CN107312751B - 一种诱导小鼠骨髓细胞稳定分化为未成熟树突状细胞的专用培养基及培养方法 - Google Patents
一种诱导小鼠骨髓细胞稳定分化为未成熟树突状细胞的专用培养基及培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于细胞培养技术领域，公开了一种诱导小鼠骨髓细胞稳定分化为未成熟树突状细胞的培养基及培养方法。所述培养基包括按照比例混合而成的无血清培养基、脂多糖、粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素‑4、青霉素‑链霉素；使用本发明DC培养基可稳定地诱导小鼠骨髓细胞高比例定向分化为未成熟树突状细胞，细胞生长状态良好，细胞数量、纯度及生物功能活性稳定，可以满足进一步实验需求，实验结果稳定，且本发明所述细胞培养基生产成本低，使用方便，具有实际的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，更具体地，涉及一种未成熟树突状细胞专用培养基及培养方法。
背景技术
树突状细胞是一类存在于外周血、皮肤、淋巴器官及胸腺中的抗原提呈细胞(Antigen presenting cells, APC)，因其细胞膜向外伸出，形成树突状或伪足样突起，故而命名为树突状细胞(dendritic cells，DCs)。它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，并可刺激成熟后活化初始T 细胞。未成熟DC细胞具有较强的迁移、摄取和加工抗原的能力，而成熟DC细胞刺激初始T 细胞增殖、 分化的能力强，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。imDC成熟过程的深入研究有助于进一步阐明免疫耐受机制，对于抗肿瘤、风湿免疫免疫、抗排斥等临床和基础研究领域有极为重要的意义。
目前实验室imDCs的获取和培养多由研究者采用人外周血或脐血单个核细胞经抗体磁珠包被分离、Ficoll梯度离心纯化后诱导分化而成，采用基础培养基、动物血清及相关细胞因子自行配置培养。但由于临床血标本的限制、DC自身增殖能力不强，加之不同品牌培养基及血清等试剂之间差异较大、成分复杂，导致不能获取足量imDCs、培养效率低下、细胞活性差、每次获取imDCs的量及成熟度均不稳定，严重影响后续实验的准确性和可靠性。因此，在实验室中如何稳定高效的获取大量imDCs，是解决问题的关键。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种诱导小鼠骨髓细胞稳定分化为未成熟树突状细胞的培养基。
本发明的第二个目的是提供利用所述培养基进行imDCs体外诱导分化的培养方法。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
一种诱导小鼠骨髓细胞稳定分化为未成熟树突状细胞的培养基，该培养基由X-VIVO 20 90～95v/v%，LPS 1μg/ml，GM-CSF 20～40ng/ml、IL-4 10～40ng/ml、青霉素-链霉素 106U/ml组成，余量为无菌注射用水；其中GM-CSF与IL-4的质量比为4：1时DC产量及纯度最高。
本发明所述培养基包括按照比例混合而成的无血清培养基、LPS、GM-CSF、IL-4、青霉素-链霉素。
其中，无血清培养基为X-VIVO 20，其配方完全并且包含药物级别的人白蛋白、重组人胰岛素及巴氏消毒转铁蛋白，可以为细胞生长提供基本物质营养、激素及各种生长因子，所含结合蛋白、促接触和伸展因子能在细胞代谢过程中起重要作用，同时由于不添加血清成分、不含不明确成分，增加确定性，性能更加一致，容易进行纯化和下游加工，细胞功能的精确评估，增强生长和/或产量，生理反应性的较好对照，增强细胞内中介物的检测。
LPS是格兰氏阴性细菌内毒素的主要成分，LPS在DC分化发育的晚期促使其成熟，但在DC分化发育的早期或其全过程中持续予以一定剂量的LPS刺激，DC的成熟明显受到抑制。
GM-CSF为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，能定向刺激骨髓细胞向粒细胞-巨噬细胞方向分化，亦诱导单核扩增向DC方向分化。
IL-4为白细胞介素-4，能抑制骨髓细胞向巨噬细胞方向分化。两者结合，使得骨髓细胞更高比例的向DC方向分化。
青霉素-链霉素为两联抗生素，青霉素主要抑制革兰氏阳性菌，链霉素主要抑制革兰氏阴性菌，两者互补，可抑制大部分常见的细菌，保证细胞生长环境。青霉素作用于细胞壁，链霉素只影响细菌蛋白质的合成，不影响真核细胞生长。
本发明在复配细胞培养基的过程及预实验中，发现GM-CSF与IL-4的配比对DC细胞纯度影响显著，持续低剂量LPS诱导所得imDCs比例最高。在无血清培养基体系中，只有GM-CSF与IL-4的质量用量比为4：1，LPS剂量为1μg/ml时，细胞生长状态最好，且纯度最高。
优选地，所述的诱导小鼠骨髓细胞稳定分化为未成熟树突状细胞的培养基，其特征在于，该培养基由X-VIVO 20 95v/v%，LPS 1μg/ml，GM-CSF 40ng/ml、IL-4 10ng/ml、青霉素-链霉素 106U/ml组成，余量为无菌注射用水。
本发明还提供利用所述培养基进行imDCs体外诱导分化的培养方法。
具体地，该方法包括以下步骤：
S1. 冰浴上收集小鼠骨髓细胞并制成悬液，离心后弃上清；
S2. 向S1离心得到的细胞沉淀加入3～5ml红细胞裂解液，混匀后静置2min，离心后弃上清；
S3. 将步骤S2离心得到的细胞重悬于RPMI1640中，离心后弃上清；
S4. 重复步骤S3两次；
S5. 将步骤S4离心得到的细胞重悬于权利要求1或2所述的培养基中，然后置于培养箱中孵育；之后隔天换液一次；
S6. 培养第1、第3天，每次换液为全量换液，培养至第5天后重新铺板；培养至7天后获得imDCs。
优选地，S1所述骨髓细胞取自小鼠胫骨、股骨。
优选地，S1，S2，S3所述离心的条件均为4℃，1000rpm，2～5min。
优选地， S5细胞重悬后细胞密度为0.5×106/ml～1×106/ml。
作为一种具体的实施方式，本发明所述培养方法包括以下步骤：
S1. 冰浴环境通过RPMI1640收集取自6～8周龄小鼠胫骨、股骨的骨髓细胞并制成悬液，4℃，1000rpm离心5min后弃上清；
S2. 将步骤S1离心得到的细胞沉淀加入3～5ml红细胞裂解液，混匀后静置2min，4℃，1000rpm离心2min后弃上清；
S3. 将步骤S2离心得到的细胞重悬于RPMI1640中，4℃，1000rpm离心2min后弃上清；重复此步骤2次；
S4. 将步骤S3离心得到的细胞重悬于本发明所述培养基中，铺至6孔板内（细胞密度0.5～1×106），然后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育；之后隔天换液一次；
S5. 培养至1～4天，此时DC细胞前体贴壁生长，丢弃原培养基悬液，应用本发明所述培养基全量换液；
S6. 培养到第5天后，DC细胞悬浮或半悬浮生长，收集全部培养基，4℃，1000rpm离心2min后弃上清，用DC培养基重悬沉淀，重新铺板；
S7. 培养到第7天，DC细胞诱导完全，可收集所培养细胞用于未成熟DC细胞的相关研究，亦可继续培养或刺激成熟以研究成熟DC相关问题。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明提供的一种诱导小鼠骨髓细胞稳定分化为未成熟树突状细胞的专用细胞培养基及培养方法，显著提高DC细胞分化数量及细胞活性。使用本发明DC培养基及培养方法，每只6～8周龄SPF级小鼠可获得80～100×106个DC细胞，显著高于利用现有技术的培养基培养获得的细胞数；其中无血清培养基不仅极大的提高了培养出的DC的纯度，而且持续低剂量LPS刺激使得DC的成熟度最大限度地统一在未成熟状态。使用本发明DC细胞培养基及培养方法，所获得的细胞中CD11c+比例超过94%，明显高于传统培养基及传统方法所得细胞含量，imDCs的比例也维持在最高水平。
利用本发明所述方法培养DC细胞，不受临床标本限制，可无限获取imDCs；无需研究者自行配制，细胞培养基成分相对固定简单，实验结果稳定性好，培养成本相对较低；培养方法操作简单，DC获取纯度高，成熟度均一，大大节省以往为纯化DC所花费的成本以及最大限度统一细胞成熟度均一性，以优化后续实验结果的同一性。
附图说明
图1为实施例1所述方法培养的光镜下典型的imDCs形态。
图2为实施例1所述方法培养的细胞经CD11c荧光标记imDCs的流式图。
图3为实施例1所述方法培养的的imDCs经TNF-α刺激成熟后表型变化的流式图。
图4为本发明效果实施例及各对比例所培养DC细胞功能的相关检测；图4A为实施例1的DC细胞抗原吞噬能力；图4B为各组DC在TNF-α刺激前后IL-12分泌水平；图4C为各组DC在TNF-α刺激前后IL-10分泌水平；图4D为各组DC抗原提呈能力；图4E为各组DC在TNF-α刺激前MLR细胞增殖的变化；图4F为各组DC在TNF-α刺激后MLR细胞增殖的变化。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例DC培养基包括下述的各组分：X-VIVO 20 95v/v%、LPS 1μg/ml、GM-CSF40ng/ml、IL-4 10ng/ml、青霉素-链霉素 106U/ml，余量为无菌注射用水。
使用本实施例所述DC培养基培养诱导小鼠骨髓细胞分化为imDCs的方法，包括以下步骤：
S1. 冰浴环境通过RPMI1640收集取自6～8周龄小鼠胫骨、股骨的骨髓细胞并制成悬液，4℃，1000rpm离心5min后弃上清；
S2. 将步骤S1离心得到的细胞沉淀加入3～5ml红细胞裂解液，混匀后静置2min，4℃，1000rpm离心2min后弃上清；
S3. 将步骤S2离心得到的细胞重悬于RPMI1640中，4℃，1000rpm离心2min后弃上清；重复此步骤2次；
S4. 将步骤S3离心得到的细胞重悬于本实施例所述DC培养基中，铺至6孔板内（细胞密度0.5～1×106），然后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育；之后隔天换液一次；
S5. 培养1～4天，此时DC前体贴壁生长，丢弃培养基悬液，全量换液；
S6. 培养到第5天后，DC悬浮或半悬浮生长，收集全部培养基，4℃，1000rpm离心2min后弃上清，用DC培养基重悬沉淀，重新铺板；
S7. 培养到第7天，DC诱导完全，可收集所培养细胞。
收集培养获得的DC细胞，光镜下观察imDC形态，结果如图1所示：imDCs形态不固定，明显树突样或伪足样突起为其特征。
通过流式细胞术和ELISA检测本实施例所述DC培养基及培养方法所得DC细胞功能活性，检测项目为DC细胞纯度及其刺激成熟前后表型变化、DC细胞分泌细胞因子、吞噬功能、抗原提呈功能。
图2所示，CD11c为DC细胞表面特征性标志，其比例间接反应DC细胞比例，图中所示实施例1中CD11c+DC细胞比例为94.2%，即是说，实施例1中DC细胞比例为94.2%。
图3所示，CD40、CD80、CD86、MHC-II均为DC细胞成熟标志，经肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）刺激后，imDCs的以上表型均有不同程度升高。流式细胞术检测发现实施例1中imDC经TNF-α刺激后，各表型均有明显上调，说明本发明培养基培养的imDCs仍有刺激成熟的潜能，与生理状态下及传统方法所得imDCs特性相似，可用于imDCs成熟变化的相关后续研究。
实施例2
本实施例DC培养基包括下述的各组分：X-VIVO 20 95v/v%、LPS 1μg/ml、GM-CSF10ng/ml、IL-4 40ng/ml、青霉素-链霉素 106U/ml，余量为无菌注射用水。
使用本实施例的DC培养基培养DC细胞的方法与实施例1的方法类似。
对比例1
本对比例DC培养基包括下述的各组分：X-VIVO 20 95v/v%、GM-CSF 40ng/ml、IL-410ng/ml、青霉素-链霉素 106U/ml，余量为无菌注射用水。
本对比例的DC细胞培养方法同实施例1，唯一不同的是所用的DC培养基是本对比例的DC培养基。
对比例2
本对比例DC培养基包括下述的各组分：RPMI1640 90v/v%、胎牛血清10 v/v %、LPS1μg/ml、GM-CSF 40ng/ml、IL-4 10ng/ml、青霉素-链霉素 106U/ml，余量为无菌注射用水。
本对比例的DC细胞培养方法同实施例1，唯一不同的是所用的DC培养基是本对比例的DC培养基。
对比例3
本对比例DC培养基包括下述的各组分：RPMI1640 90v/v%、胎牛血清10 v/v %、LPS1μg/ml、GM-CSF 10ng/ml、IL-4 40ng/ml、青霉素-链霉素 106U/ml，余量为无菌注射用水。
本对比例的DC细胞培养方法同实施例1，唯一不同的是所用的DC培养基是本对比例的DC培养基。
分别收集实施例1～2，对比例1～3的方法培养获得的DC细胞，采用细胞计数板、台盼蓝染色法进行细胞计数及活力计算，流式细胞数计数imDC比例。结果如表1所示。
如表1所示，应用本发明培养基后，每只小鼠的DCs产量更多，活率更高，同时imDC比例更高；对比传统培养基，本发明培养基及培养方法能有效弃去贴壁细胞，提高DC细胞比例，使得悬浮生长的DC细胞营养更集中，同样使细胞产量更多、活率更高。
同时检测各个实施例和对比例获得的DC细胞的功能，其结果如图4所示。图4A为采用FITC-Dextran吞噬实验来分析实施例1中imDCs的抗原吞噬情况，流式结果显示实施例1中imDCs具有很强的吞噬能力。
图4B、4C为各组imDCs在TNF-α刺激前后IL-12、IL-10分泌水平变化。imDCs在成熟过程中分泌大量的IL10、IL-12，前者抑制Th1型反应促进Th2型反应，参与调节免疫反应，而后者可以驱动Th1型反应，参与缺血再灌注、排斥反应、自身免疫性疾病的病理过程，故该两种细胞因子是DC研究中的重点。结果如图所示，应用各个实施例和对比例所培养的DC分泌的细胞因子水平相近（P＞0.05），同时发现本发明培养基组内重复实验的结果比传统培养基差异更小，水平更稳定。运用本发明培养基比传统培养基（实施例1 vs 对比例1、对比例2；实施例2 vs 对比例3）所培养的DC分泌的细胞因子水平相近（P＞0.05），但各次实验结果重复性更好。
图4D为各组imDCs抗原提呈能力的比较。DC细胞递呈OVA抗原给MF2.2D9细胞，后者特异性增殖时分泌的IL-2，因此，IL-2水平反映imDCs的抗原递呈能力。将各组imDCs与MF2.2D9肿瘤细胞按1：10混合后加入可溶性抗原OVA孵育24小时，收集上清，检测IL12水平。结果显示：各个实施例和对比例所培养的imDCs抗原提呈能力相近（P＞0.05），但实施例1的DC培养基各重复实验的结果比对比例的各个DC培养基差异更小，水平更稳定；运用本发明培养基（实施例1、实施例2）比传统培养基所培养的imDCs抗原提呈能力也相近（P＞0.05），但各次实验结果重复性更好。
图4E、4F为各组imDCs经TNF-α刺激前后MLR细胞增殖的变化。将各组TNF-α刺激前后的DCs与同种小鼠来源的脾脏CD4+T细胞按一定比例（1：40、1：10、1：2）做混合淋巴细胞培养，观察DC刺激同种T细胞增殖的能力。结果如图所示，应用各个实施例和对比例所培养的DC细胞刺激同种淋巴细胞增殖的能力相近（P＞0.05），但实施例的DC培养基组内重复实验的结果比对比例的各个培养基差异更小，水平更稳定；运用本发明培养基（实施例1、实施例2）比传统培养基所培养的DC抗原提呈能力相近（P＞0.05），但各次实验结果重复性更好。
Claims (6)
1.一种诱导小鼠骨髓细胞稳定分化为未成熟树突状细胞的培养基，其特征在于，该培养基由X-VIVO 20 90～95v/v％，LPS 1μg/ml，GM-CSF 40ng/ml、IL-4 10ng/ml、青霉素-链霉素106U/ml组成，余量为无菌注射用水；其中GM-CSF与IL-4的质量比为4：1。
2.根据权利要求1所述的诱导小鼠骨髓细胞稳定分化为未成熟树突状细胞的培养基，其特征在于，该培养基由X-VIVO 20 95v/v％，LPS 1μg/ml，GM-CSF 40ng/ml、IL-4 10ng/ml、青霉素-链霉素106U/ml组成，余量为无菌注射用水。
3.利用权利要求1或2所述培养基进行imDCs体外诱导分化的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.冰浴上收集小鼠骨髓细胞并制成悬液，离心后弃上清；
S2.向S1离心得到的细胞沉淀加入3～5ml红细胞裂解液，混匀后静置2min，离心后弃上清；
S3.将步骤S2离心得到的细胞重悬于RPMI1640中，离心后弃上清；
S4.重复步骤S3两次；
S5.将步骤S4离心得到的细胞重悬于权利要求1或2所述的培养基中，然后置于培养箱中孵育；之后隔天换液一次；
S6.培养第1、第3天，每次换液为全量换液，培养至第5天后重新铺板；培养至7天后获得imDCs。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，S1所述骨髓细胞取自小鼠胫骨、股骨。
5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，S1，S2，S3所述离心的条件均为4℃，1000rpm，2～5min。
6.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，S5细胞重悬后细胞密度为0.5×106/ml～1×106/ml。
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