CN109402053A - 一种外周血来源单个核细胞的分离及诱导培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种外周血来源单个核细胞的分离及诱导培养方法，属于生物技术的细胞培养领域。所述方法包括：采集外周血，得到外周血来源单个核细胞；将细胞接种到包含RetroNectin和CD3Mab的培养器皿中，加入无血清细胞培养基培养。本发明无血清细胞培养基包含谷氨酰胺、巯基乙醇和IFN‑γ，以及转铁蛋白、胰岛素、丙酮酸钠、胆固醇，可以促进单个核细胞大量扩增，获得足够数量的外周血来源单个核细胞。本发明同现有技术相比，采用先包被RetroNectin和CD3抗体，后加入INF‑γ、IL‑2以及SUPERGROW细胞培养添加物，通过包被使得细胞更持久的接触抗体，用量少、激活效果更好。

Description

一种外周血来源单个核细胞的分离及诱导培养方法
技术领域
本发明属于生物技术的细胞培养领域，具体涉及一种外周血来源单个核细胞的分离及诱导培养方法。
背景技术
免疫细胞，泛指能产生免疫应答的细胞，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、杀伤细胞、自然杀伤细胞等。目前，肿瘤和病毒的免疫治疗技术慢慢地应用到临床上。如肿瘤过继免疫疗法和“癌症疫苗”等，这些方法主要通过采集宿主的自体免疫细胞，然后经过体外诱导刺激、扩增培养，然后回输来提高患者的免疫能力，这些细胞主要有CIK细胞、NK细胞、DC细胞、DC-CIK细胞等。
但对于癌细胞病人来说，普遍存在免疫系统低下，不能有效地识别、杀灭癌症细胞的情形；另一方面，癌症细胞大量增殖，会进一步抑制患者的免疫功能；此外，癌症细胞有多种机制来逃脱免疫细胞的识别与杀伤。癌症的免疫治疗就是借助分子生物学技术和细胞工程技术，提高癌症的免疫原性，给机体补充足够数量的功能正常的免疫细胞和相关分子，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，提高癌症对机体抗癌症免疫效应的敏感性，在体内、外诱导癌症特异性和非特异性效应细胞和分子，达到最终清除癌症的目的。
外周血是除骨髓之外的血液，来源丰富，采集方便。通过外周血分离培养的免疫细胞具有增殖速度快、安全性、持久性、适应性、全身性等特点，与传统的放疗等方法相比，通过主动免疫能够激发全身性的抗肿瘤效应，作用范围更加广泛，特别适用于多发病灶或有广泛转移的恶性肿瘤；副作用很小。
目前免疫细胞主要来源于脐血、外周血、骨髓，但是脐血和骨髓来源的免疫细胞在体内存活率低、抗凋亡能力差、容易产生不良反应、安全性较差。而且同量的脐血、外周血、骨髓血中，从脐血和骨髓血中分离的免疫细胞较少。
而现有技术中分离培养外周血来源的免疫细胞时，常规方法通常效率低下，扩增能力不高，不容易获得足够的免疫细胞；此外，细胞活性低、在宿主体内的免疫功能达不到预期。此外，现有外周血来源的细胞分离方法中，不能充分分离红细胞和免疫细胞，获得的细胞诱导后状态不是很好。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高机体免疫功能的外周血来源单个核细胞的分离及诱导培养方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种外周血来源单个核细胞的分离及诱导培养方法，包括下列步骤：
(1)无菌采集外周血，进行抗凝处理。
(2)加入淋巴细胞分离液，500×g～1500×g离心5～15min，取上层血浆和白膜层；再400×g～800×g低速离心5～15min，得到的细胞沉淀为外周血来源单个核细胞。
外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，包含免疫细胞、单核细胞(monocyte)、树突状细胞和其它少量细胞。
本发明中采用的淋巴细胞分离液是Lymphoprep分离液，STEMCELL Technologies公司生产。本领域技术人员也可以采用别的淋巴细胞分离液。
先高速离心，便于分离免疫细胞和红细胞，如果不先高速，那么获得的免疫细胞中会混入较多红细胞，影响结果；再低速的目的是，对出于免疫细胞的保护，因为已经高速分离了免疫细胞，那么没必要再高速。
(3)将细胞接种到培养器皿中，所述培养器皿有包含RetroNectin和CD3Mab的缓冲液；
本发明中采用的RetroNectin购自日本宝日公司，CD3Mab购自BD公司，作用是提高细胞的增殖速率，而且RetroNectin参与细胞分化、附着；并且增加CD3Mab与免疫细胞的接触，进一步提高细胞的增长速度。RetroNectin和CD3Mab协同作用，效果佳。
本发明同现有技术相比，采用先包被RetroNectin和CD3抗体，后加入INF-γ、IL-2以及SUPERGROW细胞培养添加物，通过包被使得细胞更持久的接触抗体，用量少、激活效果更好。
(4)加入无血清细胞培养基，所述无血清细胞培养基的成分包括2～10mmol/L谷氨酰胺、30～70μmol/L巯基乙醇、500～1500u/mL的IFN-γ、0～800μ/ml转铁蛋白、0～800μ/ml胰岛素、0～800μ/ml丙酮酸钠、0～5μg/ml胆固醇；在37℃，5％CO2培养箱中培养。
无血清细胞培养基的作用是供给细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。
其中，无血清细胞培养基中，谷氨酰胺的作用是作为培养细胞的能量来源，参与细胞的代谢，浓度过大容易产生对细胞有毒的氨，浓度过小就不足以提供足够的能量来源。
在某些细胞生长分裂的过程中，会向培养基中释放氧自由基，氧自由基积累到一定程度的时候，是有毒的，可以破坏细胞膜和细胞器膜，从而杀死细胞，使得细胞达不到很高的密度，巯基乙醇的作用是作为一种强还原剂，中和掉细胞培养基中积累的氧自由基，这样可以使得细胞分裂到很高的密度而不死亡，从而便于进行细胞增殖实验。
IFN-γ的作用是免疫调节，大剂量干扰素会产生明显的免疫抑制作用，而低剂量干扰素则能产生免疫增强的效果。本发明研究发现在培养基中控制IFN-γ的浓度在500～1500u/mL为佳。后续在诱导阶段再继续添加低剂量的干扰素促进T细胞的增殖与活化，与IL-2协同作用。
转铁蛋白的作用是为细胞分化和细胞代谢提供所需的铁，合适的浓度有利于细胞的生长。
胰岛素的作用是促进细胞的增殖，调节细胞的吸收能力、储存、利用能力。
丙酮酸钠的作用是替代碳源的作用，参与细胞营养代谢。
胆固醇是合成细胞膜的必要成分。
根据发明人的研究发现，谷氨酰胺、巯基乙醇和IFN-γ是必须添加的，而转铁蛋白、胰岛素、丙酮酸钠、胆固醇可以选择性添加。从本发明实施例可见，培养基中除了谷氨酰胺、巯基乙醇和IFN-γ以外，再添加转铁蛋白、胰岛素后，培养效果最佳。
本发明的无血清细胞培养基可以促进单个核细胞大量扩增，获得足够数量的外周血来源单个核细胞。
(5)第0天加入500～1500u/mL的IFN-γ，2～6％的SUPERGROW细胞培养添加物，24h后加入500～1500u/mL IL-2、2～6％的SUPERGROW细胞培养添加物。
SUPERGROW细胞培养添加物中富含细胞生长所需生长因子，是免疫细胞扩增培养的天然营养物。
IL-2促进T细胞的增殖与活化。IFN-γ上调外周血免疫细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。所以需要先加入IFN-γ，后再加入IL-2，两者添加顺序不可颠倒。利用两者协同作用，使得细胞被诱导后，提高细胞在宿主体内的免疫功能。
(6)适时转移细胞到新的培养器皿中，并补充无血清细胞培养基、IL-2以及SUPERGROW细胞培养添加物。
刚开始培养体积不是很大，在培养瓶中更好操作，而培养瓶有容量要求，如300ml的容量瓶，随着细胞培养时间推移，培养液容易溢出到瓶口，造成污染；所以当培养体积大于300mL后，将培养瓶中的细胞完全吹打下来后转移到培养袋，而培养袋容量是2900ml，可以满足需要。每2～3天补充无血清细胞培养基、IL-2以及SUPERGROW细胞培养添加物，控制细胞浓度。细胞浓度过大时，细胞会死亡，可以通过加入培养基的方法，稀释细胞浓度。
如果细胞数量达到100个亿就说明已经培养好了，用Countstar细胞计数仪进行计数。所获得的细胞，将其加入到250ml 0.9％生理盐水中，就得到外周血单个核细胞产品。所述细胞产品可以通过静脉注射的方式对患者进行治疗。
优选的，抗凝处理是采用肝纳素或EDTA进行抗凝处理。
优选的，淋巴细胞分离液需要调整到室温后，再加入到外周血中。如从冰箱拿出要做回温处理。
优选的，缓冲液中RetroNectin的浓度为50～100mg/L，CD3Mab的浓度为5～10mg/L。
优选的，所述无血清细胞培养基的成分包括2～8mmol/L谷氨酰胺、30～50μmol/L巯基乙醇、700～1300u/mL的IFN-γ、0～600μ/ml转铁蛋白、0～600μ/ml胰岛素、0～600μ/ml丙酮酸钠、0～3μg/ml胆固醇。
优选的，第0天以及24h后，SUPERGROW细胞培养添加物的添加量为2～4％，按质量百分比计。
本发明的有益效果是：
本发明方法简单，可以充分分离红细胞和单个核细胞，所获单个核细胞扩增能力强，容易获得足够数量的外周血来源单个核细胞；效果明显，通过诱导培养和后期处理，所述外周血来源单个核细胞在宿主体内免疫功能明显提高。
本发明无血清细胞培养基包含谷氨酰胺、巯基乙醇和IFN-γ，以及转铁蛋白、胰岛素、丙酮酸钠、胆固醇，可以促进单个核细胞大量扩增，获得足够数量的外周血来源单个核细胞。
本发明同现有技术相比，采用先包被RetroNectin和CD3抗体，后加入INF-γ、IL-2以及SUPERGROW细胞培养添加物，通过包被使得细胞更持久的接触抗体，用量少、激活效果更好。IL-2促进T细胞的增殖与活化，IFN-γ上调外周血免疫细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。所以先加入IFN-γ，后再加入IL-2。利用两者协同作用，使得细胞被诱导后，提高在宿主体内的免疫功能。
本发明制备的免疫细胞，细胞毒活性明显高于现有免疫细胞，解决了免疫细胞繁殖能力差、细胞活性低的问题，并大大降低了成本。
附图说明
图1为外周血单个核细胞的形态特征。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
其中，RetroNectin购自日本宝日公司，CD3Mab购自BD公司，SUPERGROW细胞培养添加物购自达科为公司，其他所用化学试剂、细胞因子等，无特殊说明均采购于GIBCO。如下实例中所涉及的检测及评价方法均为本领域技术人员公知的检测、评价方法。
实施例1：
实验组：无菌采集外周血，进行抗凝处理；加入淋巴细胞分离液。1000×g离心12min，取上层血浆和白膜层；然后第二次离心，离心条件为：600×g，10min。用PBS缓冲液重复洗涤两次，600×g，离心5min，然后将获得的单个核细胞接种到包含80mg/L RetroNectin和8mg/L CD3Mab的缓冲液的培养器皿中，用无血清细胞培养基调整其密度至1～2×106个/mL进行培养，于当日加入IFN-γ(1000μ/mL)，5％的SUPERGROW细胞培养添加物，置于37℃和体积分数为5％的CO2培养箱中培养24h，第1天(也即24h后)加入IL-2(1000U/mL)，5％的SUPERGROW细胞培养添加物，以后每2～3天换液1次并补充IL-2和SUPERGROW细胞培养添加物，培养14d，收获细胞。其中所用的无血清细胞培养基成分为：2mmol/L谷氨酰胺、和50μmol/L巯基乙醇、1000U/mL的IFN-γ、400μ/ml转铁蛋白、400μ/ml胰岛素。
对照组：无菌采集健康脐血，处理方法同上。
(1)光学显微镜下动态观察细胞生长情况
在光学显微镜下连续观察免疫细胞发育过程中形态学变化。
(2)免疫细胞增殖测定
以台盼蓝拒染法，用细胞计数板分别于第1天和第14天计数两组免疫细胞数量，每一样本重复计数三次，取平均值。
(3)流式细胞仪检测细胞表型
收集培养14天的细胞，用PBS液调细胞浓度为2～5×106个/ml，加入离心管，100ul/管；分别加入CD3+CD56+双标记荧光抗体及阴性对照各10ul，置暗处孵育15min，PBS液洗涤1次，然后用流式细胞仪检测细胞表型。
(4)细胞毒活性测定
MTT法测定培养14天免疫细胞对靶细胞的杀伤活性。效应细胞为培养14天的免疫细胞。效应细胞(效应细胞液为含有培养14天的免疫细胞的液体)调整密度至1×106个/ml。取靶细胞K562，LOVO，调密度至1×105个/ml。取96孔板，分三组。①靶细胞组：加入50ul培养液和50ul的靶细胞液，且每组靶细胞做6个复孔。②效应细胞组：加入50ul培养液和50ul效应细胞液，也做6个复孔。③实验组：加入50ul的靶细胞液和50ul的效应细胞液，同样做6个复孔。37℃、5％CO2孵育24h后，每个孔加入10ul MTT溶液(5mg/ml)，37℃、5％CO2孵育2h，终止培养，每孔加入0.4％的酸化异丙醇100ul，振荡5min，静置5min。在酶标仪上测定各组在630nm处吸光度值(结果用6孔均值表示)。
杀伤活性＝[(靶细胞A值+效应细胞A值-实验组A值)/靶细胞A值]×100％
(5)统计学处理
采用SPSS软件进行处理，用X±S表示，应用重复测量的方差分析和最小显著(LSD)t检验，以α＝0.05作为显著性水准。
(6)结果
6.1外周血单个核细胞的形态特征
刚分离的外周血单个核细胞呈悬浮生长，大小均匀，折光性一致，加入细胞因子后培养至第4～5天时，可见细胞体积逐渐增大，出现细胞集落，培养至第12天细胞的胞体和胞核均增大，胞浆增多，胞核密度加强，胞质内可见分泌颗粒，胞膜光滑，未见凸起，见图1。
6.2细胞增殖能力
实验组细胞前4天已开始增殖，其后进入高速增长，每3天增长3～4倍，至第14天增长112倍，而对照组细胞增长缓慢，至第14天增长25倍，两组细胞增殖能力比较随时间变化有显著差异(P＜0.05)。
6.3细胞表型分析
分别比较两组细胞，结果见表1。
表1两组细胞的细胞表型分析比较(％，n＝10)
表1结果显示：两组不同方法诱导的细胞表型CD3、CD56差异明显，(P＞0.05)。
6.4各组效应细胞对靶细胞的杀伤比例
分别比较两种不同来源(外周血来源和脐血来源)的单个核细胞在经过诱导培养14天后对K562及LOVO的杀伤活性，效：靶分别为20:1和10:1，结果见表2。
表2诱导14天免疫细胞对K562及LOVO的杀伤活性(％，n＝10)
通过观察和分析，本发明通过外周血来源细胞中获得的单个核细胞接种到包含RetroNectin和CD3Mab的缓冲液的培养器皿中及在培养阶段加入INF-γ、IL-2以及SUPERGROW细胞培养添加物，能显著提高效应细胞群活化效率和扩增效率。经检测，活化及扩增效率以及杀伤活性较现有方法明显提高，如第14天增长112倍。表2中14天两来源的免疫细胞对靶细胞的杀伤活性显示有所差异，所以说明外周血来源的单个核细胞经过本发明的诱导培养，效果更好，优于其他来源的单个核细胞。
实施例2：
方法如实施例1所述，对实验组细胞设置不同的培养天数，其中培养天数相应增加，在28天的时候，细胞扩增达到最大倍数。分别收取0、14、28、42天培养的细胞，用流式细胞仪分析不同培养时间的细胞表型变化，结果见表3。
表3不同培养时间细胞的扩增情况
表3结果显示：第28天细胞扩增达到最高值。所以，增加培养时间，可以增加细胞的获得率。
实施例3：
方法如实施方式1所述，不同之处在于，培养基的组分为：8mmol/L谷氨酰胺、和30μmol/L巯基乙醇、IFN-γ1000U/mL。
结果见表4。
实施例4：
无菌采集外周血，进行抗凝处理；加入淋巴细胞分离液，1000×g离心12min，取上层血浆和白膜层；然后第二次离心，离心条件为：600×g，10min。用PBS缓冲液重复洗涤两次，600×g，5min离心。用细胞培养基调整至2×106个/mL进行培养，于当日加入IFN-γ(1000μ/mL)，置于37℃和体积分数为5％的CO2培养箱中培养24h，第1天加入IL-2(500U/mL)、2～6％的SUPERGROW细胞培养添加物，以后每3天换液1次，培养14d，收获细胞。其中所用培养基成分为：2mmol/L谷氨酰胺、50μmol/L巯基乙醇、1000U/mL的IFN-γ、400μ/ml转铁蛋白、400μ/ml胰岛素。
结果见表4。
实施例5：
方法如实施例1所述，不同之处在于，培养基的组分为：2mmol/L谷氨酰胺、50μmol/L巯基乙醇、1000U/mL的IFN-γ，400μ/ml转铁蛋白、400μ/ml胰岛素。
结果见表4。
实施例6：
方法如实施例1所述，不同之处在于，培养基的组分为：2mmol/L谷氨酰胺、50μmol/L巯基乙醇、1000U/mL的IFN-γ，400μ/ml转铁蛋白、400μ/ml胰岛素、400μ/ml丙酮酸钠、1.5μg/ml胆固醇。
结果见表4。
表4各实施例细胞生长和杀伤对比情况
实验组 14天的扩增倍数 细胞杀伤效率％
实施例1 112.1±3.03 56.87±4.68
实施例3 108.2±2.35 52.67±7.48
实施例4 104.1±5.41 54.41±8.37
实施例5 106.3±4.39 52.86±7.29
实施例6 110.8±3.73 53.62±6.38
通过表4可知，几种情况下，14天的外周血来源单个核细胞的扩增倍数均能达到100倍以上；细胞的杀伤效率均能达到接近60％左右，说明细胞经过该方法诱导，外周血来源单个核细胞的扩增效率和杀伤效率更好。
对比例1
传统的培养方法是：
采集外周血50～100ml，淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90％以上的PBMC；将PBMC按1～2×106/ml的浓度悬浮于市售无血清培养液中，加入1,000U/ml的重组人IFN-g，37℃，5％CO2培养箱中培养；24h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300U/ml的重组人IL-2，刺激免疫细胞的生长和增殖；每3天半量换液或扩瓶一次，并补加300U/ml重组人IL-2；在培养的第14d，收获免疫细胞。
传统的方法的缺点是细胞增长速度慢，成本高，而且获得细胞状态差，杀伤活性低。
对比例2
同实施例1，不同之处在于，在培养细胞阶段，不添加IL-2，结果培养的免疫细胞增殖缓慢。
对比例3
同实施例1，不同之处在于，INF-γ的添加时间为第二天，结果获得的细胞免疫功能低下，杀伤活性不强。
对比例4
同实施例1，不同之处在于，培养阶段，不添加浓度为50～100mg/L的RetroNectin和浓度为5～10mg/L的CD3Mab，结果获得的免疫细胞活化能力不足，增长缓慢。
对比例5
同实施例1，不同之处在于，在培养细胞阶段，不添加SUPERGROW细胞培养添加物，结果培养的免疫细胞增长速率变慢，活率不高。
对比例的结果见表5。
表5对比例细胞生长和杀伤对比情况
对比例 14天的扩增倍数 细胞杀伤效率％
对比例1 90.1±5.12 36.29±3.58
对比例2 93.4±6.2 34.74±6.47
对比例3 98.6±3.16 32.48±5.54
对比例4 88.1±4.70 34.16±3.32
对比例5 96.5±5.37 32.81±6.29
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种外周血来源单个核细胞的分离及诱导培养方法，其特征在于：包括下列步骤：
无菌采集外周血，进行抗凝处理；
加入淋巴细胞分离液，500×g～1500×g离心5-15min，取上层血浆和白膜层；再400×g～800×g低速离心5-15min，得到细胞沉淀；
将细胞接种到培养器皿中，所述培养器皿有包含RetroNectin和CD3Mab的缓冲液；
加入无血清细胞培养基，所述无血清细胞培养基的成分包括1～10mmol/L谷氨酰胺、30～70μmol/L巯基乙醇、500～1500u/mL的IFN-γ、0～800μ/ml转铁蛋白、0～800μ/ml胰岛素、0～800μ/ml丙酮酸钠、0～5μg/ml胆固醇；进行培养；
第0天加入500～1500u/mLIFN-γ、2～6％的SUPERGROW细胞培养添加物，24h后加入500～1500u/mL IL-2、2～6％SUPERGROW细胞培养添加物；
适时转移细胞到新的培养器皿中，并补充无血清细胞培养基、IL-2以及SUPERGROW细胞培养添加物。
2.根据权利要求1所述的分离及诱导培养方法，其特征在于：抗凝处理是采用肝纳素或EDTA进行抗凝处理。
3.根据权利要求1所述的分离及诱导培养方法，其特征在于：淋巴细胞分离液需要调整到室温后，再加入到外周血中。
4.根据权利要求1所述的分离及诱导培养方法，其特征在于：缓冲液中RetroNectin的浓度为50～100mg/L，CD3Mab的浓度为5～10mg/L。
5.根据权利要求1所述的分离及诱导培养方法，其特征在于：所述无血清细胞培养基的成分包括2～8mmol/L谷氨酰胺、30～50μmol/L巯基乙醇、700～1300u/mL的IFN-γ、0～600μ/ml转铁蛋白、0～600μ/ml胰岛素、0～600μ/ml丙酮酸钠、0～3μg/ml胆固醇。
6.根据权利要求1所述的分离及诱导培养方法，其特征在于：第0天以及24h后，SUPERGROW细胞培养添加物的添加量为2～4％，按质量百分比计。
7.一种外周血来源单个核细胞，其特征在于：所述外周血来源单个核细胞是由权利要求1-6任一项分离得到。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110241079A (zh) * 2019-07-25 2019-09-17 上海轩锋生物科技有限公司 一种高纯度的pbmc分离方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102641298A (zh) * 2012-05-15 2012-08-22 祁岩超 一种预防和治疗肿瘤的效应细胞组合及其制备方法
CN106635983A (zh) * 2016-10-19 2017-05-10 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存cik细胞的方法及得到的cik细胞
WO2018022646A1 (en) * 2016-07-25 2018-02-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing modified natural killer cells and methods of use
US20180264040A1 (en) * 2015-04-23 2018-09-20 Baylor College Of Medicine Nkt-cell subset for in vivo persistence and therapeutic activity and propagation of same
CN108617638A (zh) * 2017-03-22 2018-10-09 拜西欧斯（北京）生物技术有限公司 组织和/或细胞冻存保护液及其制备与应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102641298A (zh) * 2012-05-15 2012-08-22 祁岩超 一种预防和治疗肿瘤的效应细胞组合及其制备方法
US20180264040A1 (en) * 2015-04-23 2018-09-20 Baylor College Of Medicine Nkt-cell subset for in vivo persistence and therapeutic activity and propagation of same
WO2018022646A1 (en) * 2016-07-25 2018-02-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing modified natural killer cells and methods of use
CN106635983A (zh) * 2016-10-19 2017-05-10 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存cik细胞的方法及得到的cik细胞
CN108617638A (zh) * 2017-03-22 2018-10-09 拜西欧斯（北京）生物技术有限公司 组织和/或细胞冻存保护液及其制备与应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110241079A (zh) * 2019-07-25 2019-09-17 上海轩锋生物科技有限公司 一种高纯度的pbmc分离方法

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