CN105754941B - 一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种外周血NK细胞的诱导扩增培养方法。本发明所述的外周血NK细胞的诱导扩增培养方法是通过应用细胞因子白介素‑2、白介素‑15、4‑1BBL和SCGM培养基联合培养外周血单个核细胞，前期白介素‑15和4‑1BBL孵育固定在细胞培养板上诱导激活单个核细胞中的少量NK细胞快速增殖，后期溶解性的白介素‑15和4‑1BBL诱导NK细大量快速增殖，然后收集培养的NK细胞进行细胞纯度和对肿瘤细胞杀伤作用的检测以确保NK细胞的抗肿瘤作用。本发明方法诱导培养过程简单易行，周期较短，成本低廉；获得率高，重复性好；培养后细胞活力好，获得的NK细胞数量和活力均能保证临床肿瘤免疫治疗的应用。

Description

一种外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法
技术领域
本发明属于免疫学与表观遗传学研究领域，涉及一种外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法。
背景技术
NK细胞(自然杀伤细胞)属于固有免疫系统的免疫细胞，在外周血淋巴细胞中比例为10％-15％，构成了机体免疫系统首要防线。由于NK细胞识别靶细胞无MHC限制性，可以在预先无致敏的状态下直接杀伤肿瘤细胞。在NK细胞发挥免疫效应的同时可产生一系列细胞因子，调节适应性免疫，进而成为连接机体固有免疫与适应性免疫的桥梁。由于NK细胞具有直接杀伤与免疫调节的特性，使其有望成为肿瘤过继性免疫治疗的效应细胞。此外，越来越多的报道将原代NK或NK细胞系进行基因改造，以提高杀伤肿瘤的特异性和活性，进而进行过继性免疫治疗。可见，NK细胞在肿瘤生物治疗中具有广阔的应用前景，为了使更多的患者能够接受NK细胞免疫治疗，降低NK细胞的诱导扩增培养成本、简化其培养步骤和提高其诱导效率成为NK细胞临床应用的迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法，能有效降低NK细胞的培养成本和获得大量的NK细胞，为NK细胞在临床肿瘤免疫治疗方面的应用提供基础。
本发明所述的外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法包括以下步骤：
A.以常规技术制备人外周血单个核细胞；
B.用红细胞裂解液重悬所收集的单个核细胞，裂解去除残存的红细胞；
C.用38ml SCGM培养基重悬单核细胞，加入已灭活的自体血清2ml和2万单位重组人IL-2，混匀后加入培养板中，置于37℃孵箱静置培养；所述培养板中已以固定好培养激活NK细胞所需的白介素-15和4-1BBL；
D.第3天，补充20ml含有1-2％自体血清的SCGM培养基及1万单位IL-2、适量的白介素-15和适量的4-1BBL，混匀后继续培养；
E.第4天，把培养板中的培养液转移到培养袋中继续培养，每3-4天向培养袋中补充40ml含有1-2％自体血清的SCGM培养基和2万单位IL-2、适量的白介素-15和适量的4-1BBL，总共培养18天，可获得的NK细胞总数可达5.5×109个，活细胞率约为90％，且其中NK细胞的纯度约为80％。
根据本发明所述的外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法的进一步特征，步骤B中，每40ml外周血标本收集得到的单个核细胞用5ml红细胞裂解液重悬，37℃水浴1分钟，完全裂解残存的红细胞。
根据本发明所述的外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法的进一步特征，所述步骤D和E中，补充的白介素-15为10ng/ml。
根据本发明所述的外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法的进一步特征，所述步骤D和E中，补充的4-1BBL为10ng/ml。
根据本发明所述的外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法的进一步特征，步骤C中，提前一天将含有白介素-15和4-1BBL的PBS加入培养板上4℃孵育保存，使用时洗去没有固定好的白介素-15和4-1BBL。
优选地，提前一天将含有2μg/ml白介素-15和2μg/ml 4-1BBL的PBS加入培养板上4℃孵育保存。
本发明所述的NK细胞的诱导扩增培养方法具有以下特点和优点:
(1)本发明所述的外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法是通过应用细胞因子白介素-2、白介素-15、4-1BBL和SCGM培养基联合培养外周血单个核细胞，前期白介素-15和4-1BBL孵育固定在细胞培养板上诱导激活单个核细胞中的少量NK细胞快速增殖，后期溶解性的白介素-15和4-1BBL诱导NK细大量快速增殖，然后收集培养的NK细胞进行细胞纯度和对肿瘤细胞杀伤作用的检测以确保NK细胞的抗肿瘤作用。通过检测NK细胞生长状态，检测NK细胞的纯度，通过本发明所述方法获得的NK细胞的细胞数量和细胞毒性作能确保用于临床治疗。
(2)本发明确定了10ng/ml的白介素-15和10ng/ml的4-1BBL诱导培养PBMC是最适培养浓度，这是通过比较不同浓度组合方案确定的。
(3)本发明确定了最适培养时间是14天，这是通过比较不同培养时间的NK细胞肿瘤杀伤率确定的。
(4)本发明所述的NK细胞的诱导扩增培养方法过程简单易行，NK细胞的诱导增殖的周期较短，成本低。
(5)采用本发明所述的NK细胞的诱导扩增培养方法，NK细胞的诱导效率高，重复性好。
(6)采用本发明所述的NK细胞的诱导扩增培养方法，增殖后NK细胞活力好，NK细胞数量和细胞毒性作用均能保证临床免疫治疗肿瘤，能为NK细胞的临床应用提供基础，具有很好的推广价值。
附图说明
图1是不同方案诱导培养PBMC细胞14天后所获得的细胞总数。
图2是人外周血单个核细胞第0天时细胞生长状态图。
图3是人外周血单个核细胞诱导培养18天后的细胞生长状态图。
图4是人外周血单个核细胞被诱导培养后，细胞总数随时间的变化。
图5是人外周血单个核细胞被诱导培养后，细胞存活率随时间的变化。
图6是人外周血单个核细胞中NK细胞(CD3-CD16+CD56+)的流式分析图。
图7是人外周血单个核细胞诱导培养7天时，NK细胞(CD3-CD16+CD56+)的流式分析图。
图8是人外周血单个核细胞诱导培养14天时，NK细胞(CD3-CD16+CD56+)的流式分析图。
图9是人外周血单个核细胞诱导培养18天时，NK细胞(CD3-CD16+CD56+)的流式分析图。
图10是诱导培养14天后，收集到的NK细胞在无血清培养基中24h生成的IFN-γ含量。
图11是最适培养方案诱导培养PBMC细胞不同时间后获得的NK细胞对K562细胞毒性作用。
图12是诱导培养14天后，收集到的NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性作用。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
本文中所用细胞因子白介素-2购自北京双鹭药业有限公司，白介素-15和4-1BBL购自北京达科为生物技术有限公司，流式细胞术检测所用的单克隆荧光抗体购自Biolegend公司，淋巴细胞分离液购自美国Healthcare公司，SCGM无血清培养基购自德国CellGenix公司，IFN-γ的ELISA检测试剂盒购自美国R&D生物技术公司，非放射性细胞毒性检测试剂盒检测NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性作用，购自美国Promega公司。
本实验重复了6名正常志愿者的外周血标本，均取得了类似效果。
实施例一：NK细胞的诱导扩增
(1)采血：采集新鲜抗凝血约40ml；
(2)分离：于600g离心15分钟，吸取上层淡黄色血清于50ml离心管，中间白膜层用于分离PBMC；
(3)灭活血浆：收集血清于56℃水浴30分钟灭活，待血清温度降至37℃以下后，将血浆转移至新的50ml离心管，置-20℃冰箱保存，供配制NK细胞培养液；
(4)分离PBMC：把步骤(2)中的白膜层约5毫升转移到1个50ml离心管中，加生理盐水至20ml，混匀；分别加至4个各含有5ml人淋巴细胞分离液的15ml离心管中，注意不要破坏液体界面。400g离心20min(离心机升速降速建议调至最低)。吸取中间的白细胞层转移到1个50ml离心管中，用生理盐水洗两次，并计数，每毫升抗凝外周血应约得1-2×106个PBMC；
(5)培养板孵育：提前一天将2ml含有刺激因子白介素-15(2μg/ml)和4-1BBL(2μg/ml)的PBS加入6孔培养板上4℃孵育保存，使用时用PBS洗去没有固定好的白介素-15和4-1BBL；
(6)取约4×107个PBMC，加入19ml SCGM无血清培养基、1ml灭活血清以及1×104U的IL-2，混匀后，加入孵育好的培养板中，每孔5ml，置于培养箱中培养(37℃，5％CO2浓度)；
(7)培养到第3天时补液，每孔加入3ml含1％血清的SCGM培养基，继续培养；
(8)第4天收集细胞，离心，去除上清，悬浮于30ml 1％血清的SCGM培养基，转至T75培养瓶中继续培养，并加入IL-2、IL-15和4-1BBL，其终浓度分别为500U/ml、后两者则是不同浓度组合如表1所示。
(9)从第5天开始，每隔一天半量补液：加入1-2％血清的SCGM培养基，和IL-2(500U/ml)、以及不同浓度组合的IL-15和4-1BBL(两者浓度组合如表一所示)，在37℃，5％CO2的细胞培养箱中继续培养直到第18天。
表1(单位：ng/ml)
Figure BDA0000968015020000051
(10)收集各组培养到第18天的细胞并计数，结果参见图1。从图中可知，外周血PBMC按照不同方案培养18天后，从组3开始能获得多于5×109的细胞，但组4和组5培养所获得的细胞数与其比较并没有被显著性地增加，表明当IL-15和4-1BBL的浓度达到10ng/ml以后，随着其浓度增加并不能显著性增加获得的细胞数。所以组3是最适培养方案，即IL-15和4-1BBL培养细胞时的最适浓度都为10ng/ml。
实施例二：流式细胞术检测NK细胞的数量含量
(1)根据最适培养方案的确定(IL-15和4-1BBL培养细胞时的最适浓度都为10ng/ml)，选择最适培养方案的细胞为观察检测对象。在倒置相差显微镜下观察细胞形态，结果参见图2，图中可见在培养第0天时，细胞型态呈圆形，体积较小，且细胞透亮度好，胞内未见颗粒；在培养第18天时，结果参见图3，在细胞生长图可见细胞成团生长，部分细胞贴壁生长，细胞形态不规则，细胞体积比一般淋巴细胞大，透亮度好。
(2)培养细胞数量的计算：对第0、3、7、9、12、14、16和18天时培养的细胞进行细胞总数计数和台酚蓝染色计量细胞存活率。结果参见图4和5：培养细胞的初始细胞数约为40×106个，诱导培养第7天时细胞增殖速度加快，并随着时间细胞总数持续增加，第14天时，细胞总数已达到4.2×109个。培养3天后的活细胞率并不是随时间持续增长的，第14天时达到最大值97.6％，随后开始下降，这表示越来越多的细胞开始凋亡，培养到第18天时存活率只有90.3％(见图5)。所以，培养到第14天的NK细胞活力最好。
(3)分别收集第0、7、14和18天的细胞，收集的细胞每管106，用3ml含有2％胎牛血清的PBS洗涤二次，每次倾倒前离心300g×5分钟，倾倒后用滤纸吸干管口液体；用100μl含有2％胎牛血清的PBS重悬细胞，加入抗人CD3单克隆抗体和抗人CD56CD16单克隆抗体各5μl，充分混匀，4℃避光孵育30分钟；3ml含有2％胎牛血清的PBS洗涤，4℃，300g×5分钟离心，洗涤后倾倒用滤纸吸干管口液体，加入400μl 2％胎牛血清的PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测。
(4)流式细胞仪检测：应用FACSDiva软件，每管至少获取10000个细胞，以CD3阴性和CD56CD16双阳性作为NK细胞的表型特征，计算NK细胞占总细胞的百分含量。结果参见图6、图7、图8和图9，图中CD3FITC-A指anti-CD3FITC，CD16CD56PE-A指anti-CD16CD56PE；图中方框左上角中细胞群表示NK细胞，百分比表明其在所有培养细胞中的含量。图6中检测结果发现在诱导培养前，单个核细胞中的NK细胞大约只有10％；随着诱导时间的增加,第7天时单个核细胞中的NK细胞含量为20％(图7)，到第14天时NK细胞含量大约为75％(图8)，第18天NK细胞含量大约为80％(图9)。鉴于40×106个PBMC中NK只占10％左右(见图6)，培养到第18天时培养细胞总数为5.5×109(见图4)，活细胞率约为90％，且其中NK细胞的纯度约为80％(见图8)，这说明NK细胞增殖已达千倍。上述结果表明含有1-2％人血清的SCGM培养基加入白介素-2、白介素-15和4-1BBL后培养外周血PBMC能有效诱导NK细胞的生成和增殖。
实施例三：ELISA检测NK细胞生成的IFN-γ含量
1)试剂：
(1)包被缓冲液(pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液)：NaCO3 1.59克，NaHCO3 2.93克，加蒸馏水至1000ml。
(2)洗涤缓冲液(pH7.4PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克，Na2HPO4·12H2O 2.9克，NaCl8.0克，KCl 0.2克，Tween-20 0.05％0.5ml，加蒸馏水至1000ml
(3)稀释液:牛血清白蛋白(BSA)0.1克，加洗涤缓冲液至100ml；或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。
(4)终止液(2M H2SO4)：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。
(5)底物缓冲液(pH5.0磷酸二氢钠-柠檬酸)：0.2M Na2HPO4(28.4克/L)25.7ml；0.1M柠檬酸(19.2克/L)24.3ml；加蒸馏水50ml。
(6)TMB(四甲基联苯胺)使用液：TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml底物缓冲液(PH5.5)10ml，0.75％H2O2 32μl。
(7)ABTS使用液：ABTS 0.5mg，底物缓冲液(PH5.5)1ml，3％H2O2 2μl。
(8)抗原、抗体和酶标记抗体。
(9)待检测样品。
2)操作步骤
(1)收集培养到第14天的NK细胞，以及外周血PBMC，各3×106个，用3ml无血清SCGM培养基重悬混匀，加入24孔培养板中。NK细胞和PBMC各3孔，每孔1ml。另加3孔无血清SCGM培养基，作为阴性对照。置于培养箱中培养(37℃，5％CO2浓度)。
(2)培养24h后，收集培养上清(即待检测样)，准备ELISA检测各种试剂。
(3)包被：用0.05M PH9.6包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个96孔聚苯乙烯板的反应孔中加100μl，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次(简称洗涤，下同)，每次3分钟。
(4)加样：加一定稀释的待检样品100μl于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。同时做空白孔，阴性对照孔及标准曲线孔。
(5)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
(6)加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μl，37℃10～30分钟。
(7)终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸50μl。
(8)在30min内，将反应板放入在ELISA检测仪中并设置好程序，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处检测，检测仪根据标准曲线孔自动作出标准曲线并计算出样品浓度。；
(9)整理数据得出NK细胞24h生成的IFN-γ，结果参见图9。由图中可知，培养基中不含有IFN-γ，所以检测到的IFN-γ含量为PBMC或NK细胞分泌。1×106个PBMC在24h后生成74pg/ml的IFN-γ；1×106个NK细胞在24h后生成3009pg/ml的IFN-γ，明显高于前者。这说明诱导培养后的NK细胞免疫功能被显著性提高。
实施例四：确定细胞毒性最高的NK细胞
(1)此试验中的效应细胞为最适方案培养诱导的、不同时间的NK细胞。试验中的靶细胞为K562肿瘤细胞。
(2)NK细胞介导的细胞毒性作用检测，检测板的设置如下，每组设置3个复孔：
A.效应细胞自发LDH释放：把要用于实验孔的每一浓度的效应细胞按3个复孔加到含有培养基的孔中以获得效应细胞自发释放值。终体积必须与实验孔相同(用不含细胞的培养基来补足体积)；
B.实验孔：向U-底96孔板的所有实验孔中加入5000个靶细胞。将效应细胞按3个复孔加入孔中，按效靶细胞比率为10:1加入培养不同时间的效应细胞来测试。效靶细胞合在一起的终体积是100μl/孔；
C.靶细胞自发LDH释放：将靶细胞加入到含有培养基的3个复孔中，终体积必须与含有靶细胞和效应细胞的实验孔相等(用培养基调整体积)；
D.靶细胞最大LDH释放：将靶细胞加入到含有培养基的3个复孔中，终体积必须和实验孔相等。每100μl培养基加10μl的细胞裂解液(10X)。在收获上清前，使靶细胞在细胞裂解液中孵育45分钟；
E.体积校正对照：将10μl细胞裂解液(10X)加入到含有100μl培养基(不含细胞)的3个复孔中。该对照用于校正加入细胞裂解液(10X)引起的体积变化；
F.培养基背景：将100μl培养基加入3个复孔中。该对照用于校正酚红和含有血清的培养基中的LDH活性引起的背景吸光值；
G.1500rpm离心板子4分钟，以确保效应细胞和靶细胞充分接触。
(3)细胞培养与上清的收获：
A.在37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育细胞毒性检测板6小时。以保证靶细胞和效应细胞有充分的时间接触；
B.在收集上清前45分钟，向靶细胞最大释放孔加入10μl细胞裂解液(10X)/100μl靶细胞；
C.注意：如果靶细胞未被彻底裂解(通过镜下观察确定)，再加入5μl的细胞裂解液(10X)；
D.孵育45分钟后，1500rpm离心板子4分钟；
E.测量LDH：
i.用排枪从每孔转移50μl上清至一个新的96孔平底酶分析板中；
ii.向含有转移过来的样品上清的96孔酶分析板中每孔均加入50μl配好的底物。避光，室温孵育30分钟；
iii.每孔加入50μl终止液；
iv.用注射器针头戳破大的气泡，加入终止液后1小时内在490或492nm测量吸光值；
(4)实验结果的计算：
A.将所有实验孔、靶细胞自发LDH释放孔和效应细胞自发LDH释放孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；
B.将靶细胞最大LDH释放对照的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值；
C.将步骤A和B中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每种效靶比所产生的细胞毒性百分比：
％细胞毒性＝(实验-效应细胞自发-靶细胞自发)÷(靶细胞最大-靶细胞自发)×100；
(5)根据计算结果，可得出当效靶细胞比率为10:1时，不同培养时间的NK细胞对K562肿瘤细胞的细胞毒性作用，结果见图11：经过500U/ml的白介素-2、10ng/ml的白介素-15和10ng/ml的4-1BBL联合培养12天、14天、16天和18天时的NK细胞可以显著性地杀伤肿瘤细胞，细胞杀伤率分别为55.7％、60.3％、55.5％和49.4％。这些结果说明白介素-2、白介素-15和4-1BBL联合SCGM培养基培养诱导的NK细胞，培养到14天时杀伤肿瘤细胞效果最高，为最适培养时间。
实施例五：NK细胞对多种肿瘤细胞的细胞毒性作用检测
(1)此试验中的效应细胞为最适方案诱导培养14天时的NK细胞。试验中的靶细胞为PANC-1细胞、U251细胞和K562细胞，都是肿瘤细胞系。
(2)NK细胞介导的细胞毒性作用检测，方法同实施例四。加入不同数量的效应细胞来测试几组效靶细胞比率(1:1、3:1、10:1和30:1)。
(3)根据计算结果，可得出NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性作用，结果见图12：经过500U/ml的白介素-2、10ng/ml的白介素-15和10ng/ml的4-1BBL联合培养14天后的NK细胞可以显著性地杀伤肿瘤细胞，PANC-1细胞、U251细胞和K562细胞的死亡率都在30:1时达到最大值，分别为50％，60％和84％。这些结果说明白介素-2、白介素-15和4-1BBL联合SCGM培养基培养诱导的NK细胞能有效地杀伤肿瘤细胞，可以考虑其用于肿瘤病人的免疫治疗。

Claims (4)

1.一种外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.以常规技术制备人外周血单个核细胞；
B.用红细胞裂解液重悬所收集的单个核细胞，裂解去除残存的红细胞；
C.用38ml SCGM培养基重悬单核细胞，加入已灭活的自体血清2ml和2万单位重组人IL-2，混匀后加入培养板中，置于37℃孵箱静置培养；所述培养板中已固定好培养激活NK细胞所需的白介素-15和4-1BBL；
D.第3天，补充20ml含有1-2％自体血清的SCGM培养基及1万单位IL-2、10ng/ml的白介素-15和10ng/ml的4-1BBL，混匀后继续培养；
E.第4天，把培养板中的培养液转移到培养袋中继续培养，每3-4天向培养袋中补充40ml含有1-2％自体血清的SCGM培养基和2万单位IL-2、10ng/ml的白介素-15和10ng/ml的4-1BBL，总共培养18天，获得的 NK 细胞总数达 5.5 × 109 个，活细胞率为 90 ％，且其中NK 细胞的纯度为 80 ％。
2.根据权利要求1所述的外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法，其特征在于：所述步骤B中，每40ml外周血标本收集得到的单个核细胞用5ml红细胞裂解液重悬，37℃水浴1分钟，完全裂解残存的红细胞。
3.根据权利要求1所述的外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法，其特征在于：所述步骤C中，提前一天将含有白介素-15和4-1BBL的PBS加入培养板上4℃孵育保存，使用时洗去没有固定好的白介素-15和4-1BBL。
4.根据权利要求3所述的外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法，其特征在于：提前一天将含有2μg/ml白介素-15和2μg/ml 4-1BBL的PBS加入培养板上4℃孵育保存。
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