CN109722386A - 一种dc-cik细胞的诱导活化试剂盒及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种DC‑CIK细胞的诱导活化试剂盒及其应用方法，将内装采用统一标准配制的调制CIK细胞因子激活液IL2的试剂瓶、调制CIK细胞因子激活液CD3的试剂瓶、调制CIK细胞因子激活液IFN‑γ的试剂瓶、调制DC细胞因子激活液IL‑4和GM‑CSF混合液的试剂瓶、调制DC细胞因子激活液TNF‑α的试剂瓶、无血清培养液的试剂瓶的六个容器一同放入一个试剂盒内，在培养DC‑CIK细胞时无需另行配置培养基和诱导因子，缩短了培养细胞的时间，统一配置试剂，降低了培养过程中染菌的风险，同时使用方便，节省人力，可以在较短的时间内培养出质量均一的CIK细胞。

Description

一种DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒及其应用方法

技术领域

本发明涉及试剂盒或试剂箱技术领域，具体涉及一种DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒及其应用方法。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类生存和健康的几大主要病因之一。肿瘤三大治疗手段：手术治疗、放射治疗、化学治疗。肿瘤患者术后化疗或者放疗可提高无病进展生存时间(progression-free survival，PFS)与总生存时间(overall survival，OS)，但总体疗效仍有限，所以更加需要寻求综合抗肿瘤治疗途径，以延长肿瘤患者的生存期。

肿瘤生物治疗被认为是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。生物免疫疗法是通过从体外补充、诱导或活化机体内本来固有的生物应答调节系统，活化和调动具有细胞毒活性的生物活性细胞和细胞因子，以调整各种免疫杀伤性的生物反应。目前在免疫治疗方面研究应用较多的有淋巴因子激活的杀伤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、细胞因子诱导的杀伤(cytokine induced killer，CIK)细胞、树突状细胞(Dendritic cells，DC)、共培养免疫(DC-CIK)细胞、自然杀伤细胞型的淋巴细胞，其中DC和CIK细胞是肿瘤免疫治疗的两个重要部分。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkiller cell，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，它是将人外周血单个核细胞在体外用多种因子(抗CD3抗体、IL-2、IFN-γ等)诱导扩增一段时间后，获得的一群异质性细胞，具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和非主要组织相容性复盒体(majorhistocompatibility complex，MHC)限制性杀瘤的优点。而树突状细胞(dendritic cell，DC)是人体内功能最强大的抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)，DC是目前发现的功能最强的抗原呈递细胞，表面具有丰富的有助于抗原呈递的分子，如主要组织相容性复盒体Ⅰ、Ⅱ，共刺激分子B7-1、B7-2，细胞黏附分子1、3以及淋巴细胞功能相关抗原1、3等，能有效激活初始T细胞，引发机体长生抗肿瘤免疫反应。

近年来随着对DC和CIK抗肿瘤的研究深入，临床应用发现单独应用DC、CIK细胞治疗肿瘤效果并不是很理想，肿瘤细胞对这些免疫效应细胞发生抵抗导致过继免疫疗效不佳，但将两者联合使用会表现出协同作用，所以临床目前将DC-CIK共培养使用，但在培养过程中采用的试剂较多，标准不一致，培养过程中的工作量大，培养时间长，染菌风险大，使许多研究人员很难在短时间内培养出质量均一的DC-CIK细胞。

因此，有必要设计一种新的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒及其应用方法，以克服上述缺陷。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒及其应用方法，在短时间内能够培养出质量均一的DC-CIK细胞。

本发明的目之一在于提供一种DC-CIK细胞诱导活化的试剂盒，包含盒盖和盒体，该盒体内部设有一个海绵托，该海绵拖上设有六个固定孔，该六个固定孔内分别放置有内容调制CIK细胞因子激活液IL-2的试剂瓶、内容调制CIK细胞因子激活液CD3的试剂瓶、内容调制CIK细胞因子激活液IFN-γ的试剂瓶、内容调制DC细胞因子激活液IL-4和GM-CSF混合液的试剂瓶、内容调制DC细胞因子激活液TNF-α的试剂瓶、内容无血清培养液的试剂瓶。

较佳的，IL-2的浓度为500-1500U/ml，CD3的浓度为30-120ng/mL，IL-4和GM-CSF混合液的浓度为100-800U/ml，IL-4和GM-CSF混合液的浓度为500U/ml，TNF-α的浓度为100-800U/ml，IFN-γ的浓度为400-1600U/ml。

较佳的，IL-4和GM-CSF混合液的浓度为500U/ml；和/或，IL-2的浓度为1000U/ml。

较佳的，CD3的浓度为100ng/mL。

较佳的，TNF-α的浓度为500U/ml。

较佳的，IFN-γ的浓度为1000U/ml。

为达上述目的，本发明还提供一种DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒的应用方法，用于DC-CIK细胞诱导活化的试剂盒，该试剂盒包括调制CIK细胞因子激活液IL-2、调制CIK细胞因子激活液CD3、调制CIK细胞因子激活液IFN-γ、调制DC细胞因子激活液IL-4和GM-CSF混合液、调制DC细胞因子激活液TNF-α、无血清培养液，该应用方法包括如下步骤：

抽外周血100ml，收集于四联血袋；

血液预处理:将所采集100ml外周血，置于2支50ml的离心管中,离心(500-1000g,10-35min),上清转移至50ml离心管待处理备用，下部的细胞作密度梯度离心分离PBMC(外周血单核细胞)用；

细胞的分离：血液预处理获得的下层细胞用生理盐水1:1稀释，混匀。将40ml淋巴细胞分离液等量均分放入50ml刻度离心管，将离心管中已稀释的细胞悬液等量均分沿管壁缓慢匀速加入离心管，滴加过程中注意用力均匀，避免破坏分离液-白细胞界面的完整性，离心(500-1000g,15-45min，离心机升降速调到最慢)，离心后，管内液体分为三层，移液管弃去上层约15ml液体后吸取上、中层界面处白色云雾层狭窄带(即所需PBMC，约5ml)放入离心管，生理盐水洗2次(600g,8min)后弃上清，从试剂盒中取出无血清细胞培养基，每管40ml无血清细胞培养液重悬细胞分离所获得的PBMC；

接种细胞：将40ml PBMC细胞悬液加入细胞培养瓶1，置饱和湿度、37℃、3.0％-10％CO₂条件下培养。2小时后，收集悬浮细胞，并用无血清培养液调整细胞浓度到1X10⁶/ml,在其中加入IFN-γ培养(400-1600U/ml)。24小时后，从试剂盒中取出细胞因子激活液IL-2(500-1500U/ml)和CD3(30-120ng/mL)各40μl，用于CIK细胞诱导；向细胞培养瓶1中的贴壁细胞加入20ml DC细胞诱导因子IL-4和GM-CSF(100-800U/ml)混合液，用于DC细胞诱导培养；

培养至第三天，补加无血清细胞培养液40ml，40μl细胞因子激活液IL-2(500-1500U/ml)至培养瓶使培养液总体积为80ml；

培养至第四天，CIK细胞：使用50ml医用注射器将每个培养瓶中细胞悬液等量均分转入2个细胞培养袋，加入无血清细胞培养液(≥400ml/袋)和细胞因子激活液IL-2，使细胞终浓度约为1×10⁵cells/ml，IL-2终浓度为500IU/ml，置饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养。DC细胞：培养至第四天，向DC细胞培养瓶中加入10ul DC细胞诱导因子IL-4和GM-CSF(100-800U/ml)混合液；

培养至第6天，CIK细胞：每袋添加细胞因子激活液IL-2，使其终浓度为500IU/ml。DC细胞：加入肿瘤抗原5ul。

培养至第7天，DC细胞：加入DC细胞诱导因子TNF-α(100-800U/ml)，10ul；

培养至第8天，将1/2的DC细胞冻存为2份，分别标示为DC疫苗1、DC疫苗2，剩余DC细胞与CIK细胞共培养并向其中添加1.5倍的无血清细胞培养液和相应的细胞因子激活液IL-2(终浓度为50IU/ml)，并计数。抽取5ml/袋，详细填写好验单项目后，送检验科做真菌、细菌检测；

第10天，每袋细胞添加0.5倍的无血清细胞培养液和相应的细胞因子激活液IL-2(终浓度为50IU/ml)，计数并取样做细菌、真菌、内毒素、支原体检测，确认检测结果合格后，回输DC-CIK；

第12天，每袋细胞添加0.5倍的无血清细胞培养液和相应的细胞因子激活液IL-2(终浓度为50IU/ml)，计数并取样做细菌、真菌、内毒素、支原体检测，确认检测结果合格后，回输DC-CIK；

第14天，详细观察细胞生长状态后，随机均匀抽样5ml，台盼蓝染色法计数活细胞、死细胞总数量，同时取样做淋巴细胞表面标记检测；并确认细胞悬液细菌、真菌涂片、支原体及内毒素检测为阴性后，回输DC-CIK及DC疫苗2。收集细胞约4000ml，离心(1500rpm，8min)，洗液(含有0.2％人白蛋白的注射用生理盐水)洗涤(1500rpm，8min)2次，洗液按照500ml生理盐水、50万IU的IL-2、5ml 20％人血清白蛋白的配比，重悬细胞，将其装入细胞回输袋用热合机将管口热合封闭，并留样封存。

较佳的，血液预处理时，是离心700g，离心20分钟。

较佳的，细胞分离步骤中，将离心管中已稀释的细胞悬液等量均分沿管壁缓慢匀速加入离心管，滴加过程中注意用力均匀，避免破坏分离液-白细胞界面的完整性，离心800g，离心20分钟，离心后，管内液体分为三层。

较佳的，接种细胞的步骤中，将40ml PBMC细胞悬液加入细胞培养瓶，置饱和湿度、37℃、5.0％CO₂条件下培养。

与现有技术相比，本发明提供一种DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒及其应用方法，将内装采用统一标准配制的调制CIK细胞因子激活液IL2的试剂瓶、调制CIK细胞因子激活液CD3的试剂瓶、调制CIK细胞因子激活液IFN-γ的试剂瓶、调制DC细胞因子激活液IL-4和GM-CSF混合液的试剂瓶、调制DC细胞因子激活液TNF-α的试剂瓶、无血清培养液的试剂瓶一同放入一个试剂盒内，在培养DC-CIK细胞时无需另行配置培养基和诱导因子，缩短了培养细胞的时间，统一配置试剂，降低了培养过程中染菌的风险，同时使用方便，节省人力，可以在较短的时间内培养出质量均一的CIK细胞。

附图说明

图1为本发明的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒的结构示意图。

图2为本发明的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒的局部结构示意图。

具体实施方式

为使对本发明的目的、构造、特征、及其功能有进一步的了解，兹配合实施例详细说明如下。

在说明书及权利要求书当中使用了某些词汇来指称特定的元件。所属领域中具有通常知识者应可理解，制造商可能会用不同的名词来称呼同一个元件。本说明书及权利要求书并不以名称的差异来作为区分元件的方式，而是以元件在功能上的差异来作为区分的准则。在通篇说明书及权利要求当中所提及的「包括」为开放式的用语，故应解释成「包括但不限定于」。

进一步的，如图1和图2所示，该DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒由盒体1、盒盖2，海绵托3，试剂瓶4构成，所述盒体1和盒盖2可相对移动，以露出盒体1的开口，所述海绵托3上设有六个固定孔301，该六个固定孔301内分别放置有内容调制CIK细胞因子激活液IL2的试剂瓶、内容调制CIK细胞因子激活液CD3的试剂瓶、内容调制CIK细胞因子激活液IFN-γ的试剂瓶、内容调制DC细胞因子激活液IL-4和GM-CSF混合液的试剂瓶、内容调制DC细胞因子激活液TNF-α的试剂瓶、内容无血清培养液的试剂瓶。

进一步的，IL-2的浓度为500-1500U/ml，CD3的浓度为30-120ng/mL，IL-4和GM-CSF混合液的浓度为100-800U/ml，TNF-α的浓度为100-800U/ml，IFN-γ的浓度为400-1600U/ml。本实施例中，IL-2的浓度为1000U/ml。本实施例中，CD3的浓度为100ng/mL。本实施例中，TNF-α的浓度为500U/ml。本实施例中，IFN-γ的浓度为1000U/ml。本实施例中，IL-4和GM-CSF混合液的浓度为500U/ml，但不以此为限。

进一步的，每个试剂瓶4的瓶体和瓶盖上分别设有标签5，每个标签5上具有对应的内容物(试剂瓶内所容置的物体)的名称，即在不同试剂瓶4的标签上分别对应标有文字：“调制CIK细胞因子激活液IL2”、“调制CIK细胞因子激活液CD3”、“调制CIK细胞因子激活液IFN-γ”、“调制DC细胞因子激活液IL-4和GM-CSF混合液”、“调制DC细胞因子激活液TNF-α”、或者“无血清培养液”，以示不同试剂瓶4内的内容物为何物，便于取用，防止错取或者混淆。较佳的，海绵体3上邻近试剂瓶4的位置亦具有标签，该标签上具有对应的内容物的名称，便于试剂瓶取出后回归原位，防止试剂瓶混淆，达到更为规范的效果。

进一步的，盒盖2与盒体1连接，使盒盖2可相对盒体1翻转，或者，盒盖2为分体式，以形成双开门式的盒盖2。于其他实施例中，盒盖2亦可以是推拉式，具体由设计人员根据实际情况而定，在此不再赘述。

进一步的，六个固定孔301的形状与试剂瓶的形状相匹配，以利于限制试剂瓶4的滑动。本实施例中，六个固定孔301为圆形。

进一步的，六个固定孔301分两排布置。较佳的，该两排固定孔301相互平行。当然，于其他实施例中，六个固定孔301可任何分布，以不形成相互干涉为限，具体由设计人员根据实际情况而定，在此不再赘述。

进一步的，六个固定孔301中的两个固定孔301排成第一排，其余的四个固定孔301排成第二排。但不以此为限，亦可以是三个固定孔301排成该第一排，其余三个固定孔301排成该第二排，或者一个固定孔301排成该第一排，其余五个固定孔301排成该第二排。

较佳的，该第一排的两个固定301孔的尺寸大于该第二排的四个固定孔301的尺寸。本实施例中，该第一排的两个固定301孔的直径大于该第二排的四个固定孔301的直径。

进一步的，该第一排的两个固定孔301的尺寸相同，该第二排的四个固定孔301的尺寸相同。

利用该DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒培养DC-CIK细胞的步骤如下：

1.患者在病房由医护工作人员抽外周血100ml，收集于四联血袋。较佳的，采集标准：综合身体状况Karnofsky performance(卡氏行为状态评分，KPS)≥60％，预期生存时间＞6个月；无艾滋病、甲肝、乙肝、丙肝和梅毒等不可控制的传染病；心、肾等重要脏器功能储备较好；肝功能正常或异常，但ALT＜200U/L，TBiL＜36μmol/L，ALB>35g/L，凝血酶原时间＜16s；采血前1个月及治疗期间均未接受过放、化疗。

2.血液预处理:将所采集100ml外周血，置于2支50ml的离心管中,离心(500-1000(较佳为700)g,10-35(较佳为20)min),上清转移至50ml离心管待处理备用，下部的细胞作密度梯度离心分离PBMC(外周血单核细胞)用。

3.细胞的分离：血液预处理获得的下层细胞用生理盐水1:1稀释，混匀。将40ml淋巴细胞分离液等量均分放入50ml刻度离心管。将离心管中已稀释的细胞悬液等量均分沿管壁缓慢匀速加入离心管。滴加过程中注意用力均匀，避免破坏分离液-白细胞界面的完整性。离心(500-1000(较佳为800)g,15-45(较佳为20)min，离心机升降速调到最慢)。离心后，管内液体分为三层，移液管弃去上层约15ml液体后吸取上、中层界面处白色云雾层狭窄带(即所需PBMC，约5ml)放入离心管，生理盐水(600g,8min)洗2次后弃上清，从试剂盒中取出无血清细胞培养基，每管40ml无血清细胞培养液重悬细胞分离所获得的PBMC。

4.接种细胞：将40ml PBMC细胞悬液加入细胞培养瓶，置饱和湿度、37℃、3.0％-10％CO₂条件下培养。2小时后，收集悬浮细胞，并用无血清培养液调整细胞浓度到1X10⁶/ml,在其中加入IFN-γ培养(400-1600U/ml)。24小时后，从试剂盒中取出细胞因子激活液IL-2(500-1500U/ml)和CD3(30-120ng/mL)各40μl，用于CIK细胞诱导；向细胞培养瓶1中的贴壁细胞加入20ml DC细胞诱导因子IL-4和GM-CSF(100-800U/ml)混合液，用于DC细胞诱导培养。

5.培养至第三天时，视细胞生长状况，补加无血清细胞培养液40ml，40μl细胞因子激活液IL-2(500-1500U/ml，例如1000U/ml)至培养瓶使培养液总体积为80ml。

6.培养至第四天时，CIK细胞：使用50ml医用注射器将每个培养瓶中细胞悬液等量均分转入2个细胞培养袋，加入无血清细胞培养液(≥400ml/袋)和细胞因子激活液IL-2，使细胞终浓度约为1×10⁵cells/ml，IL-2终浓度为500IU/ml，置饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养。DC细胞：培养至第四天，向DC细胞培养瓶中加入10ul DC细胞诱导因子IL-4和GM-CSF(500U/ml)混合液。

7.培养至第6天，CIK细胞：每袋添加细胞因子激活液IL-2，使其终浓度为500IU/ml。DC细胞：加入肿瘤抗原5ul。

8.培养至第7天，DC细胞：加入DC细胞诱导因子TNF-α(100-800U/ml，例如500U/ml)，10ul。

9.培养至第8天，将1/2的DC细胞冻存为2份，分别标示为DC疫苗1、DC疫苗2，剩余DC细胞与CIK细胞共培养并向其中添加1.5倍的无血清细胞培养液和相应的细胞因子激活液IL-2(终浓度为50IU/ml)，并计数。抽取5ml/袋，详细填写好验单项目后，送检验科做真菌、细菌检测。

10.第10天，每袋细胞添加0.5倍的无血清细胞培养液和相应的细胞因子激活液IL-2(终浓度为50IU/ml)，计数并取样做细菌、真菌、内毒素、支原体检测，确认检测结果合格后，回输DC-CIK及DC疫苗1。

11.第12天，每袋细胞添加0.5倍的无血清细胞培养液和相应的细胞因子激活液IL-2(终浓度为50IU/ml)，计数并取样做细菌、真菌、内毒素、支原体检测，确认检测结果合格后，回输DC-CIK。

12.第14天，详细观察细胞生长状态后，随机均匀抽样5ml，台盼蓝染色法计数活细胞、死细胞总数量，同时取样做淋巴细胞表面标记检测；并确认细胞悬液细菌、真菌涂片、支原体及内毒素检测为阴性后，回输DC-CIK及DC疫苗2。收集细胞约4000ml，离心(1500rpm，8min)，洗液(含有0.2％人白蛋白的注射用生理盐水)洗涤(1500rpm，8min)2次，洗液按照500ml生理盐水、50万IU的IL-2、5ml 20％人血清白蛋白的配比，重悬细胞，将其装入细胞回输袋用热合机将管口热合封闭，并留样封存。核对病人病区、姓名、住院号、性别、年龄、细胞数、内毒素、无菌检测结果及治疗项目后，确保无误，贴上标签，填写好详细实验记录并签名后，送病区进行回输。

综上，本发明提供一种DC-CIK细胞诱导活化的试剂盒，将内装采用统一标准配制的调制CIK细胞因子激活液IL2的试剂瓶、调制CIK细胞因子激活液CD3的试剂瓶、调制CIK细胞因子激活液IFN-γ的试剂瓶、调制DC细胞因子激活液IL-4和GM-CSF混合液的试剂瓶、调制DC细胞因子激活液TNF-α的试剂瓶、无血清培养液的试剂瓶一同放入一个试剂盒内，在培养DC-CIK细胞时无需另行配置培养基和诱导因子，缩短了培养细胞的时间，统一配置试剂，降低了培养过程中染菌的风险，同时使用方便，节省人力，可以在较短的时间内培养出质量均一的CIK细胞。

本发明已由上述相关实施例加以描述，然而上述实施例仅为实施本发明的范例。必需指出的是，已揭露的实施例并未限制本发明的范围。相反地，在不脱离本发明的精神和范围内所作的更动与润饰，均属本发明的专利保护范围。

Claims (10)

1.一种DC-CIK细胞诱导活化的试剂盒，其特征在于，包含盒盖和盒体，该盒体内部设有一个海绵托，该海绵拖上设有六个固定孔，该六个固定孔内分别放置有内容调制CIK细胞因子激活液IL-2的试剂瓶、内容调制CIK细胞因子激活液CD3的试剂瓶、内容调制CIK细胞因子激活液IFN-γ的试剂瓶、内容调制DC细胞因子激活液IL-4和GM-CSF混合液的试剂瓶、内容调制DC细胞因子激活液TNF-α的试剂瓶、内容无血清培养液的试剂瓶。

2.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于，IL-2的浓度为500-1500U/ml，CD3的浓度为30-120ng/ml，IL-4和GM-CSF混合液的浓度为100-800U/ml，TNF-α的浓度为100-800U/ml，IFN-γ的浓度为400-1600U/ml。

3.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于，IL-4和GM-CSF混合液的浓度为500U/ml；和/或，IL-2的浓度为1000U/ml。

4.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于，CD3的浓度为100ng/ml。

5.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于，TNF-α的浓度为500U/ml。

6.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于，IFN-γ的浓度为1000U/ml。

7.一种DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒的应用方法，用于DC-CIK细胞诱导活化的试剂盒，该试剂盒包括调制CIK细胞因子激活液IL-2、调制CIK细胞因子激活液CD3、调制CIK细胞因子激活液IFN-γ、调制DC细胞因子激活液IL-4和GM-CSF混合液、调制DC细胞因子激活液TNF-α、无血清培养液，其特征在于，该应用方法包括如下步骤：

抽外周血100ml，收集于四联血袋；

血液预处理:将所采集100ml外周血，置于2支50ml的离心管中,离心(500-1000g,10-35min),上清转移至50ml离心管待处理备用，下部的细胞作密度梯度离心分离PBMC(外周血单核细胞)用；

细胞的分离：血液预处理获得的下层细胞用生理盐水1:1稀释，混匀。将40ml淋巴细胞分离液等量均分放入50ml刻度离心管，将离心管中已稀释的细胞悬液等量均分沿管壁缓慢匀速加入离心管，滴加过程中注意用力均匀，避免破坏分离液-白细胞界面的完整性，离心(500-1000g,15-45min，离心机升降速调到最慢)，离心后，管内液体分为三层，移液管弃去上层约15ml液体后吸取上、中层界面处白色云雾层狭窄带(即所需PBMC，约5ml)放入离心管，生理盐水洗2次(600g,8min)后弃上清，从试剂盒中取出无血清细胞培养基，每管40ml无血清细胞培养液重悬细胞分离所获得的PBMC；

接种细胞：将40ml PBMC细胞悬液加入细胞培养瓶1，置饱和湿度、37℃、3.0％-10％CO₂条件下培养。2小时后，收集悬浮细胞，并用无血清培养液调整细胞浓度到1X10⁶/ml,在其中加入IFN-γ培养(400-1600U/ml)。24小时后，从试剂盒中取出细胞因子激活液IL-2(500-1500U/ml)和CD3(30-120ng/mL)各40μl，用于CIK细胞诱导；向细胞培养瓶1中的贴壁细胞加入20ml DC细胞诱导因子IL-4和GM-CSF(100-800U/ml)混合液，用于DC细胞诱导培养；

培养至第三天，补加无血清细胞培养液40ml，40μl细胞因子激活液IL-2(500-1500U/ml)至培养瓶使培养液总体积为80ml；

培养至第四天，CIK细胞：使用50ml医用注射器将每个培养瓶中细胞悬液等量均分转入2个细胞培养袋，加入无血清细胞培养液(≥400ml/袋)和细胞因子激活液IL-2，使细胞终浓度约为1×10⁵cells/ml，IL-2终浓度为500IU/ml，置饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养。DC细胞：培养至第四天，向DC细胞培养瓶中加入10ul DC细胞诱导因子IL-4和GM-CSF(100-800U/ml)混合液；

培养至第6天，CIK细胞：每袋添加细胞因子激活液IL-2，使其终浓度为500IU/ml。DC细胞：加入肿瘤抗原5ul；

培养至第7天，DC细胞：加入DC细胞诱导因子TNF-α(100-800U/ml)，10ul；

培养至第8天，将1/2的DC细胞冻存为2份，分别标示为DC疫苗1、DC疫苗2，剩余DC细胞与CIK细胞共培养并向其中添加1.5倍的无血清细胞培养液和相应的细胞因子激活液IL-2(终浓度为50IU/ml)，并计数。抽取5ml/袋，详细填写好验单项目后，送检验科做真菌、细菌检测；

第10天，每袋细胞添加0.5倍的无血清细胞培养液和相应的细胞因子激活液IL-2(终浓度为50IU/ml)，计数并取样做细菌、真菌、内毒素、支原体检测，确认检测结果合格后，回输DC-CIK；

第12天，每袋细胞添加0.5倍的无血清细胞培养液和相应的细胞因子激活液IL-2(终浓度为50IU/ml)，计数并取样做细菌、真菌、内毒素、支原体检测，确认检测结果合格后，回输DC-CIK；

第14天，详细观察细胞生长状态后，随机均匀抽样5ml，台盼蓝染色法计数活细胞、死细胞总数量，同时取样做淋巴细胞表面标记检测；并确认细胞悬液细菌、真菌涂片、支原体及内毒素检测为阴性后，回输DC-CIK及DC疫苗2。收集细胞约4000ml，离心(1500rpm，8min)，洗液(含有0.2％人白蛋白的注射用生理盐水)洗涤(1500rpm，8min)2次，洗液按照500ml生理盐水、50万IU的IL-2、5ml 20％人血清白蛋白的配比，重悬细胞，将其装入细胞回输袋用热合机将管口热合封闭，并留样封存。

8.如权利要求7的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒的应用方法，其特征在于，血液预处理时，是离心700g，离心20分钟。

9.如权利要求7的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒的应用方法，其特征在于，细胞分离步骤中，将离心管中已稀释的细胞悬液等量均分沿管壁缓慢匀速加入离心管，滴加过程中注意用力均匀，避免破坏分离液-白细胞界面的完整性，离心800g，离心20分钟，离心后，管内液体分为三层。

10.如权利要求7的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒的应用方法，其特征在于，接种细胞的步骤中，将40ml PBMC细胞悬液加入细胞培养瓶，置饱和湿度、37℃、5.0％CO₂条件下培养。