CN116376828A - 一种诱导CD4+T细胞生成Treg细胞的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种诱导CD4+T细胞生成Treg细胞的方法及应用,属于生物医学技术领域。包括以下步骤,nMSC单细胞悬液的制备,nMSC单细胞悬液铺板,分离PBMC,PBMC与nMSC共培养,共培养时添加IFN‑γ,共培养3‑4天进行换液并更换培养板,共培养至第7天收获细胞进行流式检测。nMSC由iPSC分化获得,属于通用现货型细胞,解决了使用脐带血MSC引发的伦理问题,而骨髓来源的MSC比较稀少,nMSC可根据需要无限量获取。此外,本发明诱导过程中创造性地加入刺激因子IFN‑γ,诱导时间大幅缩短,产生Treg细胞比例高。通过本发明产生的Treg细胞可在多种自身免疫性疾病中应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,具体涉及一种间充质干细胞诱导CD4+T细胞生成调节性T细胞的方法及应用。
背景技术
调节性T细胞( regulatory T cell,Treg细胞) 是一类特殊免疫调控作用的T细胞亚群,维持机体免疫耐受的重要细胞,可调控CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和抗原呈递细胞等的免疫应答。CD4+CD25+FoxP3 Treg细胞被认为是最能表征Treg细胞的一种细胞亚群的marker,可反映 CD4+ CD25+Treg 细胞的水平和功能。Treg细胞是CD4+T细胞的主要亚群之一,主要通过分泌多种细胞因子抑制和细胞接触抑制两种方式调节肿瘤免疫。Treg细胞在免疫过程中扮演重要角色,具有多种不同的调节机制,可以根据不同微环境采取不同的免疫调控策略,叉头框蛋白P3(forkhead box protein P3,FoxP3)持续表达可促进Treg细胞分化并提高免疫抑制能力。Treg细胞数量过多与肿瘤、感染疾病等密切相关,而Treg细胞数量不足则会导致自身免疫性疾病。研究表明,在多种自身免疫性疾病中均出现了Treg细胞数量的减少或功能的异常,如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、自身免疫性甲状腺疾病、炎症性肠病等。大量研究报道了Treg细胞与Ⅰ型糖尿病关系密切,有临床试验表明Treg细胞与间充质干细胞联合治疗具有更强的减轻炎症反应的能力。
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell, MSC)不仅具有多向分化的潜能,更重要的是它具有独特的免疫抑制和免疫调控能力。MSC 可以分泌多种抗炎因子发挥其免疫调节功能,主要包括分泌IL-10、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、人白细胞抗原-G(HLA-G)、前列腺素E2(PGE2)、转化生长因子β(TGF-β)等实现免疫调节的作用。间充质干细胞除有效降低T细胞识别供体抗原复合物的免疫攻击之外,还能诱导Treg细胞增加从而抑制T细胞活化。目前常用的诱导Treg细胞的间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。参考文献1中骨髓MSC与PBMC以1:3共培养诱导7天CD4+CD25+FoxP3的Treg细胞占5.3%,诱导14天CD4+CD25+FoxP3的Treg细胞占14%。
人机体内Treg细胞的数量非常少,外周血Treg细胞仅占CD4+T淋巴细胞的5~10%。骨髓间充质干细胞来源少,脐带来源的间充质干细胞会引发伦理问题,骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞(ucMSC)诱导Treg细胞所需时间长,难以满足临床应用。因此,亟需开发一种来源充足、诱导时间短的间充质干细胞诱导CD4+T细胞生成调节性T细胞的方法。
发明内容
发明针对现有技术存在的问题提供了一种诱导效率高、时间短的间充质干细胞诱导CD4+T细胞生成调节性T细胞的方法及应用。
本发明nMSC的制备方法参照中国专利CN113025569B(发明名称为人多能干细胞来源的间充质干细胞及其制备方法和应用)。
本发明采用的技术方案如下:
一种间充质干细胞诱导CD4+T细胞生成调节性T细胞的方法,包括以下步骤:
步骤1:nMSC单细胞悬液的制备,将nMSC消化为单细胞悬液。
步骤2:nMSC铺板,制备好的nMSC单细胞悬液加入到6孔板的三个孔中,每孔1×105~8×105个nMSC,摇匀,置于培养箱中培养过夜,待细胞完全贴壁。
步骤3:分离PBMC,采集供者外周血单个核细胞(PBMC),与生理盐水混合,离心取白膜层。去除血小板等杂质后,加入RPMI 1640培养基充分混匀后离心,弃上清,收集沉淀,再加入RPMI 1640培养基重悬。
步骤4:配制培养基,按照体积比RPMI 1640培养基:FBS =6:1~12:1的比例配制RPMI 1640完全培养基,颠倒混匀,同时添加200IU/mL~800IU/mL的IL-2作为维持PBMC生长的因子。
步骤5:PBMC与nMSC共培养,用步骤4制备的培养基制备PBMC悬液,同时添加终浓度为10ng/mL~30ng/mL的IFN-γ,细胞数量比nMSC:PBMC为1:1~1:10,取出已经铺板的nMSC,将孔中nMSC培养基吸出,再加入添加有IFN-γ的PBMC悬液,混匀,置于培养箱中培养。
取出nMSC单细胞悬液新铺板的6孔板,将上述重悬的PBMC液分别加入对应的孔中。置于培养箱中继续培养,培养至第5~9天收获细胞进行流式检测。
步骤6:换液及更换培养板,培养过程中根据各孔培养基颜色判断是否需要换液,确定换液的时间后,取新的培养板进行nMSC单细胞悬液的铺板。
待所述nMSC单细胞悬液细胞贴壁后,对原培养板各孔细胞进行离心,弃nMSC上清,收集PBMC沉淀,取步骤4所制备的培养基对PBMC沉淀进行重悬,加入10ng/mL~30ng/mL IFN-γ。
取出新铺板nMSC单细胞悬液的培养板,将重悬的PBMC悬液分别加入对应的新铺板nMSC单细胞悬液的培养板孔中培养至收获细胞。
步骤7:流式检测,取出6孔板,用移液器充分吹打混匀,取出全部悬浮细胞于对应的离心管中,离心弃上清,留细胞沉淀待用。将细胞沉淀进行Zombie染色、表面染色、固定破膜、胞内染色后,即进行流式细胞仪检测。
优选地,所述步骤1中消化nMSC采用TrypLE、Solase、胰酶或Accutase中一种或多种。
优选地,所述步骤2或步骤6中铺板的nMSC单细胞悬液浓度为每孔1×105~9×105个细胞,还可以为每孔4×105~6×105个细胞,更优选为3×105~5×105个细胞。
优选地,所述步骤3中外周血单个核细胞与生理盐水混合体积比为2:1~1:2,更优选体积比为1:1。
优选地,所述步骤3中去除血小板等杂质的方法为将白膜层与DPBS、PBS或生理盐水等混合,离心弃上清,收集沉淀。
优选地,所述步骤4中体积比RPMI 1640培养基:FBS =6:1~12:1,更优选为体积比RPMI 1640培养基:FBS =8:1~10:1。
优选地,所述步骤4中添加400IU/mL~600IU/mL的IL-2作为维持PBMC生长的因子。
优选地,所述步骤5中PBMC与nMSC共培养,细胞数量比nMSC:PBMC=1:1~1:8,更优选细胞数量比nMSC:PBMC=1:1~1:5。
优选地,所述步骤5中PBMC与nMSC共培养,细胞数量比nMSC:PBMC=1:3。
优选地,所述步骤5中实验所需的PBMC数量为每孔9×105~1.5×106个。
优选地,所述步骤5中添加终浓度为15ng/mL~25ng/mL的IFN-γ。
本发明实施例中,所述步骤6换液及更换培养板,所述换液为换nMSC单细胞悬液,步骤5和步骤6均为PBMC与nMSC共培养阶段,共培养至收获细胞的时间一共为5~9天。
优选地,所述步骤6中在第3-5天换液和更换培养板。
本发明所述的一种间充质干细胞诱导CD4+T细胞生成调节性T细胞的方法,所述方法及其产生的调节性T细胞在制备治疗免疫性疾病药物中的应用,所述免疫性疾病为自身免疫性疾病和移植物抗宿主病,所述自身免疫性疾病为Ⅰ型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、自身免疫性甲状腺疾病、炎症性肠病等。
本发明所述MSC为间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell),所述nMSC为由初始细胞iPSC分化为脑类器官,进一步从脑类器官分化获得的间充质干细胞,所述nMSC与普通MSC来源不同。所述PBMC为外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell)的英文简称。
本发明的有益的效果如下:
(1)本发明所使用的nMSC并非普通MSC,而是由初始细胞iPSC分化为脑类器官,进一步从脑类器官分化获得的间充质干细胞。nMSC属于通用现货型细胞,解决了使用脐带血MSC引发的伦理问题,骨髓来源的MSC比较稀少,而nMSC可根据需要无限量获取,批次稳定可溯源。
(2)诱导过程中无需添加多种刺激因子,仅添加IFN-γ,有效刺激nMSC诱导产生Treg细胞,相比文献中骨髓来源MSC,nMSC诱导产生Treg细胞的时间由14天缩短为7天,缩减时间成本,利于工业应用。
(3)本发明所使用的nMSC诱导CD4+T细胞生成Treg细胞比常规ucMSC诱导CD4+T细胞生成Treg细胞的比例更高。
附图说明
图1为实施例1实验流程图。
图2为实施例1共培养第44h ucMSC组和nMSC组的细胞数量4倍显微镜明场图。
图3为实施例1共培养第44h ucMSC组和nMSC组的细胞数量10倍显微镜明场图。
图4为实施例1各组流式检测结果图。
图5为实施例2未添加刺激因子IFN-γ各组的流式检测结果图。
图6为实施例3 PMA+ Ionomycin组合作为刺激剂的流式检测结果图。
图7为实施例4 ucMSC和nMSC免疫调节因子的相对表达检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,对本发明作进一步详细的阐述,下述实施例不用于限制本发明,仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例完整实验流程图如图1所示,设置对照组仅添加PBMC,ucMSC或nMSC均不添加;设置实验组1和实验组2,两组实验采用两个供者的PBMC(实验取得供者同意,并签订知情同意书)进行实验作为两个生物学重复,其中实验组1(nMSC组)为nMSC与PBMC共培养,实验组2(ucMSC组)为ucMSC与PBMC共培养。以下为具体实验过程,其中ucMSC组的操作方法与nMSC组操作方法一致。
步骤1:nMSC单细胞悬液的制备
将nMSC复苏后至少传代两次以上,移除nMSC培养基,加入3mL DPBS溶液于细胞培养瓶中,轻轻摇动洗涤残留的培养基,小心移除清液;加入2mL TrypLE至培养瓶中,轻轻摇动,置于37℃培养箱中消化约3min,显微镜下观察消化状态,细胞完全消化后加入4mL RPMI1640培养基和10% FBS终止消化,制备得单细胞悬液。
步骤2:nMSC铺板
将制备好的nMSC悬液涡旋混匀,分别加入到6孔板的三个孔中,使得每孔3×105 ~5×105个nMSC,摇动混匀使细胞均匀分布,置于培养箱中培养过夜,待细胞完全贴壁。
步骤3:分离PBMC
1)分别采集供者ZJL和FJR(为保护供者隐私,ZJL和FJR为供者虚拟代号,仅为将实验组别进行区分)的外周血单个核细胞,将新鲜采集的抗凝全血与生理盐水按照体积比2:1~1:2混合,颠倒混匀。2)将混合液沿管壁缓缓加入到装有样本密度分离液的15mL离心管中,混合液与分离液体积比为1:1,离心。3)小心吸取白膜层,每管约取出2mL白膜层,将白膜层转移至装有8mL DPBS的15mL离心管中,充分颠倒混匀,离心。4)弃去上清,加入10mL DPBS充分混匀,离心,弃上清,收集沉淀。5)加入10mL RPMI 1640培养基充分混匀,离心,弃上清,收集沉淀。6)加入1mL RPMI 1640培养基重悬,细胞计数仪计数。
步骤4:配制培养基
按照体积比RPMI 1640培养基:FBS = 8:1~10:1的比例配制RPMI 1640完全培养基,颠倒混匀,同时添加400IU/mL~600IU/mL的IL-2作为维持PBMC生长的因子。
步骤5:PBMC与nMSC共培养
用步骤4制备的培养基制备PBMC悬液,并在6孔板中添加重悬后的PBMC,每孔添加9×105~1.5×106个,同时添加终浓度为15ng/mL~25ng/mL的IFN-γ,涡旋混匀。取出已经nMSC铺板的6孔板,将孔中nMSC培养基吸出,加入添加有IFN-γ的PBMC悬液。同时在6孔板新的2个孔中分别加入PBMC悬液,每孔 9×105~1.5×106个PBMC作为对照,摇动混匀,置于培养箱中培养。图2和图3分别为共培养第44h ucMSC组和nMSC组细胞数量4倍和10倍显微镜明场图,由图可见ucMSC组和nMSC组培养至第44h时视野中的细胞数量接近。
步骤6:换液及更换培养板
培养过程中根据各孔培养基颜色判断是否需要换液(一般3-4天需要更换一次)。确定换液的时间后,提前一天或至少提前4h进行nMSC单细胞悬液的铺板,铺板每孔3×105~5×105个,置于培养箱中待用。
待上述nMSC单细胞悬液的细胞贴壁后,对原6孔板各孔细胞进行离心,弃nMSC上清,收集PBMC沉淀。取步骤4配制的培养基加入离心管中,加入10ng/mL~30ng/mL IFN-γ,充分混匀细胞沉淀。
取出新铺板的6孔板,小心移除孔中的培养基,将上述重悬的PBMC悬液分别加入对应的孔中。置于培养箱中继续培养,PBMC与nMSC共培养至第七天收获细胞进行流式检测。
步骤7:流式检测
取出6孔板,用移液器充分吹打混匀,取出全部悬浮细胞于对应的15mL离心管中,离心,弃上清,留细胞沉淀待用。将细胞沉淀进行Zombie染色、表面染色、固定破膜、胞内染色后,即进行流式细胞仪检测。流式检测结果画门时,第一步根据细胞大小及颗粒度圈出目标主群,设为P1门;第二步,在P1门中去除粘连体,圈出单个细胞,设为P2门;第三步,在P2门中圈出Zombie低表达的活细胞,设为P3门;第四步,在P3门中圈出CD4阳性的细胞群,设为CD4+门;第五步,在CD4+门中根据CD25-FMO及Foxp3-FMO画十字门或直接根据细胞分群画门,确定Treg比例,CD4+CD25+FoxP3的Treg细胞流式检测的实验结果如图4所示。
根据图4可知,nMSC诱导PBMC-FJR和PBMC-ZJL在第7天产生Treg细胞的比例分别为13.41%和11.55%,而ucMSC诱导PBMC-FJR 和PBMC-ZJL 在第7天产生Treg细胞的比例为10.89%和1.66%。由此可见,在两组生物学重复实验中,nMSC均比ucMSC诱导PBMC中CD4+T细胞生成Treg细胞的效率高。
实施例2未添加刺激因子IFN-γ
其他实验步骤与实施例1相同,区别在于步骤5中PBMC与nMSC或ucMSC共培养时所有组别均不添加IFN-γ,本实施例设置nMSC与PBMC共培养两个实验组,分别为PBMC+nMSC1组和PBMC+nMSC2组,设置一组ucMSC与PBMC共培养ucMSC+PBMC组,设置一组仅有PBMC培养作为对照组,共培养期间观察诱导情况,流式检测结果如图5所示。
通过图5的流式结果可知,无论是nMSC还是ucMSC与PBMC共培养,均未检测到Treg细胞产生。由此可见,不添加IFN-γ不利于nMSC和ucMSC诱导PBMC中CD4+T细胞生成Treg细胞。
实施例3 PMA+ Ionomycin组合作为刺激剂进行诱导
其他实验步骤与实施例1相同,区别在于步骤5中添加IFN-γ改为添加50ng/mL的PMA+1μg/mL的Ionomycin,诱导至第7天检测Treg细胞生成情况,流式检测实验结果如图6所示。
由图6可知,添加50ng/mL的PMA+1μg/mL的Ionomycin进行刺激,ucMSC组以及nMSC组未诱导产生Treg细胞。
实施例4 ucMSC和nMSC免疫调节因子的相对表达
ucMSC或nMSC单细胞悬液的制备、铺板,分离PBMC、制备培养基、PBMC与ucMSC或nMSC共培养的方法与实施例1相同。
实验分为四组,按照不同的细胞数量比,分为MSC:PBMC=1:7.5组、MSC:PBMC=1:15组、MSC:PBMC=1:30组及对照组MSC。
各组培养体系如下表
实验分组以及各组培养体系中MSC分为ucMSC和 nMSC进行比较。
共培养43h后,取出6孔板,按照上表体系,向对应孔中加入刺激剂(PMA+Ionocymin)和蛋白转运抑制剂BFA,使PMA终浓度为50ng/mL、Ionomycin终浓度为1μg/mL、BFA终浓度为10μg/mL。
根据终浓度及工作液浓度(PMA工作液浓度:100μg/mL,Ionomycin工作液浓度:0.5mM,BFA工作液浓度:5mg/mL)计算得出每孔中需加入PMA 1μL、Ionomycin 5μL、BFA 4μL,同时按照每孔200μL的体系用RPMI 1640完全培养基补齐,涡旋混匀,每孔添加200μL,用移液器轻轻混匀。
继续置于培养箱中培养5h,之后收集上清液用于ELISA检测,将细胞用DPBS清洗两次后,每孔加入200μL TrypLE,收集MSC提取RNA用于qPCR检测。ucMSC和nMSC免疫调节因子的相对表达结果如图7所示。
由图7可知,不同比例的ucMSC和nMSC与PBMC共培养,均释放出免疫调节因子IDO、IL-10、PGE2、HLA-G、TGF-β。特别显著地,不同比例的nMSC与PBMC共培养,相比ucMSC与PBMC共培养,检测到更高基因水平的IDO、IL-10、PGE2、HLA-G、TGF-β的表达。参考文献2和3均报道了免疫调节因子TGF-β与FoxP3+Treg细胞的表达相关。此外,参考文献4和5均报道了IDO诱导Treg细胞产生。此外,参考文献6、7和8分别报道了免疫调节因子IL-10、PEG2和HLA-G的表达与Treg细胞产生有关。
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参考文献2:Chen WConversion of peripheral CD4+CD25- naive T cells toCD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factorFoxp3. J Exp Med. 2003 Dec 15。
参考文献3:Enriched circulating and tumor-resident TGF-β+ regulatory Bcells in patients with melanoma promote FOXP3+ Tregs. Oncoimmunology. 2022Jul 28。
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参考文献5:Indoleamine 2,3-dioxygenase-expressing mature humanmonocyte-derived dendritic cells expand potent autologous regulatory T cells.Blood. 2009 Jul 16。
参考文献6:IL-10 produced by iTreg cells controls colitis andpathogenic ex-iTreg cells during immunotherapy. journal of immunology.2012Nov 2。
参考文献7:Tumor Cyclooxygenase-2/Prostaglandin E2–Dependent Promotionof FOXP3 Expression and CD4+CD25+ T Regulatory Cell Activities in LungCancer. Cancer Research.2005 June 15。
参考文献8:南京大学硕士学位论文.间充质干细胞通过调控sHLA-G上调Treg。
Claims (10)
1.一种间充质干细胞诱导CD4+T细胞生成调节性T细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:将nMSC消化为单细胞悬液;
步骤2:将步骤1所制备的nMSC单细胞悬液铺板培养板,摇匀,过夜培养,待细胞贴壁;
步骤3:采集外周血单个核细胞,与生理盐水混合,离心取白膜层,去除杂质后,加入RPMI 1640培养基重悬;
步骤4:配制培养基,按照体积比RPMI 1640培养基:FBS=6:1~12:1的比例配制RPMI1640完全培养基,颠倒混匀,同时添加200IU/mL~800IU/mL的IL-2作为维持PBMC生长的因子;
步骤5:PBMC与nMSC共培养,用步骤4所制备的培养基制备PBMC悬液,加入10ng/mL~30ng/mL的IFN-γ,细胞数量比nMSC:PBMC为1:1~1:10,取出已经铺板的nMSC,将孔中nMSC培养基吸出,再加入添加有IFN-γ的PBMC悬液,混匀,置于培养箱中培养;
步骤6:换液及更换培养板,培养过程中根据各孔培养基颜色判断是否需要换液,确定换液的时间后,取新的培养板进行nMSC单细胞悬液的铺板,待所述nMSC单细胞悬液的细胞贴壁后,对原培养板各孔细胞进行离心,弃nMSC上清,收集PBMC沉淀,取步骤4所制备的培养基对PBMC沉淀进行重悬,加入10ng/mL~30ng/mL IFN-γ,取出新铺板nMSC单细胞悬液的培养板,将重悬的PBMC悬液分别加入对应的新铺板nMSC单细胞悬液的培养板孔中培养至收获细胞。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞诱导CD4+T细胞生成调节性T细胞的方法,其特征在于,所述步骤1中消化nMSC采用TrypLE、Solase、胰酶或Accutase中一种或多种。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞诱导CD4+T细胞生成调节性T细胞的方法,其特征在于,所述步骤2或步骤6中nMSC单细胞悬液铺板的浓度为每孔1×105~9×105个nMSC。
4.根据权利要求1所述的间充质干细胞诱导CD4+T细胞生成调节性T细胞的方法,其特征在于,所述步骤3中外周血单个核细胞与生理盐水混合的体积比为2:1~1:2,所述去除杂质的方法为将白膜层与DPBS、PBS或生理盐水混合,离心弃上清,收集沉淀。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的间充质干细胞诱导CD4+T细胞生成调节性T细胞的方法,其特征在于,所述步骤4中体积比RPMI 1640培养基:FBS=8:1~10:1,添加400IU/mL~600IU/mL的IL-2作为维持PBMC生长的因子。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的间充质干细胞诱导CD4+T细胞生成调节性T细胞的方法,其特征在于,所述步骤5中细胞数量比nMSC:PBMC为1:1~1:5,实验所需的PBMC数量为每孔9×105~1.5×106个。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的间充质干细胞诱导CD4+T细胞生成调节性T细胞的方法,其特征在于,所述步骤5中IFN-γ添加终浓度为15ng/mL~25ng/mL。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的间充质干细胞诱导CD4+T细胞生成调节性T细胞的方法,其特征在于,所述步骤6中在第3-5天换液及更换培养板,nMSC单细胞悬液铺板浓度为每孔3×105~5×105个/mL。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的间充质干细胞诱导CD4+T细胞生成调节性T细胞的方法,其特征在于,所述步骤6换液及更换培养板,所述换液为换nMSC单细胞悬液,所述步骤5和步骤6均为PBMC与nMSC共培养阶段,共培养至收获细胞的时间一共为5~9天。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的间充质干细胞诱导CD4+T细胞生成调节性T细胞的方法产生的调节性T细胞在制备治疗免疫性疾病药物中的应用,所述免疫性疾病为自身免疫性疾病和移植物抗宿主病,所述自身免疫性疾病为Ⅰ型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、自身免疫性甲状腺疾病、炎症性肠病。
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