CN102978161A - Dc-cik细胞分离培养试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种DC-CIK细胞分离培养试剂盒及其应用，该试剂盒包括：淋巴细胞分离液、外周血样处理液、CIK细胞诱导增殖体系、DC诱导增殖体系、细胞培养瓶包被体系、淋巴细胞培养基GT-T551以及细胞培养袋；其在分离和培养DC-CIK细胞中的应用，具体步骤如下：外周血样单核细胞的分离、DC和CIK细胞的分离、DC细胞的诱导增殖、CIK细胞的诱导增殖以及DC与CIK细胞的共培养。本发明试剂盒分离所得淋巴细胞具有很高的纯度和活性、CIK细胞增殖速度快、CD3+CD56+双阳性细胞比例高、操作方法简单，条件易控，可广泛应用于人和哺乳动物DC-CIK细胞的分离培养。

Description

DC-CIK细胞分离培养试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于分离和培养DC-CIK细胞的试剂盒及其应用。

背景技术

以肿瘤免疫治疗为核心的生物治疗已成为继手术、放疗和化疗之后的第四种治疗模式。该治疗模式是采用患者自体免疫细胞进行诱导，刺激或辅助人体自身免疫系统，从而完善和增强患者的免疫机能，且治疗手段安全，基本无毒副作用，因此于近年来显示出良好的应用前景。

DC-CIK联合治疗是目前肿瘤生物治疗中最成熟的治疗方案之一。DC（树突状细胞）是迄今发现的功能最强大的抗原提呈细胞，可高效准确识别肿瘤抗原并将信息传递给人体免疫系统，在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要作用；DC主要由骨髓中的髓样干细胞和淋巴样干细胞分化而来，数量较少，仅占外周血单核细胞数量的1%以下。CIK 细胞（细胞因子诱导的杀伤细胞）是一种新型免疫活性细胞，兼有T淋巴细胞的强大抗肿瘤活性和NK细胞（自然杀伤细胞）的非主要组织相关性复合物限制性杀瘤的特点，对肿瘤细胞的杀伤活性可达84.7% ；CIK细胞主要由CD3+CD56+和CD3+CD8+ T细胞亚群组成，其中CD3+CD56+ T细胞为自然杀伤活性T细胞（NKT细胞），在正常人外周血中含量极少，具有抗肿瘤活性，CD3+CD8+  T细胞为细胞毒性T细胞（CTL细胞），是体内执行细胞免疫功能的主要效应细胞。DC和CIK细胞共同培养联合应用不仅可显著增强CIK的抗肿瘤活性，还可提高CIK对肿瘤靶细胞杀伤作用的特异性。DC-CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤谱广、杀瘤活性高等优势，可在不损伤机体免疫系统结构和功能的前提下直接杀伤肿瘤细胞，并且具有调节和增强机体免疫的功能，尤其是对手术和放化疗后的患者效果更为显著，能消除患者机体微小的残留或转移性病灶，防止癌细胞的扩散和复发，对改善患者生活质量以及提高患者生存率具有重要意义，是现今肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。

DC和CIK细胞尚不能直接从组织中大量分离获得，必须经过培养扩增并纯化后才能满足临床应用的需求。目前，国内DC-CIK细胞的分离和培养技术主要存在以下缺点：

（1）分离获得的DC和CIK细胞纯度和活性较低。国内主要采用淋巴细胞分离法，分离得到的DC和CIK细胞纯度和活性普遍较低，其中还混杂有较多的红细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、血小板等，当细胞碎片回输入人体后易引发病人出现发热、炎症等不良反应。

（2）CIK细胞增殖速度慢，数量少。国内现有技术培养的CIK细胞其增殖速度慢，难以达到肿瘤治疗所需数量级，肿瘤治疗效果欠佳。

（3）CIK细胞有效抑瘤因子表达水平低。CIK细胞的细胞毒性与CD3+CD56+的表达水平呈正相关，而国内现有技术培养的CIK细胞中CD3+CD56+双阳性细胞比例低，双阳性表达率不足10%。 

发明内容

本申请人针对现有DC-CIK细胞分离和培养技术存在的上述缺陷，经过研究改进，提供一种DC-CIK细胞分离培养试剂盒；本发明的另一个目的在于提供上述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养DC-CIK细胞中的应用。

本发明的技术方案如下：

一种DC-CIK细胞分离培养试剂盒，包括：

（1）淋巴细胞分离液；

（2）外周血样处理液：包括含有质量百分浓度为1~3%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液；

（3）CIK细胞诱导增殖体系：包括CD3、白细胞介素-1和白细胞介素-2；

（4）DC诱导增殖体系：包括GM-CSF和白细胞介素-4；

（5）细胞培养瓶包被体系：包括纤粘连蛋白和γ干扰素；

（6）淋巴细胞培养基GT-T551；

（7）细胞培养袋。

本发明还提供了一种上述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养DC-CIK细胞中的应用，具体步骤如下：

   （1）外周血样单核细胞的分离：取新鲜的人外周血样，在其中加入血液抗凝剂后制得抗凝血样；向所述抗凝血样中加入1/3~2/3体积的所述外周血样处理液，充分混匀，用1~1.5倍体积的所述淋巴细胞分离液分离所得混合液中的单个核细胞，并用所述淋巴细胞培养基GT-T551调节所述单个核细胞密度至1~5×10⁶个/mL，得到外周血单核细胞悬液；将所述外周血单核细胞悬液用所述外周血样处理液洗涤，于室温离心5~10 min，转速1500~2000r/min，取白膜层细胞；

（2）DC和CIK细胞的分离：

 向步骤（1）所得白膜层细胞中加入含有5~10%自体血清的所述淋巴细胞培养基GT-T551，将所得细胞混悬液接种至所述纤粘连蛋白预包被的细胞培养瓶，为瓶A，并于细胞培养箱中进行细胞培养；1~5h后，将瓶A中的悬浮细胞接种至所述γ干扰素预包被的细胞培养瓶，为瓶B；

   （3） DC细胞的诱导增殖：

向瓶A中的贴壁细胞加入含有5~10%自体血清的所述淋巴细胞培养基GT-T551，并同时加入终浓度为500~750U/mL的所述GM-CSF以及终浓度为500~1000U/mL的所述白细胞介素-4，于细胞培养箱中进行细胞培养；培养过程中每三天更换一次含有5~10%自体血浆的所述淋巴细胞培养基GT-T551，同时再次加入上述GM-CSF和白细胞介素-4；5~7天后，收获细胞并将其转移至所述细胞培养袋中进行扩大培养，8~10天后收获细胞，即得DC细胞；

（4）CIK细胞的诱导增殖：

向瓶B中加入含有5~10%自体血清的所述淋巴细胞培养基GT-T551，并同时加入终浓度为300~500μg/mL的所述CD3、终浓度为100~300U/mL的所述白细胞介素-1以及终浓度为5000~7500U/ml的所述白细胞介素-2，于细胞培养箱中进行细胞培养； 48~72 h后，换用含有5~10%自体血浆以及终浓度为500~750万U/L所述白细胞介素-2的所述淋巴细胞培养基GT-T551继续培养；8~10天后，收获细胞并将其转移至所述细胞培养袋中进行扩大培养，14~16天后收获细胞，即得CIK细胞； 

（5）DC与CIK细胞的共培养：

 将步骤（3）所得DC细胞和步骤（4）所得CIK细胞按照细胞数量比1:5~1:8的比例混合培养，得到DC-CIK细胞；

所述自体血清分离自添加了血液促凝剂的所述人外周血样；

所述自体血浆分离自步骤（1）所制抗凝血样；

以上百分含量如无特殊说明均为体积百分含量。

其进一步的技术方案为：

步骤（3）所述扩大培养是在所述淋巴细胞培养基GT-T551中进行的。

步骤（4）所述扩大培养是在含有5~10%所述自体血浆以及终浓度500~750万U/L的所述白细胞介素-2的所述淋巴细胞培养基GT-T551中进行的。

步骤（5）所述混合培养是在含有1~5%所述自体血浆以及终浓度500~750万U/L的所述白细胞介素-2的所述淋巴细胞培养基GT-T551中进行的。

与现有DC-CIK细胞分离和培养技术相比，本发明具有如下有益技术效果：

1．本发明试剂盒分离所得淋巴细胞具有很高的纯度和活性，经检测细胞纯度和活性（活细胞百分率）均能达到98%以上。

2．本发明试剂盒共培养的CIK细胞增殖速度快，经检测，用本发明试剂盒进行DC-CIK细胞共培养的CIK细胞在培养第14天数量可达2.5×10⁹个/L，完全满足肿瘤治疗所需有效数量级。

3．本发明试剂盒培养的CD3+CD56+双阳性细胞比例高，经检测培养14天后CD3+CD56+双阳性细胞可达52.3%，具有很好的临床效应。                    

4．本发明试剂盒操作方法简单，条件易控，可广泛应用于人和哺乳动物DC-CIK细胞的分离培养。

附图说明

图1为本发明实施例2中CIK细胞培养第0～14天的生长状态图。

图2为本发明实施例2中DC细胞培养第7天的形态观测图。

图3为本发明实施例2中不同培养时间（0～15天）CD3+CD56+细胞的流式细胞仪检测结果，其中，右上角方框中显示的是CD3+CD56+细胞。

图4为本发明实施例2中不同培养时间（0～14天）CD3+CD56+细胞的间接免荧光法检测结果。

具体实施方式

以下结合附图，并通过实施例对本发明进行具体说明。 

实施例1～实施例3中所述血库浓缩白细胞血采集自医院肿瘤病人，所述自体血清分离自添加了血液促凝剂的上述血库浓缩白细胞血，分离步骤为：取上述血液于3000r/min离心30min，吸取上清即得。

所述自体血浆分离自添加了肝素的上述血库浓缩白细胞血，分离步骤为同上。

实施例1

本实施例中DC-CIK细胞分离培养试剂盒组成如下：

（1）淋巴细胞分离液；

（2）外周血样处理液：含有质量百分浓度为1%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液；

（3）CIK细胞诱导增殖体系： CD3、白细胞介素-1和白细胞介素-2；

（4）DC诱导增殖体系： GM-CSF、白细胞介素-4；

（5）细胞培养瓶包被体系：纤粘连蛋白、γ干扰素；

（6）淋巴细胞培养基GT-T551。

 将上述试剂盒应用于DC-CIK细胞的分离培养，具体步骤如下：

（1）外周血样单核细胞的分离：吸取20mL淋巴细胞分离液置于50mL离心管中，取20mL 添加了肝素的血库浓缩白细胞血，并在其中加入8mL外周血样本处理液（含有质量百分浓度为1%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液），充分混匀，将所得混合液沿试管壁缓慢加至上述淋巴细胞分离液液面上方，加样过程中勿使血液混入淋巴细胞分离液；将该离心管置于水平式离心机内，于室温以2000r/min的转速离心15min； 吸去上层血浆，用毛细吸管吸取单个核细胞，并用淋巴细胞培养基GT-T551调节单个核细胞密度至1×10⁶个/mL，得到外周血单核细胞悬液；将所得外周单核细胞悬液用5倍体积的外周血样处理液洗涤3次，于室温以1500r/min的转速离心8 min，取白膜层细胞。

（2）DC和CIK细胞的分离：

 向步骤（1）所得白膜层细胞中加入20mL淋巴细胞培养基GT-T551（含1mL自体血清），将所得细胞混悬液接种至纤粘连蛋白预包被的T75方瓶，为瓶A，并于5%CO₂恒温细胞培养箱中进行细胞培养； 1h后，将瓶A中的悬浮细胞接种至γ干扰素预包被的T75方瓶，为瓶B；

   （3） DC细胞的诱导增殖：

向瓶A中的贴壁细胞加入20mL淋巴细胞培养基GT-T551（含1mL自体血清），同时加入终浓度为500U/mL的GM-CSF以及终浓度为750U/mL的白细胞介素-4，于5%CO₂恒温细胞培养箱中进行细胞培养；培养过程中每三天更换一次新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551（含5%的自体血浆），同时再次加入上述GM-CSF和白细胞介素-4；5天后收获细胞并将其转移至1.8L细胞培养袋中进行扩大培养（培养基为GT-T551），10天后收获细胞，即得DC细胞。

（4）CIK细胞的诱导增殖：

向瓶B中加入20mL淋巴细胞培养基GT-T551（含1mL自体血清），并同时加入终浓度为400μg/mL的CD3、终浓度为100U/mL的白细胞介素-1以及终浓度为7500U/mL的白细胞介素-2，于5%CO₂恒温细胞培养箱中进行细胞培养； 48h后，将瓶B细胞转移至T175方瓶，换用60mL新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551（含3mL自体血浆以及终浓度为750万U/L的白细胞介素-2）继续培养，8天后，收获细胞并将其转移至1.8L细胞培养袋中进行扩大培养，培养液为含5%自体血浆以及终浓度为750万U/L的白细胞介素-2的淋巴细胞培养基GT-T551，两天补一次液，每次补加100mL新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551（含1%自体血浆以及终浓度为750万U/L的白细胞介素-2），14天后收获细胞即得CIK细胞； 

（5）DC与CIK细胞的共培养：

 将步骤（3）所得DC细胞和步骤（4）所得CIK细胞经活细胞计数后按照细胞数量比1:8的比例于含有1%自体血浆以及终浓度为750万U/L的白细胞介素-2的淋巴细胞培养基GT-T551中混合培养，14天后得到DC-CIK细胞。

实施例2

本实施例中DC-CIK细胞分离培养试剂盒组成如下：

（1）淋巴细胞分离液

（2）外周血样处理液：含有质量百分浓度为2.5%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液；

（3）CIK细胞诱导增殖体系： CD3、白细胞介素-1和白细胞介素-2；

（4）DC诱导增殖体系： GM-CSF、白细胞介素-4；

（5）细胞培养瓶包被体系：纤粘连蛋白、γ干扰素；

（6）淋巴细胞培养基GT-T551。

 将上述试剂盒应用于DC-CIK细胞的分离培养，具体步骤如下：

（1）外周血样单核细胞的分离：吸取20mL淋巴细胞分离液置于50mL离心管中，取20mL 添加了肝素的血库浓缩白细胞血，并在其中加入10mL外周血样本处理液（含有质量百分浓度为2.5%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液），充分混匀，将所得混合液沿试管壁缓慢加至上述淋巴细胞分离液液面上方，加样过程中勿使血液混入淋巴细胞分离液；将该离心管置于水平式离心机内，于室温以2000r/min的转速离心15min； 吸去上层血浆，用毛细吸管吸取单个核细胞，并用淋巴细胞培养基GT-T551调节单个核细胞密度至3×10⁶个/mL，得到外周血单核细胞悬液；将所得外周单核细胞悬液用5倍体积的外周血样处理液洗涤3次，于室温以2000r/min的转速离心5 min，取白膜层细胞。

（2）DC和CIK细胞的分离：

 向步骤（1）所得白膜层细胞中加入20mL淋巴细胞培养基GT-T551（含2mL自体血清），将所得细胞混悬液接种至纤粘连蛋白预包被的T75方瓶，为瓶A，并于5%CO₂恒温细胞培养箱中进行细胞培养；2h后，将瓶A中的悬浮细胞接种至γ干扰素预包被的T75方瓶，为瓶B；

   （3） DC细胞的诱导增殖：

向瓶A中的贴壁细胞加入20mL淋巴细胞培养基GT-T551（含2mL自体血清），同时加入终浓度为750U/mL的GM-CSF以及终浓度为500U/mL的白细胞介素-4，于5%CO₂恒温细胞培养箱中进行细胞培养；培养过程中每三天更换一次新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551（含10%的自体血浆），同时再次加入上述GM-CSF和白细胞介素-4；6天后收获细胞并将其转移至1.8L细胞培养袋中进行扩大培养（培养基为GT-T551），9天后收获细胞，即得DC细胞。

（4）CIK细胞的诱导增殖：

向瓶B中加入20mL淋巴细胞培养基GT-T551（含2mL自体血清），并同时加入终浓度为300μg/mL的CD3、终浓度为100U/mL的白细胞介素-1以及终浓度为5000U/mL的白细胞介素-2，于5%CO₂恒温细胞培养箱中进行细胞培养； 48 h后，将瓶B细胞转移至T175方瓶，换用60mL新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551（含6mL自体血浆以及终浓度为500万U/L的白细胞介素-2）继续培养，9天后，收获细胞并将其转移至1.8L细胞培养袋中进行扩大培养，培养液为含10%自体血浆以及终浓度为500U/L的白细胞介素-2的淋巴细胞培养基GT-T551，两天补一次液，每次补加100mL新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551（含1%自体血浆以及终浓度为500万U/L的白细胞介素-2），15天后收获细胞即得CIK细胞； 

（5）DC与CIK细胞的共培养：

 将步骤（3）所得DC细胞和步骤（4）所得CIK细胞经活细胞计数后按照细胞数量比1:5的比例于含有5%自体血浆以及终浓度为500万U/L的白细胞介素-2的淋巴细胞培养基GT-T551中混合培养，15天后得到DC-CIK细胞。

 实施例3

本实施例中DC-CIK细胞分离培养试剂盒组成如下：

（1）淋巴细胞分离液

（2）外周血样处理液：含有质量百分浓度为3%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液；

（3）CIK细胞诱导增殖体系： CD3、白细胞介素-1和白细胞介素-2；

（4）DC诱导增殖体系： GM-CSF、白细胞介素-4；

（5）细胞培养瓶包被体系：纤粘连蛋白、γ干扰素；

（6）淋巴细胞培养基GT-T551。

 将上述试剂盒应用于DC-CIK细胞的分离培养，具体步骤如下：

（1）外周血样单核细胞的分离：吸取20mL淋巴细胞分离液置于50mL离心管中，取20mL 添加了肝素的血库浓缩白细胞血，并在其中加入15mL外周血样本处理液（含有质量百分浓度为3%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液），充分混匀，将所得混合液沿试管壁缓慢加至上述淋巴细胞分离液液面上方，加样过程中勿使血液混入淋巴细胞分离液；将该离心管置于水平式离心机内，于室温以2000r/min的转速离心15min； 吸去上层血浆，用毛细吸管吸取单个核细胞，并用淋巴细胞培养基GT-T551调节单个核细胞密度至5×10⁶个/mL，得到外周血单核细胞悬液；将所得外周单核细胞悬液用5倍体积的外周血样处理液洗涤3次，于室温以1800r/min的转速离心10 min，取白膜层细胞。

（2）DC和CIK细胞的分离：

 向步骤（1）所得白膜层细胞中加入20mL淋巴细胞培养基GT-T551（含1.5mL自体血清），将所得细胞混悬液接种至纤粘连蛋白预包被的T75方瓶，为瓶A，并于5%CO₂恒温细胞培养箱中进行细胞培养；5h后，将瓶A中的悬浮细胞接种至γ干扰素预包被的T75方瓶，为瓶B；

   （3） DC细胞的诱导增殖：

向瓶A中的贴壁细胞加入20mL淋巴细胞培养基GT-T551（含1.5mL自体血清），同时加入终浓度为600U/mL的GM-CSF以及终浓度为1000U/mL的白细胞介素-4，于5%CO₂恒温细胞培养箱中进行细胞培养；培养过程中每三天更换一次新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551（含7.5%的自体血浆），同时再次加入上述GM-CSF和白细胞介素-4；7天后收获细胞并将其转移至1.8L细胞培养袋中进行扩大培养（培养基为GT-T551），8天后收获细胞，即得DC细胞。

（4）CIK细胞的诱导增殖：

向瓶B中加入20mL淋巴细胞培养基GT-T551（含1.5mL自体血清），并同时加入终浓度为500μg/mL的CD3、终浓度为200U/mL的白细胞介素-1以及终浓度为6000U/mL的白细胞介素-2，于5%CO₂恒温细胞培养箱中进行细胞培养； 72h后，将瓶B细胞转移至T175方瓶，换用60mL新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551（含4.5mL自体血浆以及终浓度为600万U/L的白细胞介素-2）继续培养，10天后，收获细胞并将其转移至1.8L细胞培养袋中进行扩大培养，培养液为含7.5%自体血浆以及终浓度为600万U/L的白细胞介素-2的淋巴细胞培养基GT-T551，两天补一次液，每次补加100mL新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551（含1%自体血浆以及终浓度为600万U/L的白细胞介素-2），16天后收获细胞即得CIK细胞； 

（5）DC与CIK细胞的共培养：

 将步骤（3）所得DC细胞和步骤（4）所得CIK细胞经活细胞计数后按照细胞数量比1:6的比例于含有3%自体血浆以及终浓度为600万U/L的白细胞介素-2的淋巴细胞培养基GT-T551中混合培养，14天后得到DC-CIK细胞。

实施例4  DC-CIK细胞的相关性能指标检测

1．活细胞百分率和细胞纯度的测定

采用台盼兰活细胞计数法对实施例1～实施例3中与DC细胞共培养的CIK活细胞进行计数（第14天），得出活细胞百分率，计算公式为：活细胞百分率=（活细胞数/细胞总数）×100%。

采用镜检法检测细胞纯度，计算公式为：细胞纯度=（1-血细胞数/活细胞总数）×100%

结果参见表1。

表1 CIK活细胞计数、活细胞百分率以及细胞纯度测定结果

2．细胞生长状态和形态观察

使用倒置显微镜，观察CIK细胞在培养0～14天的生长状态以及DC细胞在培养第0～10天的形态特征；

    细胞形态检测结果参见图1和图2（以实施例2为例）。如图1所示，CIK细胞在培养第6天进入明显增殖期，部分细胞体积明显增大，呈丛或集落状悬浮生长，第14天可见细胞大量成团，成悬浮状生长；如图2所示，DC细胞在培养第7天可观察到典型的树状或毛刺状突起。

3．DC与CIK细胞共培养后的免疫表型分析

用流式细胞仪和间接免荧光法分别测定实施例2中与DC共培养0～15天以及0～14天的CIK细胞免疫表型，并统计CD3+CD56+双阳性细胞比例，统计结果参见表2。

流式细胞仪检测结果参见图3（以CD3+CD56+细胞为例），随着培养时间的延长， CD3+CD56+双阳性细胞比例显著增加。

间接免荧光法检测结果参见图4（以CD3+CD56+细胞为例），随着培养时间的延长， CD3+CD56+双阳性细胞比例显著增加。

   表2 CD3+CD56+双阳性细胞不同培养时间的比例变化

由表2可知，随着时间的延长，CD3+CD56+双阳性细胞的比例逐渐增加，培养至14天可达到50%以上，满足肿瘤临床治疗需求。

综上所述，实施例2中的试剂盒应用效果最好，CIK细胞增殖速度快，CD3+CD56+双阳性细胞比例高，为最佳实施例。

上述实施例中所述试验方法均为本领域常规方法，所述试剂均为市售商品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种DC-CIK细胞分离培养试剂盒，其特征在于包括：

（1）淋巴细胞分离液；

（2）外周血样处理液：包括含有质量百分浓度为1~3%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液；

（3）CIK细胞诱导增殖体系：包括CD3、白细胞介素-1和白细胞介素-2；

（4）DC诱导增殖体系：包括GM-CSF和白细胞介素-4；

（5）细胞培养瓶包被体系：包括纤粘连蛋白和γ干扰素；

（6）淋巴细胞培养基GT-T551；

（7）细胞培养袋。

2.权利要求1所述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养DC-CIK细胞中的应用，其特征在于具体步骤如下：

   （1）外周血样单核细胞的分离：取新鲜的人外周血样，在其中加入血液抗凝剂后制得抗凝血样；向所述抗凝血样中加入1/3~2/3体积的所述外周血样处理液，充分混匀，用1~1.5倍体积的所述淋巴细胞分离液分离所得混合液中的单个核细胞，并用所述淋巴细胞培养基GT-T551调节所述单个核细胞密度至1~5×10⁶个/mL，得到外周血单核细胞悬液；将所述外周血单核细胞悬液用所述外周血样处理液洗涤，于室温离心5~10 min，转速1500~2000r/min，取白膜层细胞；

（2）DC和CIK细胞的分离：

 向步骤（1）所得白膜层细胞中加入含有5~10%自体血清的所述淋巴细胞培养基GT-T551，将所得细胞混悬液接种至所述纤粘连蛋白预包被的细胞培养瓶，为瓶A，并于细胞培养箱中进行细胞培养；1~5h后，将瓶A中的悬浮细胞接种至所述γ干扰素预包被的细胞培养瓶，为瓶B；

   （3） DC细胞的诱导增殖：

向瓶A中的贴壁细胞加入含有5~10%自体血清的所述淋巴细胞培养基GT-T551，并同时加入终浓度为500~750U/mL的所述GM-CSF以及终浓度为500~1000U/mL的所述白细胞介素-4，于细胞培养箱中进行细胞培养；培养过程中每三天更换一次含有5~10%自体血浆的所述淋巴细胞培养基GT-T551，同时再次加入上述GM-CSF和白细胞介素-4；5~7天后，收获细胞并将其转移至所述细胞培养袋中进行扩大培养，8~10天后收获细胞，即得DC细胞；

（4）CIK细胞的诱导增殖：

向瓶B中加入含有5~10%自体血清的所述淋巴细胞培养基GT-T551，并同时加入终浓度为300~500μg/mL的所述CD3、终浓度为100~300U/mL的所述白细胞介素-1以及终浓度为5000~7500U/mL的所述白细胞介素-2，于细胞培养箱中进行细胞培养； 48~72 h后，换用含有5~10%自体血浆以及终浓度为500~750万U/L所述白细胞介素-2的所述淋巴细胞培养基GT-T551继续培养；8~10天后，收获细胞并将其转移至所述细胞培养袋中进行扩大培养，14~16天后收获细胞，即得CIK细胞； 

（5）DC与CIK细胞的共培养：

 将步骤（3）所得DC细胞和步骤（4）所得CIK细胞按照细胞数量比1:5~1:8的比例混合培养，得到DC-CIK细胞；

所述自体血清分离自添加了血液促凝剂的所述人外周血样；

所述自体血浆分离自步骤（1）所制抗凝血样；

以上百分含量如无特殊说明均为体积百分含量。

3.根据权利要求2所述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养

DC-CIK细胞中的应用，其特征在于：步骤（3）所述扩大培养是在所述淋巴细胞培养基GT-T551中进行的。

4.根据权利要求2所述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养DC-CIK细胞中的应用，其特征在于：步骤（4）所述扩大培养是在含有5~10%所述自体血浆以及终浓度500~750万U/L的所述白细胞介素-2的所述淋巴细胞培养基GT-T551中进行的。

5.根据权利要求2所述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养DC-CIK细胞中的应用，其特征在于：步骤（5）所述混合培养是在含有1~5%所述自体血浆以及终浓度500~750万U/L的所述白细胞介素-2的所述淋巴细胞培养基GT-T551中进行的。

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