CN115505567A - 临床级混合型免疫细胞的制备方法 - Google Patents

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CN115505567A CN202211172103.7A CN202211172103A CN115505567A CN 115505567 A CN115505567 A CN 115505567A CN 202211172103 A CN202211172103 A CN 202211172103A CN 115505567 A CN115505567 A CN 115505567A
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Abstract

本发明公开一种临床级混合型免疫细胞的制备方法，其步骤包括：采用淋巴细胞分离液从外周血中分离出单个核细胞；完全培养基A液悬浮单个核细胞，混匀后，置于培养箱内培养；培养后，向培养液中添加等体积的完全培养基B液，混匀后，置于培养箱内继续培养；每2至3天根据细胞计数结果等体积补充完全培养基C液；培养16天后，获得CD3‑CD56+、CD3+CD56+为主要效应细胞的混合免疫细胞群。本发明的技术方案能够提供了一种含有NK和CIK的混合型免疫细胞，是由单个核细胞经过体外诱导、扩增培养获得的大量具有多种免疫活性的免疫细胞群，包含CD3‑CD56+细胞群、CD3+CD56+细胞群。其制备工艺简单、有效成分稳定、细胞毒性高、成本低等特点，弥补了多种免疫细胞联合治疗的空缺。

Description

临床级混合型免疫细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种临床级混合型免疫细胞的制备方法。
背景技术
细胞治疗是继手术、放疗和化疗之后的又一种肿瘤治疗方法，它一般作为手术、放化疗的辅助手段，延长患者的寿命，清除体内手术后残余的癌细胞。常用的免疫细胞主要有细胞因子诱导的杀伤细胞CIK)、自然杀伤细胞(NK)、树突状细胞(DC)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等。
CIK和NK细胞是进行肿瘤免疫治疗的两个重要部分。CIK是一群具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性及NK细胞的非主要组织相容性复合物限制性细胞，CD3+CD56+细胞是其主要的效应细胞。CIK细胞主要是以MHC限制性的方式杀伤靶细胞，DC细胞通过MHC限制性的方式抗原呈递给CIK细胞，以激活CIK细胞的杀伤效应，清除残存的肿瘤细胞而发挥更加强大的细胞毒性作用。NK细胞是一群表达CD3-CD56+的淋巴细胞，NK细胞对肿瘤和病毒的识别无MHC限制性，不依赖于抗体，无需致敏就可以发挥杀伤肿瘤和病毒的功能。NK细胞也是机体抗肿瘤、抗感染的第一道防线。NK细胞还可分泌多种细胞因子，如穿孔素、细胞毒因子、TNF、IFN-y、IL-2等来发挥免疫监视功能。CIK细胞能够特异性的杀伤肿瘤细胞，但无法识别不表达MHC-I类分子的肿瘤细胞，而NK细胞能识别不表达MHC-I类分子的肿瘤细胞，并能杀伤肿瘤细胞，因此，两者的共同回输可对大部分肿瘤细胞进行有效杀伤。
大量的临床研究表明，CIK、NK具有提高肿瘤临床治愈率、减少肿瘤复发、改善生活质量、延长生存期等作用。目前，体外诱导CIK和NK的技术都比较成熟，可以获得满足临床使用的细胞。但是，临床中所使用的细胞多为CIK或NK单独使用，联合应用进行治疗的较少，且联合应用对肿瘤细胞的杀伤功能缺乏报道。张光辉、邵小燕等研究证明，CIK与NK细胞联合应用对肿瘤细胞的杀伤毒性优于单独使用。
综上所述，如何设计一种一次性制备含有CD3-CD56+和CD3+CD56+的淋巴细胞的方法，是目前本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明实施例的主要目的在于提出一种临床级混合型免疫细胞的制备方法，旨在一次性制备含有CD3-CD56+和CD3+CD56+的淋巴细胞。
本发明解决上述技术问题的技术方案是，提供一种临床级混合型免疫细胞的制备方法，其步骤包括：
采用淋巴细胞分离液从外周血中分离出单个核细胞；
完全培养基A液悬浮单个核细胞，混匀后，置于培养箱内培养；
培养后，向培养液中添加等体积的完全培养基B液，混匀后，置于培养箱内继续培养；
每2至3天根据细胞计数结果等体积补充完全培养基C液；
培养16天后，获得CD3-CD56+、CD3+CD56+为主要效应细胞的混合免疫细胞群。
在本发明一实施例中，所述完全培养基A液包括：含有1ug/ml～5ug/ml的CD16单抗的SCGM NK培养基、20ug/ml～100μg/ml的力尔凡及2％～5％的血清替代物。
在本发明一实施例中，所述完全培养基B液包括：10ug/ml～100ug/ml胸腺法新、1000ug/ml～5000U/ml的IL-2、10ug/ml～100ng/ml的IL15及2％～5％的血清替代物。
在本发明一实施例中，所述完全培养基C液包括：1％～3％的血清替代物、1000U/ml～2000U/ml的IL-2及1U/ml～10ug/ml的LacNAC。
在本发明一实施例中，所述采用淋巴细胞分离液从外周血中分离出单个核细胞的步骤包括：
外周血置于50ml的离心管中，并放入离心机中；
加入等体积的羟乙基淀粉注射液，摇匀后放入离心机中，离心机的离心力为250g，离心20min；
弃上清，细胞沉淀中加入等体积的PBS，混匀，加入上淋巴细胞分离液800g，离心处理；
收集白膜层层于新的离心管中，将PBS加入到含有PBMC的离心管中，混匀后，放入离心机中，离心力为400g，离心洗涤10min，离心洗涤2遍，得单个核细胞。
在本发明一实施例中，所述完全培养基A液悬浮单个核细胞，混匀后，置于培养箱内培养的步骤包括：
完全培养基A液悬浮单个核细胞，混匀，调整细胞浓度为1×106～2×106个细胞/ml；
调整后，置于培养箱内培养。
在本发明一实施例中，所述每2至3天根据细胞计数结果等体积补充完全培养基C液的步骤中，保持细胞密度在1×106～3×106个细胞/ml。
本发明的技术方案，提供了一种含有NK和CIK的混合型免疫细胞，命名为MAK(Mixed-activated killer)免疫细胞，是由单个核细胞经过体外诱导、扩增培养获得的大量具有多种免疫活性的免疫细胞群，包含CD3-CD56+细胞群、CD3+CD56+细胞群。其制备工艺简单、有效成分稳定、细胞毒性高、成本低等特点，弥补了多种免疫细胞联合治疗的空缺，为肿瘤患者和亚健康患者提供一种全新的治疗方案。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明所述临床级混合型免疫细胞的制备方法的流程示意图；
图2为本发明所述临床级混合型免疫细胞的制备方法的步骤S10的流程示意图；
图3为本发明所述临床级混合型免疫细胞的制备方法的步骤S20流程示意图；
图4为本发明所述临床级混合型免疫细胞的制备方法的MAK的流式表型图；
图5为本发明所述临床级混合型免疫细胞的制备方法的MAK其中一杀伤毒性检测图；
图6为本发明所述临床级混合型免疫细胞的制备方法的MAK其中一杀伤毒性检测图；
图7为本发明所述临床级混合型免疫细胞的制备方法的MAK与CIK、NK流式表型图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“若干”、“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“连接”、“固定”等应做广义理解，例如，“固定”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
另外，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
本发明提出一种临床级混合型免疫细胞的制备方法，旨在一次性制备含有CD3-CD56+和CD3+CD56+的淋巴细胞。
下面将在具体实施例中对本发明提出的临床级混合型免疫细胞的制备方法的具体结构进行说明：
在本实施例的技术方案中，如图1所示，一种临床级混合型免疫细胞的制备方法，其步骤包括：
S10：采用淋巴细胞分离液从外周血中分离出单个核细胞；
S20：完全培养基A液悬浮单个核细胞，混匀后，置于培养箱内培养；
可以理解地，完全培养基A能够活化NK细胞，增强其活性及细胞毒性，并且消除可能残存的肿瘤细胞，使NK细胞、CIK细胞、祖细胞优势生存。
S30：培养后，向培养液中添加等体积的完全培养基B液，混匀后，置于培养箱内继续培养；
可以理解地，完全培养基B能够增强目的细胞的聚集簇状生长,活化其表面的激活受体的表达，增强其活性及细胞毒性。
S40：每2至3天根据细胞计数结果等体积补充完全培养基C液；
可以理解地，完全培养基C能为细胞增殖提供足够的营养物质，同时提高抗氧化性、活性，抑制非目的细胞的增殖；
S50：培养16天后，获得CD3-CD56+、CD3+CD56+为主要效应细胞的混合免疫细胞群。
可以理解地，本发明提供了一种含有NK和CIK的混合型免疫细胞，命名为MAK(Mixed-activatedkiller)免疫细胞，是由单个核细胞经过体外诱导、扩增培养获得的大量具有多种免疫活性的免疫细胞群，包含CD3-CD56+细胞群、CD3+CD56+细胞群。其制备工艺简单、有效成分稳定、细胞毒性高、成本低等特点，弥补了多种免疫细胞联合治疗的空缺，为肿瘤患者和亚健康患者提供一种全新的治疗方案。
在本发明一实施例中，所述完全培养基A液包括：含有1μg/ml～5ug/ml的CD16单抗的SCGM NK培养基、20μg/ml～100μg/ml的力尔凡及2％～5％的血清替代物。
可以理解地，CD16单抗益于NK细胞的激活扩增，激活NK细胞抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用，且可显著性提高NK的扩增数量；SCGM NK培养基是一种优化的无异种GMP培养基，对NK细胞和CIK培养非常有益,能够保障NK和CIK的优势生长，同时可用于少量分离的人类造血干细胞和祖细胞的无血清扩增，保证祖细胞的存活及其向NK分化。GT-551H3无血清培养基，为常规无血清培养基，适用于人体淋巴细胞、DC细胞培养、NK细胞的培养，适用于后期的大量培养。多种培养基的联合应用更是在节约成本的前提下，实现目的细胞的优势生长和成分稳定；力尔凡能够有效诱导机体产生IL-2、肿瘤坏死因子，活化巨噬细胞和NK细胞；其次力尔凡通过破坏肿瘤细胞DNA杀死肿瘤细胞，对原发性、移植性肿瘤有较强的杀伤和抑制作用，清除PBMC中可能残存的肿瘤细胞；血清替代物为合成的细胞营养因子，在细胞培养过程中可以替代患者自身的血浆使用，避免血浆质量不佳及不足的缺点，可以稳定培养工艺及产能。
在本发明一实施例中，所述完全培养基B液包括：10μg/ml～100ug/ml胸腺法新、1000μg/ml～5000U/ml的IL-2、10μg/ml～100ng/ml的IL15及2％～5％的血清替代物。
可以理解地，胸腺法新可以增强NK细胞的聚集及其细胞毒性增强。同时增提高白介素2的分泌水平；IL-2/IL-15具有相似结构的细胞因子，能够有效调节T细胞和NK细胞的活化和增殖，IL-2为免疫细胞培养必须的刺激因子，缺乏IL-2细胞发生皱缩及凋亡；血清替代物为合成的细胞营养因子，在细胞培养过程中可以替代患者自身的血浆使用，避免血浆质量不佳及不足的缺点，可以稳定培养工艺及产能。
在本发明一实施例中，所述完全培养基C液包括：1％～3％的血清替代物、1000μg/ml～2000U/ml的IL-2及1μg/ml～10ug/ml的LacNAC。
可以理解地，血清替代物为合成的细胞营养因子，在细胞培养过程中可以替代患者自身的血浆使用，避免血浆质量不佳及不足的缺点，可以稳定培养工艺及产能；IL-2具有相似结构的细胞因子，能够有效调节T细胞和NK细胞的活化和增殖，IL-2为免疫细胞培养必须的刺激因子，缺乏IL-2细胞发生皱缩及凋亡；LacNAC可以促进CD3+CD56+细胞的增殖，减少CD3+CD4+细胞的增殖，促进CD3+CD8+细胞的增殖，同时增强免疫细胞群的抗氧化性，提高活性。
在本发明一实施例中，如图2所示，所述采用淋巴细胞分离液从外周血中分离出单个核细胞的步骤包括：
S11：外周血置于50ml的离心管中，并放入离心机中；
可以理解地，离心机的离心条件为：转速为2000rpm，离心时间为10min，分层后，取下层的到血细胞沉淀；
S12：加入等体积的羟乙基淀粉注射液，摇匀后放入离心机中，离心机的离心力为250g，离心20min；
S13：弃上清，细胞沉淀中加入等体积的PBS，混匀，加入上淋巴细胞分离液800g，离心处理；
可以理解地，离心处理20min，
S14：收集白膜层层于新的离心管中，将PBS加入到含有PBMC的离心管中，混匀后，放入离心机中，离心力为400g，离心洗涤10min，离心洗涤2遍，得单个核细胞。
在本发明一实施例中，如图3所示，所述完全培养基A液悬浮单个核细胞，混匀后，置于培养箱内培养的步骤包括：
S21：完全培养基A液悬浮单个核细胞，混匀，调整细胞浓度为1×106～2×106个细胞/ml；
S22：调整后，置于培养箱内培养。
在本发明一实施例中，所述每2至3天根据细胞计数结果等体积补充完全培养基C液的步骤中，保持细胞密度在1×106～3×106个细胞/ml。
本发明的实施例1
MAK细胞的培养：
外周血置于50ml的离心管中，并放入离心机中，离心机的离心条件为：转速为2000rpm，离心时间为10min，分层后，取下层的到血细胞沉淀。
加入等体积的羟乙基淀粉注射液，摇匀后放入离心机中，离心机的离心力为250g，离心20min；
弃上清，细胞沉淀中加入等体积的PBS，混匀，加入上淋巴细胞分离液，800g，离心20min；
收集白膜层层于新的离心管中，将PBS加入到含有PBMC的离心管中，混匀后，放入离心机中，离心力为400g，离心洗涤10min，离心洗涤2遍。
完全培养基A液悬浮单个核细胞，计数，接种密度为2.0*106/ml,混匀后培养箱内培养3天，三天无需观察、补液等操作；
3天后向培养液中添加等体积的完全培养基B液，混匀后培养箱内继续培养，培养液总体积超过200ml时，转入细胞培养袋内培养；
每2～3天根据细胞计数结果等体积补充完全培养基C液，维持细胞密度为1.5～2*106/ml；
培养16天获得CD3-CD56+、CD3+CD56+为主要效应细胞的混合免疫细胞群。
实施例1中制得的MAK的：MAK流式表型检测：
收集培养16天MAK细胞悬液2ml，2000rpm，离心时间为10min去上清，PBS清洗细胞2遍，计数，分5管检测，5*105/管，200ul/管。①空白管、②阴性对照管、③CD3FITC/CD19PE、④CD3FITC/CD4PE、⑤CD3FITC/CD8PE/CD56APC，依次朝向五个检测管中加入检测抗体，混匀，常温避光30min后，加入PBS清洗2遍，弃上清，加入500ulPBS悬浮，混匀，流式细胞仪检测各细胞群表达。
如图4所示，MAK细胞群以CD3-CD56+和CD3+CD56+(CD3+CD8+CD56+)细胞为主，含有少量的CD3+CD4<5％，不含有其他细胞群。
实施例1中制得的MAK的：MAK广谱杀伤毒性检测：
收集对数生长期的11种荧光素酶标记的肿瘤细胞，PBS清洗2遍，调整细胞密度6*104/ml，加入96孔板中，按效靶比10:1和5:1的比例收集MAK免疫细胞，PBS清洗2遍，计数，调整细胞密度至6*105/ml和3*105/ml，分别加入到96孔板中，与肿瘤细胞共孵育24h后，加检测液，上化学发光微孔检测仪进行杀伤毒性检测；
表1 MAK对不同肿瘤细胞的杀毒性
10:1 5:1
Bel7402-luc 93.84±3.52a 91.22±4.31a
MCF-7-luc 96.12±4.29a 91.07±5.76a
NCI-H446-luc 85.96±4.90a 74.94±4.69a
769-P-luc 88.60±8.46a 78.31±10.97a
MKN45-luc 96.04±4.95a 90.41±6.49a
QGY-7701-luc 90.16±8.02a 84.09±8.32a
GBC-SD-luc 26.01±5.52c 11.17±3.76c
QBC939-luc 85.19±12.18a 79.02±13.76a
HUH7-luc 89.80±6.96a 83.36±12.33a
A549/t-luc 46.64±20.01b 27.55±16.91b
HepG2-luc 96.91±4.92a 94.88±6.43a
由表1和图5、图6所示，可知MAK对肿瘤细胞具有广谱杀伤作用，对各种肿瘤均表现较强的杀伤毒性，对肝癌细胞HepG2的杀伤毒性最高，对人非小细胞肺癌A549和人胆囊癌细胞GBC的敏感性略低。
实施例1制备的MAK分别与CIK、NK进行活性对比：
取三份健康的外周血，分别进行MAK、CIK、NK细胞培养，培养16天进行流式表型检测、酶联免疫法IFN-r分泌能力检测、免疫细胞不同效靶比对HepG2-luc杀伤毒性检测。
表2 MAK、CIK、NK的细胞表型、细胞因子、杀伤毒性对比表(CD3-CD19+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+、CD3+CD56+为细胞表型对比列，IFN-r为细胞因子对比列，10:1、5:为杀伤毒性对比列)
Figure BDA0003863535640000091
Figure BDA0003863535640000101
由表2和图7的结果显示：MAK、CIK、NK细胞群存在显著性差异，CIK高表达CD3+CD56+，NK高表达CD3-CD56+，CIK高表达CD3-CD56+和CD3+CD56+，各亚群存在显著性差异，P<0.05；IFN-r分泌能力存在显著性差异MAK>NK>CIK，P<0.05；杀伤毒性存在显著性差异MAK>NK>CIK，P<0.05。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种临床级混合型免疫细胞的制备方法，其特征在于，其步骤包括：
采用淋巴细胞分离液从外周血中分离出单个核细胞；
完全培养基A液悬浮单个核细胞，混匀后，置于培养箱内培养；
培养后，向培养液中添加等体积的完全培养基B液，混匀后，置于培养箱内继续培养；
每2至3天根据细胞计数结果等体积补充完全培养基C液；
培养16天后，获得CD3-CD56+、CD3+CD56+为主要效应细胞的混合免疫细胞群。
2.根据权利要求1所述的临床级混合型免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述完全培养基A液包括：含有1μg/ml～5ug/ml的CD16单抗的SCGMNK培养基、20μg/ml～100μg/ml的力尔凡及2％～5％的血清替代物。
3.根据权利要求1所述的临床级混合型免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述完全培养基B液包括：10μg/ml～100ug/ml胸腺法新、1000μg/ml～5000U/ml的IL-2、10μg/ml～100ng/ml的IL15及2％～5％的血清替代物。
4.根据权利要求1所述的临床级混合型免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述完全培养基C液包括：1％～3％的血清替代物、1000μg/ml～2000U/ml的IL-2及1μg/ml～10ug/ml的LacNAC。
5.根据权利要求1所述的临床级混合型免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述采用淋巴细胞分离液从外周血中分离出单个核细胞的步骤包括：
外周血置于50ml的离心管中，并放入离心机中；
加入等体积的羟乙基淀粉注射液，摇匀后放入离心机中，离心机的离心力为250g，离心20min；
弃上清，细胞沉淀中加入等体积的PBS，混匀，加入上淋巴细胞分离液800g，离心处理；
收集白膜层层于新的离心管中，将PBS加入到含有PBMC的离心管中，混匀后，放入离心机中，离心力为400g，离心洗涤10min，离心洗涤2遍，得单个核细胞。
6.根据权利要求1所述的临床级混合型免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述完全培养基A液悬浮单个核细胞，混匀后，置于培养箱内培养的步骤包括：
完全培养基A液悬浮单个核细胞，混匀，调整细胞浓度为1×106～2×106个细胞/ml；
调整后，置于培养箱内培养。
7.根据权利要求1所述的临床级混合型免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述每2至3天根据细胞计数结果等体积补充完全培养基C液的步骤中，保持细胞密度在1×106～3×106个细胞/ml。
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