CN110857435B

CN110857435B - 用于培养从脐血中分离的免疫细胞的培养基及其培养方法

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Publication number: CN110857435B
Application number: CN201810975365.4A
Authority: CN
Inventors: 高戎戎; 佟艳辉
Original assignee: Shanghai Zhongyi Accurate Medical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Zhongyi Accurate Medical Technology Co ltd
Priority date: 2018-08-24
Filing date: 2018-08-24
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2038-08-24
Also published as: CN110857435A

Abstract

本发明公开了一种用于培养从脐血中分离的免疫细胞的培养基，其组成如下：基础培养基为含有体积浓度为15‑25％的KSR(Knockout serum replacement)血清替代物的CTS AIM‑V SFM培养基，其中添加有以下五种细胞因子：

本发明还提供了将上述培养基与1640培养基混合使用的技术方案以及从脐血中分离的免疫细胞的培养方法。本发明提供的培养基具有成本低、培养效果好的优点，培养出的免疫细胞具有更高的活性、生长速度较快、杀伤能力更强，并降低的大规模生产细胞的成本。

Description

用于培养从脐血中分离的免疫细胞的培养基及其培养方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于培养从脐血中分离的免疫细胞的培养基及其培养方法，尤其涉及一种成分及细胞因子以最优比例混合的改良免疫细胞培养液及其培养方法。

背景技术

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞。作为免疫细胞体外增殖诱导的重要载体即培养基，直接关系着体外诱导结果，包括增殖数量、杀瘤效果等等。免疫细胞具有以下几个特点：增殖速度快，主要效用细胞 CD3+CD56+T（抗肿瘤活性）可大量增殖，且细胞活性也大大增强；杀伤活性强，远优于传统的淋巴因子激活的杀伤细胞；杀瘤谱广，不受 MHC 限制，具有广谱杀肿瘤和病毒的作用。

免疫细胞过继免疫治疗现已成为生物治疗的重要分支，它克服了以往效应细胞增殖数量少，需大量输注IL-2，提升白细胞效价较低及副作用大等的缺点，对于促进患者免疫系统的重建、骨髓净化、微小残留病灶的清除以及防止肿瘤的复发和转移等均具有重要的意义。

免疫细胞的体外扩增需要外源性细胞因子，如 IL-2、IL-1α、IL-15等的辅助，这些因子控制着人免疫系统内特异性细胞的扩增及其生物学活性。细胞因子是免疫活性细胞和其它细胞分泌的具有多种生物活性的多肽或蛋白质，这些细胞因子是重要的信息传递物质，特别在免疫、炎症和造血系统等生物学反应过程中具有重要的作用。近几年，细胞因子的研究已成为生物学研究中最活跃的领域之一。新的细胞因子不断被发现，大量的细胞因子正在或将要应用于医学临床。细胞因子的研究带动了整个免疫学的发展。其应用展现出广阔的前景。

在基础研究中，为了促进细胞生长，培养液中添加了动物源性血清等生物活性物质，但是动物性成分在免疫细胞的临床性应用显然是不被允许的，因为存在血清批次造成的质量不稳定以及动源性污染等问题而存在安全隐患，在血源性细胞的培养中可从自身血样中提取的小量血清即可满足，甚至可以无需添加血清。因而越来越多的公司或者研究机构致力于研究成分明确的不含动物血清的培养基，即无血清培养基（Serum Free Medium，SFM），可排除动物源性污染和血清导致的不确定性。

目前，无血清培养基已用于血源性细胞的培养、真核系统中重组蛋白的表达、病毒及寄生。无血清培养基的出现是培养基发展历程上的一个里程碑，一般意义上的无血清培养基，是在各种基础培养基（如DMEM、RPMI1640、Ham’s F-12等）的基础上，添加各类可替代血清功能的组分（如人血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素等生物大分子物质，以及混合脂类、水解蛋白、微量元素、细胞因子等）配制成细胞培养基。目前，市场上有很多免疫细胞培养基：如 X-VIVO、RPMI-1640、ALY505N、KBM551/561/581系列等，这些培养基各有各的优缺点。

目前研究发现，常用的几种免疫细胞体外扩增方案的扩增产物在扩增倍数、细胞表型上并没有明显差异；但在免疫细胞杀伤活性方面，经过体外大规模扩增之后，IL- 2、IL- 15、IL- 1α、OKT3扩增产物的杀伤活性明显优于普通培养的免疫细胞的扩增情况，其中加入IL- 2的效果最明显。在此基础之上，可以进一步地探讨和优化扩增方案，从而获得高效高纯度的免疫细胞。培养基作为免疫细胞体外扩增的主要载体，直接关系着其体外诱导的结果，包括增殖数量、杀瘤效果等各种生物活性指标。

无血清培养基具有许多含血清培养基不具有的优点，尤其是在细胞免疫治疗领域。首先可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性；其次，血清对细胞有一定的毒性作用以及可能的血清源性污染都会对实验结果带来很大的影响；最关键的是，免疫细胞治疗最终要应用于临床，培养过程中应严禁加入任何异体或者动物来源的生物组分。

发明内容

针对目前国内外临床上用于辅助治疗及医疗保健中的免疫细胞在商品化大规模生产中的诸多缺陷，如成本较高、细胞生长速度问题、细胞活性问题及免疫细胞对肿瘤细胞或衰老损伤的细胞杀伤能力问题和免疫排斥反应等研究现状，本发明提供了一种改良配方的无血清培养基用于从脐血中分离的免疫细胞的培养。

本发明提供的用于培养从脐血中分离的免疫细胞的培养基命名为GR培养基，其组成如下：

基础培养基为含有体积浓度为15-25%的KSR（Knockout serum replacement）血清替代物的CTS AIM-V SFM培养基，其中添加有以下五种细胞因子：

OKT-3 与培养基质量比为1:4500-5500；

IL-2 900-1100 IU/mL；

IL-1α 900-1100 IU/mL；

IL-15 900-1100 IU/mL；

IFN-γ 900-1100 IU/mL。

优选地，所述CTS AIM-V SFM培养基为Gibco A3021002培养基，所述KSR血清替代物为Gibco KSR血清替代物。

优选地，本发明所述GR培养基的组成如下：

基础培养基为含有体积浓度为20%的KSR（Knockout serum replacement）血清替代物的CTS AIM-V SFM培养基，其中添加有以下五种细胞因子：

OKT-3 与培养基质量比为1:5000；

IL-2 1000 IU/mL；

IL-1α 1000 IU/mL；

IL-15 1000 IU/mL；

IFN-γ 1000 IU/mL。

在本发明的一种优选实施方式中，所述用于培养从脐血中分离的免疫细胞的培养基由GR培养基与1640培养基混合而成；优选地，GR培养基与1640培养基的体积比为1:0 .8-3，最佳为1:1。

进一步，本发明提供了所述从脐血中分离的免疫细胞的培养方法，包括以下步骤：

1）脐带血单核细胞的分离：将脐血缓慢加至淋巴细胞分离液上，以400 g的转速离心30分钟，分别收集上层血浆和白膜层溶液，并在白膜层溶液中加入一定量生理盐水后，摇晃、振荡混匀，以1800 rpm转速离心10分钟，弃上清，以收集的上层血浆重悬细胞，即为分离出的脐带血单核细胞；

2）用本发明的用于培养从脐血中分离的免疫细胞的培养基培养分离出的脐带血单核细胞，温度为37℃，CO₂浓度为5%，每隔2-3天补加培养基一次。

优选地，所述淋巴细胞分离液为Ficoll细胞分离液。

优选地，步骤1）中将脐血缓慢加至淋巴细胞分离液上的具体操作方法为：在预先加有3 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中以10 mL的注射器组合1 mL注射器针头，将5 mL血液沿壁缓慢加入所述离心管内，注意保持分层。

进一步，所述白膜层溶液包括白膜层及其上层的残留血浆和少量下层淋巴细胞分离液；优选地，步骤1）中收集白膜层溶液的具体操作方法为：用3 mL无菌滴管吸取白膜层及其上层的残留血浆和少量下层淋巴细胞分离液，合并多管白膜层溶液转移至50 mL离心管中。

优选地，步骤1）中所述以400 g的转速离心30分钟的离心升速为9，降速为0；所述以1800 rpm转速离心10分钟的离心升速为9，降速也为9。

本发明提供的改良后的用于培养从脐血中分离的免疫细胞的培养基在现有无血清基础培养基AIM-V的基础上，添加了一些成分明确的营养因子，可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性，具有成本低、培养效果好的优点，培养出的免疫细胞具有更高的活性、生长速度较快、杀伤能力更强，并降低的大规模生产细胞的成本。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是GR、505、G三种培养基培养的免疫细胞的生长曲线比较；

图2是GR、505、G三种培养基培养的免疫细胞的生长状态比较；

图3是GR、505、G三种培养基培养的细胞杀伤24小时的MTT结果；

图4是GR、505、G三种培养基培养的细胞杀伤48小时的MTT结果；

图5是GR+1640混合培养基与G培养基培养的免疫细胞的生长曲线比较；

图6是GR+1640混合培养基与G培养基培养的细胞杀伤24小时的MTT结果；

图7是GR+1640混合培养基与G培养基培养的细胞杀伤48小时的MTT结果。

具体实施方式

下面详细说明本发明的实施例。

实施例1

本实施例提供的用于培养从脐血中分离的免疫细胞的GR培养基配方为：

OKT-3 与培养基质量比为1:5000；

IL-2 1000 IU/mL；

IL-1α 1000 IU/mL；

IL-15 1000 IU/mL；

IFN-γ 1000 IU/mL。

对比例1

G培养基配方：

Gibco DMEM-F12培养基为基础培养基，其中添加有：

OKT-3 与培养基质量比为1:5000；

IL-2 1000 IU/mL；

IFN-γ 1000 IU/mL。

对比例2

505培养基配方：

AlyS505培养基为基础培养基，其中添加有：

OKT-3 与培养基质量比为1:5000；

IL-2 1000 IU/mL；

IFN-γ 1000 IU/mL。

实施例2

本实施例提供一种用细胞因子诱导免疫细胞的培养方法，从而获得一种新型的免疫活性细胞。具体通过如下方法培养获得：

（1）脐带血单核细胞的分离：

①在预先加入3 mL Ficoll淋巴细胞分离液的15 mL离心管中以10 mL注射器组合1 mL注射器针头，将5 mL脐血缓慢加入上述离心管内（沿壁注射，保持分层）400 g、升速9、降速0，离心30分钟；用3 mL无菌滴管将离心液的上层血浆取出，转移至一个50 mL离心管中（所有血浆并入同一离心管）；

②用3 mL无菌滴管取白膜层及其上层的残留血浆和少量下层Ficoll淋巴细胞分离液，转移至干净的50 mL离心管中（每4个15 mL离心管的白膜层并入一个50 mL离心管）；向每个50 mL离心管中补加生理盐水至45 mL刻度，摇晃、振荡混匀，1800 rpm、升速9、降速9，离心10分钟；弃上清，用残留液体振荡后多管并为一个50 mL离心管，用少量生理盐水洗原50 mL离心管，清洗液体也转移至同一个离心管内，后补加生理盐水至45 mL刻度，摇晃、振荡混匀，1800 rpm、升速9、降速 9，离心10分钟，弃上清。

③以十分之一的原脐血体积的血浆重悬脐带血单核细胞细胞，吹打混匀后取100μL计数。

（2）免疫细胞培养：

分离出PMBC后，将血浆重悬的细胞液均分为两份，加入10 mL的实施例1中的GR培养基，置于T75培养瓶中培养，温度设为37℃，CO₂浓度为5%；培养每2天镜检观察一次，拍照，吹打混匀，计数；每个T75培养瓶中分别补加 5 mL GR培养基。2周后镜检细胞，拍照，吹打混匀后计数，两份各取10 mL转移至新T75培养瓶中，补加培养液；剩下的细胞用于细胞表型流式测定以及台酚蓝染色确定细胞活率。

实施例3 三种培养基培养效果比较

（1）细胞生长情况比较

分别用GR、G、505培养基按实施例2中的方法培养免疫细胞，以三份脐血做三次重复实验，以验证三种培养基的效果对比实验是否具可重复性，排除其他条件的干扰。每次实验进行至第13天时做台酚蓝活性测定，现以第二次实验数据为例。三种培养基进行平行操作，初始细胞浓度均为 1×10⁶/mL。

免疫细胞活性检测方法：取适量培养至d13的免疫细胞液，将团块吹打分散后取100 μL，与100 μL的台酚蓝染剂充分混匀后置于载玻片上，于显微镜（×100）下观察、拍照、估算细胞活率。

后续每次补液操作均对细胞进行计数，由计数结果和对应体积计算得到各操作点的细胞总量，将两次实验的计数结果汇总后以操作时间为横轴、细胞总数为纵轴作细胞增殖曲线（图1），从该曲线可看出 GR 培养基所培养的细胞增殖最快，505 培养基次之，两者的最终增殖倍率都高于130倍；G 培养基培养的细胞增殖最缓，且最终增殖倍率也不如其他两种培养基。培养至 13天时以台酚蓝测定三组细胞的活性，其中从GR组细胞测定吹打前和吹打后两种状态（图2）可以看出用GR培养的细胞呈团块化生长，需吹打才能分散成单个细胞，三组细胞的活率都≥99%，细胞密度都比较高。

（2）对免疫细胞免疫表型影响的比较：

免疫细胞鉴定方法：通过流式检测技术，取适量培养至第13天（d13）的CIK细胞液吹打混匀，以无菌的D-hanks液清洗细胞 2-3次，用不含血清的RPMI-1640重悬细胞，调整浓度为 1×10⁷-3×10⁷/mL，将细胞重悬液分装至1.5 mL离心管（100 μL/管）中，加入PE-CD3、FITC-CD56、APC-8a抗体（1 μL/test），冰上孵育1小时，用400 μL不含血清的RPMI-1640重悬细胞。

细胞免疫表型流式分析图以第二次实验的结果为例。培养至第 13 天时每组取约15 mL细胞液分离细胞清洗处理后加入对应抗体进行流式细胞分析，检测CD3+CD56+细胞的比例，对比GR、G、505培养基培养细胞的流式结果（表 1）。GR组的细胞双阳性接近70%，三阳性均值都高于50%，而另两组细胞的双阳性和三阳性均值都低于20%，反映出GR培养基比另两种培养基更宜于促进CD3+CD56+细胞群的增殖。

表1. GR/505/G培养基培养的免疫细胞表型比例（%）

	CD3+CD56	CD3+CD56+CD8a
			GR	76.3±0.25	51.2±0.46
505	19.8±0.36	16.23±0.78
			G	15.5±0.72	12.9±0.2

实施例4 免疫细胞杀伤能力检测与比较

以肿瘤细胞HEPG-2为杀伤实验对象，预铺细胞于T25培养瓶中，细胞数为2×10⁵/T25），免疫细胞培养至第13天，以无菌的D-hanks液清洗T25培养瓶内的HEPG-2细胞2-3次，用1 mL胰酶将其消化脱壁，并用2 mL含10%FBS的DMEM/HIGH GLUCOSE（10%FBS -DMEM/HIGHGLUCOSE）终止消化，吹打使其分散为单个细胞后转移至15 mL离心管内，原T25培养瓶以6 mL无菌的D-hanks液清洗，清洗液并入同一15 mL离心管，1000 rpm离心10分钟；弃上清，以2 mL的10%FBS -DMEM/HIGHGLUCOSE重悬后计数，用10%FBS -DMEM/HIGHGLUCOSE调整浓度为1×10⁶/mL，取干净的T25培养瓶，在每个T25培养瓶中加入200 μL上述细胞液（含2×10⁵/T25）和5 mL 10%FBS -DMEM/HIGHGLUCOSE。

第14天时，在昨天预铺肿瘤细胞的T25培养瓶中加入对应的免疫细胞2×10⁶/T25（10倍肿瘤细胞数量）；通过MTT实验验证细胞杀伤能力，将杀伤24小时或48小时的细胞镜检拍照，每个时间点设置空白对照（NC，不加免疫细胞的肿瘤细胞），以无菌的D-hanks液清洗2-3次后再次镜检拍照，用胰酶将残余的肿瘤细胞消化脱壁，以10%FBS-DMEM/HIGH GLUCOSE终止消化后加少量无菌的D-hanks液转移至15 mL离心管，1000 rpm离心10分钟；弃上清，以适量10%FBS-DMEM/HIGH GLUCOSE重悬（使NC约为2×10⁴/200μL）后铺96孔板，每种细胞铺一列6孔，每孔200 μL细胞悬液；培箱中放置24小时后加入20 μL/孔MTT，培箱中静置4小时后，将孔中溶液吸出，加入150 μL的 DMSO，再在培箱中静置30分钟，用酶标仪在492 nm下测定吸光度（OD 值）。

将三次实验杀伤24小时、48小时的MTT 结果经数据处理后得到柱状图（图3-4），由该图可看出杀伤24小时时GR组的细胞能达到大于60%的杀伤活性，G组的细胞杀伤活性略低，但也能达到 50%，而505组的细胞杀伤活性仅能达到15%；杀伤48小时时，GR组和G组细胞的杀伤活性都在50%左右，GR组杀伤效果相对较好，505组杀伤活性则低于40%。

本发明实施例3和4通过平行使用三种培养基培养免疫细胞，观察并记录操作过程细胞状态和数量的变化，作出增殖曲线，可以明显的看出GR培养基在促进细胞增殖方面要优于另两个培养基（可达到 170 倍倍增）。同时，在第 13 天的细胞免疫表型流式结果中也能看出GR培养基相较G、505培养基更能激发 CD3+CD56+异质性细胞群的增殖（双阳率均值76.3%，三阳性均值42.56%），即可提高免疫细胞中杀伤细胞的比例。另外，在第 14天的杀伤24小时、48小时后所做的MTT 实验结果，同样反映出GR培养基对于提高细胞杀伤活性的能力也优于另两种培养基，验证了GR培养基的优化效果。

实施例5 GR+1640混合培养基与G培养基培养效果比较

本实施例中所述GR+1640混合培养基由GR培养基与1640培养基以体积比1:1混合而成。两种培养基进行平行操作，初始细胞浓度均为1×10⁶/mL。后续每次补液操作均对细胞进行计数，由计数结果和对应体积计算得到各操作点的细胞总量，将三次实验的计数结果汇总后以操作时间为横轴、细胞总数为纵轴作细胞增殖曲线（图5），从该曲线可看出混合培养基所培养的细胞增殖速率和扩增倍数都不如G培养基。培养至 13天时以台酚蓝测定两组细胞的活性，两组细胞的活率都≥95%，细胞密度都比较高。

培养至第13天时每组取约15 mL细胞液分离细胞清洗处理后加入对应抗体进行流式细胞分析，检测CD3+CD56+细胞的比例，对比GR+1640混合培养基与G 培养基所培养细胞的流式结果（表2）。混合培养基组的细胞双阳性接近40%，三阳性均值超过20%，而G组细胞的双阳性和三阳性均值低于12%，反映出混合培养基比G培养基更宜于促进CD3+CD56+细胞群的增殖，但这种优势不明显。GR+1640混合培养免疫细胞24小时与48小时杀伤效果要明显高于G培养基培养的免疫细胞（图6-7）。

表2. GR+1640/G培养基培养的免疫细胞表型比例

	CD3+CD56	CD3+CD56+CD8a
			GR+1640	45.9±1.85	21.1±1.55
G	12±0.92	9.73±2.15

为了进一步降低生产成本，本实施例在原有GR培养基基础上添加1640培养基，1640 培养基是一种成本较低廉的培养基，因为考虑到GR 培养基若直接进行商业化应用，生产成本可能会比较高，故尝试以GR 培养基混合1640培养基培养免疫细胞。将这种混合培养基与市场上主流的G培养基做培养效果方面的比较，若可以达到相近甚至更好的培养效果，即说明这种以混合培养基培养免疫细胞的培养方法是可行的。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种用于培养从脐血中分离的免疫细胞的培养基，其特征在于，其是由GR培养基与1640培养基混合而成的，所述GR培养基与所述1640培养基的体积比为1:0.8-3；其中所述GR培养基的组成如下：

基础培养基为含有体积浓度为15-25％的KSR(Knockout serum replacement)血清替代物的CTS AIM-V SFM培养基，其中添加有以下五种细胞因子：

2.如权利要求1所述的用于培养从脐血中分离的免疫细胞的培养基，其特征在于，所述GR培养基与所述1640培养基的体积比为1:1。