CN107022525A - 用于肿瘤治疗的nk细胞培养方法 - Google Patents

用于肿瘤治疗的nk细胞培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107022525A
CN107022525A CN201710291427.5A CN201710291427A CN107022525A CN 107022525 A CN107022525 A CN 107022525A CN 201710291427 A CN201710291427 A CN 201710291427A CN 107022525 A CN107022525 A CN 107022525A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
culture
blood
sample
centrifuge tube
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710291427.5A
Other languages
English (en)
Inventor
赵进军
何文丽
邱丽媛
谷广其
李亚平
王晶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Defender Huayi (beijing) Hospital Management Ltd
Original Assignee
Defender Huayi (beijing) Hospital Management Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Defender Huayi (beijing) Hospital Management Ltd filed Critical Defender Huayi (beijing) Hospital Management Ltd
Priority to CN201710291427.5A priority Critical patent/CN107022525A/zh
Publication of CN107022525A publication Critical patent/CN107022525A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Abstract

本发明涉及一种用于肿瘤治疗的NK细胞培养方法，为解决现有技术不能获得大量的、应用安全的、纯度较高的NK细胞问题。其依次包括如下步骤：1）分离单核细胞：2）单核细胞洗涤：3）NK细胞培养；加入培养基，重悬；将用NK细胞因子包被好的包被液吸出，再将细胞悬液转移到包被过的培养瓶中，再加入自体灭活血清、培养；Day 1‑12 NK细胞前期扩增，每次扩增需加自体血清；NK细胞后期扩增：在NK细胞后期扩大培养时使用OKM200培养基，使用方法与OKM100一样，最后扩增到1×109以上即可；最后一次扩繁用培养袋培养；Day12无菌检测后Day14 收获。具有可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的NK细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标的优点。

Description

用于肿瘤治疗的NK细胞培养方法
技术领域
本发明涉及一种细胞培养方法，特别是涉及一种用于肿瘤治疗的NK细胞培养方法。
背景技术
癌症是目前困扰人类的最为重大的疾病之一，无论发病率还是死亡率均呈持续上升趋势。我国具有13.7亿的庞大人口，据统计显示，2015年我国约有4292,000例癌症新发病例，其中2814,000例死亡；，癌症治疗问题亟待解决；肿瘤临床治疗基本以手术、放疗和化疗为主，但手术和放疗虽然在控制肿瘤的局部病灶方面有很好的疗效，但在预防肿瘤的复发和转移方面显得无能为力，而肿瘤的免疫学治疗可以弥补传统治疗手段的这一不足，给癌症治疗带来新的曙光。
肿瘤免疫学治疗是通过激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而达到控制和杀死癌细胞的目的。目前，肿瘤免疫学治疗已成为继手术治疗，放、化疗之后的第四种癌症治疗模式，正逐渐为人们所接受。 这些方法可以清除、杀死少量的术后残留或扩散的癌细胞，提高、巩固癌症治疗的效果，减少癌症的复发。
自然杀伤细胞(natural killer cell,NK) ，属淋巴细胞谱系，是机体的一种重要免疫细胞，主要分布于外周血中，占 PBMC 5～10％ ( 脐带血中 NK 细胞含量约为 7％左右，淋巴结和骨髓中也有NK，但水平较外周血低)。NK细胞其对靶细胞的识别无MHC限制性 ,无需预先致敏即可直接杀伤癌细胞 , 也可分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能, 是机体天然免疫的主要承担者 ,也是获得性细胞免疫的核心调节细胞 , 在肿瘤免疫、抗病毒感染及清除非己细胞中发挥重要作用。有研究证明自然杀伤细胞其实不仅是天然免疫系统中的重要作用成分，它同样具有获得性免疫细胞的一些特征。 在免疫系统中，NK 细胞反应的速度比 T 细胞和B 细胞要快，其作用机制主要是识别靶细胞，通过释放穿孔素、颗粒酶和分泌多种细胞因子，迅速溶解某些癌细胞，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。 但由于 NK 细胞在人外周血中的含量低及肿瘤组织中分布频率较低 ，极大的限制了 NK 细胞作为过继免疫细胞在临床上的应用。目前，国内外已经有大量的学者对NK细胞的培养进行了研究，但是常规技术主要是在体外培养体系中加入 IL-2、IL-12和 IFN-γ等细胞因子来促进 NK 细胞的扩增，经过一段时间的培养后，NK细胞的纯度和数量均不理想，因此也不能满足实际的应用；另外，这种方法因子需求量较大，成本较高，培养效果不稳定，不适合体外大规模的应用。另一种技术是以肿瘤滋养层促进NK细胞扩增的方法虽然能够获得大量的高纯度的的细胞，但是安全性问题却是其无法绕过的门槛。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种用于肿瘤治疗的NK细胞培养方法，这种方法可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的 NK 细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标。
为实现上述目的，本发明用于肿瘤治疗的NK细胞培养方法，其特征在于依次包括如下步骤：1）分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀；根据血液体积计算需要的离心管的个数，离心管中分别加入FicoLL；用移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，每管加入血液，旋紧盖子离心，注意血液要加到淋巴分离液的上层，切勿打破分界面。
将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层；用移液管小心将血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干离心管中，等体积添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀。
2）单核细胞洗涤：将上述收集好的细胞稀释液进行离心，弃上清；用生理盐水定容混合均匀，离心；重复洗涤细胞1次，离心前吸取样本，赤藓红染色计数；最后收集得到的沉淀即为单核细胞。
3）NK细胞培养；根据前步骤中测得的细胞总数，加入OKM100培养基，使细胞的接种浓度为2-4×106/ml，重悬；将用NK细胞因子包被好的培养瓶中的包被液吸出，再将细胞悬液转移到包被过的培养瓶中，再加入自体灭活血清；旋紧瓶盖，置于培养箱中37℃，5% CO2培养。
Day 1-12 NK细胞前期扩增：细胞生长到一定密度培养基颜色变黄时，需进行扩大培养。NK细胞在前期培养时，必须使用营养成分高含有IL-2的OKM100培养基，每次扩增需加自体血清。
NK细胞后期扩增：在NK细胞后期扩大培养时使用OKM200培养基，使用方法与OKM100一样，最后扩增到1×109以上即可；最后一次扩繁用培养袋培养。
Day12无菌检测：细胞收获前两天，要对培养体系做无菌检测；将细胞培养袋放入生物安全柜中，挤压袋子，混匀体系，打开培养袋取样管盖子，用注射器抽取细胞样本，做微生物检测。
4）Day14 收获：（1）从培养箱中取出细胞培养袋，置于生物安全柜中，将细胞悬液从细胞培养袋中转入若干离心管中，拧紧盖子，配平后置于离心机中，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
（2）用已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗前步离心管，将前述离心管内细胞悬液并入另一离心管中，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
（3）用已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗前步离心管，合并前述离心管内细胞悬液，吸取细胞样本于取样离心管中，交予质量人员进行细胞计数，用生理盐水将合并离心管内细胞悬液定容，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
（4）加入生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白；取出细胞样品，交给质量部进行内毒素及微生物检测，并留样冻于冰箱待后续检测；细胞悬液过细胞筛后，通过注射器将细胞悬液转入细胞转移袋中，封口，待出厂检测合格即为成品。
本发明解决了现有技术中 NK 细胞扩增后数量、纯度不理想、成本较高等问题，可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的 NK 细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标。
作为优化，所述出厂检测是如下细胞检验：细胞数量与活性检测，细胞无菌检测，支原体检测，内毒素检测，细胞表型检测。
作为优化，所述细胞数量与活性检测：是将细胞样本混匀，取10μL细胞悬液用10μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量达到1-3×109,细胞活性≧90%为合格。
所述细胞无菌检测：是将细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性。
所述支原体检测：将Day12操作中取的细胞样本混匀，取适量用支原体检测试剂盒进行支原体检测。
所述内毒素检测：是用鲎试剂凝胶法对细胞样本进行检测，内毒素标准≤0.25EU；操作如下：准品处理：向内毒素检测标准品加入BET水进行稀释，按照鲎试剂规格稀释成2λ的液体备用；鲎试剂处理：设置一组阴性对照一组阳性对照，加上Day14 收获操作中取的细胞样本，每组两支，加入0.1mLBET水溶解，阳性对照组加入0.1mL 2λ的标准品，阴性对照组加入0.1 mLBET水；放在37℃培养箱中30min-60min，观察结果，阳性对照凝结，阴性对照和供试品组不凝结则说明供试品内毒素合格。
所述细胞表型检测：根据每种抗体1 x 106个细胞计算需要的细胞数，并采用阴性对照管，生理盐水洗涤细胞，标记抗体，在4℃孵育30min，生理盐水清洗1-2次，去除未标记的抗体，流式细胞仪进行检测，将检测结果用相关软件进行分析， CD3-CD56+所占的比例≧70%-80%即为合格。
作为优化，培养过程中对全血、第一次细胞接种、细胞转袋培养、细胞收获前两天、出厂时分别做一次如下血平板检测。
细胞数量与活性检测：将细胞样本混匀，取10μL细胞悬液用10μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量达到1-3×109,细胞活性≧90%为合格。
细胞无菌检测：是将细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性。
作为优化，在1）分离单核细胞前先进行如下准备步骤：分离前准备：操作中所需物品都用75%酒精消毒后才能放入生物安全柜；物品放入安全柜时要从右手进入，用完后从左手出；废液缸放在左手边，一般常用的物品如枪头、移液器、移液管、剪刀、止血钳等放在右手边；不常用的物品可放在左手靠里的位置；操作过程中，不许左右手交叉操作，不许将手放在打开的无菌容器或培养瓶的上方。
全血检验与血样保存：根据淋巴细胞绝对值计算采血量，将采血管用75%酒精喷洒消毒后放入生物安全柜，颠倒混匀；开启采血管，用10mL移液管将血液从采血管中转移至250mL离心管中，反复吹打混匀后取出约0.5mL血液到用于微生物检测；取1mL血液于1.5mL冻存管中，保存在-80℃冰箱，作为档案以备后续检验。
血浆处理：将盛有血液的250mL离心管放入离心机中，配平后，2500rpm离心10min，升10降10；离完心将上层血浆转移到50mL离心管中，盖紧盖子，贴封口膜，置于56℃水浴锅中灭活30min，灭活后，3000rpm离心10min，弃沉淀，留上清；将处理好的血浆置于4℃保存待用。
作为优化，步骤1）分离单核细胞中：所述离心管为50mL离心管，离心管中分别加入FicoLL的数量为15mL，把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中的所述移液管为25mL移液管，每管加入血液的数量为30mL，所述离心为7升4降2000rpm离心20min，将血浆层尽量吸弃干净的移液管为10mL移液管。
作为优化，步骤2）单核细胞洗涤中：收集好的细胞稀释液进行的离心是1600rpm离心10min，用生理盐水定容混合均匀后的离心是1200rpm离心8min，离心前吸取的样本数量是0.5mL。
作为优化，步骤3）NK细胞培养中；加入自体灭活血清是加入5-10%体积比的自体灭活血清，每次扩增加自体血清的数量为1-5%体积比，抽取细胞样本是用2mL注射器抽取约0.5mL细胞样本。
作为优化，步骤4）Day14 收获是：（1）步骤中：所述离心管是250mL离心管，所述离心是2000rpm离心5min；（2）步骤中：用已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗前步离心管是用25mL×3次已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗离心管，将前述离心管内细胞悬液并入另一离心管中，离心是细胞悬液并入另一离心管中，共75mL；依此操作，将离心管并为两个，2000rpm离心5min；（3）步骤中：用已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗前步离心管是用50mL×2次已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗离心管；合并前述离心管内细胞悬液，吸取细胞样本于取样离心管中是合并细胞悬液，共100mL，吸取约0.5mL细胞样本于1.5mL离心管中；用生理盐水将合并离心管内细胞悬液定容，离心是用生理盐水将细胞悬液定容至250mL，2000rpm离心5min；（4）步骤中：加入生理盐水混匀细胞是加入100mL生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白是加入适量人血白蛋白使人血白蛋白终浓度为1%，取出细胞样品是取出约1.5mL细胞样品，留样冻于冰箱待后续检测是留样冻于-80℃冰箱待后续检测，细胞悬液过细胞筛是细胞悬液过100μm的细胞筛，通过注射器将细胞悬液转入细胞转移袋中是通过60mL注射器将100mL细胞悬液转入细胞转移袋中，封口是用封管热合器封口。
作为优化，1）分离单核细胞前先进行如下生产前准备：1）对于生产车间，要提前进行各项洁净室验证，包括沉降菌、浮游菌和尘埃粒子的验证，通过验证后，才可以投入使用。
2）NK细胞刺激因子OKM-25应用无菌PBS稀释100-200倍后，取5-10 mL加入到75cm2细胞培养瓶内,然后将细胞培养瓶放平，于室温条件下过夜，然后转入4℃冰箱内保存待用。
3）洁净室通风循环系统预先运行并正常工作30min，进入洁净室打开生物安全柜紫外灯设置30 min，打开整个洁净区紫外灯进行消毒灭菌；水浴锅打开设置工作温度为56℃。
4）将淋巴细胞分离液以及无血清培养基（OKM100）置于冰箱外部恢复室温。
本发明解决了现有技术中 NK 细胞扩增后数量、纯度不理想、成本较高等问题，可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的 NK 细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标。
采用上述技术方案后，本发明用于肿瘤治疗的NK细胞培养方法具有可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的 NK 细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标的优点。
具体实施方式
本发明用于肿瘤治疗的NK细胞培养方法依次包括如下步骤：1）分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀；根据血液体积计算需要的离心管的个数，离心管中分别加入FicoLL；用移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，每管加入血液，旋紧盖子离心，注意血液要加到淋巴分离液的上层，切勿打破分界面。
将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层；用移液管小心将血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干离心管中，等体积添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀。
2）单核细胞洗涤：将上述收集好的细胞稀释液进行离心，弃上清；用生理盐水定容混合均匀，离心；重复洗涤细胞1次，离心前吸取样本，赤藓红染色计数；最后收集得到的沉淀即为单核细胞。
3）NK细胞培养；根据前步骤中测得的细胞总数，加入OKM100培养基，使细胞的接种浓度为2-4×106/ml，重悬；将用NK细胞因子包被好的培养瓶中的包被液吸出，再将细胞悬液转移到包被过的培养瓶中，再加入自体灭活血清；旋紧瓶盖，置于培养箱中37℃，5%CO2培养。
Day 1-12 NK细胞前期扩增：细胞生长到一定密度培养基颜色变黄时，需进行扩大培养；NK细胞在前期培养时，必须使用营养成分高含有IL-2的OKM100培养基，每次扩增需加自体血清。
NK细胞后期扩增：在NK细胞后期扩大培养时使用OKM200培养基，使用方法与OKM100一样，最后扩增到1×109以上即可；最后一次扩繁用培养袋培养。
Day12无菌检测：细胞收获前两天，要对培养体系做无菌检测；将细胞培养袋放入生物安全柜中，挤压袋子，混匀体系，打开培养袋取样管盖子，用注射器抽取细胞样本，做微生物检测。
4）Day14 收获：（1）从培养箱中取出细胞培养袋，置于生物安全柜中，将细胞悬液从细胞培养袋中转入若干离心管中，拧紧盖子，配平后置于离心机中，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
（2）用已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗前步离心管，将前述离心管内细胞悬液并入另一离心管中，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
（3）用已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗前步离心管，合并前述离心管内细胞悬液，吸取细胞样本于取样离心管中，交予质量人员进行细胞计数，用生理盐水将合并离心管内细胞悬液定容，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
（4）加入生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白；取出细胞样品，交给质量部进行内毒素及微生物检测，并留样冻于冰箱待后续检测；细胞悬液过细胞筛后，通过注射器将细胞悬液转入细胞转移袋中，封口，待出厂检测合格即为成品。本发明解决了现有技术中NK 细胞扩增后数量、纯度不理想、成本较高等问题，可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的 NK 细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标。
具体是所述出厂检测是如下细胞检验：细胞数量与活性检测，细胞无菌检测，支原体检测，内毒素检测，细胞表型检测。
更具体是所述细胞数量与活性检测：是将细胞样本混匀，取10μL细胞悬液用10μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量达到1-3×109,细胞活性≧90%为合格。
所述细胞无菌检测：是将细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性。
所述支原体检测：将Day12操作中取的细胞样本混匀，取适量用支原体检测试剂盒进行支原体检测。
所述内毒素检测：是用鲎试剂凝胶法对细胞样本进行检测，内毒素标准≤0.25EU；操作如下：准品处理：向内毒素检测标准品加入BET水进行稀释，按照鲎试剂规格稀释成2λ的液体备用；鲎试剂处理：设置一组阴性对照一组阳性对照，加上Day14 收获操作中取的细胞样本，每组两支，加入0.1mLBET水溶解，阳性对照组加入0.1mL 2λ的标准品，阴性对照组加入0.1 mLBET水；放在37℃培养箱中30min-60min，观察结果，阳性对照凝结，阴性对照和供试品组不凝结则说明供试品内毒素合格。
所述细胞表型检测：根据每种抗体1 x 106个细胞计算需要的细胞数，并采用阴性对照管，生理盐水洗涤细胞，标记抗体，在4℃孵育30min，生理盐水清洗1-2次，去除未标记的抗体，流式细胞仪进行检测，将检测结果用相关软件进行分析， CD3-CD56+所占的比例≧70%-80%即为合格。
具体是：培养过程中对全血、第一次细胞接种、细胞转袋培养、细胞收获前两天、出厂时分别做一次如下血平板检测。
细胞数量与活性检测：将细胞样本混匀，取10μL细胞悬液用10μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量达到1-3×109,细胞活性≧90%为合格。
细胞无菌检测：是将细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性。
具体是：在1）分离单核细胞前先进行如下准备步骤：分离前准备：操作中所需物品都用75%酒精消毒后才能放入生物安全柜；物品放入安全柜时要从右手进入，用完后从左手出；废液缸放在左手边，一般常用的物品如枪头、移液器、移液管、剪刀、止血钳等放在右手边；不常用的物品可放在左手靠里的位置；操作过程中，不许左右手交叉操作，不许将手放在打开的无菌容器或培养瓶的上方。
全血检验与血样保存：根据淋巴细胞绝对值计算采血量，将采血管用75%酒精喷洒消毒后放入生物安全柜，颠倒混匀；开启采血管，用10mL移液管将血液从采血管中转移至250mL离心管中，反复吹打混匀后取出约0.5mL血液到用于微生物检测；取1mL血液于1.5mL冻存管中，保存在-80℃冰箱，作为档案以备后续检验。
血浆处理：将盛有血液的250mL离心管放入离心机中，配平后，2500rpm离心10min（升10降10）。离完心将上层血浆转移到50mL离心管中，盖紧盖子，贴封口膜，置于56℃水浴锅中灭活30min，灭活后，3000rpm离心10min，弃沉淀，留上清；将处理好的血浆置于4℃保存待用。
具体是：步骤1）分离单核细胞中：所述离心管为50mL离心管，离心管中分别加入FicoLL的数量为15mL，把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中的所述移液管为25mL移液管，每管加入血液的数量为30mL，所述离心为7升4降2000rpm离心20min，将血浆层尽量吸弃干净的移液管为10mL移液管。
具体是：步骤2）单核细胞洗涤中：收集好的细胞稀释液进行的离心是1600rpm离心10min，用生理盐水定容混合均匀后的离心是1200rpm离心8min，离心前吸取的样本数量是0.5mL。具体是：步骤3）NK细胞培养中；加入自体灭活血清是加入5-10%体积比的自体灭活血清，每次扩增加自体血清的数量为1-5%体积比，抽取细胞样本是用2mL注射器抽取约0.5mL细胞样本。
具体是：步骤4）Day14 收获是：（1）步骤中：所述离心管是250mL离心管，所述离心是2000rpm离心5min；（2）步骤中：用已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗前步离心管是用25mL×3次已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗离心管，将前述离心管内细胞悬液并入另一离心管中，离心是细胞悬液并入另一离心管中，共75mL；依此操作，将离心管并为两个，2000rpm离心5min；（3）步骤中：用已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗前步离心管是用50mL×2次已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗离心管；合并前述离心管内细胞悬液，吸取细胞样本于取样离心管中是合并细胞悬液，共100mL，吸取约0.5mL细胞样本于1.5mL离心管中；用生理盐水将合并离心管内细胞悬液定容，离心是用生理盐水将细胞悬液定容至250mL，2000rpm离心5min；（4）步骤中：加入生理盐水混匀细胞是加入100mL生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白是加入适量人血白蛋白使人血白蛋白终浓度为1%，取出细胞样品是取出约1.5mL细胞样品，留样冻于冰箱待后续检测是留样冻于-80℃冰箱待后续检测，细胞悬液过细胞筛是细胞悬液过100μm的细胞筛，通过注射器将细胞悬液转入细胞转移袋中是通过60mL注射器将100mL细胞悬液转入细胞转移袋中，封口是用封管热合器封口。
具体是：1）分离单核细胞前先进行如下生产前准备：1）对于生产车间，要提前进行各项洁净室验证，包括沉降菌、浮游菌和尘埃粒子的验证，通过验证后，才可以投入使用。
2）NK细胞刺激因子OKM-25应用无菌PBS稀释100-200倍后，取5-10 mL加入到75cm2细胞培养瓶内,然后将细胞培养瓶放平，于室温条件下过夜，然后转入4℃冰箱内保存待用；
3）洁净室通风循环系统预先运行并正常工作30min，进入洁净室打开生物安全柜紫外灯设置30 min，打开整个洁净区紫外灯进行消毒灭菌；水浴锅打开设置工作温度为56℃。
4）将淋巴细胞分离液以及无血清培养基（OKM100）置于冰箱外部恢复室温。
本发明解决了现有技术中 NK 细胞扩增后数量、纯度不理想、成本较高等问题，可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的 NK 细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标。更详细说明如下。
生产前准备：1.1、对于生产车间，要提前进行各项洁净室验证，包括沉降菌、浮游菌和尘埃粒子的验证。通过验证后，才可以投入使用。
1.2、 NK细胞刺激因子OKM-25应用无菌PBS稀释100-200倍后，取5-10 mL加入到75cm2细胞培养瓶内,然后将细胞培养瓶放平，于室温条件下过夜，然后转入4℃冰箱内保存待用。
1.3、洁净室通风循环系统预先运行并正常工作30min，进入洁净室打开生物安全柜紫外灯设置30 min，打开整个洁净区紫外灯进行消毒灭菌。水浴锅打开设置工作温度为56℃。
1.4、将淋巴细胞分离液以及无血清培养基（OKM100）置于冰箱外部恢复室温。
人外周血单核细胞分离：2.1分离前准备：在操作中，所需物品都需要用75%酒精消毒后才能放入生物安全柜。物品放入安全柜时要从右手进入，用完后从左手出。废液缸放在左手边，一般常用的物品如枪头、移液器、移液管、剪刀、止血钳等放在右手边；不常用的物品可放在左手靠里的位置。操作过程中，不许左右手交叉操作，不许将手放在打开的无菌容器或培养瓶的上方。
全血检验与血样保存：根据淋巴细胞绝对值计算采血量，计算公式：采血量（mL）=80/淋巴细胞绝对值。将采血管用75%酒精喷洒消毒后放入生物安全柜，颠倒混匀。开启采血管，用10mL移液管将血液从采血管中转移至250mL离心管中，反复吹打混匀后取出约0.5mL血液到用于微生物检测；取1mL血液于1.5mL冻存管中，保存在-80℃冰箱，作为档案以备后续检验。
血浆处理：将盛有血液的250mL离心管放入离心机中，配平后，2500rpm离心10min，升10降10；离完心将上层血浆转移到50mL离心管中，盖紧盖子，贴封口膜，置于56℃水浴锅中灭活30min，灭活后，3000rpm离心10min，弃沉淀，留上清。将处理好的血浆置于4℃保存待用。
分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀；根据血液体积计算需要的50mL离心管的个数，离心管中分别加入15mLFicoLL；用25mL移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，每管加入30mL血液，旋紧盖子，2000rpm离心20min（升7降4）。注意血液要加到淋巴分离液的上层，切勿打破分界面。
将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层。用10mL移液管小心将血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干50mL离心管中，等体积添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀。
单核细胞洗涤：将上述收集好的细胞稀释液进行离心，1600rpm离心10min，弃上清；用生理盐水定容到45mL，混合均匀，1200rpm离心8min；重复洗涤细胞1次，离心前吸取约0.5mL样本，赤藓红染色计数。最后收集得到的沉淀即为单核细胞。
细胞培养：根据前步骤中测得的细胞总数，加入OKM100培养基，使细胞的接种浓度为2-4×106/ml，重悬。将用NK细胞因子包被好的培养瓶中的包被液吸出，再将细胞悬液转移到包被过的培养瓶中，再加入5-10%自体灭活血清。旋紧瓶盖，置于培养箱中37℃，5% CO2培养。
细胞前期扩增：细胞生长到一定密度培养基颜色变黄时，需进行扩大培养。NK细胞在前期培养时，必须使用营养成分高的OKM100培养基，每次扩增需加自体血清（根据自体血清体积加1-5%）。因为OKM培养基中已含有IL-2，所以NK细胞在使用OKM培养基进行培养时，不需要再添加任何细胞因子。
细胞后期扩增：在NK细胞后期扩大培养时可以使用OKM200培养基，使用方法与OKM100一样，最后扩增到1×109以上即可。最后一次扩繁可以用培养袋培养。
无菌检测：细胞收获前两天，要对培养体系做无菌检测。将细胞培养袋放入生物安全柜中，挤压袋子，混匀体系，打开培养袋取样管盖子，用2mL注射器抽取约0.5mL细胞样本，做微生物检测。
收获：1）从培养箱中取出细胞培养袋，置于生物安全柜中，将细胞悬液从细胞培养袋中转入若干250mL离心管中，拧紧盖子，配平后置于离心机中，2000rpm离心5min，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
2）用25mL×3次生理盐水（已加入适量人血白蛋白）洗离心管，细胞悬液并入另一离心管中，共75mL；依此操作，将四个离心管并为两个，2000rpm离心5min，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
3）用50mL×2次生理盐水（已加入适量人血白蛋白）洗离心管，合并细胞悬液，共100mL，吸取约0.5mL细胞样本于1.5mL离心管中，交予质量人员进行细胞计数，用生理盐水将细胞悬液定容至250mL，2000rpm离心5min，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
4）加入100mL生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白（终浓度为1%）；取出约1.5mL细胞样品，交给质量部进行内毒素及微生物检测，并留样冻于-80℃冰箱待后续检测，细胞悬液过100μm的细胞筛后，通过60mL注射器连接100mL细胞转移袋，将细胞悬液转入细胞转移袋中，用封管热合器封口，待出厂检测。
细胞检验：4.1细胞数量与活性检测：将细胞样本混匀，取10μL细胞悬液用10μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量要求1-3×109,细胞活性要求≧90%。
细胞无菌检测：将细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性。
除此之外，还需要对全血、第一次细胞接种、细胞转袋培养、细胞收获前两天、出厂时分别做一次血平板检测。用这两种方法可以监控细胞有无细菌污染，并方便排查原因。
支原体检测：支原体个体小，较一般细菌更难检测，本公司用支原体检测试剂盒进行检测。方法是将Day12操作中取的细胞样本混匀，取适量用于支原体检测。
内毒素检测：本公司用鲎试剂凝胶法对细胞样本进行检测。内毒素标准≤0.25EU。操作如下：1）准品处理：向内毒素检测标准品加入BET水进行稀释，按照鲎试剂规格稀释成2λ的液体备用。2）鲎试剂处理：设置一组阴性对照一组阳性对照，加上Day14 收获操作中取的细胞样本，每组两支，加入0.1mLBET水溶解，阳性对照组加入0.1mL 2λ的标准品，阴性对照组加入0.1 mLBET水。3）放在37℃培养箱中30min-60min，观察结果，阳性对照凝结，阴性对照和供试品组不凝结则说明供试品内毒素合格。
细胞表型检测：根据每种抗体1 x 106个细胞计算需要的细胞数，需要阴性对照管，生理盐水洗涤细胞，标记抗体，在4℃孵育30min，生理盐水清洗1-2次，去除未标记的抗体，流式细胞仪进行检测，将检测结果用相关软件进行分析， CD3-CD56+所占的比例≧70%-80%。
本发明解决了现有技术中 NK 细胞扩增后数量、纯度不理想、成本较高等问题，可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的 NK 细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标。

Claims (10)

1.一种用于肿瘤治疗的NK细胞培养方法，其特征在于依次包括如下步骤：
1）分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀；根据血液体积计算需要的离心管的个数，离心管中分别加入FicoLL；用移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，每管加入血液，旋紧盖子离心，注意血液要加到淋巴分离液的上层，切勿打破分界面；将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层；用移液管小心将血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干离心管中，等体积添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀；
2）单核细胞洗涤：将上述收集好的细胞稀释液进行离心，弃上清；用生理盐水定容混合均匀，离心；重复洗涤细胞1次，离心前吸取样本，赤藓红染色计数；最后收集得到的沉淀即为单核细胞；
3）NK细胞培养；根据前步骤中测得的细胞总数，加入OKM100培养基，使细胞的接种浓度为2-4×106/ml，重悬；将用NK细胞因子包被好的培养瓶中的包被液吸出，再将细胞悬液转移到包被过的培养瓶中，再加入自体灭活血清；旋紧瓶盖，置于培养箱中37℃，5% CO2培养；
Day 1-12 NK细胞前期扩增：细胞生长到一定密度培养基颜色变黄时，需进行扩大培养；NK细胞在前期培养时，必须使用营养成分高含有IL-2的OKM100培养基，每次扩增需加自体血清；
NK细胞后期扩增：在NK细胞后期扩大培养时使用OKM200培养基，使用方法与OKM100一样，最后扩增到1×109以上即可；最后一次扩繁用培养袋培养；
Day12无菌检测：细胞收获前两天，要对培养体系做无菌检测；将细胞培养袋放入生物安全柜中，挤压袋子，混匀体系，打开培养袋取样管盖子，用注射器抽取细胞样本，做微生物检测；
4）Day14 收获：
（1）从培养箱中取出细胞培养袋，置于生物安全柜中，将细胞悬液从细胞培养袋中转入若干离心管中，拧紧盖子，配平后置于离心机中，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；
（2）用已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗前步离心管，将前述离心管内细胞悬液并入另一离心管中，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；
（3）用已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗前步离心管，合并前述离心管内细胞悬液，吸取细胞样本于取样离心管中，交予质量人员进行细胞计数，用生理盐水将合并离心管内细胞悬液定容，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；
（4）加入生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白；取出细胞样品，交给质量部进行内毒素及微生物检测，并留样冻于冰箱待后续检测；细胞悬液过细胞筛后，通过注射器将细胞悬液转入细胞转移袋中，封口，待出厂检测合格即为成品。
2.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于所述出厂检测是如下细胞检验：细胞数量与活性检测，细胞无菌检测，支原体检测，内毒素检测，细胞表型检测。
3.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于所述细胞数量与活性检测：是将细胞样本混匀，取10μL细胞悬液用10μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量达到1-3×109,细胞活性≧90%为合格；
所述细胞无菌检测：是将细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性；
所述支原体检测：将Day12操作中取的细胞样本混匀，取适量用支原体检测试剂盒进行支原体检测；
所述内毒素检测：是用鲎试剂凝胶法对细胞样本进行检测，内毒素标准≤0.25EU；操作如下：准品处理：向内毒素检测标准品加入BET水进行稀释，按照鲎试剂规格稀释成2λ的液体备用；鲎试剂处理：设置一组阴性对照一组阳性对照，加上Day14 收获操作中取的细胞样本，每组两支，加入0.1mLBET水溶解，阳性对照组加入0.1mL 2λ的标准品，阴性对照组加入0.1 mLBET水；放在37℃培养箱中30min-60min，观察结果，阳性对照凝结，阴性对照和供试品组不凝结则说明供试品内毒素合格；
所述细胞表型检测：根据每种抗体1 x 106个细胞计算需要的细胞数，并采用阴性对照管，生理盐水洗涤细胞，标记抗体，在4℃孵育30min，生理盐水清洗1-2次，去除未标记的抗体，流式细胞仪进行检测，将检测结果用相关软件进行分析， CD3-CD56+所占的比例≧70%-80%即为合格。
4.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于培养过程中对全血、第一次细胞接种、细胞转袋培养、细胞收获前两天、出厂时分别做一次如下血平板检测；
细胞数量与活性检测：将细胞样本混匀，取10μL细胞悬液用10μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量达到1-3×109,细胞活性≧90%为合格；
细胞无菌检测：是将细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性。
5.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于在1）分离单核细胞前先进行如下准备步骤：分离前准备：操作中所需物品都用75%酒精消毒后才能放入生物安全柜；物品放入安全柜时要从右手进入，用完后从左手出；废液缸放在左手边，一般常用的物品如枪头、移液器、移液管、剪刀、止血钳等放在右手边；不常用的物品可放在左手靠里的位置；操作过程中，不许左右手交叉操作，不许将手放在打开的无菌容器或培养瓶的上方；
全血检验与血样保存：根据淋巴细胞绝对值计算采血量，将采血管用75%酒精喷洒消毒后放入生物安全柜，颠倒混匀；开启采血管，用10mL移液管将血液从采血管中转移至250mL离心管中，反复吹打混匀后取出约0.5mL血液到用于微生物检测；取1mL血液于1.5mL冻存管中，保存在-80℃冰箱，作为档案以备后续检验；
血浆处理：将盛有血液的250mL离心管放入离心机中，配平后，2500rpm离心10min，升10降10；离完心将上层血浆转移到50mL离心管中，盖紧盖子，贴封口膜，置于56℃水浴锅中灭活30min，灭活后，3000rpm离心10min，弃沉淀，留上清；将处理好的血浆置于4℃保存待用。
6.根据权利要求1－5任一所述培养方法，其特征在于步骤1）分离单核细胞中：所述离心管为50mL离心管，离心管中分别加入FicoLL的数量为15mL，把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中的所述移液管为25mL移液管，每管加入血液的数量为30mL，所述离心为7升4降2000rpm离心20min，将血浆层尽量吸弃干净的移液管为10mL移液管。
7.根据权利要求1－5任一所述培养方法，其特征在于步骤2）单核细胞洗涤中：收集好的细胞稀释液进行的离心是1600rpm离心10min，用生理盐水定容混合均匀后的离心是1200rpm离心8min，离心前吸取的样本数量是0.5mL。
8.根据权利要求1－5任一所述培养方法，其特征在于 步骤3）NK细胞培养中；加入自体灭活血清是加入5-10%体积比的自体灭活血清，每次扩增加自体血清的数量为1-5%体积比，抽取细胞样本是用2mL注射器抽取约0.5mL细胞样本。
9.根据权利要求1－5任一所述培养方法，其特征在于步骤4）Day14 收获是：（1）步骤中：所述离心管是250mL离心管，所述离心是2000rpm离心5min；（2）步骤中：用已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗前步离心管是用25mL×3次已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗离心管，将前述离心管内细胞悬液并入另一离心管中，离心是细胞悬液并入另一离心管中，共75mL；依此操作，将离心管并为两个，2000rpm离心5min；（3）步骤中：用已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗前步离心管是用50mL×2次已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗离心管；合并前述离心管内细胞悬液，吸取细胞样本于取样离心管中是合并细胞悬液，共100mL，吸取约0.5mL细胞样本于1.5mL离心管中；用生理盐水将合并离心管内细胞悬液定容，离心是用生理盐水将细胞悬液定容至250mL，2000rpm离心5min；（4）步骤中：加入生理盐水混匀细胞是加入100mL生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白是加入适量人血白蛋白使人血白蛋白终浓度为1%，取出细胞样品是取出约1.5mL细胞样品，留样冻于冰箱待后续检测是留样冻于-80℃冰箱待后续检测，细胞悬液过细胞筛是细胞悬液过100μm的细胞筛，通过注射器将细胞悬液转入细胞转移袋中是通过60mL注射器将100mL细胞悬液转入细胞转移袋中，封口是用封管热合器封口。
10.根据权利要求1－5任一所述培养方法，其特征在于1）分离单核细胞前先进行如下
生产前准备：1）对于生产车间，要提前进行各项洁净室验证，包括沉降菌、浮游菌和尘埃粒子的验证，通过验证后，才可以投入使用；2）NK细胞刺激因子OKM-25应用无菌PBS稀释100-200倍后，取5-10 mL加入到75 cm2细胞培养瓶内,然后将细胞培养瓶放平，于室温条件下过夜，然后转入4℃冰箱内保存待用；3）洁净室通风循环系统预先运行并正常工作30min，进入洁净室打开生物安全柜紫外灯设置30 min，打开整个洁净区紫外灯进行消毒灭菌；水浴锅打开设置工作温度为56℃；4）将淋巴细胞分离液以及无血清培养基（OKM100）置于冰箱外部恢复室温。
CN201710291427.5A 2017-04-28 2017-04-28 用于肿瘤治疗的nk细胞培养方法 Pending CN107022525A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710291427.5A CN107022525A (zh) 2017-04-28 2017-04-28 用于肿瘤治疗的nk细胞培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710291427.5A CN107022525A (zh) 2017-04-28 2017-04-28 用于肿瘤治疗的nk细胞培养方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107022525A true CN107022525A (zh) 2017-08-08

Family

ID=59526727

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710291427.5A Pending CN107022525A (zh) 2017-04-28 2017-04-28 用于肿瘤治疗的nk细胞培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107022525A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107541491A (zh) * 2017-10-12 2018-01-05 广州金晟生物科技有限公司 一种nk细胞体外培养方法
CN108484775A (zh) * 2018-03-13 2018-09-04 北京鼎成肽源生物技术有限公司 靶向pd-l1的t和nkt混合细胞、制备方法和应用
CN108753724A (zh) * 2018-05-07 2018-11-06 广州沙艾生物科技有限公司 一种免疫细胞培养方法及其应用
CN111548994A (zh) * 2020-04-24 2020-08-18 广东华夏健康生命科学有限公司 一种细胞培养基及其培养nk细胞的方法
CN114058584A (zh) * 2022-01-07 2022-02-18 山东省齐鲁干细胞工程有限公司 一种临床用自然杀伤细胞的制备方法
CN116904397A (zh) * 2023-09-04 2023-10-20 山东德升细胞治疗工程技术有限公司 Nk细胞的细胞外囊泡的制备及应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103756964A (zh) * 2013-12-30 2014-04-30 天津斯坦姆生物科技有限公司 一种高效扩增cd3-cd56+的自然杀伤细胞培养系统的方法
CN104395461A (zh) * 2012-08-02 2015-03-04 阿部博幸 得到单核细胞或nk 细胞的方法
CN104928243A (zh) * 2015-07-13 2015-09-23 山西大医院 实体瘤患者自体nk细胞分离、活化扩增及活性检测方法
CN105754942A (zh) * 2016-05-18 2016-07-13 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 一种体外扩增nk细胞的方法及其获得的nk细胞
CN106011061A (zh) * 2016-08-04 2016-10-12 广东省第二人民医院 一种自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法
CN106282110A (zh) * 2016-07-29 2017-01-04 中卫华医（北京）生物科技有限公司 高效cik细胞制备及检测方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104395461A (zh) * 2012-08-02 2015-03-04 阿部博幸 得到单核细胞或nk 细胞的方法
CN103756964A (zh) * 2013-12-30 2014-04-30 天津斯坦姆生物科技有限公司 一种高效扩增cd3-cd56+的自然杀伤细胞培养系统的方法
CN104928243A (zh) * 2015-07-13 2015-09-23 山西大医院 实体瘤患者自体nk细胞分离、活化扩增及活性检测方法
CN105754942A (zh) * 2016-05-18 2016-07-13 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 一种体外扩增nk细胞的方法及其获得的nk细胞
CN106282110A (zh) * 2016-07-29 2017-01-04 中卫华医（北京）生物科技有限公司 高效cik细胞制备及检测方法
CN106011061A (zh) * 2016-08-04 2016-10-12 广东省第二人民医院 一种自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107541491A (zh) * 2017-10-12 2018-01-05 广州金晟生物科技有限公司 一种nk细胞体外培养方法
CN108484775A (zh) * 2018-03-13 2018-09-04 北京鼎成肽源生物技术有限公司 靶向pd-l1的t和nkt混合细胞、制备方法和应用
CN108753724A (zh) * 2018-05-07 2018-11-06 广州沙艾生物科技有限公司 一种免疫细胞培养方法及其应用
CN111548994A (zh) * 2020-04-24 2020-08-18 广东华夏健康生命科学有限公司 一种细胞培养基及其培养nk细胞的方法
CN111548994B (zh) * 2020-04-24 2021-05-25 广东华夏健康生命科学有限公司 一种细胞培养基及其培养nk细胞的方法
CN114058584A (zh) * 2022-01-07 2022-02-18 山东省齐鲁干细胞工程有限公司 一种临床用自然杀伤细胞的制备方法
CN116904397A (zh) * 2023-09-04 2023-10-20 山东德升细胞治疗工程技术有限公司 Nk细胞的细胞外囊泡的制备及应用
CN116904397B (zh) * 2023-09-04 2023-12-26 山东德升细胞治疗工程技术有限公司 Nk细胞的细胞外囊泡的制备及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107022525A (zh) 用于肿瘤治疗的nk细胞培养方法
CN106282110A (zh) 高效cik细胞制备及检测方法
CN105861430A (zh) 一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备治疗脓毒症药物或者制剂中的应用
CN104498434B (zh) 一种大量树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞
JP7332787B2 (ja) 免疫細胞のインビトロ培養、誘導、活性化、凍結保存方法及びその細胞バンクの作成
CN108310014A (zh) 一种干细胞制剂及其制备方法与在制备防治肺损伤的药物中的应用
CN104839146A (zh) 组合物及其用途、胎盘保存制剂及其制备方法
CN108251365A (zh) 免疫细胞培养基体系
CN106367393B (zh) 小鼠前列腺癌循环肿瘤细胞系及前列腺癌循环肿瘤细胞分离和培养方法
CN105602897A (zh) 人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后诱导的方法
CN106591231B (zh) 促进cik细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培养基、培养方法和应用
CN108315297A (zh) 一种从脂肪组织中分离、纯化脂肪干细胞的方法
CN109402055A (zh) 一种dc-cik细胞培养试剂盒及其培养方法
CN105532647A (zh) 经血保存液及其应用、经血源宫内膜干细胞的分离培养方法
CN105238756A (zh) 一种脐带血单核细胞的制备方法
Karapetyan In vitro cultivation of Giardia duodenalis
CN107904175B (zh) 用于免疫细胞的诱导扩增的培养箱
CN101914497B (zh) 临床用n-cik细胞培养、质量控制鉴定试剂盒及应用
CN101757027A (zh) 一种体外制备抗鸡传染性支气管炎病毒特异性转移因子的制备方法
CN107417809A (zh) 硫酸软骨素用于扩增cik细胞、制备cik细胞扩增试剂和包被培养器皿的用途
KR20210127344A (ko) 로봇을 이용한 세포배양 자동화 시스템
CN106754690A (zh) 一种快速收获中期细胞的染色体培养基及应用
CN106190973B (zh) 一种nkt细胞培养方法
CN106190969A (zh) 一种蜕膜间充质干细胞的制备方法
CN115089611A (zh) 一种cd146+或cd146-脐带间充质干细胞亚群在制备防治脓毒症的产品中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170808

RJ01 Rejection of invention patent application after publication