CN110195039B - 一种中国恒河猴γδT细胞的培养方法 - Google Patents

一种中国恒河猴γδT细胞的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中国恒河猴γδT细胞的培养方法，属于细胞生物学技术领域。本发明使用的OpTmizer细胞培养基中加入低浓度的猴自体血清，T细胞培养必备的IL‑2，以及已报道能够促进γδT细胞扩增的IL‑18等物质，能较快且稳定地在体外培养出高纯度的γδT细胞，培养的细胞具有典型的γδT细胞形态特征和免疫学特性，此外，该方法采用猴自体血清培养细胞，降低外源性血清对实验结果的干扰、步骤少，适合于需使用中国恒河猴γδT细胞的科研工作。

Description

一种中国恒河猴γδT细胞的培养方法
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种中国恒河猴γδT细胞的培养方法。
背景技术
γδT细胞是同时具备天然免疫和获得性免疫特性的T细胞(D'Ombrain M.C.,Hansen D.S.,Simpson K.M.,et al.,gammadelta-T cells expressing NK receptorspredominate over NK cells and conventional T cells in the innate IFN-gammaresponse to Plasmodium falciparum malaria[J].Eur J Immunol,2007.37(7):p.1864-73)，主要分布于皮肤、小肠、肺等粘膜以及皮下组织，在机体抗病原微生物感染、抗肿瘤及治疗自身免疫疾病中均扮演了重要的角色，具有免疫杀伤和免疫调节功能(BonnevilleM.,O'Brien R.L.,Born W.K.,Gammadelta T cell effector functions:a blend ofinnate programming and acquired plasticity[J].Nat Rev Immunol,2010.10(7):p.467-78.)，也具有杀细胞毒作用(Havranek P.,Hajkova H.,[Volvulus of theappendix][J].Rozhl Chir,1989.68(10):p.663-5)。γδT细胞不需要抗原递呈细胞对抗原进行处理和递呈而直接发挥杀伤作用(Brandes M.,Willimann K.,Moser B.,Professional antigen-presentation function by human gammadelta T Cells[J].Science,2005.309(5732):p.264-8.)。γδT细胞通过其特定的受体识别微生物的磷酸化代谢产物、脂质抗原等常见的抗原，如分枝杆菌的单烷基磷酸酯等。
根据δ链的亚型，人类的γδT细胞可分为Vδ1和Vδ2两大亚群。Vδ1T细胞亚群集中分布于上皮组织中，参与呼吸道、肠道的粘膜免疫反应；Vδ2T细胞亚群占外周血的T淋巴细胞的1％～10％，占到成人外周血中γδT细胞的80％～90％，为外周血中主要的γδT细胞。当发生特定病原生物感染时，Vδ2T的数量能迅速达到血液中白细胞总量的一半以上(MoritaC.T.,Jin C.,Sarikonda G.,et al.,Nonpeptide antigens,presentation mechanisms,and immunological memory of human Vgamma2Vdelta2 T cells:discriminatingfriend from foe through the recognition of prenyl pyrophosphate antigens[J].Immunol Rev,2007.215:p.59-76.)。异戊烯焦磷酸单酯(Isopentenyl pyrophosphate,IPP)是一种较常见的磷酸类抗原，是病变细胞或感染细胞所释放的危险信号，Vδ2T细胞主要通过其TCR与IPP及其类似物结合而被激活发挥功能(Gober H.J.,Kistowska M.,AngmanL.,et al.,Human T cell receptor gammadelta cells recognize endogenousmevalonate metabolites in tumor cells[J].J Exp Med,2003.197(2):p.163-8.)。因此，以IPP及其类似物作为刺激因子来刺激γδT细胞可以使γδT细胞尤其是Vδ2T细胞扩增及特异性地激活。
近年研究发现，双磷酸盐扩增γδT细胞的效率更高(Kabelitz D.,Wesch D.,HeW.,Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology[J].Cancer Res,2007.67(1):p.5-8)，需要的时间更短；唑来膦酸(Zoledronic acid,ZA)诱导得到的γδT细胞数量及纯度均较高(Girardi M.,Immunosurveillance and immunoregulation bygammadelta T cells[J].J Invest Dermatol,2006.126(1):p.25-31.)
。体外培养、扩增γδT细胞技术对于病原生物学、肿瘤学、免疫学及相关研究十分重要，尽管已有体外分化培养人γδT细胞的实验技术方法的报道(Kondo M.,Izumi T.,Fujieda N.,et al.,Expansion of human peripheral blood gammadelta T cellsusing zoledronate[J].J Vis Exp,2011(55).)，但有关体外培养非人灵长类动物，尤其是中国恒河猴γδT细胞的报道却十分有限，且用于人细胞培养的方法及所使用的试剂并不一定完全适用于非人灵长类动物细胞的培养。鉴于非人灵长类动物已被广泛用于作为人类疾病的模型来研究，建立体外培养、分化、扩增中国恒河猴γδT细胞的方法十分必要。
发明内容
本发明是针对目前缺乏体外培养非人灵长类动物外周血来源γδT细胞的问题而做出的，本发明的一个目的在于提供一种用于分离和培养外周血来源γδT细胞的可重复性方法，使用的OpTmizer细胞培养基中加入低浓度的猴自体血清，T细胞培养必备的IL-2，以及已报道能够促进γδT细胞扩增的IL-18，能较快且稳定地在体外培养出高纯度的，具有γδT细胞形态学和免疫学特性的中国恒河猴γδT细胞。
为实现上述目的，本发明提供的一种中国恒河猴γδT细胞的培养方法，该方法包括如下步骤：
(1)分离中国恒河猴外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)；
(2)分化、诱导、培养猴γδT细胞：步骤(1)的PBMCs用PBS重悬、洗涤2次，洗过的细胞经离心回收，每次400g离心10min，最后用专用培养液重悬PBMCs，重悬的细胞密度为2×106个细胞/mL，立即加入到48孔培养板，以3×106个细胞/孔密度进行培养；每隔2-3天，弃去孔中一半体积的旧培养液，并添加新鲜的含中国恒河猴自体血清的OpTmizer细胞培养液，保持细胞浓度在0.5～2×106个细胞/mL，最后将细胞悬液转移到培养板或细胞培养瓶中进行培养；
所述专用培养液的组成为：含有5％中国恒河猴自体血清、1％浓度为104U/mL青霉素-104μg/mL链霉素、1‰的浓度为10mol/L的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、5μmol/L的唑来膦酸、1000U/mL的重组人白介素-2(IL-2)，以及10ng/mL的猴白介素-18(rIL-18)的OpTmizer细胞培养基；
所述含恒河猴血清的OpTmizer细胞培养液为：含2％中国恒河猴自体血清、1％青霉素-链霉素、1‰的HEPES、1000U/mL IL-2以及10ng/mL rIL-18的OpTmizer细胞培养液。
(3)培养细胞鉴定：包括猴细胞形态学观察、用流式细胞仪检测细胞表面CD3及TCRVγ9表达水平、免疫激活表型(激活标记物为CD56、CD69及HLA-DR)以及猴γδT细胞分泌的IFN-γ的表达水平；
其中细胞形态学观察，将培养第3天和第5天的细胞直接置于倒置显显微镜下，高倍镜(200x)观察、拍照；
γδT细胞表面抗原CD3、TCRγδ、CD56,CD69及HLA-DR，γδT细胞分泌IFN-γ的表达水平的检测，采用如下步骤：在中国恒河猴γδT细胞扩增的第8天，分别收集约1×106个细胞，用含有1％BSA的PBS溶液洗涤2次，随后加入适量荧光标记抗体(见下表)，4℃避光孵育20分钟，再用PBS洗涤2次，重悬于1％多聚甲醛的PBS溶液中待检。检测IFN-γ时，则需在用IFN-γ-PE(BD，USA)荧光抗体染色前，往细胞中加入20ng/mL PMA，0.5μg/mL Ionomycin及3μg/mL BFA，置于细胞培养箱中放置6小时，制备好样品后用流式细胞术(BD FACS Verse，USA)检测特异性抗体及细胞因子的表达。
流式检测的细胞表面抗原及免疫激活物的荧光抗体
Figure BDA0002068572690000031
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：本研究提供了一种简单、经济、有效地体外培养分化和鉴定中国恒河猴γδT细胞的方法。这种方法适于原代中国恒河猴外周血源γδT细胞的体外扩增，且经过8天培养后的细胞具有典型的γδT细胞形态特征和免疫学特性，扩增出的中国恒河猴γδT细胞纯度高。此外，我们的方法采用猴自体血清培养细胞，降低外源性血清对实验结果的干扰、步骤少，适合于需使用中国恒河猴γδT细胞的科研工作。
附图说明
图1为唑来膦酸/IL-2刺激后中国恒河猴外周血中γδT细胞的形态学观察图，其中A图为未经刺激时细胞镜下生长形态；B图为经过5μmol/L唑来膦酸/IL-2刺激后培养第3天的细胞镜下生长形态；C图为经过唑来膦酸/IL-2刺激后培养第5天的细胞镜下生长形态。
图2为不同浓度唑来膦酸/IL-2刺激8天后，流式细胞检测猴γδT细胞的比例，上图依次为唑来膦酸/IL-2刺激前，浓度为1，5及10μmol/L唑来膦酸/IL-2刺激8天后，细胞表面CD3/TCTγδ的表达。
图3为5μmol/L唑来膦酸/IL-22刺激8天后，流式细胞检测猴γδT的CD56，CD69以及HLA-DR的比例(依次从左到右)。
图4为5μmol/L唑来膦酸/IL-22刺激8天后，流式细胞检测分泌IFN-γ的猴γδT细胞的比例。
具体实施方式
现结合以下实施例来更加详细地描述本发明的用于中国恒河猴外周血源γδT细胞的培养和鉴定方法。提供这些实施例的目的仅在于示例性地说明本发明，不能将其理解为是对本发明的范围和实质的限制。
本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
相关溶液如下：
磷酸盐缓冲液(PBS)pH 7.4
淋巴细胞分离液/Ficoll(GE Healthcare)
专用培养液：93.9％Gibco公司货号为A30218-01的OpTmizer细胞培养基，5％中国恒河猴自体血清，1％Gibco公司货号为15140163的浓度为104U/mL青霉素-104μg/mL链霉素，1‰Gibco公司货号为15630-080的浓度为10mol/L的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，5μmol/L Sigma-Aldrich公司货号为165800-06-6的唑来膦酸，1000U/mL的PeproTech公司货号为200-02的重组人白介素-2(IL-2)，以及10ng/mL的Gibco公司货号为RRMIL 18I的猴白介素-18(rIL-18)组成。
实施例1中国恒河猴外周血单核巨噬细胞分离培养
用氯胺酮对健康成年(4-5岁)中国恒河猴进行肌注麻醉(10mg/kg)，分别用含EDTA抗凝的真空采血管采集静脉血5-10ml和无抗凝剂真空采血管采集全血5mL。抗凝血用于PBMCs的分离，非抗凝血自凝后用于猴血清的分离。将抗凝全血(5-10mL)用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)对倍稀释，然后缓慢加入到稀释血液1/2体积的淋巴细胞分离液(Ficoll)上层，于22℃以1800g离心30分钟，吸出介于血浆稀释液与Ficoll之间的PBMCs层。收集的细胞用等体积PBS重悬、洗涤2次，洗过的细胞经离心回收(每次400g离心10分钟)，最后用专用培养液重悬(重悬的细胞的密度在2×106个细胞/mL)。
分离出的恒河猴PBMCs立即加入48孔培养板，以3×106个细胞/孔密度进行培养。每隔2-3天，弃去孔中一半体积的旧培养液，并添加新鲜的含2％中国恒河猴自体血清、1％青霉素-链霉素、1‰的HEPES、1000U/mL IL-2以及10ng/mL rIL-18的OpTmizer细胞培养液，保持细胞浓度在0.5～2×106个细胞/mL范围内，必要时将细胞悬液转移到6孔培养板或T25的细胞培养瓶中进行培养。
将培养第3天和第5天的细胞直接置于倒置显微镜下，高倍镜(200x)观察、拍照，观察细胞形态，判定细胞分化结果。分化培养良好的细胞随着培养时间延长，细胞团的体积和所含细胞数目也在增多，呈现明显的扩增趋势(如图1)。
实施例2不同浓度唑来膦酸对中国恒河猴外周血源γδT细胞分化的作用
分别以1，5，10μmol/L唑来膦酸的专门培养液培养猴PBMC 8天后，收集细胞并用PBS洗2遍后加50μl PBS重悬，制成单个细胞悬液，并加入CD3-PerCP-Cy5.5(BD Pharm，USA)和TCR Vγ9-FITC抗体(Thermo，USA)各2μl，阴性对照管加同型(Isotype)抗体IgG1-Percp-Cy5.5(BD Pham，USA)和IgG1-FITC(eBioscience，USA)各2μl，4℃避光孵育15min后用PBS洗2遍，去除多余抗体后加入固定液(2％多聚甲醛)重悬细胞，用流式细胞仪(BD FACS Verse，USA)检测细胞表面CD3及CR Vγ9表达水平。经检测，经过1，5，10μmol/L唑来膦酸和1000U/mL IL-2刺激后培养得到的中国恒河猴外周血源γδT细胞表面CD3/TCR Vγ9的双阳性表达率分别为89.3％，90％和70.3％％(如图2)。
实施例3流式细胞术鉴定培养的中国恒河猴外周血源γδT细胞的免疫激活
以含有5μmol/L唑来膦酸的专门培养液培养猴PBMC 8天后，收集细胞并用PBS洗2遍后加50μl PBS重悬，制成单个细胞悬液，并加入TCR Vγ9-FITC抗体(Thermo，USA)、CD56-PE抗体(BD Bio，USA)、CD69-APC抗体(BD Bio，USA)以及HLA-DR-PE-Cy7抗体(BD Bio，USA)各2μl，阴性对照管加同型(Isotype)抗体IgG1-FITC(eBioscience，USA)、IgG1-PE(Biolegend，USA)、IgG1-APC(Biolegend，USA)和IgG2a-PE-Cy7(BD Pham，USA)各2μl，4℃避光孵育15分钟后用PBS洗2遍，去除多余抗体后加入固定液(2％多聚甲醛)重悬细胞，用流式细胞仪(BD FACS Verse，USA)检测细胞表面表面标志CD56，CD69以及HLA-DR的表达水平。经检测，CD56，CD69以及HLA-DR的比例分别为75.6％，75.5％以及78％(图3)。说明由唑来膦酸/IL-2刺激得到的γδT细胞是激活状态的。
以含有5μmol/L唑来膦酸的专门培养液培养猴PBMC 8天后，收集细胞并用PBS洗2遍后加50μl PBS重悬，制成单个细胞悬液，往细胞中加入20ng/mL PMA，0.5μg/mLIonomycin及3μg/mL BFA，于细胞培养箱中放置6小时。收集细胞并用PBS洗2遍后再加50μlPBS重悬制成单个细胞悬液，并加入TCR Vγ9-FITC抗体(Thermo，USA)和IFN-γ-PE抗体(BDBio，USA)各2μl，阴性对照管加同型(Isotype)抗体IgG1-FITC(eBioscience，USA)和IgG1-PE(Biolegend，USA)各2μl，4℃避光孵育15分钟后用PBS洗2遍，去除多余抗体后加入固定液(2％多聚甲醛)重悬细胞，用流式细胞仪(BD FACS Verse，USA)检测细胞IFN-γ的表达水平。经检测，84.8％的γδT细胞内的表达IFN-γ(图4)。说明由唑来膦酸/IL-2刺激得到的γδT细胞具有杀伤作用。

Claims (1)

1.一种中国恒河猴γδT细胞的培养方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
（1）分离中国恒河猴外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）；
（2）分化、诱导、培养猴γδT细胞：步骤（1）的PBMCs用PBS重悬、洗涤2次，洗过的细胞经离心回收，每次400g离心10 min，最后用专用培养液重悬PBMCs，重悬的细胞密度为2×106个细胞/mL，立即加入到48孔培养板，以3×106个细胞/孔密度进行培养；每隔2-3天，弃去孔中一半体积的旧培养液，并添加新鲜的含中国恒河猴自体血清的OpTmizer细胞培养液，保持细胞浓度在0.5~2×106个细胞/mL，最后将细胞悬液转移到培养板或细胞培养瓶中进行培养；
所述专用培养液的组成为：含有5%中国恒河猴自体血清、1%浓度为104 U/mL青霉素-104μg/mL链霉素、1‰的浓度为10mol/L的4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、5μmol/L的唑来膦酸、1000U/mL的重组人白介素-2（IL-2），以及10ng/mL的猴白介素-18（rIL-18）的OpTmizer细胞培养基；
所述含恒河猴血清的OpTmizer细胞培养液为：含2%中国恒河猴自体血清、1%青霉素-链霉素、1‰的HEPES、1000 U/mL IL-2以及10ng/mL rIL-18的OpTmizer细胞培养液；
（3）培养细胞鉴定：猴细胞形态学观察、用流式细胞仪检测细胞表面CD3及TCR Vγ9表达水平、免疫激活表型以及猴γδT细胞分泌的IFN-γ的表达水平。
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