CN111718901B - 一种高活性t细胞体外培养试剂盒及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高活性T细胞体外培养试剂盒，包括：主要成分为zometa、PHA、her‑2、INF‑γ的诱导液，主要成分为IL‑2的刺激液，主要成分为IL‑2、IL‑1α、IL‑7的活化液，主要成分为IL‑2、IL‑21的扩增液。前述体外培养试剂盒能方便临床上同时培养一次回输两种细胞(γδT细胞和CIK细胞)，减少实验操作风险，缩短操作人员操作时间和细胞培养周期，有效减少试剂耗材的使用。

Description

一种高活性T细胞体外培养试剂盒及培养方法

技术领域

本发明属于免疫细胞治疗技术领域，尤其涉及一种高活性T细胞(Highly activeT cells，HAT)体外培养试剂盒及培养方法。

背景技术

细胞免疫疗法是一种新型且具有显著疗效的生物治疗技术，这种利用改造自身免疫抗癌的新型治疗方法，主要是运用生物技术和生物制剂对患者采集的自身的免疫细胞进行体外培养和改造然后回输到患者体内的方法，来激发识别和引导免疫杀伤肿瘤细胞从而增强机体自身免疫功能，达到治疗肿瘤的效果。

γδT细胞是执行固有免疫功能的T细胞，其TCR由γ和δ链组成。它主要用于杀伤癌细胞与协助DC细胞识别发现癌细胞抗原，然后将这些抗原进行杀伤或是传递给其他细胞。γδT细胞可以杀灭癌细胞，无须外增靶向性。细胞治疗副作用小，γδT细胞免疫疗法副作用小或无副作用。γδT细胞几乎对所有的癌细胞起杀伤作用。CIK细胞是由多种细胞因子诱导的杀伤细胞，同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。CIK细胞增殖速度快，抗肿瘤活性细胞可大量增殖，并具有识别多种肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用。

CIK细胞和γδT细胞对肿瘤杀伤、人体免疫保护起着重要作用。CIK细胞和γδT细胞回输的常规做法是先对外周血单个核细胞分别诱导分化为CIK细胞和γδT细胞，单独扩增培养后，再把两种细胞混合回输到人体内。这种单独培养后混合回输的方法，增加了实验操作风险，增加了操作人员操作时间和细胞培养周期，试剂耗材的使用也大大增加，也增加了治疗费用。

发明内容

本发明的目的在于构建一种高活性T细胞体外培养试剂盒及培养方法，方便临床上同时培养一次回输两种细胞，减少实验操作风险，缩短操作人员操作时间和细胞培养周期，有效减少试剂耗材的使用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种高活性T细胞体外培养试剂盒，包括主要成分为zometa、PHA、her-2、INF-γ的诱导液，主要成分为IL-2的刺激液，主要成分为IL-2、IL-1α、IL-7的活化液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液。

作为进一步的方案，所述诱导液1ml、刺激液1ml、活化液1ml、扩增液1ml。

作为一种可能方案，所述诱导液中，zometa、PHA、her-2、INF-γ的有效浓度范围分别为1ug/ml～10ug/ml、1ug/ml～10ug/ml、10ug/ml～30ug/ml和100IU/ml～1000IU/ml。

作为进一步的方案，所述诱导液中，zometa、PHA、her-2、INF-γ的有效浓度分别为1ug/ml、5ug/ml、25ug/ml和500IU/ml。

作为一种可能方案，所述刺激液中，IL-2的有效浓度范围为500IU/ml～1500IU/ml。

作为进一步的方案，所述刺激液中，IL-2的有效浓度为1000IU/ml。

作为一种可能方案，所述活化液中，IL-2、IL-1α、IL-7的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、10IU/ml～50IU/ml、10IU/ml～100IU/ml。

作为进一步的方案，所述活化液中，IL-2、IL-1α、IL-7的有效浓度分别为400IU/ml、10IU/ml、50IU/ml。

作为一种可能方案，所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、20IU/ml～60IU/ml。

作为进一步的方案，所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度分别为400IU/ml、50IU/ml。

前述体外培养试剂盒能方便临床上同时培养一次回输两种细胞(γδT细胞和CIK细胞)，减少实验操作风险，缩短操作人员操作时间和细胞培养周期，有效减少试剂耗材的使用。

一种利用前述试剂盒培养高活性T细胞的培养方法，包括下列步骤：

(1)制备单个核细胞：使用肝素钠抗凝采血管采集人外周血40ml，并依次分离血浆和单个核细胞，血浆56℃30min灭活处理离心备用。

(2)单个核细胞用40ml含10％自体灭活血浆的诱导液吹打均匀，使细胞密度范围为1.5-2.0×10⁶cell/ml，装入悬浮细胞培养瓶静置于37℃ 5％CO₂培养箱培养。

(3)Day1补加1ml刺激液至培养瓶内。

(4)制备活化培养基:吸取1ml活化液加入500ml ALyS505N-0培养基内配制成活化培养基；Day3、Day5、Day7均使用活化培养基进行补液，共500ml，均置于37℃ 5％CO₂培养箱培养。

(5)制备扩增培养基:吸取1ml扩增液加入2L ALyS505N-0内配制成扩增培养液；Day7转到细胞培养袋扩大培养，Day9和Day11使用扩增培养液对细胞进行补液，静置于37℃5％CO₂培养箱培养。

(6)培养Day14收获细胞，计数并进行检测，其中，利用CD3⁺CD56⁺和CD3⁺γδ⁺进行表型检测。

本发明有如下效果：

(1)本发明通过构建一种高活性T细胞体外培养试剂盒及培养方法，利用同一个细胞培养周期、同一个培养体系内培养出两类效应细胞。解决了以前细胞免疫治疗所提倡的多细胞联合治疗，而传统的诱导单一效应细胞的方式，不但增加了细胞培养人员的操作负担，而且相对而言增加了耗材等的消耗，从而加重患者的经济支出的问题。即本发明摒弃传统的诱导单一效应细胞的观念，同时诱导两类效应细胞，既达到了多细胞治疗的目的，又减少了不必要的耗材浪费从而降低经济成本。

(2)本发明T细胞(γδT与CIK细胞)培养方法，只需采集患者外周血40ml，采血量少，且无需使用细胞分选等系统，减轻患者痛苦及医疗成本。

(3)本发明提供的试剂盒与培养方法，培养周期为14天，培养周期短，即可获得高纯度、高数量、高杀伤力的γδT与CIK细胞。

(4)本发明提供的试剂盒采用的成分均为临床治疗级别药物或因子，避免了外源性动物成分的带入，对细胞培养无毒副作用。

(5)本发明提供的试剂盒与培养方法操作简单，无需包被培养瓶，无需额外添加其它试剂和因子。

(6)本发明提供的试剂盒与培养方法培养γδT与CIK细胞，可使γδT及CIK细胞培养标准化，减少误差，是一个实用性高、操作简便的商品化试剂盒。

综上所述，本发明在现有的γδT及CIK细胞单独培养的基础上，开发出一种高活性T细胞(HAT)试剂盒即γδT与CIK细胞共培养的试剂盒，既降低了细胞培养成本，缩短操作人员操作时间和细胞培养周期，又提高了细胞培养的安全性，使γδT与CIK细胞共培养标准化、简单化。为细胞治疗临床广泛应用和研究提供了优质的培养方案。共培养的CIK细胞和γδT细胞具有多重杀伤肿瘤机制，杀瘤能力强。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请实施例二培养方法在Day3细胞生长图；

图2是本申请实施例二培养方法在Day5细胞生长图；

图3是本申请实施例二培养方法在Day7细胞生长图；

图4为通过本申请实施例二培养方法所收获的细胞生长曲线；

图5是本申请实施例三中三个样本在Day14收获的细胞数量。

图6是本申请实施例三利用本申请试剂盒及培养方法取得表型检测效果示意图。

图7是本申请实施例四中所述实验组对MOLT-4细胞杀伤效果示意图

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。

本发明需要提示说明的实验环境、实验材料和仪器设备如下：

1、实验环境：GMP环境下实验室内的超净工作台中操作。

2、试剂：鲎试剂、除热原吸嘴、除热原空安瓿、内毒素工作标准品(厦门市鲎试剂实验厂有限公司)，支原体液体培养液、硫乙醇酸盐流体培养液、胰酪大豆胨液体培养液(珠海经济特区益民生物制品厂)，恒温自动加热仪、台盼蓝染色液、PBS(珠海贝索生物技术有限公司)、ALyS505N-0无血清培养液(株式会社细胞科学研究所CSTI)，IgG1-APC、IgG1-FITC、IgG1-PE、CD56-APC、γδT-PE、CD3-FITC(美国贝克曼公司)，MOLT-4细胞株(遵义医学院珠海校区研发中心提供)MTT试剂盒、二甲亚砜、胎牛血清，人淋巴细胞分离液、肝素钠溶液。

3、仪器与设备：离心机(THERMO，美国)、T-75cm²悬浮培养瓶、T-225cm²悬浮培养瓶、细胞培养袋(日本NIPRO株式会社)、CO₂培养箱(三洋，中国)、程控降温仪(THERMO，美国)、超净工作台(智净、中国)、50ml离心管(BD，美国)、96孔板、酶联免疫检测仪、移液管、血细胞计数盘(株式会社细胞科学研究所CSTI)、液氮罐。

实施例一：

本实施例用于介绍本发明一种高活性T细胞体外培养试剂盒及其制备和试剂盒质量检测，本发明所述高活性T细胞(Highly active T cells，HAT)特指γδT和CIK细胞的组合，本发明所述体外培养试剂盒能方便临床上同时培养一次回输两种细胞(γδT细胞和CIK细胞)，减少实验操作风险，缩短操作人员操作时间和细胞培养周期，有效减少试剂耗材的使用。

一种高活性T细胞体外培养试剂盒，包括主要成分为zometa(唑来膦酸)、PHA(phytohemagglutinin，植物血凝素)、her-2(human epidermal growth factorreceptor2，人类表皮生长因子受体2)、INF-γ(干扰素-γ)的诱导液，主要成分为IL-2(白细胞介素2)的刺激液，主要成分为IL-2、IL-1α、IL-7的活化液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液。本实施例具体为所述诱导液1ml、刺激液1ml、活化液1ml、扩增液1ml。

所述诱导液中，zometa、PHA、her-2、INF-γ的有效浓度范围分别为1ug/ml～10ug/ml、1ug/ml～10ug/ml、10ug/ml～30ug/ml和100IU/ml～1000IU/ml。具体地，本实施例zometa、PHA、her-2、INF-γ的有效浓度分别为1ug/ml、5ug/ml、25ug/ml和500IU/ml。

所述刺激液中，IL-2的有效浓度范围为500IU/ml～1500IU/ml。本实施例IL-2的有效浓度为1000IU/ml。

所述活化液中，IL-2、IL-1α、IL-7的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、10IU/ml～50IU/ml、10IU/ml～100IU/ml。本实施例IL-2、IL-1α、IL-7的有效浓度分别为400IU/ml、10IU/ml、50IU/ml。

所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、20IU/ml～60IU/ml。本实施例IL-2、IL-21的有效浓度分别为400IU/ml、50IU/ml。

构建本发明所述试剂盒的依据为：

本发明试剂盒所述的诱导液主要成分为zometa、PHA、her-2、INF-γ。其中Zometa(唑来膦酸)属于双膦酸盐类药物，大量文献报道其可诱导PBMC(外周血单个核细胞)向γδT细胞分化，并有研究发现双膦酸盐类药物与机体γδT细胞天然配体IPP(异戊烯基焦磷酸酯)具有同源结构，而IPP可以与γδT细胞的TCR分子直接结合并进行诱导γδT细胞活化；PHA可作为致有丝分裂原，在免疫学中广泛用于刺激T淋巴细胞的增殖；her-2可刺激CD16下游的PI3K、VAV、RAC、ERK等蛋白持续活化，给予重复刺激，上述蛋白磷酸化水平可再次上调，从而促进NK细胞的体外扩增和活化；IFN-γ具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。

本发明试剂盒所述的刺激液主要成分为IL-2，IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。

本发明试剂盒所述的活化液主要成分为IL-2、IL-1α、IL-7。T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，因此在细胞活化阶段也需要添加；IL-1可体外刺激CD4+T细胞的增殖，诱导IL-2的产生，共刺激细胞活化；IL-7通过与白介2共用γc受体亚单位，刺激T细胞的存活增殖和维持。

本发明试剂盒所述的扩增液主要成分为IL-2、IL-21。T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，因此在细胞扩增阶段也需要添加；、IL-21与其他白介2家族成员一样通过一个特异性受体亚单位及IL2受体γc亚单位复合受体发挥其生物学功能。IL21的多种生物学效应包括：促进CD4+和CD8+T细胞的增殖，增强CD8+T细胞和NK细胞的细胞毒性而不引起活化产生的细胞凋亡。

本发明涉及的一种高活性T细胞体外培养试剂盒制备方法：

(1)物料准备：准备配制诱导液、刺激液、活化液、扩增液所需的各类原辅料。

(2)诱导液配制：在常温洁净环境下，按照各组分有效浓度需求取相应量的物质；取ALyS505N-0加入zometa、PHA、赫赛汀her-2、INF-γ中，用移液器将液体轻轻吹打，使原料完全溶解，完全溶解应为澄清透明、无沉淀物；将完全溶解的液体转移至血清瓶中；加入ALyS505N-0冲洗原瓶，并将液体回收入容量瓶中；用ALyS505N-0定容到所需要量体积(人份)，轻晃瓶身，使液体充分混匀；

(3)刺激液配制：在常温洁净环境下，按照组分有效浓度需求取相应量的物质；取ALyS505N-0加入IL-2中，用移液器将液体轻轻吹打，使原料完全溶解，完全溶解应为澄清透明、无沉淀物；将完全溶解的液体转移至血清瓶中；加入ALyS505N-0冲洗原瓶，并将液体回收入容量瓶中；用ALyS505N-0定容到所需要量体积(人份)，轻晃瓶身，使液体充分混匀；

(4)活化液配制：在常温洁净环境下，按照各组分有效浓度需求取相应量的物质；ALyS505N-0加入IL-2、IL-7、IL-1α中，用移液器将液体轻轻吹打，使原料完全溶解，完全溶解应为澄清透明、无沉淀物；将完全溶解的液体转移至血清瓶中；加入ALyS505N-0冲洗原瓶，并将液体回收入容量瓶中；用ALyS505N-0定容到所需要量体积(人份)，轻晃瓶身，使液体充分混匀；

(5)扩增液配制：在常温洁净环境下，按照各组分有效浓度需求取相应量的物质；取ALyS505N-0加入IL-2、IL-21中，用移液器将液体轻轻吹打，使原料完全溶解，完全溶解应为澄清透明、无沉淀物；将完全溶解的液体转移至血清瓶中；加入ALyS505N-0冲洗原瓶，并将液体回收入容量瓶中；用ALyS505N-0定容到所需要量体积(人份)，轻晃瓶身，使液体充分混匀；

4.半成品质检：分别对上述诱导液、刺激液、活化液、扩增液取样，进行PH、渗透压、内毒素检测；

5.分装：符合质检要求后用无菌针头式滤器过滤，按1ml/支分装于无菌冻存管内；

6.包装：经质量检测后将诱导液、刺激液、活化液、扩增液各1支装入包装盒中。

试剂盒质量检测

1.内毒素检测

本发明中试剂盒内毒素检测凝胶法鲎试剂及相关消耗品购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司，鲎试剂规格为0.1ml/支，λ＝0.06，内毒素标准品规格为15EU/支。

内毒素检测操作步骤

取细菌内毒素工作标准品一支配制2λ内毒素标准溶液，阴性对照液，

浓度为2λ的内毒素标准溶液做为阳性对照液。取出鲎试剂，分别用除热源吸头加入0.1ml检查用水，轻摇使鲎试剂完全溶解；在溶解的鲎试剂安瓿瓶内分别加入0.1ml的阴性对照液、阳性对照液和供试品液，用封口膜封闭管口轻轻摇匀，垂直放入37℃恒温器中孵育60min±2min，期间避免振动。

内毒素检测结果判定

孵育结束，将安瓿瓶从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°。若管内的内容物呈坚实凝胶，不变形，不从管壁滑脱为阳性，记录为(+)；不成凝胶或者虽呈凝胶但不能保持完整并从管壁滑脱为阴性，记为(-)；只有当阴性对照管为阴性，阳性对照管为阳性，实验方为有效，否则无效。

内毒素检测结果见表1

2.支原体检测

将本试剂盒产品各组分，取100ul到支原体液体培养液内，微需氧环境，35-37℃培养3～7天，观察液体培养液是否变浑浊。

若液体培养液变浑浊再转种支原体固体培养液，微需氧环境，35-37℃继续培养3-7天，观察生长菌落，进行支原体确认。

支原体检测结果见表1。

3.真菌及细菌检测

将本试剂盒检测样品试剂接种于硫乙醇酸盐流体培养液及胰酪大豆胨液体培养液中，置于35～37℃条件下，培养3～7天观察结果；

结果判定：若样品检测管7天均澄清无菌生长，判供试品符合规定；若样品检测管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供若样品检测不符合规定。

检测结果：真菌及细菌检测见表1

实施案例一结果:

检测项目

诱导液

刺激液

活化液

扩增液

判定

技术要求

内毒素

<0.06EU/ml

<0.06EU/ml

<0.06EU/ml

<0.06EU/ml

合格

<0.25EU/ml

支原体

阴性

阴性

阴性

阴性

合格

阴性

真菌

阴性

阴性

阴性

阴性

合格

阴性

细菌

阴性

阴性

阴性

阴性

合格

阴性

表1

作为另外一种实现，一种高活性T细胞体外培养试剂盒，包括主要成分为zometa、PHA、her-2、INF-γ的诱导液，主要成分为IL-2的刺激液，主要成分为IL-2、IL-1α、IL-7的活化液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液；所述诱导液中，zometa、PHA、her-2、INF-γ的有效浓度分别为5ug/ml、1ug/ml、10ug/ml和100IU/ml；所述刺激液中，IL-2的有效浓度为500IU/ml；所述活化液中，IL-2、IL-1α、IL-7的有效浓度分别为100IU/ml、20IU/ml、10IU/ml；所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度分别为100IU/ml、10IU/ml。制备方法同前。

作为又一种实现，一种高活性T细胞体外培养试剂盒，包括主要成分为zometa、PHA、her-2、INF-γ的诱导液，主要成分为IL-2的刺激液，主要成分为IL-2、IL-1α、IL-7的活化液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液；所述诱导液中，zometa、PHA、her-2、INF-γ的有效浓度分别为10ug/ml、10ug/ml、30ug/ml和1000IU/ml；所述刺激液中，IL-2的有效浓度为1500IU/ml；，所述活化液中，IL-2、IL-1α、IL-7的有效浓度分别为1000IU/ml、50IU/ml、100IU/ml；所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度分别为1000IU/ml、60IU/ml。制备方法同前。

实施例二：

采集1名健康志愿者人外周血，分离单个核细胞，利用本发明实施例一所述高活性T细胞(γδT及CIK细胞)试剂盒培养，分析细胞扩增数量、细胞活率和细胞增殖倍数。

本发明培养方法包括以下步骤：

1、制备PBMC(外周血单个核细胞)：利用肝素钠抗凝管采集人外周血40ml，根据密度梯度离心法进行血液分离。并依次分离血浆和单个核细胞，血浆56℃30min灭活处理离心备用，制备单个核细胞：用PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)按1:1的比例稀释分离血浆后的细胞，注到淋巴细胞分离液上缓升缓降离心，小心吸取单个核细胞。用PBS重悬离心洗涤三次，在最后一次离心之前进行计数，用1ml诱导液重悬细胞。

一般而言，灭活方式可采用水浴灭活或者恒温加热仪(BASO)灭活，本实施例采用恒温加热仪灭活，减小污染风险；相对离心力优选1200xg，离心时间优选为10mins充分去除变性的补体蛋白等成分。

所述PBS优选CSTI生产的无钙、镁离子的PBS；淋巴细胞分离液无特殊要求，选用操作人员常用产品即可；离心机品牌及离心环境无特殊要求，选用操作人员常用、熟知的即可。洗涤细胞时，为最大限度保证细胞的活性及安全性，本实施例优选ALyS505N-0无血清培养基(CSTI)洗涤三次。同时，细胞培养时的背景更为干净、清晰。

2、细胞刺激诱导：单个核细胞用40ml含10％自体灭活血浆的诱导液吹打均匀，使细胞密度范围为1.5-2.0×10⁶cell/ml，装入悬浮细胞培养瓶(T75)静置于37℃5％CO₂培养箱培养。24小时后，加入1ml刺激液，静置于37℃5％CO₂培养箱继续培养。

所述诱导液主要成分是zometa、PHA、her-2、INF-γ，有效浓度范围分别为1ug/ml～10ug/ml、1ug/ml～10ug/ml、10ug/ml～30ug/ml和100IU/ml～1000IU/ml。本实施例中优选浓度分别为1ug/ml、5ug/ml、25ug/ml和500IU/ml，所含成分均优选临床用药级别。

所述刺激液主要成分是IL-2，有效浓度范围为500IU/ml～1500IU/m。本实施例中优选浓度为1000IU/ml；所含成分均优选临床用药级别。

3、细胞活化培养：吸取1ml活化液加入500mlALyS505N-0培养基内配制成活化培养基。把细胞和培养基转移至离心管中并进行离心，再用1ml活化培养基重悬细胞，并按照1.5-2.0×10⁶cell/ml进行种瓶(T75培养瓶)。Day3、Day5和Day7都是通过活化培养基对细胞进行补液，分别加入60ml、200ml、240ml。其中，Day5细胞转到容量大培养瓶(T225)，Day7会将细胞转到2个细胞培养袋中扩大培养，为了保证细胞生长过程中气体交换，满足细胞生长需要。如图1、2、3所示依次为Day3、Day5和Day7细胞生长图。

所述活化液主要成分是IL-2、IL-1α、IL-7，有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、10IU/ml～50IU/ml、10IU/ml～100IU/ml。本实施例中优选浓度分别为400IU/ml、10IU/ml，50IU/ml；所含成分均优选临床用药级别。本实施例优选用日本NIPRO株式会社生产的细胞培养袋；同时优选日本细胞科学研究所株式会社生产的ALyS505N-0为扩大培养用培养基。

4、细胞扩增培养：吸取1ml扩增液加入2LALyS505N-0内配制成扩增培养液。Day9和Day11使用扩增培养液对细胞进行补液，2个细胞培养袋每次分别补液500ml。

所述扩增液主要成分为IL-2、IL-21，有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、20IU/ml～60IU/ml。本实施例中优选浓度分别为400IU/ml、50IU/ml，所含成分均优选临床用药级别。

5、Day14收获细胞并洗涤计数，同时进行细胞活性检测、杀瘤活性、内毒素、真菌细菌、支原体检测。

检测项目所用的试剂和仪器不作特定要求，按照实际情况及操作员熟练技术进行检测即可。

6、结果测试

收集由本实施例所述培养方法培养Day14细胞用于细胞扩增数量、细胞活率和细胞增殖倍数的测定。

收获培养Day14细胞，用台盼蓝染色并用血球计数板计算细胞总数，实际扩增倍数＝当前细胞总数/初始单个核细胞数，数值即为细胞扩增后的细胞数量。细胞活率＝台盼蓝染色的细胞数/当前细胞总数×100％。从表2可看出通过实施例所述培养方法扩增后的细胞数量、细胞活率和细胞增殖倍数。图4为通过本实施例培养方法所收获的细胞生长曲线，可见本发明方法能够满足临床应用。

Day3

Day5

Day7

Day9

Day11

Day14

细胞数量

9.0×10<sup>7</sup>

2.4×10<sup>8</sup>

5.4×10<sup>8</sup>

1.8×10<sup>9</sup>

4.8×10<sup>9</sup>

9.3×10<sup>9</sup>

细胞活率

98％

97％

97％

96％

94％

92％

表2

实施例三：

采集3名健康志愿者(A、B、C)人外周血，分离单个核细胞，利用本发明实施例一所述高活性T细胞(γδT及CIK细胞)试剂盒同时进行细胞培养，观察三个不同样本γδT及CIK细胞表型差异。

本发明培养方法包括以下步骤：

制备PBMC：利用肝素钠抗凝管采集人外周血40ml，根据密度梯度离心法进行血液分离。并依次分离血浆和单个核细胞，血浆56℃30min灭活处理离心备用，制备单个核细胞：用PBS按1:1的比例稀释分离血浆后的细胞，注到淋巴细胞分离液上缓升缓降离心，小心吸取单个核细胞。用PBS重悬离心洗涤三次，在最后一次离心之前进行计数，用1ml诱导液重悬细胞。

细胞刺激诱导：单个核细胞用40ml含10％自体灭活血浆的诱导液吹打均匀，使细胞密度范围为1.5-2.0×10⁶cell/ml，装入悬浮细胞培养瓶(T75)静置于37℃5％CO₂培养箱培养。24小时后，加入1ml刺激液，静置于37℃5％CO₂培养箱继续培养。

细胞活化培养：吸取1ml活化液加入500ml ALyS505N-0培养基内配制成活化培养基。把细胞和培养基转移至离心管中并进行离心，再用1ml活化培养基重悬细胞，并按照1.5-2.0×10⁶cell/ml进行种瓶(T75培养瓶)。Day3、Day5和Day7都是通过活化培养基对细胞进行补液，分别加入60ml、200ml、240ml。其中，Day5细胞转到容量大培养瓶(T225)，Day7会将细胞转到2个细胞培养袋中扩大培养，为了保证细胞生长过程中气体交换，满足细胞生长需要。

细胞扩增培养：吸取1ml扩增液D加入2L ALyS505N-0内配制成扩增培养液。Day9和Day11使用扩增培养液对细胞进行补液，2个细胞培养袋每次分别补液500ml。

Day14收获细胞并进行细胞计数和CD3⁺CD56⁺和CD3⁺γδ⁺表型检测。

本实施例中相应的实验材料的参数、设备等参见实施例二。

结果测试

收集由本实施例所述培养方法培养Day14的细胞，用于各项测试。

(1)细胞数量的测定

收获培养Day14细胞，用台盼蓝染色并用血球计数板计算细胞总数。从附图5可显示三个样本在Day14收获的细胞数量。

(2)CD3⁺CD56⁺和CD3⁺γδ⁺表型检测

收获培养Day14细胞，洗涤后的细胞重悬至密度为1×10⁷cell/ml，各取四个管分别加入其中一个样本100μl的细胞悬液，一管加10μl IgG1-APC及10μl IgG1-FITC，另一管加10μl CD56-APC及10μl CD3-FITC作为样品检测；一管加10μl IgG1-PE及10μl IgG1-FITC作为同型对照，另一管加10μl γδ-PE及10μl CD3-FITC作为样品检测。其他两个样本如是操作，共同避光孵育15min后检测。图6可显示本发明试剂盒及共培养γδT及CIK细胞方法取得了较好的效果。

实施例四：

采集1名健康志愿者人外周血，分离单个核细胞，利用本发明实施例一所述高活性T细胞(γδT及CIK细胞)试剂盒培养，分析细胞肿瘤杀伤活性。

本发明培养方法包括以下步骤：

制备PBMC：利用肝素钠抗凝管采集人外周血40ml，根据密度梯度离心法进行血液分离。并依次分离血浆和单个核细胞，血浆56℃30min灭活处理离心备用，制备单个核细胞：用PBS按1:1的比例稀释分离血浆后的细胞，注到淋巴细胞分离液上缓升缓降离心，小心吸取单个核细胞。用PBS重悬离心洗涤三次，在最后一次离心之前进行计数，用1ml诱导液A重悬细胞。

细胞刺激诱导：单个核细胞用40ml含10％自体灭活血浆的诱导液吹打均匀，使细胞密度范围为1.5-2.0×10⁶cell/ml，装入悬浮细胞培养瓶(T75)静置于37℃5％CO₂培养箱培养。24小时后，加入1ml刺激液，静置于37℃ 5％CO₂培养箱继续培养。

细胞活化培养：吸取1ml活化液加入500ml ALyS505N-0培养基内配制成活化培养基。把细胞和培养基转移至离心管中并进行离心，再用1ml活化培养基重悬细胞，并按照1.5-2.0×10⁶cell/ml进行种瓶(T75培养瓶)。Day3、Day5和Day7都是通过活化培养基对细胞进行补液，分别加入60ml、200ml、240ml。其中，Day5细胞转到容量大培养瓶(T225)，Day7会将细胞转到2个细胞培养袋中扩大培养，为了保证细胞生长过程中气体交换，满足细胞生长需要。

细胞扩增培养：吸取1ml扩增液加入2L ALyS505N-0内配制成扩增培养液。Day9和Day11使用扩增培养液对细胞进行补液，2个细胞培养袋每次分别补液500ml。

D14收获细胞并洗涤计数。

本实施例中相应的实验材料的参数、设备等参见实施例二。

结果测试

收集由本实施例所述培养方法培养Day14细胞，用于测试γδT及CIK对MOLT-4细胞的杀伤效果。

利用MTT法检测其细胞毒性，收集对数生长期的MOLT-4细胞离心计数并调整密度为1×10⁵cell/ml。在试验孔中按5:1、10:1、20:1一一对应加入效应细胞及靶细胞各100μl，37℃、5％CO₂培养箱共培养15h，然后每孔加入MTT20μl(5mg/ml)继续培养4h，弃掉上清并每孔加入Formazan溶解液100μl/孔，置于摇床低速振荡10min，在酶联免疫检测仪490nm处检测吸光值。计算公式为：细胞毒作用(％)＝[1-(实验组A值-单独效应细胞A值)/单独靶细胞A值]×100％。从附图7可看出所述实验组(本申请所述培养方法培养的高活性T细胞)与单独效应细胞对MOLT-4细胞杀伤效果有明显差异，说明本发明提供的CIK与γδT共培养试剂盒及培养方法得到的T细胞展现出较高杀瘤活性。

Claims (7)

1.一种高活性T细胞体外培养试剂盒，其特征在于，主要包括：主要成分为 zometa、植物血凝素PHA、her-2、INF-γ的诱导液，主要成分为IL-2的刺激液，主要成分为 IL-2、IL-1α、IL-7的活化液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液；

所述诱导液中，zometa、植物血凝素PHA、her-2、INF-γ的有效浓度范围分别为1ug/ml-10ug/ml、1ug/ml-10ug/ml、10ug/ml-30ug/ml和100 IU/ml-1000IU/ml；

所述刺激液中，IL-2的有效浓度范围为500 IU/ml-1500IU/ml；

所述活化液中，IL-2、IL-1α、IL-7的有效浓度范围分别为100IU/ml-1000IU/ml、10IU/ml-50IU/ml、10IU/ml-100IU/ml；

所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度范围分别为100IU/ml-1000IU/ml、20IU/ml-60IU/ml。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述诱导液1ml、刺激液1ml、活化液1ml、扩增液1ml。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述诱导液中，zometa、植物血凝素PHA、her-2、INF-γ的有效浓度分别为1ug/ml、5ug/ml、25ug/ml和500 IU/ml。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述刺激液中，IL-2的有效浓度为1000IU/ml。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述活化液中，IL-2、IL-1α、IL-7的有效浓度分别为400 IU/ml、10 IU/ml、50 IU/ml。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度分别为400IU/ml、50IU/ml。

7.利用权利要求1-6任意一项所述试剂盒培养高活性T细胞的培养方法，包括：

（1）制备单个核细胞：使用肝素钠抗凝采血管采集人外周血40ml，并依次分离血浆和单个核细胞，血浆56℃30min灭活处理离心备用；

（2）单个核细胞用40ml含10%自体灭活血浆的诱导液吹打均匀，使细胞密度范围为1.5-2.0×10⁶cell/ml，装入悬浮细胞培养瓶静置于37℃ 5%CO₂培养箱培养；

（3）Day1补加1ml 刺激液至培养瓶内；

（4）制备活化培养基:吸取1ml活化液加入500ml ALyS505N-0培养基内配制成活化培养基；Day3、Day5、Day7均使用活化培养基进行补液，共500ml，均置于37℃ 5%CO₂培养箱培养；

（5）制备扩增培养基:吸取1ml扩增液加入2L ALyS505N-0内配制成扩增培养液；Day7转到细胞培养袋扩大培养，Day9和Day11使用扩增培养液对细胞进行补液，静置于37℃ 5%CO₂培养箱培养；

（6） 培养Day14收获细胞，计数并进行检测，其中，利用CD3⁺CD56⁺和CD3⁺γδ⁺进行表型检测。

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