列连接在一起，以产生重组表达载体，该载体包括一个或多个方便的限制性位点，以允许在这些位点插入或替换本揭示的多核苷酸。另外，在一些实施态样中，通过将本揭示的多核苷酸或包含该序列的核酸构建体插入适当的表达载体中来表达本揭示的多核苷酸。在涉及创建表达载体的一些实施态样中，编码序列位于载体中，以便编码序列与适当的控制序列可操作地连接以进行表达。重组表达载体可以是任何合适的载体(例如质体或病毒)，可以方便地进行重组DNA程序并带来本揭示的多核苷酸的表达。载体的选择通常取决于载体与将载体引入其中的宿主细胞的兼容性。载体可以是线性或封闭的圆形质体。在一个实施态样中，该载体是病毒载体。病毒载体的例子包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、α病毒载体等。在某些实施态样中，病毒载体是慢病毒载体。慢病毒载体是基于或衍生自癌病毒(含MLV的逆转录病毒亚群)和慢病毒(含HIV的逆转录病毒亚群)。这种例子包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(equine infectious anaemia virus，EIAV)、模拟免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)和猫免疫缺陷病毒(felineimmunodeficiency virus，FIV)。另外，还考虑使用其他逆转录病毒作为载体主干的基础，如鼠白血病病毒(murine leukemia virus、MLV)。
在一些实施态样中，已经在各种分化试验中测试了本揭示的基因工程MSCs，以建立其与从哺乳动物体的其他位置分离的常规MSC的相符性。分化试验包括脂肪生成分化、成骨分化和软骨生成分化。在一些实施态样中，分化测定还包括神经元细胞分化。
本揭示的基因工程MSCs群通过将MSC转染Akt或HGF基因和PD-L1基因，可以协同提高MSC的生存状态和免疫调节能力。因此，本揭示提供了一种预防、改善和/或治疗缺血状况、增强神经再生或减少神经元死亡的方法，包括向有需要的个体施用有效量的本揭示的基因工程MSCs群。
在一些实施例中，缺血状况包括但不限于卒中和心肌梗塞(MI)。优选地，MI是急性心肌梗塞(AMI)。本揭示的施用可减弱MI-诱导的纤维化。本揭示的施用还可减少缺血组织上的炎症。
施用可增加个体T细胞上调节分子的表达，降低炎症反应，但可增强缺血组织中CD8+CD122+Tregs的积累。与未受影响的组织相比，用本揭示的基因工程MSCs群处理的缺血组织中，包括CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD11b+PD-L1+巨噬细胞和F4/80+PD-L1+小胶质细胞在内的有活力的白细胞总数显著增加，而处理组和对照组之间的细胞总数在任一组织中都没有变化。
本揭示有效量的基因工程MSCs群可升高Akt或HGF和PD-L1的表达。特别是，本揭示的基因工程MSCs群的有效量范围为约1×105个细胞至约1×108个细胞。该量的其它实施例已揭示本文中。
根据本揭示的间充质干细胞包含在可注射制剂中。可注射制剂可通过公知的方法制备。例如，可注射制剂可通过例如将医药组合物溶解、悬浮或乳化在常规用于注射的无菌水介质或油性介质中来制备。注射用的水性介质的例子包括生理盐水、含有葡萄糖和其它辅助剂的等渗溶液等，可与适当的增溶剂如醇(如乙醇)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[如聚山梨酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩尔)加合物)]等结合使用。油性介质的例子包括芝麻油、大豆油等，可与增溶剂如苯甲酸苄酯、苯甲醇等结合使用。这样制备的注射剂优选装入适当的安瓿中。
本发明中MSC的施用途径取决于需要治疗的组织或器官。在一些有心肌梗塞的个体的情况下，MSCs的施用途径可以是静脉注射、动脉注射或其组合。含有细胞的溶液可以用合适的稀释剂如水、乙醇、甘油、液态聚乙二醇、各种油和/或它们的混合物以及本领域技术人员已知的其它稀释剂来制备。在某一特定实施态样中，在患有卒中或AMI的个体中，施用是颈动脉内注射结合静脉注射。在另一个特定的实施态样中，该施用的有效量范围为颈动脉内注射的约1×105个细胞至约3×106个细胞和静脉注射的约3×105个细胞至约3×106个细胞。
根据本揭示的施用还包括通过动脉内途径结合静脉途径，将间充质干细胞注射到需要此治疗的个体中。在本揭示的一个优选实施态样中，动脉内途径是通过颈动脉。
在本发明的一些实施态样中，施用MSCs的过程为术语“移植”或“植入”。
在一个实施态样中，本揭示的工程干细胞可以与额外的活性剂一起施用。在一些实施例中，工程干细胞和额外的活性剂可以同时、分别或同时施用。在一个实施态样中，工程干细胞和额外的活性剂可以定期施用。
应当理解的是，如果在此提及任何现有技术出版物，这种提及并不构成承认该出版物构成本技术领域普通常识的一部分。
虽然为了理解的明确性，已经通过说明和示例的方式提供了一些细节的揭示，但对于本领域具通常知识者来说，将显而易见的是，可以在不偏离揭示的精神或范围的情况下实施各种变化和修改。因此，前述描述和示例不应解释为限制性的。
实例
方法和材料：
脐带间充质干细胞UMSCs、脐带脂肪间充质干细胞ADSCs或骨髓间充质干细胞BMSCs的制备、分离和鉴定
收集经台湾中国医药大学医院机构审查委员会(IRB)认可之人类脐带组织，并用无钙及无镁PBS(DPBS，Life Technology)洗涤三次。用剪刀在中线方向切割，使脐动脉、静脉和外膜血管与沃顿果冻(Wharton’s jelly，WJ)分离。然后将沃顿果冻内容物广泛切成小于0.5cm3的小块，用胶原酶1型(Sigma，St Louis，USA)处理，并在37℃、95％空气/5％CO2增湿空气中培养3小时。然后将外植体培养在含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素的DMEM中，温度为37℃，环境为95％空气/5％二氧化碳增湿空气。接着保持5-7天不受干扰，以允许细胞从外植体迁移。源自脐带间充质干细胞(UMSCs)的细胞形态在培养4-8代后变为均匀梭形，并且将来自WJ的细胞表面分子通过流式细胞仪分析进行表征。细胞在PBS中用2mM EDTA分离，用含有2％BSA和0.1％迭氮钠的PBS(Sigma，USA)洗涤，并用结合有异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)的相应抗体，包括CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD49b、CD1q、CD3、CD10、CD14、CD31、CD34、CD45、CD49d、CD56、CD117、HLA-ABC和HLA-DR(BD，PharMingen)共同培养。之后，使用Becton-Dickinson流式细胞仪(Becton Dickinson，SanJose，CA)对细胞进行分析。脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)均购自ATCC(ADSCs，PCS 500-011；BMSCs，PCS 500-012)。
质体构建
将Akt质体(0.1μg)(pCMV6-myc-DDK-Akt，OriGene)、HGF(0.1μg)(pCMV6-XL4-HGF，OriGene)及PD-L1质体(0.1μg)(pCMV6-myc-DDK-PD-L1，OriGene)中的Akt、PD-L1和GFPcDNA通过特异性限制性酶连接符(TK中的EcoR1和Nhe1，BamH1和PD-1中的Not1)转入pIRES(Clontech)或pSF-CMV-SbfI(Oxford Genetics)中，构建pSF-PD-L1-Akt、pSF-PD-L1-HGF、pSF-Akt-GFP、pSF-PD-L1-GFP等的构筑物，并按照制造商的指示，由XtremeGene HP DNA(Roche)转染到UMSCs、ADSCs或BMSCs中，以获得UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-PD-L1-HGF、UMSC-Akt-GFP、UMSC-HGF-GFP和UMSC-PD-L1-GFP。
慢病毒质体
获得慢载体(pLAS3w)和包装(psPAX2)/包膜质体(pMD2.G)。自pCMV6-myc-DDK-Akt、pCMV6-XL4-HGF、pCMV6-myc-DDK-PD-L1和pRMT-Luc(OriGene)重组取得编码人类全长的Akt，PD-L1，荧光素酶(Luc)和对照GFP的cDNA，并通过特异性限制性内切酶中转入pUltra(Addgene)或pSF-CMV-CMV-Sbf1(Oxford Genetics)以获得pUltra-PD-L1-Akt、pUltra-PD-L1-HGF、pUltra-Akt-GFP、pUltra-HGF-GFP、pUltra-PD-L1-GFP的构筑物。随后，用特异性引物对这些模板进行PCR扩增，并用限制性内切酶将其复制到慢病毒载体主干质体pLAS3w。为制备携带PD-L1-Akt、Akt、PD-L1、Luc及对照GFP的重组慢病毒，将重组质体与包装及包膜载体以3:3:1的比例转染293T细胞(XtremeGene HP DNA(Roche)transfection)。36小时后收集含有病毒颗粒的培养上清液，24小时后再次以一半体积收集，然后以15,000rpm/min离心10min去除碎屑，然后转移到36mL超离心管中，在25℃下进行超离心，25,000rpm/min 3小时。再悬浮含有慢病毒的颗粒。病毒在定价和细胞转导前立即解冻。用合适的慢病毒感染骨髓间充质干细胞，其基因转移效率至少达到80％。
慢病毒转导
在6孔盘上进行慢病毒质体转导。除非另有规定，UMSCs以每孔1×105细胞的形式接种并重复三份，最终体积为1ml/孔，感染倍数(MOI)为5。添加5mg/ml鱼精蛋白硫酸盐(Sigma-Aldrich)的储备溶液(DMEM-LG中，无菌过滤)，以获得所需的最终浓度。将细胞转导24小时，然后替换为1.5ml/孔，以获得UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-Akt-GFP、UMSC-Luc和UMSC-PD-L1-GFP。用1.0mg/ml G418或嘌呤霉素溶液(Sigma)将生长过度的细胞接种到六孔盘上进行药物筛选。培养基每2天更换一次。根据培养基的颜色和细胞状态，利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达。筛选7天后，更换不含嘌呤霉素的完整培养基，继续培养。
稳定细胞系piggyBac转座子系统的构建
将pPB-CMV-MCS-EF1α-RedPuro(System Bioscience)的piggyBac载体做为基本载体，其包含多复制位点(MCS)、piggyBac末端重复序列(PB-TRs)、核心绝缘体(CIs)和融合至RFP的嘌呤霉素选择激素(BSD)，以人EF1α驱动。PCR扩增含有PD-L1-Akt、PD-L1-HGF、Akt、HGF或PD-L1的DNA片段(来自pUltra-PD-L1-Akt、pUltra-PD-L1-HGF、pUltra-Akt、pUltra-HGF、pUltra-PD-L1)，亚复制到pPB-CMV-MCS-EF1α-RedPuro载体中，位于EF1α编码区前面。关于载体构建的详细信息(pPB-PD-L1-Akt、pPB-PD-L1-HGF、pPB-Akt、pPB-HGF、pPB-PD-L1)可根据要求提供。为了获得稳定的UMSCs细胞，上述pPB-PD-L1-Akt、pPB-PD-L1-HGF、pPB-Akt、pPB-HGF、pPB-PD-L1载体通过磷酸钙(Invitrogen)或电穿孔(Amaxa nucleafectorII，Lonza)与一个piggyBac转酶表达载体(System Biosciences)共转染至UMSCs、ADSCs和BMSCs细胞。在嘌呤霉素存在下筛选出稳定的细胞。
体外增殖、迁移和分化试验
为了检测细胞的增殖和迁移，用CFSE染色法和跨孔迁移法对UMSC-PD-L1Akt和UMSCs进行比较。应用CFSE染色法检测UMSC-Akt-PD-L1或UMSCs的增殖情况，评价其对其增殖的影响。CFSE染色的UMSC-Akt-PD-L1以2×104个细胞/mL的密度接种在37℃和5％的CO2中5天。增殖细胞的一般选通策略与PBMC相同。在这个增殖门中测得的荧光与5天实验中的增殖活性相对应。采集完成后，所有的数据分析都使用FlowJo 8.7软件进行。
细胞迁移试验评估根据制造商的说明(Costar，#3421)，将100μL UMSC-Akt-PD-L1或UMSCs置于上室(transwell:6.5-mm直径，5.0-mm孔径)。下室使用SDF-1α(100ng/mL，R&DSystem，阳性对照)。在37℃的温度下，5％二氧化碳培养箱中进行4小时的培养。因为几乎所有的细胞在迁移后都停留在膜的下方，所以只需对这些细胞进行计数就可以进行定量。如前该，在显微镜下对膜下侧的粘附细胞进行计数。
诱导成脂分化，将UMSC-Akt-PD-L1或UMSCs的融合单层细胞培养在包含DMEM高糖(DMEM-HG，Sigma)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素、100mM胰岛素(Sigma)、500mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Sigma)、1mM地塞米松(Sigma)、100mM吲哚美辛(Sigma)和10％FCS的成脂分化培养基中生长。使用普通UMSCs培养基中保存的细胞作为阴性对照。成脂分化培养基每周更换3次。为了评估成脂分化，将细胞在室温下用0.3％油红O(Sigma)染色10分钟(以标记细胞内脂质积聚)，并用苏木精复染。
为了诱导成骨分化，在含有100U/mL青霉素(Sigma)、100mg/mL链霉素(Sigma)、50mg/mL L-抗坏血酸2-磷酸(Sigma)、10mM b-甘油磷酸(Sigma)、100nM地塞米松(Sigma)和10％FCS的DMEM高糖(DMEM-HG，Sigma)中培养融合的单层UMSC-Akt-PD-L1或UMSCs。以普通UMSCs培养基为阴性对照。成骨分化培养基每周更换3次。用茜素红S染色法(1％，Sigma)测定成骨水平，以检测钙矿化。
使用高密度颗粒细胞培养系统诱导UMSC-Akt-PD-L1或UMSC的软骨分化。细胞在无血清软骨分化培养基中洗涤，该培养基包含DMEM-HG、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素、50mg/mL L-抗坏血酸2-磷酸、40mg/mL脯胺酸(Sigma)、100mg/mL丙酮酸钠(Sigma)、100nM地塞米松及ITS加成物(10mg/mL牛胰岛素、5.5mg/mL转铁蛋白、5mg/mL亚硒酸钠、4.7mg/ml亚油酸和0.5mg/ml牛血清白蛋白(Sigma))。将250,000个细胞的等分试样重新悬浮在软骨分化培养基中，以250×g离心，然后加入10ng/mL的TGF-β1(R&D Systems)。以不含TGF-β1的成软骨分化培养基为阴性对照。培养基每周更换两次。用硫酸化蛋白多糖的阿尔辛蓝染色(Sigma)从组织学上证实颗粒培养物的软骨分化。此外，在EBM(Cambrex)中培养UMSC-Akt-PD-L1或UMSCs 2-3天，在预涂有基质凝胶(300μL/孔；Becton-Dickinson)和血管内皮生长激素(VEGF，10ng/ml，Sigma)的24孔盘上培养2-3天，诱导内皮细胞分化成血管的管形成。
为了诱导神经细胞分化，将UMSC-Akt-PD-L1或UMSCs与DMEM共孵育，采用三步法。简单地说，在神经诱导步骤中，细胞被低密度地涂盘在含有纤维连接蛋白(Sigma)的6孔盘上，然后依次暴露于(1)含有10％FCS的DMEM-HG(Sigma)和10ng/mL bFGF(R&D Systems)中24小时，(2)在神经承诺(neural commitment)步骤中，含有1mMβ-巯基乙醇(βME，Sigma)的DMEM-HG、10ng/mL NT-3(R&D Systems)中2天，以及(3)在神经分化阶段，含NT-3(10ng/mL，R&D Systems)、NGF(10ng/mL，R&DSystems)和BDNF(50ng/mL，R&D Systems)的DMEM-HG持续3-7天。细胞分化后，留作免疫组化分析。
流式细胞术
为了分析细胞表面标记物的表达，在PBS中用2mM EDTA分离细胞，用含有BSA(2％)和迭氮钠(0.1％)的PBS洗涤，然后用分别与异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)结合的抗体孵育直到分析。作为对照，用小鼠IgG1同型对照抗体染色。用于流式细胞术的抗PD-1、PD-L1、CD3、CD8、CD4、CD25、Foxp3、CD44、CD45、CD11b、F4/80、IFN-γ、CD206和GFP抗体购自BD Biosciences。细胞分析使用FACScan(BD)和CellQuest Analysis(BD Biosciences)和FlowJo v.8.8软件(TreeStar)进行。结果用阳性细胞占总细胞数的百分比表示。为了定量比较表面蛋白的表达，每个样本的荧光强度被表示为中值荧光强度(MFI)。为了Ki-67和颗粒酶B的细胞内染色，TIL在1μg/ml的抗CD3存在下培养48小时。然后在Triton x100渗透前用抗CD8培养细胞，然后用抗Ki-67抗体(Millipore)和Granzyme B染色。使用FACScan(BD)和CellQuest Analysis(BD Biosciences)和FlowJo v.8.8(TreeStar)对数据进行分析。
缺氧程序
UMSC-Akt-PD-L1或UMSC(1×105/mL)在37℃下于5％CO2增湿培养箱中培养，在常氧(21％O2)或缺氧条件(1％O2)中处理不同时间点。缺氧培养在一个双气体培养箱(Jouan，Winchester，Virginia)中培养，该培养箱配有O2探针以调节N2水平。用台盼蓝排斥试验和TUNEL法评价细胞数量和活力。
过氧化氢诱导细胞死亡的测定
采用MTT法(C，Ndipheyl-N-4，5-二甲基噻唑-2-基四唑溴化铵，Sigma)检测细胞的活性。UMSCs在96孔盘中培养。用过氧化氢孵育1h后，用MTT溶液(PBS中5mg/mL)代替培养基。继续孵育4h，然后抽吸去除上清液。加入二甲基亚砜(DMSO，Sigma)，在570nm处用微板阅读器(Molecular Devices)读取吸亮度，得到细胞活力百分比。此外，非极性化合物DCFH-DA(Sigma)进入细胞后，被裂解形成DCFH，并被氧自由基捕获氧化生成荧光DCF。UMSCs在无血清DMEM中预培养24小时，用H2O2处理30分钟，在37℃下用10μM DCFH-DA预加载30分钟。荧光强度由荧光阅读器(Finland)使用485nm激发和538nm发射滤光片进行分析。
抗原特异性T细胞反应的体外分析
将BALB/c小鼠脾细胞(2×106)置于RPMI-1640培养基(Gibco)24孔盘上，添加10％FBS(Sigma)、1％青霉素/链霉素(Gibco)。然后，以不同比例(10:1或1:1)细胞(2×105或2×106)共培养脾细胞，以不刺激，或与CD3-CD28微珠(dynabeals，thermal)孵育。对于增殖试验，脾细胞用羧荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)(Invitrogen)染色。用增殖指数(PI)来估计细胞的增殖/分裂，公式计算：PI＝增殖后的总数/增殖前的总数。培养6天后取细胞进行染色，分析Treg、CD4和CD8-T细胞亚群的增殖情况。或者，为了分析纵贯型样本中6天培养后的的增殖情况，当中细胞数量为受限的，培养未经CFSE染色的脾细胞，并用Ki67或同型对照抗体染色。增殖倍数变化(FC增殖)计算为UMSC-TRAIL-TK-PD-1条件下的增殖率除以对照条件下的增殖率。
TUNEL分析
细胞凋亡用免疫组织化学方法，使用商业TUNEL染色试剂盒(DeadEnd fluoremicTUNEL system；Promega)进行检测。TUNEL标记的百分率表示为TUNEL阳性核数除以DAPI染色的细胞核总数。
动物脑缺血再灌注模型
选用成年雄性Sprague-Dawley大鼠(体重250-300g)。动物接受三血管结扎。所有手术程序、动物实验方案和方法均按照机构指南进行，并经台湾中国医药大学动物与临床研究机构委员会批准。用水合氯醛(0.4g/kg，ip)麻醉大鼠，并结扎右大脑中动脉(MCA)和双侧颈总动脉(CCA)。双侧CCAs用非创伤性动脉夹夹闭。利用外科显微镜，在颧骨与鳞状骨融合处钻一个2×2毫米的颅骨切开孔。右侧大脑中动脉用l0-0尼龙线结扎。用激光多普勒流量计(PF-5010，Periflux system，Sweden)连续测量麻醉动物的皮质血流量。在右额顶叶区域形成一个直径为1毫米的毛刺孔，以便放置光电探测器。将探头(直径0.45mm)立体定向放置在皮质(后方1.3mm，囱门外侧2.8mm，硬脑膜下1.0mm)。缺血90分钟后，取下MCA上的缝线和CCA上的动脉夹，以允许再灌注。用热敏电阻探针监测核心体温，麻醉期间用加热垫维持在37℃。麻醉恢复后，用加热灯将体温维持在摄氏37度。
颈动脉内和/或静脉移植UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-PD-L1-HGF、ADSC-PD-L1-Akt或BMSC-PD-L1-Akt
在脑缺血后2小时，用水合氯醛(0.4g/kg，ip)麻醉成年雄性Sprague-Dawley大鼠(200-250g)，静脉注射约1×106细胞(UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-PD-L1-HGF、UMSC-Akt、UMSC-HGF或UMSC-PD-L1)。对照组动物仅给予PBS。颈动脉内注射时，再次暴露同侧颈总动脉，颈外动脉用6-0丝结扎，使甲状腺上动脉和翼腭动脉凝血，在卒中后24小时，使用24-G血管导管将1×105UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-PD-L1-HGF、UMSC-Akt、UMSC-HGF、UMSC-PD-L1、ADSC-PD-L1-Akt或BMSC-PD-L1-Akt注入颈内动脉。由于间充质干细胞具有免疫抑制特性，大鼠宿主未接受任何免疫抑制药物。
神经行为评估
分别于脑缺血前5天、细胞移植后1、7、14、28天进行行为学评估。测试测量了身体不对称性，运动能力和握力。记录基线检测之分数，以使脑缺血后的评分标准化。以抬高身体摆动试验用于评估大脑中动脉结扎术后的身体不对称性。最初，动物们被检查是否有侧向运动，它们的身体被尾巴悬在离笼子地板10厘米的地方。在20个连续试验中，计算缺血侧对侧的初始头部摆动频率，并将其以基线分数标准化。运动活动测量由VersaMax动物活动监测(Accuscan Instruments，Inc.，Columbus，OH)进行约2小时的行为记录。该仪器包含16个水平和8个垂直红外传感器。垂直传感器位于离试验室地板10厘米的地方。运动活动被计算为一只老鼠在室内的运动所破坏的光束的数量。计算2小时以上垂直项目的三个参数：(i)垂直活动(ii)垂直时间(iii)垂直运动次数。
用磁共振成像(MRI)测量梗塞面积
以3.0T的R4成像系统(GE)中对麻醉大鼠进行MRI检查。以2mm厚，无缝隙的6-8个冠状图像切片扫描大脑。利用自旋回波技术(重复时间4000毫秒；回波时间105毫秒)获得T2加权成像(T2WI)脉冲序列。分别在脑缺血后1、7和28天对每只动物进行图像采集。为了测量右皮质的梗塞面积，我们从左半球的总皮质面积中减去右皮质的非梗塞区。用手工逐层绘制梗塞面积，然后用内部体积分析软件(Voxtool，General Electric)计算体积。
生物发光成像
动物用IVIS成像系统200系列(Xenogen)成像以记录生物发光信号。用异氟醚麻醉动物，腹腔注射D-荧光素(Caliper)，剂量为270mg/g体重。在腹腔注射荧光素后15分钟进行图像采集。对于BLI分析，使用IVIS系统(Xenogen)确定包括颅内信号区在内的感兴趣区域，并记录总光子通量。为了便于细胞植入率的比较，每只动物的发光评分在第14天根据自己的发光读数进行标准化，从而使每只老鼠作为自己的对照。
从脾脏和脑中分离白细胞
取单个对照组和治疗组大鼠的脾脏，通过将组织穿过100μm尼龙网制备单细胞悬浮液(Fisher Scientific)。用RPMI 1640(Invitrogen)清洗细胞。用1×红细胞裂解缓冲液(eBioscience)裂解红细胞，孵育3min。然后用RPMI 1640冲洗细胞两次，计数并重新悬浮在含有2％胎牛血清(Gibco)和0.4％β-ME(Sigma-Aldrich)的刺激培养基中。
将大脑分为缺血(右)和非缺血(左)半球，并在3U/mL重组DNA酶I(Roche)和1mg/mL溶组织梭菌胶原酶(Sigma-Aldrich)中酶解，在80％Percoll(GE Healthcare)中重新悬浮，并以1600rpm(400g)的速度进行30分钟的密度梯度离心。从间期提取18个白细胞，用RPMI1640洗涤两次，计数后再悬浮于刺激培养基中，并使用流式细胞仪检测单个大脑半球的炎性细胞。
流式细胞术检测T细胞群
采用多色流式细胞仪分析细胞群。首先，用含有BSA(2％)和迭氮钠(0.1％)的PBS洗涤细胞。随后，在分析前，用来自BD的相应抗体(PD-L1、CD3、CD8、CD4、CD25、Foxp3、CD44、CD45、CD11b、F4/80、IFN-γ、7AAD和CD206)培养细胞，然后进行分析。
用小鼠IgG1同型对照抗体染色作为对照。使用FACScan(BD)和CellQuestAnalysis(BD Biosciences)和FlowJo软件v.8.8(TreeStar Inc.)，选通策略是基于第一个门的正确认证、以SSC-A和SSC-H排除重复、排除死细胞并进一步选择为7-AAD+/FSC-A。结果以阳性细胞占总细胞数的百分比表示。两组间的差异用Newman-Keuls事后检验进行方差分析。P值<0.05被认为是显著的。
细胞内染色
进行细胞内染色。简而言之，再悬浮已分离的白细胞(2×106个细胞/mL)并与LPS(10μg/mL，Sigma)、佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐(50ng/mL，Sigma)、离子霉素(500ng/mL)和GolgiPlug蛋白转运抑制剂(BD Biosciences)培养4小时。根据制造商的说明，用固定/渗透缓冲液(BD Biosciences)固定和渗透细胞。用肿瘤坏死激素-α(复制MP6-XT22)、白细胞介素(IL)-10(复制JES5-16E3)、PD-1(复制J43)和FoxP3(复制FJK-16s)染色，然后再悬浮在染色缓冲液中进行采集。同型匹配的单复制抗体作为阴性对照。
细胞激素测定
为检测TNF-α、VEGF和TGF-β的水平，在肿瘤接种后4周，从以不同剂量IO@FuDex制剂处理的小鼠体内分离TILs。用PRMI-1640培养基和L-谷氨酰胺(2mM)在6孔盘(2×105细胞ml-1)中进一步培养TIL 48h。在分光亮度计(Molecular Devices)下用Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems)半定量培养液中的TNF-α、TGF-β与VEGF，并用SOFTmax(MolecularDevices)程序生成标准曲线。
免疫组化评估
动物用水合氯醛(0.4g/kg，ip)麻醉，经心灌注生理盐水固定脑，再灌注4％PFA。然后收集组织样本，用4％PFA浸泡进一步固定，在30％蔗糖中脱水，并在干冰上冷冻。冠状切片(6μm厚)用低温恒温器切割，并用H&E染色，再以光学显微镜(E600，Nikon)观察。采用双重免疫荧光法检测荧光素酶+细胞中细胞类型特异性标记的表达。每个冠状切片首先用一级荧光素酶抗体(1:1000，Novus)、MAP-2(1:200，Millipore)、GFAP(1:500，Millipore)和GFP抗体(1:200，Millipore)染色，然后用特异性抗体处理与第二抗体结合的Cy3(1:500；山羊抗兔IgG，Jackson Immunology Research)或FITC(1:500；山羊抗鼠IgG，JacksonImmunology Research)进行双重免疫染色，以证明它们在CLSM下在一个细胞中的共定位。
免疫相关不良事件(irAE)的评估
在IO@FuDex3和M-IO@FuDex3处理后，评估irAEs，包括：(1)体重监测，(2)组织学，(3)免疫细胞浸润，(4)肝肾功能。处理期间监测小鼠体重。此外，在肿瘤接种后4周(n＝6)，对以IO@FuDex制剂处理的小鼠肝脏、肺、脾脏、肾脏和结肠切片进行H&E染色，并进行组织学分析。通过IHC检查肝、结肠、肾和肺的CD8+和CD4+T细胞浸润，并计算每平方毫米10个高倍视野中的阳性细胞数量，以进行评分。此外，用Beckman Unicell DxC800分析仪从每组(n＝6)的连续时间点(0、5、10、15、20、25和30d)使用小鼠血清测定ALT、AST、肌酐和葡萄糖的生化特征。
大鼠急性心肌梗塞模型及治疗方案
成年雄性Sprague-Dawley大鼠(SD，200-250g)通过结扎冠状动脉左前降支(LAD)以造成AMI。简而言之，在100％氧气中用2％异氟醚诱导麻醉后，大鼠使用呼吸机(SN-480-7，Japan)进行人工通气，呼气量为1mL/100g，呼吸频率为80/min。使用肋骨牵开器(MY-9454S，Japan)在第4-5肋间进行左开胸手术；用一小块浸有盐水的纱布将左肺放气。然后取出心包，用6-O聚乙烯带线缝合针在房室沟下方1-2mm处进行心肌内结扎(Ethicon，UK)。然后在胸腔关闭前重新充气。除结扎冠状动脉外，假手术组大鼠接受相同的治疗方案。
AK-PD-L1-PD、UMSC-PD-L1-HGF、AK-PD-L1-Akt或BMTID-L1-PD移植
急性心肌梗塞后2小时，用水合氯醛(0.4g/kg，ip)麻醉大鼠，静脉注射1×106细胞(UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-PD-L1-HGF)。对照组动物仅给予PBS。颈动脉内注射时，暴露左颈总动脉，颈外动脉用6-0丝结扎，甲状腺上动脉和翼腭动脉凝血，急性心肌梗塞后24小时，用30克血管导管将0.5×106UMSC-Akt-PD-L1、UMSC-PD-L1-HGF、ADSC-PD-L1-Akt或BMSC-PD-L1-Akt注入颈内动脉。
心肌组织学及免疫组化分析
实验大鼠用水合氯醛(0.4g/kg IP)再次麻醉，分别于AMI后3天和28天牺牲。3只未结扎LAD的大鼠作为正常对照。将大鼠心脏固定在4％多聚甲醛中，在30％蔗糖中浸泡3天。用低温恒温器从冠状面上的每个组织块切下一系列6μm厚的切片，用H&E染色，并用光学显微镜进行分析(Nikon，E600)。使用ImageJ软件(NIH)对沿长轴的不同水平(心尖、左室中部和基底部)的Masson trichrome(Sigma)染色切片进行分析，以计算梗塞面积、壁厚和纤维化百分比。梗塞面积以心肌梗塞28天后Masson trichrome染色切片的LV周长百分比进行测量。炎症和纤维化的分级采用光学显微镜下的评分系统进行盲法检查：0级，无炎症或纤维化；1级，最多5％的心脏节段有心脏浸润或纤维化；2级，6％-10％；3级，11％-30％；4级，31％-50％；5级，>50％。
在梗塞心肌边缘区随机选取10个高视野，用一级CD68(1:200，milipore)染色检测炎性细胞浸润(CD68阳性)，并以个每高倍视野之个数表示。组织切片用Carl Zeiss LSM510激光扫描共聚焦显微镜进行分析。免疫荧光标记载玻片上的FITC(绿色，1:500；JacksonImmunoresearch)、Cy3(红色，1:500；Jackson Immunoresearch)和Alexa Fluor 680(蓝色，1:1000；Invitrogen)荧光染料分别在488nm、543nm和680nm处激发。
统计分析
所有测量均采用盲法设计。结果用平均±SEM表示。采用双尾Student t检验评估对照组和治疗组之间的平均差异的显著性。两组间的差异用Newman-Keuls事后检验进行方差分析。P值<0.05被认为是显著的。
实例1：UMSCs和UMSC-PD-L1-Akt的体外特性
从沃顿果冻(WJ)中制备了脐带间充质干细胞(UMSCs)的原代培养物，并对细胞形态和生物学特性进行了分析(图1A)。流式细胞术显示CD1q、CD3、CD10、CD14、CD31、CD34、CD45、CD49d、CD56、CD117和HLA-DR呈阴性，但CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD49b和HLA-ABC呈阳性(图1b)。这些观察结果表明，UMSCs具有与间充质干细胞(MSCs)相同的表面标记物，与骨髓间充质干细胞的观察结果一致。
采用流式细胞仪检测了UMSC-PD-L1-Akt的RFP荧光和PD-L1的表达水平。转染后36小时至48小时，通过RFP和PD-L1流式细胞术的结果显示摄取效率平均为55-65％(图1C)。随后，经过3-5天的嘌呤霉素筛选，90％以上的细胞被转基因完全转化(图1C)。在西方墨点法中，在UMSC-PD-L1-Akt上也观察到Akt转基因表达的显著增加(图1D)。
为了测定UMSC-PD-L1-Akt-Luc在体内的存活率，在试验范围内观察到体内表达Luc信号强度的UMSCs细胞数与体外具直接相关性。UMSC-PD-L1-Akt-Luc在100-150天内仍保持荧光素酶的表达(图1D)。这些结果表明，piggyBac转座子能高效、稳定地转染骨髓间充质干细胞，且转座子素基因修饰不会改变间充质干细胞的DNA拷贝数和排列方式。
为了证明UMSC-PD-L1-Akt是否仍然具有多潜能分化潜能，分析了成脂、成软骨、成骨和血管的成管形成，结果表明UMSC-PD-L1-Akt表现出与未经PD-L1及Akt转基因转导的普通UMSCs相似(图1G)。
实例2：增强UMSC-PD-L1-Akt增殖
为了证明增殖效应，以CFSE分析检测UMSC-PD-L1-Akt的生物学特性。与UMSC相比，UMSC-PD-L1-Akt中观察到的增殖显著增加，与UMSC相比，在CFSE分析中观察到增殖细胞的百分比，并且不影响细胞活性(图2A)。
实例3：在H2O2诱导细胞凋亡中提高UMSC-PD-L1-Akt存活率
为了探讨H2O2促进细胞存活的机制，我们在体外观察了H2O2对UMSC-PD-L1-Akt细胞凋亡的影响。与UMSC-Luc和对照UMSCs相比，UMSC-PD-L1-Akt以剂量依赖性方式(0、1、10、100μM)对H2O2诱导的细胞死亡更具抵抗力(图2B)。与UMSCs相比，给予过氧化氢后，UMSC-PD-L1-Akt中TUNEL+细胞显著减少(图2C)。H2O2处理后，DCF荧光分析的细胞内活性氧(ROS)水平显示，与UMSCs相比，UMSC-PD-L1-Akt显著降低(图2D)。在西方墨点分析中，UMSCs和UMSC-PD-L1-Akt中的Akt水平在H2O2后30分钟内被诱导磷酸化(图2E)。重要的是，磷酸化Akt水平在UMSCs中恢复到接近基础水平，但在UMSC-PD-L1-Akt中在3小时后仍然显著升高(图2E)。
实例4：颈动脉内联合静脉注射UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-PD-L1-HGF、ADSC-PD-L1-Akt或BMSC-PD-L1-Akt后梗塞体积减少
首先证明静脉注射或颈动脉内注射UMSC-PD-L1-Akt或UMSC-PD-L1-HGF(IV-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-HGF、IA-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-HGF)与IV-UMSC-Akt、IA-UMSC-Akt、IV-UMSC-HGF、IA-UMSC-HGF、IV-UMSC-PD-L1、IA-UMSC-PD-L1、IV-UMSCs、IA-UMSCs和TTC染色的载具控制组相比，对减少卒中后梗塞体积及最大梗塞面积有更好的效果(图3A-B)。然后，接受合并颈动脉内注射及静脉注射UMSC-PD-L1-Akt或UMSC-PD-L1-HGF(IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt或IA-IV-UMSC-PD-L1-HGF)治疗的大鼠在脑缺血3天后通过TTC检查发现轻度梗塞(图3C)。定量测量显示，IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治疗组、IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治疗组、IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治疗组和对照组大鼠相比，梗塞体积明显减小(图3C)。同样地，IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治疗的大鼠最大梗塞面积小于IA-IV-UMSC-Akt治疗、IA-IV-UMSC-PD-L1治疗、IA-IV-UMSCs治疗和对照动物的面积(图3C)。此外，进一步确定卒中后3天的神经再生效果，与IA-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-HGF、IV-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-HGF和对照组相比，IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt或IA-IV-UMSC-PD-L1-HGF组的梗塞体积和最大梗塞切片明显减少(图3D)。同时，在IA-IV-ADSC-PD-L1-Akt、治疗或IA-IV-BMSC-PD-L1-Akt治疗的大鼠中也观察到类似的结果(图3E-F)。
实例5：颈动脉内合并静脉注射UMSC-PD-L1-Akt、ADSC-PD-L1-Akt或BMSC-PD-L1-Akt可改善脑卒中大鼠的神经行为
脑卒中模型显示了IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt的体内神经再生潜能。在大鼠脑卒中前后28天，对两种神经功能缺损测量方法，包含身体不对称和运动活动，进行评估。首先将大鼠分为4个治疗组，即IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-Akt和对照组。在身体不对称试验中，IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治疗大鼠的恢复情况优于IA-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-Akt和对照组(图4A)。此外，与IA-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-Akt和对照组相比，IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt大鼠的神经功能缺损也有显著改善(图4B)。这些结果表明IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt对卒中具有更高的神经再生潜力。一致地，在IA-IV-ADSC-PD-L1-Akt治疗或IA-IV-BMSC-PD-L1-Akt治疗大鼠中也观察到类似的结果(图4C-D)。
实例6：UMSC-PD-L1-Akt治疗减少脑卒中后神经死亡
用TUNEL染色法观察缺血大鼠脑细胞凋亡。没有卒中的对照组动物大脑的任何部分几乎没有TUNEL染色。IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治疗组大鼠缺血核心周围的半影区含有的TUNEL+细胞少于IA-IV-UMSC、IA-IV-UMSC-Akt、IA-IV-UMSC-PD-L1和对照组(图4E)。
实例7：脑卒中模型中UMSC-PD-L1-Akt-Luc靶向性研究
为了证明UMSC-PD-L1-Akt的归巢效应利用IVIS对UMSC-PD-L1-Akt-Luc在颈动脉内或静脉内的生物分布进行了研究。静脉注射UMSC-PD-L1-Akt-Luc移植于注射后6小时，最初被困于肺毛细血管中，显示肺IVIS增强的生物亮度图像(图5A)。而在卒中后24小时的颈动脉内注射中，UMSC-PD-L1-Akt-Luc的归巢在6小时到1周以上的时间内确实存活下来并重新定位到卒中区域的右大脑半球，而没有发生肺摄取(图5B)。在IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt-Luc组，从6小时到一周以上，跟踪UMSC-PD-L1-Akt-Luc在右半球和肺中的生物分布(图5B)。此外，在共聚焦显微镜免疫荧光研究中，位于梗塞周围区域的荧光素酶+细胞显示与MAP-2的神经元标记物或GFAP的胶质标记物共定位(图5C)。
实例8：IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治疗可减少炎症反应，但可增加缺血脑内CD8+CD122+Tregs的积聚
为了证明UMSC-PD-L1-Akt是否改变了脑卒中后白细胞的组成，检测了白细胞总数的绝对值。如图6A-1及6A-2所示执行选通策略。UMSC-PD-L1-Akt治疗的大鼠缺血半脑中，其白细胞总数(包括CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD11b+PD-L1+巨噬细胞和F4/80+PD-L1+小胶质细胞)均显著增加，而治疗组和对照组在两个半球的细胞总数没有变化(图6B)。UMSC-PD-L1-Akt治疗脑卒中大鼠可显著降低缺血半球的活化CD11b+肿瘤坏死激素-α(TNF-α)、CD11b+INF-γ+、CD3+TNF-α+和CD3+INF-γ+细胞的百分比(图6C)，从而提高缺血半球总CD8+、CD8+CD122+IL-10+Treg细胞和CD19+IL-10+Breg细胞的百分比(图6D-2)，白细胞介素-10的产量相应增加。抗PD-L1单抗治疗MCAO小鼠对CNS浸润的CD4+T细胞无影响，但观察到CD5+CD1dhi-CD19+Breg细胞减少。
实例9：IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治疗增加卒中后脾脏T细胞调节分子的表达
为评价UMSC-PD-L1-Akt治疗后的外周免疫功能，对脑卒中动物脾脏进行流式细胞术分析。卒中后4小时用UMSC-PD-L1-Akt治疗，可显著抑制96小时卒中后所评估的脾脏CD19+B细胞、CD4+和CD8+T细胞、CD11b+单核细胞/巨噬细胞和CD11c+树突状细胞(dc)上PD-L1的表达(图7A-4)。相反地，UMSC-PD-L1-Akt显著降低脾脏中活化的CD3+TNF-α+和CD3+INF-γ+炎性细胞的百分比(图7B)。此外，在UMSC-PD-L1-Akt治疗的卒中小鼠中，观察到脾脏中CD8+CD122+Tregs和CD19+IL-10+Bregs的百分比增加(图7C)。在UMSC-PD-L1-Akt治疗后，Foxp3+CD4+CD25+Tregs的频率没有变化。
实例10：通过颈内组合静脉注射UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-PD-L1-HGF、ADSC-PD-L1-Akt或BMSC-PD-L1-Akt，缓解MI后的左心室功能障碍，缩小MI后的梗塞面积
为了验证静脉注射(IV)或动脉内(IA)UMSC-PD-L1-Akt或UMSC-PD-L1-HGF(IV-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-HGF、IA-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-HGF、IV-IA-UMSC-PD-L1-Akt或IV-IA-UMSC-PD-L1-HGF)在抢救心肌缺血损伤中的重要作用，检测了AMI模型中的梗塞面积。在心肌梗塞后28天，IV-IA-UMSC-PD-L1-Akt治疗组或IV-IA-UMSC-PD-L1-HGF治疗组的梗塞体积远小于IV-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-HGF、IA-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-HGF和对照组的梗塞体积(图8A)。此外，与对照组相比，IV-IA-UMSC-PD-L1-Akt治疗组或IV-IA-UMSC-PD-L1-HGF治疗组梗塞壁厚度增加(图8B)。同时，在IV-IA-ADSC-PD-L1-Akt治疗或IV-IA-BMSC-PD-L1-Akt治疗的大鼠中也观察到类似的结果(图8C-D)。
实例11：UMSC-PD-L1-Akt对缺血心肌的抗炎作用
为了观察UMSC-Akt-PD-L1治疗是否抑制了MI后的炎症反应，对MI后3天的炎性细胞浸润进行了免疫组化分析。与IV-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-Akt和对照组相比，IV-IA-UMSC-PD-L1-Akt治疗组的炎症明显减轻(图9A)。与IV-UMSC-PD-L1-Akt组和对照组相比，IV-IA-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-Akt治疗组和对照组在梗塞后3天的梗塞周围区域的CD68+细胞浸润明显减少(图9B)。
实例12：UMSC-PD-L1-Akt治疗可减轻MI诱导的纤维化
与假手术相比，心肌梗塞后28天，三色染色切片观察到左室纤维化显著增加(图9C)。有趣的是，与IV-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-Akt和对照组相比，我们观察到IV-IA-UMSC-PD-L1-Akt治疗后心肌梗塞后纤维化明显减轻(图9C)。
实例13：急性心肌梗塞模型中UMSC-PD-L1-Akt-Luc靶向性研究
为了证明UMSC-PD-L1-Akt的归巢效应，利用IVIS对UMSC-PD-L1-Akt-Luc在颈动脉内或静脉内的生物分布进行了研究。静脉注射UMSC-PD-L1-Akt-Luc移植于注射后6小时开始初步被困于肺毛细血管中，显示肺IVIS增强的生物亮度图像(图10)。而在心肌梗塞后24小时的颈动脉内注射中，UMSC-Akt-PD-L1-Luc的归巢在6小时到1周以上的时间内确实存活下来并转移到心脏区域而无肺摄取(图10)。
虽然已经结合上述具体实施例描述了本揭示，但对于本领域具通常知识者来说，其许多替代方案及其修改和变化将是显而易见的。所有这些替代方案、修改和变型都被视为属于本揭示的范围。

Claims (22)

1.一种基因工程间充质干细胞(mesenchymalstem cells，MSCs)群，其中该MSCs包含一个生存基因和一个免疫检查点基因。
2.如权利要求1所述的基因工程MSCs群，其中该MSCs是以Akt或肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)基因和PD-L1基因进行基因工程。
3.如权利要求1或2所述的基因工程MSCs群，其中该MSCs是脐带间充质干细胞(umbilicalcord mesenchymal stem cells，UMSCs)、脂肪衍生间充质干细胞(adiposederived mesenchymal stem cells，ADSCs)或骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymalstem cells，BMSCs)。
4.如权利要求1至3中任一项所述的基因工程MSCs群，其中该生存基因和免疫检查点基因包含在一个载体中。
5.如权利要求1至4中任一项所述的基因工程MSCs群，其中该载体是慢病毒载体。
6.一种医药组合物，包含如权利要求1至5中任一项所述的MSCs群。
7.一种协同增加MSCs的生存状态和免疫调节能力或增强MSCs增殖的方法，包括以协同有效量之Akt或HGF基因和PD-L1基因转染MSC。
8.如权利要求7的方法，其中该MSC是UMSC、ADSC或BMSC。
9.如权利要求1至5中任一项所述的基因工程MSCs群之用途，其用于制造用于预防、改善和/或治疗缺血状况、增强神经再生或减少神经元死亡的药剂，其中该药剂为将有效量的基因工程MSCs群施用于需要之个体。
10.如权利要求9所述的用途，其中该MSC是UMSC、ADSC或BMSC。
11.如权利要求9所述的用途，其中该有效量范围为约1×105个细胞至约1×108个细胞。
12.如权利要求9所述的用途，其中该施用降低炎症反应，但增强了缺血组织中CD8+CD122+Tregs的积累。
13.如权利要求13所述的用途，其中该缺血组织是缺血的脑组织。
14.如权利要求9所述的用途，其中该施用增加了该个体中T细胞上调节分子的表达。
15.如权利要求9所述的用途，其中该缺血状况是卒中。
16.如权利要求9所述的用途，其中该缺血状况是心肌梗塞(myocardial infarction，MI)。
17.如权利要求16所述的用途，其中该MI是急性心肌梗塞(acute myocardialinfarction，AMI)。
18.如权利要求9所述的用途，其中该施用是静脉注射、颈动脉内注射、动脉内注射或其组合。
19.如权利要求9所述的用途，其中该施用是颈动脉内注射结合静脉注射或动脉内注射结合静脉注射。
20.如权利要求9所述的用途，其中在患有卒中或AMI的个体中，该施用是颈动脉内注射结合静脉注射或动脉内注射结合静脉注射相。
21.如权利要求20所述的用途，其中该施用的有效量为颈动脉内注射约1×104细胞至约1×106细胞，静脉注射约3×104细胞至约1×107细胞。
22.如权利要求9所述的用途，其中该施用可减轻MI-诱导的纤维化、减少缺血组织上的炎症、减轻MI后的功能障碍和减少MI后的梗塞大小、增加卒中后脾脏中T细胞上调节分子的表达、或减少卒中脑损伤的神经元死亡。
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