CN105062968B - 一种dc-cik细胞培养试剂及其培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种DC‑CIK细胞培养试剂及其培养方法。该培养试剂包括DC细胞培养试剂、CIK细胞培养试剂和共培养试剂；DC细胞培养试剂包括第一DC细胞培养试剂和第二DC细胞培养试剂；第一DC细胞培养试剂包括GM‑SCF和IL‑4；第二DC细胞培养试剂包括GM‑SCF、IL‑4、TNF‑α和MDC。通过本发明提供的培养方法得到的DC细胞和DC‑CIK细胞量大，DC‑CIK有效细胞CD3+CD56+比例高，对肿瘤的杀伤能力更强。

Description

一种DC-CIK细胞培养试剂及其培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种DC-CIK细胞培养试剂及其培养方法。

背景技术

肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。新生物一旦形成，不因病因消除而停止生长，他的生长不受正常机体生理调节，而是破坏正常组织与器官，这一点在恶性肿瘤尤其明显。与良性肿瘤相比，恶性肿瘤生长速度快，呈浸润性生长，易发生出血、坏死、溃疡等，并常有远处转移，造成人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等，最终造成患者死亡。

恶性肿瘤是严重威胁人们生命健康的第一病害，在继切除手术、放疗、化疗之后，肿瘤免疫细胞治疗是临床用于肿瘤治疗的第四大疗法，它是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。在现有的免疫细胞治疗中有相继出现LAK细胞疗法、TIL细胞疗法、DC细胞疗法、CIK细胞疗法和DC-CIK联合疗法，在肿瘤治疗中发挥举足轻重的作用。

树突状细胞(Dendritic cells,DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。DC细胞是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，当细胞数量达到一定数量后回输给病人，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。

CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞(自然杀伤细胞)样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。

DC和CIk共培养可以同时促进CIK细胞和DC细胞的增殖和免疫功能。化疗后应用DC-CIK细胞可有效抑制肿瘤细胞生长，甚至使肿瘤完全消失；而且DC-CIK细胞的抗肿瘤效应对集体免疫系统功能不产生危害，在当前对肿瘤特异性抗原了解相对较少的情况下，应用DC-CIK细胞作为肿瘤放化疗和手术后的辅助治疗有重要的临床意义。

目前，DC和CIk共培养方法为：1、外周血分离单个核细胞；2、无血清培养基培养1-3h，贴壁细胞添加自体血清致敏培养DC细胞，第6-7天，添加肿瘤坏死因子培养；未贴壁细胞按常规CIK细胞培养方案培养；3、DC细胞和CIK细胞混合培养5-8天，收获细胞。专利公开号为CN 103981144A、CN 103255105A、CN 104357394A、CN 102978161A等专利也均公开了DC-CIK细胞共培养方法。

然而，上述培养方法存在一定的缺陷：DC细胞培养过程中，初始贴壁细胞易向巨噬细胞分化，收获的DC细胞很少；肿瘤病人血清致敏DC细胞，抗原致敏性弱，DC细胞抗原递呈能力低，获得的DC-CIK细胞杀伤活性不高。因此，急需提供一种DC细胞收获量大、对肿瘤细胞杀伤能力强的DC-CIK细胞共培养方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种DC-CIK细胞培养试剂及其培养方法。通过本发明提供的培养方法得到的DC细胞和DC-CIK细胞量大，第7天DC细胞可到(2.68～3.08)×10⁷/mL，活率能够保持在95.2％～97.2％；第14天DC-CIK细胞可到(1.88～2.08)×10¹⁰/mL，活率能够保持在95.8％～96.2％；通过本发明提供的培养方法得到的DC-CIK有效细胞CD3+CD56+比例高，可达65.7％，对肿瘤的杀伤能力更强。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种DC-CIK细胞培养试剂，包括DC细胞培养试剂、CIK细胞培养试剂和共培养试剂；

DC细胞培养试剂包括第一DC细胞培养试剂和第二DC细胞培养试剂；第一DC细胞培养试剂包括GM-SCF和IL-4；第二DC细胞培养试剂包括GM-SCF、IL-4、TNF-α和MDC；

CIK细胞培养试剂包括第一CIK细胞培养试剂和第二CIK细胞培养试剂；第一CIK细胞培养试剂包括INF-γ；第二CIK细胞培养试剂包括OKT-3、IL-1α和IL-2；

共培养试剂包括IL-2。

本发明通过改进DC细胞和CIK细胞培养过程中细胞因子的种类和浓度，促进了DC和DC-CIK细胞数量的增殖，并保持较好的细胞活率，DC-CIK细胞具有更好的抗肿瘤效果。

作为优选，还包括含有血浆的无血清培养基。

作为优选，无血清培养基中血浆的体积百分含量为5％～15％。

在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基中血浆的体积百分含量为5％。

在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基中血浆的体积百分含量为10％。

在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基中血浆的体积百分含量为15％。

作为优选，血浆为自体血浆。

本发明还提供了一种DC-CIK细胞的培养方法，包括如下步骤：

步骤1：将单个核细胞进行细胞培养，获得贴壁细胞和悬浮细胞；

步骤2：采用第一DC细胞培养试剂培养贴壁细胞，培养4～6天后，采用第二DC细胞培养试剂培养24-48h，得到DC细胞；第一DC细胞培养试剂为包含GM-SCF和IL-4的培养基，第二DC细胞培养试剂为包含GM-SCF、IL-4、TNF-α和MDC的培养基；

采用第一CIK细胞培养试剂培养悬浮细胞，培养1～3天后，采用第二CIK细胞培养试剂继续培养7～8天，继续培养过程中每隔3天补加IL-2，获得CIK细胞；第一CIK细胞培养试剂为包含INF-γ的培养基，第二CIK细胞培养试剂为包含OKT-3、IL-1α和IL-2的培养基；

步骤3：将DC细胞和CIK细胞混合，采用共培养试剂培养5～8天，得到DC-CIK细胞；共培养试剂为包含IL-2的培养基。

作为优选，第一DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为100～1000U/mL，IL-4的浓度为100～1000U/mL。

在本发明提供的一些实施例中，第一DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为100U/mL，IL-4的浓度为100U/mL。

在本发明提供的另一些实施例中，第一DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为500U/mL，IL-4的浓度为500U/mL。

在本发明提供的另一些实施例中，第一DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为1000U/mL，IL-4的浓度为1000U/mL。

作为优选，第二DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为50～500U/mL，IL-4的浓度为50～500U/mL，TNF-α的浓度为100～1000U/mL，MDC的浓度为1～20ng/mL。

在本发明提供的一些实施例中，第二DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为50U/mL，IL-4的浓度为50U/mL，TNF-α的浓度为100U/mL，MDC的浓度为1ng/mL。

在本发明提供的另一些实施例中，第二DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为200U/mL，IL-4的浓度为200U/mL，TNF-α的浓度为500U/mL，MDC的浓度为4ng/mL。

在本发明提供的另一些实施例中，第二DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为500U/mL，IL-4的浓度为500U/mL，TNF-α的浓度为1000U/mL，MDC的浓度为20ng/mL。

作为优选，第一CIK细胞培养试剂中，INF-γ的浓度为500～2000U/mL。

在本发明提供的一些实施例中，第一CIK细胞培养试剂中，INF-γ的浓度为500U/mL。

在本发明提供的另一些实施例中，第一CIK细胞培养试剂中，INF-γ的浓度为1000U/mL。

在本发明提供的另一些实施例中，第一CIK细胞培养试剂中，INF-γ的浓度为2000U/mL。

作为优选，第二CIK细胞培养试剂中，OKT-3的浓度为10～100ng/mL、IL-1α的浓度为50～200U/mL，IL-2的浓度为100～1000U/mL。

在本发明提供的一些实施例中，第二CIK细胞培养试剂中，OKT-3的浓度为10ng/mL、IL-1α的浓度为50U/mL，IL-2的浓度为100U/mL。

在本发明提供的另一些实施例中，第二CIK细胞培养试剂中，OKT-3的浓度为20ng/mL、IL-1α的浓度为100U/mL，IL-2的浓度为500U/mL。

在本发明提供的另一些实施例中，第二CIK细胞培养试剂中，OKT-3的浓度为100ng/mL、IL-1α的浓度为200U/mL，IL-2的浓度为1000U/mL。

作为优选，共培养试剂中，IL-2的浓度为100～500U/mL。

在本发明提供的一些实施例中，IL-2的浓度为100U/mL。

在本发明提供的另一些实施例中，IL-2的浓度为200U/mL。

在本发明提供的另一些实施例中，IL-2的浓度为500U/mL。

作为优选，步骤2中维持细胞密度为(5～20)×10⁵/mL。

在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基为Lonza的X-VIVO15、BioWiseTech的BICBM0001或PC-1TM培养基。

在本发明提供的一些实施例中，DC细胞培养试剂、CIK细胞培养试剂或共培养试剂中的基础培养基为含有血浆的无血清培养基。

作为优选，无血清培养基中血浆的体积百分含量为5％～15％。

在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基中血浆的体积百分含量为5％。

作为优选，血浆为自体血浆。

在本发明提供的一些实施例中，DC-CIK细胞的培养方法包括如下步骤：

(一)单个核细胞分离：

1.将外周血或脐带血离心，吸取上层血浆，经灭活后，离心，得到上清血浆；

2.取下层血液，加入生理盐水重悬，按稀释后的血液：Ficoll分离液为2:1，把稀释后的血液缓慢加入到Ficoll分离液上层，使分层清晰；

3.离心，吸取中间白膜层，即为单个核细胞。

(二)DC细胞分离培养

1.获得的单个核细胞加生理盐水稀释后，离心，清洗；

2.加无血清培养基(含5％～15％自体血浆)重悬细胞，按(2～8)×10⁶/mL接种，静置1～5h，获得贴壁细胞；

3.贴壁细胞加生理盐水轻洗1遍，加入含5％～15％自体血浆的无血清培养基，同时添加因子GM-SCF为100～1000U/mL，IL-4为100～1000U/mL进行培养；

4.三天后补加GM-SCF为100～1000U/mL，IL-4为100～1000U/mL，培养至4～6天后换液，同时添加GM-SCF为50～500U/mL，IL-4为50～500U/mL、TNF-α为100～1000U/mL、MDC为1～20ng/mL，培养24～48h，得到DC细胞。

(三)CIK细胞培养

1.取DC细胞培养第2步中未贴壁的细胞(悬浮细胞)调整细胞密度为5-15×10⁵/mL进行CIK培养；

2.第1天添加细胞因子INF-γ500～2000U/mL，自体血浆5％～15％；第2天添加细胞因子OKT-310～100ng/mL、IL-1α50～200U/mL、IL-2100～1000U/mL；

3.每隔3天补加无血清培养基(第1、4天加5％～15％的自体血浆)，维持细胞密度(5～20)×10⁵/mL，并添加100～1000U/mL的IL-2。

(四)DC细胞和CIK细胞共培养

培养至7～8天，DC细胞和CIK细胞混合培养，同时添加100～500U/mL的IL-2，培养5～8天后获得DC-CIK细胞。

本发明提供了一种DC-CIK细胞培养试剂及其培养方法。该培养试剂包括DC细胞培养试剂、CIK细胞培养试剂和共培养试剂；DC细胞培养试剂包括第一DC细胞培养试剂和第二DC细胞培养试剂；第一DC细胞培养试剂包括GM-SCF和IL-4；第二DC细胞培养试剂包括GM-SCF、IL-4、TNF-α和MDC；CIK细胞培养试剂包括第一CIK细胞培养试剂和第二CIK细胞培养试剂；第一CIK细胞培养试剂包括INF-γ；第二CIK细胞培养试剂包括OKT-3、IL-1α和IL-2；共培养试剂包括IL-2。本发明至少具有如下优势之一：

1、通过本发明提供的培养方法得到的DC细胞和DC-CIK细胞量大，第7天DC细胞可到(2.68～3.08)×10⁷/mL，活率能够保持在95.2％～97.2％；第14天DC-CIK细胞可到(1.88～2.08)×10¹⁰/mL，活率能够保持在95.8％～96.2％；

2、通过本发明提供的培养方法得到的DC-CIK有效细胞CD3+CD56+比例高，可达65.7％，对肿瘤的杀伤能力更强。

附图说明

图1示流式细胞仪检测结果；其中，1-1示组A1中阴性对照组检测细胞数量，1-2示组A1中CD3CD56双阴性的细胞含量，1-3示组B2中阴性对照组检测细胞数量，1-4示组B2中CD3CD56双阴性的细胞含量。

具体实施方式

本发明公开了一种DC-CIK细胞培养试剂及其培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语解释：

GM-CSF:GM-CSF(人粒细胞-巨噬细胞集弱刺激因子)，能刺激粒细胞及巨噬细胞等白细胞的增殖、分化及活化作用，从而增强造血功能。它也能增强中性粒细胞，嗜曙红细胞及单核细胞的多种功能。它还能促使效应细胞增强如吞噬细菌及消灭癌细胞等免疫活动。

IL-4：白细胞介素4，是促进B细胞增殖的因子，是T细胞自身分泌的生长因子，在DC细胞培养中，可以抑制铁壁的单个核细胞朝巨噬细胞分化。

TNF-α：肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor，简写TNF)是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一。

INF-α：干扰素家族中的一种，具有抗肿瘤功效。

MDC:巨噬细胞活化因子(macrophage-derived chemokine)，由活化T细胞产生的一种淋巴因子，可招引巨噬细胞至局部，亦可诱发免疫细胞聚集，进行特异性抗原清理，是迟发型超敏反应的介质之一。

IL-2：阿地白介素，主要成份为重组人白细胞介素，为多肽类免疫增强剂。能够诱导干扰素和多种细胞因子的分泌。临床用于肿瘤辅助治疗和癌性胸、腹水的治疗。

IL-1α:是一种细胞因子，属于白细胞介素的一种。它是由活化的巨噬细胞所产生，能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。

OKT-3：CD3抗体，可特异地识别T细胞表面的CD3分子，通过T细胞表面TCR-CD3复合物与APC表面MHC-Ⅱ类分析抗原肽的结合导致T细胞活化并增殖。

INF-γ：干扰素家族中的一种，又称免疫干扰素，是由有丝分裂原刺激T淋巴细胞产生。干扰素是一种高效的抗病毒生物活性物质，又是一种具有广泛免疫调节作用的淋巴因子。

本发明提供的DC-CIK细胞培养试剂及其培养方法中所用试剂、培养基等均可由市场购得。细胞培养所用的无血清培养基为Lonza的X-VIVO15、BioWiseTech的BICBM0001或PC-1TM培养基等。在本实施例中所用无血清培养基为Lonza的X-VIVO15。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 DC-CIK细胞共培养实例

(一)单个核细胞分离

1.外周血或脐带血40mL，500-800g离心10分钟，吸取上层血浆，经56℃灭活30min后，2000-3000g离心5min，上清血浆2-8℃备用；

2.下层血液，加入2倍体积的生理盐水重悬，按稀释后的血液：Ficoll分离液为2:1，把稀释后的血液缓慢加入到Ficoll分离液上层，使分层清晰；

3.500-700g离心15-30min，吸取中间白膜层，即为单个核细胞。

(二)DC细胞分离培养

1.获得的单个核细胞加生理盐水稀释后，按200-400g离心5min，清洗两遍；

2.加无血清培养基(含5％自体血浆)重悬细胞，按2-8×10⁶/mL接种T75培养瓶中静置1-5h，获得贴壁细胞；

3.贴壁细胞加生理盐水轻洗1遍，加入含5％自体血浆的无血清培养基，同时添加因子GM-SCF为100U/mL、IL-4为100U/mL进行培养；

4.三天后补加GM-SCF为100U/mL、IL-4为100U/mL，培养至4-6天后换液，同时添加GM-SCF为50U/mL、IL-4为50U/mL、TNF-α为100U/mL、MDC为1ng/mL，培养48h，得到目的DC细胞。

(三)CIK细胞培养

1.DC细胞培养第2步中未贴壁的细胞转移至另一T75培养瓶中并计数，根据计数结果，调整细胞密度为5-15×10⁵/mL进行CIK培养；

2.第1天添加细胞因子INF-γ500U/mL，自体血浆5％；第2天添加细胞因子OKT-310ng/mL、IL-1α50U/mL、IL-2100U/mL；

3.每隔3天补加无血清培养基(第1、4天加5％的自体血浆)，维持细胞密度5-20×10⁵/mL，并添加100U/mL的IL-2。

(四)DC细胞和CIK细胞共培养

CIK培养至7天，DC细胞和CIK细胞混合培养，同时添加100U/mL的IL-2，培养5天后获得DC-CIK细胞。

实施例2 DC-CIK细胞共培养实例

(一)单个核细胞分离

1.外周血或脐带血40mL，500-800g离心10分钟，吸取上层血浆，经56℃灭活30min后，2000-3000g离心5min，上清血浆2-8℃备用；

2.下层血液，加入2倍体积的生理盐水重悬，按稀释后的血液：Ficoll分离液为2:1，把稀释后的血液缓慢加入到Ficoll分离液上层，使分层清晰；

3.500-700g离心15-30min，吸取中间白膜层，即为单个核细胞。

(二)DC细胞分离培养

1.获得的单个核细胞加生理盐水稀释后，按200-400g离心5min，清洗两遍；

2.加无血清培养基(含10％自体血浆)重悬细胞，按2-8×10⁶/mL接种T75培养瓶中静置1-5h，获得贴壁细胞；

3.贴壁细胞加生理盐水轻洗1遍，加入含10％自体血浆的无血清培养基，同时添加因子GM-SCF为500U/mL、IL-4为500U/mL进行培养；

4.三天后补加GM-SCF为500U/mL、IL-4为500U/mL，培养至4-6天后换液，同时添加GM-SCF为200U/mL、IL-4为200U/mL、TNF-α为500U/mL、MDC为4ng/mL，培养36h，得到目的DC细胞。

(三)CIK细胞培养

1.DC细胞培养第2步中未贴壁的细胞转移至另一T75培养瓶中并计数，根据计数结果，调整细胞密度为5-15×10⁵/mL进行CIK培养；

2.第1天添加细胞因子INF-γ1000U/mL，自体血浆10％；第2天添加细胞因子OKT-320ng/mL、IL-1α100U/mL、IL-2500U/mL；

3.每隔3天补加无血清培养基(第1、4天加10％的自体血浆)，维持细胞密度5-20×10⁵/mL，并添加500U/mL的IL-2。

(四)DC细胞和CIK细胞共培养

CIK培养至7天，DC细胞和CIK细胞混合培养，同时添加200U/mL的IL-2，培养5天后获得DC-CIK细胞。

实施例3 DC-CIK细胞共培养实例

(一)单个核细胞分离

1.外周血或脐带血40mL，500-800g离心10分钟，吸取上层血浆，经56℃灭活30min后，2000-3000g离心5min，上清血浆2-8℃备用；

2.下层血液，加入2倍体积的生理盐水重悬，按稀释后的血液：Ficoll分离液为2:1，把稀释后的血液缓慢加入到Ficoll分离液上层，使分层清晰；

3.500-700g离心15-30min，吸取中间白膜层，即为单个核细胞。

(二)DC细胞分离培养

1.获得的单个核细胞加生理盐水稀释后，按200-400g离心5min，清洗两遍；

2.加无血清培养基(含15％自体血浆)重悬细胞，按2-8×10⁶/mL接种T75培养瓶中静置1-5h，获得贴壁细胞；

3.贴壁细胞加生理盐水轻洗1遍，加入含15％自体血浆的无血清培养基，同时添加因子GM-SCF为1000U/mL、IL-4为1000U/mL进行培养；

4.三天后补加GM-SCF为1000U/mL、IL-4为1000U/mL，培养至4-6天后换液，同时添加GM-SCF为500U/mL、IL-4为500U/mL、TNF-α为1000U/mL、MDC为20ng/mL，培养24h，得到目的DC细胞。

(三)CIK细胞培养

1.DC细胞培养第2步中未贴壁的细胞转移至另一T75培养瓶中并计数，根据计数结果，调整细胞密度为5-15×10⁵/mL进行CIK培养；

2.第1天添加细胞因子INF-γ2000U/mL，自体血浆15％；第2天添加细胞因子OKT-3100ng/mL、IL-1α200U/mL、IL-21000U/mL；

3.每隔3天补加无血清培养基(第1、4天加15％的自体血浆)，维持细胞密度5-20×10⁵/mL，并添加1000U/mL的IL-2。

(四)DC细胞和CIK细胞共培养

CIK培养至7天，DC细胞和CIK细胞混合培养，同时添加500U/mL的IL-2，培养5天后获得DC-CIK细胞。

实施例4 效果验证试验

分别取40mL外周血，按照专利号CN 103981144A、CN 103255105A、CN 104357394A、CN 102978161A方法以及本发明实施例1～3的方法进行DC-CIK细胞培养，分组如下：

组A1：专利号CN 103981144A实施例中方法；

组A2：专利号CN 103255105A实施例中方法；

组A3：专利号CN 104357394A实施例1～4中方法；

组A4：专利号CN 102978161A实施例2公开的培养方法；

组B1：本发明实施例1方法；

组B2：本发明实施例2方法；

组B3：本发明实施例3方法。

于DC细胞培养的第7天进行DC细胞计数，共培养至7天时进行DC-CIK细胞计数；并取组A1和组B₂进行流式检测；对K562细胞的杀伤实验。

杀伤试验流程具体如下：

分别取杀伤性细胞(效应细胞)和肿瘤细胞(靶细胞K562)，分别按效应细胞：靶细胞为10:1、20:1、40:1进行3组，每组3个平行实验的试验，并做1组靶细胞自然凋亡。一般取靶细胞1×10⁵，效应细胞分别取1×10⁶，2×10⁶，4×10⁶。共培养4h。

通过酶标仪检测靶细胞死亡后分泌的蛋白成分鉴定，确定靶细胞自然凋亡量和各组杀伤后靶细胞死亡量，计算：杀伤组死亡的靶细胞量减去自然凋亡的细胞量，再除以靶细胞总量，得到杀伤效率值(效靶比)。

(一)细胞计数试验结果

表1 细胞计数结果

结果分析：

组B1、B2、B3得到的DC细胞和DC-CIK细胞量明显高于组A1、A2、A3、A4。

(二)对K562杀伤结果

表2 对K562杀伤的效靶比

组别	10:1	20:1	40:1
				组A1	21.8％	40.7％	69.9％
组A2	12.2％	30.7％	58.8％
				组A3	16.8％	35.7％	49.7％
组A4	12.8％	29.8％	45.6％

组B1	30.6％	65.8％	79.2％
				组B2	32.5％	66.3％	80.5％
组B3	38.8％	68.6％	81.2％

结果分析：

组B1、B2、B3得到的DC-CIK细胞对K562细胞的杀伤能力明显优于组A1、A2、A3、A4。

(三)流式检测结果

流式检测结果见图1。

从流式结果可知，DC-CIK的有效细胞CD3+CD56+细胞：组A1为38.2％，组B2达到65.7％，明显优于组A1。

由上述试验结果可知，本发明共培养方法得到的DC-CIK细胞在细胞量上、有效细胞比例上以及在对肿瘤细胞的杀伤能力上都优于现有方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种DC-CIK细胞培养试剂，其特征在于，由DC细胞培养试剂、CIK细胞培养试剂、共培养试剂组成；

所述DC细胞培养试剂由第一DC细胞培养试剂和第二DC细胞培养试剂组成；所述第一DC细胞培养试剂由GM-SCF、IL-4和含有体积百分含量5％～15％血浆的无血清培养基组成；所述第一DC细胞培养试剂中，GM-CSF的浓度为100～1000U/mL，IL-4的浓度为100～1000U/mL；所述第二DC细胞培养试剂由GM-SCF、IL-4、TNF-α、MDC和含有体积百分含量5％～15％血浆的无血清培养基组成；所述第二DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为50～500U/mL，IL-4的浓度为50～500U/mL，TNF-α的浓度为100～1000U/mL，MDC的浓度为1～20ng/mL；

所述CIK细胞培养试剂由第一CIK细胞培养试剂和第二CIK细胞培养试剂组成；所述第一CIK细胞培养试剂由INF-γ和含有体积百分含量5％～15％血浆的无血清培养基组成；所述第一CIK细胞培养试剂中，INF-γ的浓度为500～2000U/mL；所述第二CIK细胞培养试剂由OKT-3、IL-1α、IL-2和含有体积百分含量5％～15％血浆的无血清培养基组成；所述第二CIK细胞培养试剂中，OKT-3的浓度为10～100ng/mL，IL-1α的浓度为50～200U/mL，IL-2的浓度为100～1000U/mL；

所述共培养试剂由IL-2和含有体积百分含量5％～15％血浆的无血清培养基组成；所述共培养试剂中，IL-2的浓度为100～500U/mL。

2.一种DC-CIK细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将单个核细胞进行细胞培养，获得贴壁细胞和悬浮细胞；

步骤2：采用第一DC细胞培养试剂培养所述贴壁细胞，培养4～6天后，采用第二DC细胞培养试剂培养24-48h，得到DC细胞；所述第一DC细胞培养试剂由GM-SCF、IL-4和含有体积百分含量5％～15％血浆的无血清培养基组成；所述第一DC细胞培养试剂中，GM-CSF的浓度为100～1000U/mL，IL-4的浓度为100～1000U/mL；所述第二DC细胞培养试剂由GM-SCF、IL-4、TNF-α、MDC和含有体积百分含量5％～15％血浆的无血清培养基组成；所述第二DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为50～500U/mL，IL-4的浓度为50～500U/mL，TNF-α的浓度为100～1000U/mL，MDC的浓度为1～20ng/mL；

采用第一CIK细胞培养试剂培养所述悬浮细胞，培养1～3天后，采用第二CIK细胞培养试剂继续培养7～8天，继续培养过程中每隔3天补加IL-2，获得CIK细胞；所述第一CIK细胞培养试剂由INF-γ和含有体积百分含量5％～15％血浆的无血清培养基组成；所述第一CIK细胞培养试剂中，INF-γ的浓度为500～2000U/mL；所述第二CIK细胞培养试剂由OKT-3、IL-1α、IL-2和含有体积百分含量5％～15％血浆的无血清培养基组成；所述第二CIK细胞培养试剂中，OKT-3的浓度为10～100ng/mL，IL-1α的浓度为50～200U/mL，IL-2的浓度为100～1000U/mL；

步骤3：将所述DC细胞和所述CIK细胞混合，采用共培养试剂培养5～8天，得到DC-CIK细胞；所述共培养试剂由IL-2和含有体积百分含量5％～15％血浆的无血清培养基组成；所述共培养试剂中，IL-2的浓度为100～500U/mL。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤2中维持细胞密度为(5～15)×10⁵/mL。